一种耐高温碱性蛋白酶突变体及其应用 |
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| 申请号 | CN202211323507.1 | 申请日 | 2022-10-27 | 公开(公告)号 | CN117947004A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司; | 发明人 | 张霞; 李玉强; 曹兴南; 鲍锴; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基因工程与 蛋白质 改造技术领域，具体涉及一种耐高温 碱 性蛋白酶突变体及其应用。本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的野生型碱性蛋白酶AprE为 基础 ，提供了包含选自V30M/I，I77L/V，S101G，P127M，N138Q/K，F183K/D，V197I/L，P219F/E，A226S/T，N232D中所述突变位点的突变体，其耐热性得到显著提高，有利于促进其在洗涤工业领域的广泛应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：30，77，101，127，138，183，197，219，226，232。 |
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| 说明书全文 | 一种耐高温碱性蛋白酶突变体及其应用技术领域背景技术[0002] 碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，最适pH在9～11范围内。碱性蛋白酶是蛋白酶家族中最重要的一类蛋白酶，它能够在极端的碱性环境下发挥作用，被广泛应用于食品、纺织、医药、洗涤等行业。碱性蛋白酶的年产量占全球酶生产量的50%，超过三分之二的碱性蛋白酶应用于洗涤工业。洗涤剂中的碱性蛋白酶几乎都是由天然的芽孢杆菌类微生物及其变体生产的具有耐碱、耐表面活性剂等性质且有广泛肽键水解选择性的一类丝氨酸蛋白酶。碱性蛋白酶能够水解各类蛋白质污垢，如血液、汗渍、牛奶污渍等，并且能够释放因蛋白质包裹的污垢或因蛋白质加强对基底粘附力的污渍，能够与表面活性剂起到良好的协同去污能力。 [0003] 目前，主要产碱性蛋白酶的芽孢杆菌及研究对象有：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliqueaciens）、嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）和克劳氏芽孢杆菌 （Bacillus clausii）（刘逸寒等 2008）等。我国碱性蛋白酶产业日趋成熟，但常用生产菌株及发酵工艺缺少更新，导致产量和成本无法与国际大公司竞争（袁媛等 2021）。目前，国内酶制剂公司大多以2709菌株生产碱性蛋白酶，发酵水平约在5万U/mL，主要用于食品原料动物植物蛋白水解和皮革除毛，市场小（低于1000万）、利润低，难以进入洗涤用碱性蛋白酶市场。 [0004] 过去几十年的研究中，蛋白质工程已经成为提高碱性蛋白酶酶活和改善酶学性能的重要技术手段。蛋白质改造技术手段可以有效提高酶的催化活性、酸碱稳定性、热稳定性、底物特异性和表达效价越来越多的市场在售碱性蛋白酶是野生型蛋白酶的蛋白质工程突变体。我国碱性蛋白酶的市场主要被巨头公司诺维信和杜邦公司垄断，主要是因为国内碱性蛋白酶生产菌种的生产能力较差、酶的发酵活力低、酶比活低以及洗涤应用效果差。因此，高活力、高稳定性、高效价的碱性蛋白酶的蛋白质工程改造和筛选及其高产工程菌的构建成为国内外的研究热点。蛋白质工程技术为改善酶的应用性能和拓展应用领域开辟了新的途径。 发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种耐高温碱性蛋白酶突变体。与野生型相比，所述突变体的的耐热性有明显提升，有利于该酶在工业领域的广泛应用。 [0006] 本发明通过以下技术方案来实现的：本发明涉及一种碱性蛋白酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的 氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代： 30，77，101，127，138，183，197，219，226，232。 [0007] 在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。 [0008] 在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。 [0009] 在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：V30M/I，I77L/V，S101G，P127M，N138Q/K，F183K/D，V197I/L，P219F/E，A226S/T，N232D。 [0010] 在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：V30I； V30I/I77V； V30I/S101G； V30I/N138K； V30IV197L； V30I/P219E； V30I/A226T； V30I/N232D； V30I/I77V/S101G； V30I/I77V/N138K； V30I/I77V/F183D； V30I/I77V/V197L/； V30I/I77V/P219E； V30I/I77V/A226T； V30I/I77V/A226T/N232D； V30I/I77V/S101G/N138K； V30I/I77V/S101G/F183D； V30I/I77V/S101G/V197L； V30I/I77V/S101G/P219E； V30I/I77V/S101G/A226T； V30I/I77V/S101G/N232D； V30I/S101G/N138K/F183D； V30I/S101G/N138K/V197L； V30I/S101G/N138K/P219E； 