亚硝酸盐还原酶突变体及其应用 |
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| 申请号 | CN202311854457.4 | 申请日 | 2023-12-29 | 公开(公告)号 | CN117946989A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司; | 发明人 | 方国康; 汪本助; 徐斌; 赵亚飞; 常凯丽; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种亚 硝酸 盐还原酶突变体及其应用，所述亚硝酸盐还原酶突变体的 氨 基酸序列相对于野生型亚硝酸盐还原酶，在对应于SEQ ID NO:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个 位置 上，具有氨基酸的取代。本发明提供的亚硝酸盐还原酶突变体与野生型亚硝酸盐还原酶相比，具有增加的 稳定性 ，可应用于降解污 水 中亚硝酸盐；且本发明提供的亚硝酸盐还原酶突变体制备方法工艺简单、条件温和，具有较好的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型亚硝酸盐还原酶，在对应于SEQ ID NO:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个位置上具有氨基酸的取代。 |
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| 说明书全文 | 亚硝酸盐还原酶突变体及其应用技术领域背景技术[0002] 亚硝酸盐广泛存在于地下水和地表水中，造成水体亚硝酸盐污染的主要原因是过量化肥的使用，以及动物粪便、生活污水和工业废水的不合理处置等。研究表明，饮用含有亚硝酸盐的水会对人体产生毒害作用，长期饮用会导致癌症发病率的提高。目前去除废水中亚硝酸盐最普遍的方法是采用生物处理，相比化学法处理，生物法具有费用低、不产生二次污染等优势。 [0003] 亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，NIR)是从植物细胞体内提取的一种氧化还原酶，能催化亚硝酸盐还原，在细菌和古细菌中均广泛分布。野生型亚硝酸盐还原酶对于某些底物的催化活力低，稳定性较差。现有技术中通过蛋白质工程的方法，在野生型亚硝酸盐还原酶的氨基酸序列的基础上，对特定位置进行了氨基酸突变，一定程度解决了亚硝酸盐还原酶的稳定性差的问题。但是，这些亚硝酸盐还原酶突变体仍然存在制备工艺复杂、发酵时间长等问题。 [0004] 因此需要一种同时具备酶活性高、稳定性好，且制备方法工艺简单、条件温和等优点的亚硝酸盐还原酶。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种酶活性高，稳定性好，制备工艺简单的亚硝酸盐还原酶突变体。 [0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： [0007] 第一方面，本发明提供一种亚硝酸盐还原酶突变体，在对应于SEQ ID NO:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个位置上具有氨基酸的取代。 [0008] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有亚硝酸盐还原酶活性。在一些实施方式中，与野生型亚硝酸盐还原酶相比，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有增加的稳定性；其中所述的野生型亚硝酸盐还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 [0009] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第48位氨基酸可以被取代为丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或苏氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第48位氨基酸被取代为丝氨酸。 [0010] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第64位氨基酸可以被取代为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第64位氨基酸被取代为甘氨酸。 [0011] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第70位氨基酸可以被取代为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第70位氨基酸被取代为丙氨酸。 [0012] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第240位可以被取代为丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或苏氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第240位被取代为谷氨酰胺。 [0013] 在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体可以具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列一致性的氨基酸序列。 [0014] 在第二方面，本发明提供了一种编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的核酸分子。 [0015] 在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含第二方面的核酸分子。 [0016] 在一些实施方式中，所述表达载体可通过将上述核酸分子连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。在一些实施方式中，所述原核表达载体或真核表达载体选自pGEX、pMAL或pET。在一些实施方式中，所述原核表达载体为pET‑28a。 [0017] 在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的表达载体。 [0018] 在一些实施方式中，所述宿主细胞可以是常规用于生产上述亚硝酸盐还原酶突变体的细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以选自真菌细胞、细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞选自酵母细胞、霉菌、大肠杆菌。 [0019] 在第五方面，本发明还提供了一种制备上述亚硝酸盐还原酶突变体的方法，包括发酵培养上述宿主细胞，收集和制备上述亚硝酸盐还原酶突变体。 [0020] 在一些实施方式中，所述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备上述亚硝酸盐还原酶突变体。在一些实施方式中，所述生产罐发酵条件为DO 30％以上，空气流量1∶(1～2)vvm。 [0021] 在第六方面，本发明提供了一种本公开的亚硝酸盐还原酶突变体在降解亚硝酸盐中的应用。 [0024] 图1显示了亚硝酸盐还原酶在不同温度下的相对酶活。 [0025] 图2显示了亚硝酸盐还原酶在不同pH的相对酶活。 具体实施方式[0026] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。 [0027] 定义 [0028] 除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。 [0029] 除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。 [0030] 野生型是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。 [0031] 序列一致性即序列同一性，两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸或氨基酸，而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。 [0032] 本文所用的表述“至少85％的序列一致性”可以涵盖至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。 [0033] 可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl 2se q，其为可 从美 国政府 的国 家生物 技术信 息中 心B LAS T网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。 [0034] 表达载体可包含本发明所述的核酸，其形式适于在宿主细胞中表达所述核酸，这意味着所述表达载体包括一个或多个调节元件，可根据用于表达的宿主细胞进行选择，其与待表达的核酸序列可操作连接。在表达载体内，“可操作连接”旨在将目的的核苷酸序列与调节元件以容许核苷酸表达的方式连接(例如在体外转录/翻译系统或当所述载体引入宿主细胞时在宿主细胞中表达)。 [0035] 下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。 [0036] 实施例1：野生型亚硝酸盐还原酶基因工程菌的建立 [0037] 本实施例中，根据NCBI收录的Pseudomonas sp.B21‑044亚硝酸盐还原酶野生型基因序列GenBank:UVL19616.1)，进行序列优化后人工合成全基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，并经基因合成公司通过BamH I和XhoⅠ内切酶将基因插入pET‑28a质粒中，得到表达野生型亚硝酸盐还原酶的质粒，命名为pET‑WT，将pET‑WT转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立野生型亚硝酸盐还原酶基因工程菌。 [0038] 实施例2：亚硝酸盐还原酶突变体文库的构建 [0039] 本实施例中利用易错PCR随机突变的方法，基于实施例1得到的pET‑WT质粒，对亚硝酸盐还原酶进行了蛋白质工程改造。 [0040] 易错PCR扩增亚硝酸盐还原酶的基因：采用较低保真度的Taq聚合酶，同时利用Mn2+2+ 替代天然辅助因子Mg 增加易错概率。 [0041] 50μL PCR体系：5×PCR Buffer(10μL)，dATP(2.5mmol/L，1μL)，dGTP(2.5mmol/L，1μL)，dCTP(2.5mmol/L，1μL)，dTTP(2.5mmol/L，1μL)，MgCl2(5mmol/L，1μL)，MnCl2(5mmol/L，1μL)，亚硝酸盐还原酶模板基因(1μL)，Taq DNA聚合酶(5U/μL，0.5μL)，加入灭菌双蒸水到50μL。 [0042] PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，50‑65℃退火40s及72℃延伸40s进行35个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。 [0043] 易错PCR扩增后基因片段，连接至pET‑28a载体。将连接后载体转入至大肠杆菌BL21(DE3)中建立亚硝酸盐还原酶基因突变文库。 [0044] 利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET28a质粒为载体，表达扩展突变的亚硝酸盐还原酶，通过如下的酶活力检测方法高通量筛选高活性突变株。 [0045] 将细胞沉淀在4℃重悬于pH 6.0的100mM柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液中，重悬后的菌泥浓度为200g/L。