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I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D； P127M； P127M/N138Q； P127M/F183K； P127M/V197I； P127M/P219F； P127M/A226S； P127M/N232D； P127M/N138Q/F183K； P127M/F183K/V197I； P127M/V197I/P219F； P127M/V197I/A226S； P127M/V197I/N232D； P127M//P219F/A226S； P127M/P219F/N232D； P127M/N138Q/F183K/V197I； P127M/F183K/V197I/P219F； P127M/V197I/P219F/A226S； P127M/P219F/A226S/N232D； P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F； P127M//F183K/V197I/P219F/A226S； P127M/V197I/P219F/A226S/N232D； P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S； P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D； P127M/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D； P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D； N138Q； N138Q/F183K； N138Q/V197I； N138Q/P219F； N138Q/A226S； N138Q/N232D； N138Q/F183K/V197I； N138Q/V197I/P219F； N138Q/P219F/A226S； N138Q/P219F/N232D； N138Q/A226S/N232D； N138Q/F183K/V197I/P219F； N138Q/V197I/P219F/A226S； N138Q/P219F/A226S/N232D； N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S； N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D； N138Q/V197I/P219F/A226S/N232D； N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D； F183K； F183K/V197I； F183K/P219F； F183K/A226S； F183K/N232D； F183K/V197I/P219F； F183K/P219F/A226S； F183K/A226S/N232D； F183K/V197I/P219F/A226S； F183K/V197I/P219F/N232D； F183K/V197I/A226S/N232D； F183K/P219F/A226S/N232D； F183K/V197I/P219F/A226S/N232D； V197I； V197I/P219F； V197I/A226S； V197I/N232D； V197I/P219F/A226S； V197I/P219F/N232D； V197I/A226S/N232D； V197I/P219F/A226S/N232D； P219F； P219F/A226S； P219F/N232D； P219F/A226S/N232D； A226S； A226S/N232D； N232D。 [0011] 本发明还提供了编码上述碱性蛋白酶突变体的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。 [0012] 本发明还提供包含上述碱性蛋白酶突变体基因的重组表达载体。 [0013] 本发明还提供了包含上述重组表达载体的宿主细胞。 [0014] 所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。 [0015] 本发明以克劳氏芽孢杆菌野生型碱性蛋白酶AprE为基础，提供了分别包含V30M/I，I77L/V，S101G，P127M，N138Q/K，F183K/D，V197I/L，P219F/E，A226S/T，N232D中任意一个突变位点的单点突变体。与野生型相比，所述单点突变体在80℃条件下处理5min后，其相对酶活残留率普遍提高了7.6%‑38.6%，耐热性得到显著提高；60℃条件下处理2h后，其相对酶活残留率普遍提高了5.6%‑24.5%，热稳定性显著增强。而本发明提供的含两个或两个以上突变位点的碱性蛋白酶突变体的耐热性也得到进一步提高，80℃条件下处理5min后，其相对酶活残留率比对应单点突变体普遍提高了10.2%‑34.5%；60℃条件下处理2h后，其相对酶活残留率普遍提高了11.7%‑25.4%，取得了意料不到的技术效果，有利于促进其在洗涤工业领域中的广泛应用。 具体实施方式[0016] 本发明涉及一种耐高温碱性蛋白酶突变体、其制备方法及应用、编码该碱性蛋白酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞。 [0017] 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 [0018] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。 [0019] 本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%； LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，琼脂2%； 脱脂牛奶平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，脱脂牛奶1%，琼脂1.5%； GM I配制方法为：1*最低盐溶液95.6ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.4 ml， 10%酵母粉汁1ml；其中1*最低盐溶液的配制方法为：K2HPO4 14 g/L，KH2PO4 6 g/L，（NH4） 2SO4 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO4•7H2O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解； GM II配制方法为：1*最低盐溶液96.98 ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.08 ml，10%酵母粉汁0.04 ml，1 M MgCl2 0.25 ml，1 M CaCl2 0.05 ml； 种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，Nacl 0.5%； 发酵培养基：葡萄糖1%、磷酸氢二钠0.2%，蛋白胨1%、氯化钠1%，酵母粉0.5%。 [0020] 本发明实施例中所述碱性蛋白酶的酶活测定方法如下：1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如： 酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品的酶活力。 [0021] 2、酶活定义蛋白酶活力定义，即蛋白酶活力为蛋白酶活力单位表示，定义为1g固体酶粉（或 1ml液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。 [0022] 3 试剂和溶液（1）福林（Folin）试剂（福林︰水=1︰2）；（2）42.4g/L碳酸钠溶液；（3）0.5mol/L氢氧化钠溶液；（4）硼酸缓冲液（pH10.5）；（5）10.0g/L酪蛋白溶液；（6）100 g/mL和1mg/ml的L‑酪氨酸标准溶液；（7）6.54%三氯乙酸。 4. 测定方法 （1）标准曲线的制定： 配置浓度分别为0 g/mL，10 g/mL，20 g/mL，30 g/mL，40 g/mL和50 g/mL的L‑酪氨酸标准溶液。分别取标准液各1.00ml，各加0.4mol/L碳酸钠溶液 5.00ml、福林试剂使用液1.00ml，振荡均匀，置于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。 [0023] （2）酶活测定取预稀释适量酶液，然后加入等体积的40℃预热10%酪蛋白，40℃反应10min；然后加入与反应体系等体积三氯乙酸（浓度6.54%），混匀后室温静置10min以终止反应。取出1ml已终止的反应液，然后加入5ml42.4g/L碳酸钠溶液，接着加入1ml福林（Folin）试剂，40℃显色反应20min；最后测定OD608值。 [0024] （3）计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下面 的公式计算： X=（A×K×4×n）/10。 [0025] 式中：X——样品的酶活力（u/g或u/ml）；A——样品平行试验的平均吸光度； K——吸光常数； 4——反应试剂的总体积（ml）； 10——反应时间10min，以1min计； n——稀释倍数。 [0026] 下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。 [0027] 实施例1碱性蛋白酶突变体的构建将来源于克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）的碱性蛋白酶基因aprE前导肽和 成熟肽段，根据芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。将该蛋白酶基因命名aprE，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。 [0028] 以aprE基因（SEQ ID NO:2）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR引物和反应条件如下：aprE‑F：gcactgctggcaggaggcgcaactcaagcttttgccgctgaagaagcaaaagaaaaata； aprE‑Rv：ggaaacagctatgaccatgattacgccaagctttagcgtgttgccgcttctgcattg。 [0029] PCR条件为：98℃ 2min；98℃ 10s；58℃ 20s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用HindIII酶切后与经HIndIII酶处理的载体pX131连接，其中表达载体pX131的酶切条件如下：pX131 20uL，10×Buffer 5ul，Hind III 2.5uL，ddH2O 22.5ul，总体积为50ul。 [0031] 利用NEB Gbison assembly试剂盒，20uL反应体系中，基因aprE片段和载体pX131的摩尔数比为1:3，50℃，反应60min。 [0032] 实施例2 耐高温碱性蛋白酶突变体的筛选将上述20 uL assembly反应液通过感受态方法转化宿主细胞枯草芽孢杆菌 1A751，具体转化过程如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌1A751由LB平板接种到5 ml GMI溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜；第二天取1 ml转接到9 ml GMI中，37℃、220 rpm培养 3.5 h；再取1 ml上一步骤的培养液转接到9 ml GMⅡ溶液中，37℃、125 rpm培养90 min后， 5000 g、10 min离心收集菌体；用1 ml GMⅡ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后取0.2 ml感受态细胞，加入20 uL assembly反应液，于37℃、200 rpm振荡培养60 min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的脱脂牛奶平板，37℃培养过夜培养，次日检查转化子和相应透明圈的大小，以野生型碱性蛋白酶aprE为对照。 [0033] 从转化平板上挑取透明圈较大的转化子，在含30μg/mL卡那霉素的脱脂牛奶平板上划线纯化，得到单菌落。用牙签分别逐个接种于96孔板中，每个孔板中加入200 uL LB溶液，37℃、500 rpm振荡培养约48h；离心菌体获得上清液，分别测定上清液中碱性蛋白酶酶活；然后将孔板中的发酵上清液，置于80℃处理5min后取出，分别测定其残余酶活。不同的突变子高温处理后保持的活性不同。最终，申请人从10000多株转化子中筛选出能明显提高碱性蛋白酶耐热性的突变位点：V30M/I，I77L/V，S101G，P127M，N138Q/K，F183K/D，V197I/L，P219F/E，A226S/T，N232D。 [0034] 在野生型碱性蛋白酶aprE的基础上，本发明提供了包括V30M/I，I77L/V，S101G，P127M，N138Q/K，F183K/D，V197I/L，P219F/E，A226S/T，N232D中任意一个突变位点的单点突变体。 [0035] 本发明还提供了包含V30M/I、I77L/V、S101G、P127M、N138Q/K、F183K/D、V197I/L、P219F/E、A226S/T、N232D中至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个突变位点组合的突变体。例如： V30I/I77V、V30I/S101G、V30M/N138Q、I77V/S101G、I77L/N232D、N138K/F183D、N138K/V197L、N138Q/P219F、F183D/V197L、F183K/A226S、V197L/P219E、V197I/N232D、P219E/A226T、A226S/N232D两点突变体；V30I/I77V/S101G、V30M/P127M/N138Q、I77V/S101G/N138K、I77L/N138Q/V197I、I77L/N138Q/V197I、V197L/P219E/A226T、P219F/A226S/N232D 三点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K、V30I/F183D/V197L/A226T、V30M/I77L/P219F/A226S、I77V/N138K/V197L/P219E 、I77V/V197L/P219E/A226T 、 I77L/F183K/V197I/P219F、 P127M/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219、F183D/V197L/P219E/A226T、V197I/P219F/A226S/N232D四点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D、V30M/P127M/N138Q/F183K/V197I、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、I77L/V197I/P219F/A226S/N232D、P127M//F183K/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219E/A226T五点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、V30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、P127M/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、六点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、V30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/A226S/N232D、P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D七点突变体和V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D八点突变体；V30I/I77V/S101G/P127M /N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30I/I77V/S101G/ P127M/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D九点突变体；V30M/I77V/S101G/P127M/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/S101G/P127M/N138K /F183K/V197L/P219E/A226T/N232D十点突变体。 [0036] 实施例3 碱性蛋白酶突变体耐热性分析将实施例2构建得到的重组表达野生型碱性蛋白酶AprE或其突变体的枯草芽孢杆 菌工程菌分别接种于发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）中摇瓶发酵48 h后，5000 rpm、10 min 离心，收集上清液，分别测定上清液中碱性蛋白酶酶活；将上清液置于80℃处理5min后取出，分别测定其残余酶活。以处理前的原始酶活计 100%，计算高温处理后碱性蛋白酶的酶活残留率。 [0037] 然后，以野生型碱性蛋白酶AprE的酶活残留率计100%，计算突变体的相对酶活残留率，具体结果见表1。 [0038] 相对酶活残留率（%）=突变体的酶活残留率/野生型的酶活残留率×100%。 [0039] 表1 碱性蛋白酶突变体耐热性比较碱性蛋白酶突变体 80℃处理5min相对酶活残留率 野生型AprE 100% V30I 109.4% V30M 107.2% I77V 108.0% I77L 114.5% S101G 115.8% P127M 126.2% N138K 107.6% N138Q 129.4% F183D 112.6% F183K 116.4% V197L 117.6% V197I 118.0% P219W 116.2% P219F 110.5% A226T 110.1% A226S 113.8% N232D 138.6% 从表1的数据可以看出，与野生型碱性蛋白酶AprE相比，本发明提供的分别含 V30M、V30I、I77L、I77V、S101G、P127M、N138Q、N138K、F183K、F183D、V197I、V197L、P219F、P219E、A226S、A226T、N232D单个突变位点的碱性蛋白酶突变体在80℃条件下处理5min后，酶活残留率普遍提高了7.6%‑38.6%，耐热性得到显著提高。 [0040] 此外，本发明提供的V30I/I77V、V30I/S101G、V30M/N138Q、I77V/S101G、I77L/N232D、N138K/F183D、N138K/V197L、N138Q/P219F、F183D/V197L、F183K/A226S、V197L/P219E、V197I/N232D、P219E/A226T、A226S/N232D两点突变体；V30I/I77V/S101G、V30M/P127M/N138Q、I77V/S101G/N138K、I77L/N138Q/V197I、I77L/N138Q/V197I、V197L/P219E/A226T、P219F/A226S/N232D 三点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K、V30I/F183D/V197L/A226T、V30M/I77L/P219F/A226S、I77V/N138K/V197L/P219E 、I77V/V197L/P219E/A226T 、 I77L/F183K/V197I/P219F、 P127M/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219、F183D/V197L/P219E/A226T、V197I/P219F/A226S/N232D四点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D、V30M/P127M/N138Q/F183K/V197I、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、I77L/V197I/P219F/A226S/N232D、P127M//F183K/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219E/A226T五点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、V30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、P127M/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、六点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、V30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/A226S/N232D、P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D七点突变体和V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D八点突变体；V30I/I77V/S101G/P127M /N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30I/I77V/S101G/ P127M/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D九点突变体；V30M/I77V/S101G/P127M/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/S101G/P127M/N138K /F183K/V197L/P219E/A226T/N232D十点突变体的耐热性也得到进一步提高，80℃条件下处理5min后，其相对酶活比对应单点突变体普遍提高了10.2%‑34.5%，取得了意料不到的技术效果。 [0041] 实施例4 碱性蛋白酶突变体热稳定性分析将实施例2构建得到的重组表达野生型碱性蛋白酶AprE或其突变体的枯草芽孢杆 菌工程菌分别接种于发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）中摇瓶发酵48 h后，5000 rpm、10 min 离心，收集上清液，分别测定上清液中碱性蛋白酶酶活；将上清液置于60℃条件下保温2h后取出，分别测定其残余酶活。以处理前的原始酶活计 100%，计算碱性蛋白酶的酶活残留率。 [0042] 然后，以野生型碱性蛋白酶AprE的酶活残留率计100%，计算突变体的相对酶活残留率，具体结果见表2。 [0043] 表2 碱性蛋白酶突变体热稳定性比较碱性蛋白酶突变体 60℃处理2h相对酶活残留率 野生型AprE 100% V30I 109.3% V30M 110.3% I77V 106.5% I77L 118.0% S101G 115.6% P127M 120.8% N138K 106.5% N138Q 122.2% F183D 112.7% F183K 112.7% V197L 120.4% V197I 119.3% P219W 117.0% P219F 111.5% A226T 109.1% A226S 116.7% N232D 124.5% 从表2的数据可以看出，与野生型碱性蛋白酶AprE相比，本发明提供的分别含 V30M、V30I、I77L、I77V、S101G、P127M、N138Q、N138K、F183K、F183D、V197I、V197L、P219F、P219E、A226S、A226T、N232D单个突变位点的碱性蛋白酶突变体在60℃条件下处理2h后，相对酶活残留率普遍提高了5.6%‑24.5%，热稳定性显著增强。 [0044] 此外，本发明提供的V30I/I77V、V30I/S101G、V30M/N138Q、I77V/S101G、I77L/N232D、N138K/F183D、N138K/V197L、N138Q/P219F、F183D/V197L、F183K/A226S、V197L/P219E、V197I/N232D、P219E/A226T、A226S/N232D两点突变体；V30I/I77V/S101G、V30M/P127M/N138Q、I77V/S101G/N138K、I77L/N138Q/V197I、I77L/N138Q/V197I、V197L/P219E/A226T、P219F/A226S/N232D 三点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K、V30I/F183D/V197L/A226T、V30M/I77L/P219F/A226S、I77V/N138K/V197L/P219E 、I77V/V197L/P219E/A226T 、 I77L/F183K/V197I/P219F、 P127M/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219、F183D/V197L/P219E/A226T、V197I/P219F/A226S/N232D四点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D、V30M/P127M/N138Q/F183K/V197I、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、I77L/V197I/P219F/A226S/N232D、P127M//F183K/V197I/P219F/A226S、N138K/F183D/V197L/P219E/A226T五点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L、30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、P127M/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、六点突变体；V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E、V30M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D、I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/A226S/N232D、P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D七点突变体和V30I/I77V/S101G/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/N232D、I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D八点突变体；V30I/I77V/S101G/P127M /N138K/F183D/V197L/P219E/A226T、V30I/I77V/S101G/ P127M/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/P127M/N138Q/F183K/V197I/P219F/A226S/N232D九点突变体；V30M/I77V/S101G/P127M/N138K/F183D/V197L/P219E/A226T/N232D、V30M/I77L/S101G/P127M/N138K /F183K/V197L/P219E/A226T/N232D十点突变体的热稳定性也得到进一步提高，60℃条件下处理2h后，其相对酶活比对应单点突变体普遍提高了11.7%‑25.4%，取得了意料不到的技术效果。 [0045] 综上，本发明提供的突变位点V30M、V30I、I77L、I77V、S101G、P127M、N138Q、N138K、F183K、F183D、V197I、V197L、P219F、P219E、A226S、A226T、N232D可以使碱性蛋白酶AprE的耐热性和热稳定性得到显著提高，有利于促进其在工业酶领域的广泛应用。 |
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