超声破碎后，通过离心(13000rpm、30min、4℃)去除细胞碎片。收集澄清的裂解物上清液制得蛋白样品液。 [0046] 酶活力检测：酶催化反应体系为270μL，先取125μL 0.1mol/L pH 7.4的Tris‑HCl缓冲液、15μL 0.1mol/L的NaCl溶液、12.5μL 0.1mol/L的NaNO2溶液和7.5μL 0.1mol/L的甲基紫精溶液于1.5ml离心管中，混匀，30℃预热5min；再加入70μL粗蛋白样品液，30℃预热5min；加入40μL 0.1mol/L的Na2S2O4溶液(Na2S2O4溶于0.1mol/L的NaHCO3溶液中，现配现用)，此时酶催化反应被启动，置于30℃水浴锅中，并计时；分别在0min、30min取反应液10μL，加990μL水，剧烈震荡至蓝色完全褪去，酶催化反应终止。 [0047] 根据酶活力检测结果，筛选高活性突变株，对高活性突变株进行基因鉴定，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，该基因所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。将筛选到的该高活性突变体命名为M1突变体。 [0048] 实施例3：在摇瓶中小规模生产亚硝酸盐还原酶突变体 [0049] 本实施例将包含M1突变体基因的质粒pET‑M1的大肠杆菌，接种到含硫酸卡那霉素(100μg/mL)的100mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)。大肠杆菌在摇床中在37℃生长，伴随以250rpm摇动，培养16小时。转接按比例1∶100，将1mL菌体培养液于100mL含硫酸卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。 [0050] 当培养物的OD600是0.6至0.8时，通过加入异丙基β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM来诱导亚硝酸盐还原酶基因的表达，然后培养持续过夜(10～16小时)。通过离心(10000rpm、10min、4℃)收集细胞，丢弃上清液。将细胞沉淀在4℃重悬于pH6.0的100mM柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液中，重悬后的菌泥浓度为200g/L。超声破碎后，通过离心(13000rpm、30min、4℃)去除细胞碎片。收集澄清的裂解物上清液制得粗酶液，储存在‑20℃。 [0051] 实施例4：亚硝酸盐还原酶突变体的发酵生产 [0052] 本实施例将包含M1突变体基因的质粒pET‑M1的大肠杆菌，接种含硫酸卡那霉素(100mg/mL)的120mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)中。大肠杆菌在摇床中在37℃过夜生长(10‑16小时)，伴随以250rpm摇动。将种子液按2％的接种量加入含有6L发酵培养基的15L发酵罐中，发酵液通过加入氨水维持pH7.0‑7.2，罐温37℃，搅拌转速300～900rpm，发酵过程中控制溶氧30％左右，空气流量1∶1～2vvm，培养8小时后加入终浓度1mmol/L的IPTG以诱导亚硝酸盐还原酶的表达，此后继续发酵12‑16小时，罐温22℃。发酵过程中通过加入含葡萄糖200g/L，酵母提取物100g/L，pH7.2的补料液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物直接用高压均质机匀浆破碎，经离心、过滤、超滤浓缩后，制备得到亚硝酸盐还原酶突变体粗酶液并于‑20℃保存。 [0053] 实施例5：亚硝酸盐还原酶酶活力的测定 [0054] 本实施例使用实施例3和实施例4制备的亚硝酸盐还原酶突变体M1粗酶液，进行酶活力测试。 [0055] 亚硝酸盐还原酶活的测定方法：酶催化反应体系为270μL，先取125μL 0.1mol/L pH 7.4的Tris‑HCl缓冲液、15μL 0.1mol/L的NaCl溶液、12.5μL 0.1mol/L的NaNO2溶液和7.5μL0.1mol/L的甲基紫精溶液于1.5ml离心管中，混匀，30℃预热5min；再加入70μL粗蛋白样品液，30℃预热5min；加入40μL 0.1mol/L的Na2S2O4溶液(Na2S2O4溶于0.1mol/L的NaHCO3溶液中，现配现用)，此时酶催化反应被启动，置于30℃水浴锅中，并计时；分别在0min、 30min取反应液10μL，加990μL水，剧烈震荡至蓝色完全褪去，酶催化反应终止。 [0057] 结论：氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的亚硝酸盐还原酶突变体，在摇瓶中小规模生产和发酵罐发酵生产的酶活分别为2300U和2800U，均高于野生型的200U；相比于野生型的亚硝酸盐还原酶对亚硝酸盐具有较高的降解作用。 [0058] 实施例6：亚硝酸盐还原酶稳定性的测定 [0059] 分别以温度30℃、pH7.0条件下测定的酶活为100％酶活，检测亚硝酸盐还原酶在不同pH及温度下的相对酶活。 [0060] 结果如图1和图2所示，由图1可以看出，以30℃下酶活为100％酶活时，各温度下测得的相对酶活均低于100％，且随着温度的升高，酶活下降趋势加。由图2可以看出，当pH为7.5时，其相对酶活达到153.90％，而当pH为6.0时，其相对酶活仅为44.45％。 [0061] 因此，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的亚硝酸盐还原酶的在25‑35℃和pH为7.0‑8.0的条件下具有较高的稳定性，特别地，亚硝酸盐还原酶的最适反应温度为30℃，最适pH为7.5。 [0062] 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。 |
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