SETD2的医药用途 |
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申请号 | CN202311422471.7 | 申请日 | 2023-10-30 | 公开(公告)号 | CN117942401A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
申请人 | 中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心); | 发明人 | 王前飞; 李玥莹; 陈蕾; 刘景坤; | ||||
摘要 | 本 发明 属于 生物 医药领域,涉及SETD2的医药用途或者SETD2的 抑制剂 的医药用途。具体地,本发明涉及选自如下的(1)-(4)项中的任一项在制备促进 哺乳动物 的巨核细胞生成或分化的药物、巨核祖细胞生成或分化的药物、 治疗 巨核细胞发育障碍的药物或者促进血小板生或前血小板成的药物中的用途:(1)SETD2蛋白;(2)SETD2基因;(3)抑制SETD2蛋白活性的药物;(4)降低SETD2基因表达 水 平的药物。本发明能够有效地促进体外巨核细胞的生成,从而显著提高体外制备血小板的效率,具有良好的应用前景。 | ||||||
权利要求 | 1.选自如下的(1)-(4)项中的任一项在制备促进哺乳动物巨核细胞生成或分化的药物、促进哺乳动物巨核祖细胞生成或分化的药物、治疗哺乳动物巨核细胞发育障碍的药物、治疗哺乳动物血小板异常相关疾病(例如血小板减少症)的药物或者促进哺乳动物血小板或前血小板生成的药物中的用途: |
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说明书全文 | SETD2的医药用途技术领域背景技术[0003] 巨核细胞多倍体化是大量产生具有凝血、止血等功能的血小板的重要保障。巨核细胞是造血细胞中数目最少的一类细胞,仅占骨髓细胞的0.05%,但正常生理情况下,巨核 11 细胞能够产生每日机体所需的约10 个血小板进入血液循环,这依赖于巨核细胞复杂而有 趣的多倍体化过程:二倍体的巨核祖细胞通过有丝分裂进行增殖,随后停止有丝分裂而选 择进行特殊的核内有丝分裂方式,即染色体进行正常复制加倍后,细胞并没有一分为二,子 代细胞仍然是一个细胞,但细胞的染色体数目不断加倍,形成四倍体、八倍体……最多形成 64倍体(小鼠)甚至到128倍体(人)的成熟巨核细胞。 [0004] 巨核细胞多倍体化过程伴随着细胞体积不断增大,直径最高可达100μm。同时,巨核细胞形态也随之发生改变:细胞胞体不断增大,胞质内容物增加,功能蛋白质合成增加, 产生分界膜系统(Demarcation membrane system,DMS)和特异性的颗粒(例如α颗粒),这些 颗粒包裹很多血小板功能相关的酶、细胞因子等。成熟的高倍体巨核细胞的细胞质拉伸形 成伪足至血管中,形成前血小板(proplatelet),伪足在血流的冲击下脱离巨核细胞产生大 量的血小板,进而满足机体的需求。 [0005] 巨核细胞的多倍体化程度越高,体积越大,产生的血小板数目越多。一个成熟的巨核细胞大约可以产生2000‑10000个血小板,而高倍体巨核细胞相对低倍体能够产生更多血 小板,进而满足机体的需求。因此,巨核细胞的多倍体化对于维持体内血小板的数量非常关 键,是维持血液系统内稳态的必要基础。 发明内容[0007] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,发现了下调SETD2基因表达水平,或者抑制SETD2蛋白,能够显著地促进体外巨核细胞多倍体化发育成熟,提高体外干细胞产生成 熟巨核细胞的比例,可产生具有功能的血小板,能够应用于促进体外巨核细胞或血小板再 生。由此提供了下述发明: [0008] 本发明的一个方面涉及选自如下的(1)-(4)项中的任一项在制备促进哺乳动物巨核细胞生成或分化的药物、促进哺乳动物巨核祖细胞生成或分化的药物、治疗哺乳动物 巨核细胞发育障碍的药物、治疗哺乳动物血小板异常相关疾病(例如血小板减少症)的药物 或者促进哺乳动物血小板或前血小板生成的药物中的用途: [0009] (1)SETD2蛋白; [0010] (2)SETD2基因; [0011] (3)抑制SETD2蛋白活性的药物; [0012] (4)降低SETD2基因表达水平的药物。 [0013] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述哺乳动物独立地为人或小鼠。 [0014] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述促进哺乳动物巨核细胞生成或分化的药物为在体内或体外促进哺乳动物巨核细胞生成或分化的药物。 [0015] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述促进哺乳动物巨核祖细胞生成或分化的药物为在体内或体外促进哺乳动物巨核祖细胞生成或分化的药物。 [0016] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述促进哺乳动物血小板或前血小板生成的药物为体内或体外促进哺乳动物血小板或前血小板生成的药物。 [0017] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,巨核细胞或巨核祖细胞分化成高倍体巨核细胞,例如8N巨核细胞、16N巨核细胞或32N巨核细胞。 [0018] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述巨核细胞为MEG‑01细胞或高倍体巨核细胞,例如8N巨核细胞、16N巨核细胞或32N巨核细胞。 [0019] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述SETD2蛋白为人或小鼠的SETD2蛋白; [0020] 优选地,所述SETD2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。 [0021] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述SETD2基因为人或小鼠的SETD2基因; [0022] 优选地,所述SETD2基因的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。 [0023] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物选自EPZ‑719、EZM0414和MMSET‑IN‑1中的任意一种或者多种。 [0024] EZM0414的结构式如下面的式I所示: [0025] [0026] EZP‑719的结构式如下面的式II所示: [0027] [0028] MMSET‑IN‑1的结构式如下面的式III所示: [0029] [0030] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物为抗SETD2蛋白的抗体;优选地,所述抗体为抗SETD2蛋白的单克隆抗体,例如Absolute Antibody公司的Ab01863‑10.6、Cell Signaling Technology公司的84384S或80290S、Enzo Life Sciences,Inc.公司BML‑SA289‑0100、或者Novus Biologicals的NBP2‑71850。 [0031] 在本发明的一些实施方式中,所述的用途,其中,所述降低SETD2基因表达水平的药物为用于完全敲除或者部分敲除SETD2基因的多核苷酸;优选地,所述多核苷酸为siRNA 例如shRNA,或者为用于CRISPR/Cas9系统的guide RNA。 [0032] 本发明的另一方面涉及一种宿主细胞,其中的SETD2基因被完全敲除或部分敲除; [0033] 优选地,所述宿主细胞为诱导性多潜能干细胞、造血干细胞(例如人脐血CD34+细胞)或人巨核细胞(例如MEG‑01细胞); [0034] 优选地,所述诱导性多潜能干细胞为重组的BC1细胞。 [0035] 本发明的再一方面涉及一种组合物,其包括: [0036] 本发明的宿主细胞,以及细胞培养液。 [0037] 在本发明的一个具体的实施方式中,本发明人利用干细胞体外分化体系,测试SETD2发挥作用的时间点,以及使用SETD2抑制剂能够显著地促进体外巨核细胞和/或成熟 巨核细胞的生成。 [0039] 1)抑制SETD2蛋白活性的药物; [0040] 2)降低SETD2基因表达水平的药物; [0041] 优选地,所述诱导性多潜能干细胞为重组的BC1细胞。 [0042] 在本发明的一些实施方式中,所述的试剂盒,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物选自EPZ‑719、EZM0414和MMSET‑IN‑1中的任意一种或者多种。 [0043] 在本发明的一些实施方式中,所述的试剂盒,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物为抗SETD2蛋白的抗体;优选地,所述抗体为抗SETD2蛋白的单克隆抗体,例如Absolute Antibody公司的Ab01863‑10.6、Cell Signaling Technology公司的84384S或80290S、Enzo Life Sciences,Inc.公司BML‑SA289‑0100、或者Novus Biologicals的NBP2‑71850。 [0044] 在本发明的一些实施方式中,所述的试剂盒,其中,所述降低SETD2基因表达水平的药物为用于完全敲除或者部分敲除SETD2基因的多核苷酸;优选地,所述多核苷酸为 siRNA例如shRNA,或者为用于CRISPR/Cas9系统的guide RNA。 [0045] 本发明的再一方面涉及一种在体外制备巨核细胞或血小板或前血小板的方法,包括: [0046] 抑制诱导性多潜能干细胞、造血干细胞(例如人脐血CD34+细胞)或人巨核细胞(例如MEG‑01细胞)中SETD2蛋白活性的步骤;或者 [0047] 降低诱导性多潜能干细胞、造血干细胞(例如人脐血CD34+细胞)或人巨核细胞(例如MEG‑01细胞)中SETD2基因表达水平的步骤。 [0048] 在本发明的一些实施方式中,所述的制备方法,其中,通过施用抑制SETD2蛋白活+ 性的药物来抑制诱导性多潜能干细胞、造血干细胞(例如人脐血CD34 细胞)或人巨核细胞 (例如MEG‑01细胞)中SETD2蛋白活性。 [0049] 在本发明的一些实施方式中,所述的制备方法,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物选自EPZ‑719、EZM0414和MMSET‑IN‑1中的任意一种或者多种。 [0050] 在本发明的一些实施方式中,所述的制备方法,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物为抗SETD2蛋白的抗体;优选地,所述抗体为抗SETD2蛋白的单克隆抗体,例如Absolute Antibody公司的Ab01863‑10.6、Cell Signaling Technology公司的84384S或80290S、Enzo Life Sciences,Inc.公司BML‑SA289‑0100、或者Novus Biologicals的NBP2‑71850。 [0051] 在本发明的一些实施方式中,所述的制备方法,其中,通过施用降低SETD2基因表+ 达水平的药物来降低诱导性多潜能干细胞、造血干细胞(例如人脐血CD34 细胞)或人巨核 细胞(例如MEG‑01细胞)中SETD2基因表达水平。 [0052] 在本发明的一些实施方式中,所述的制备方法,其中,所述降低SETD2基因表达水平的药物为用于完全敲除或者部分敲除SETD2基因的多核苷酸;优选地,所述多核苷酸为 siRNA例如shRNA,或者为用于CRISPR/Cas9系统的guide RNA。 [0053] 本发明还涉及一种治疗和/或预防巨核细胞发育障碍或者治疗和/或预防血小板异常相关疾病(例如血小板减少症)的方法,包括给予受试者有效量的本发明的宿主细胞、 组合物或者试剂盒的步骤,或者包括给予受试者有效量的选自如下的①-②项中的任一项 的步骤: [0054] ①降低SETD2基因表达水平的药物; [0055] ②抑制SETD2蛋白活性的药物; [0056] 所述降低SETD2基因表达水平的药物或者抑制SETD2蛋白活性的药物如前面所述。 [0057] 在本发明的一个实施方案中,所述的方法,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物选自EZM0414、EPZ‑719和MMSET‑IN‑1中的任意一种或者多种。 [0058] 在本发明的一个实施方案中,所述的方法,其中,所述抑制SETD2蛋白活性的药物为抗SETD2蛋白的抗体;优选地,所述抗体为单克隆抗体。 [0059] 在本发明的一个实施方案中,所述的方法,其中,所述对SETD2基因进行完全敲除或者部分敲除的药物用于完全敲除或者部分敲除SETD2基因的多核苷酸;优选地,所述多核 苷酸为siRNA例如shRNA,或者为用于CRISPR/Cas9系统的guide RNA。 [0060] 抑制受试者的SETD2蛋白活性的水平或者下调受试者的SETD2基因表达的水平,取决于许多因素,例如所治疗病况的严重程度,患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应,以 及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是,从低于为得到所需治疗效 果和/或预防效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。 [0061] 下面给出了本发明的部分术语的解释。 [0062] 术语“巨核细胞分化”是指,本专利主要指的是体外的巨核细胞分化,具体过程是从具有多向分化能力的胚胎干细胞/诱导性多潜能干细胞,在多种细胞因子组合下,使多能 干细胞向造血干细胞分化,进而在细胞因子促血小板生成素(TPO)的作用下分化为巨核祖 + 细胞(MKP)以及成熟巨核细胞。或者从造血干细胞,主要来自人脐血CD34细胞,在细胞因子 促血小板生成素(TPO)的作用下分化为巨核祖细胞(MKP)以及成熟巨核细胞。 [0063] 本领域技术人员知悉,SETD2(SET domain containing 2)基因编码的SETD2蛋白是重要的甲基转移酶,能修饰组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine 36,H3K36)位点 的三甲基化(H3K36me3)。SETD2作为哺乳动物唯一的H3K36三甲基转移酶具有非常重要的功 能,能够修复损伤和错配DNA,可以帮助选择可变剪切的位点。此外,SETD2也可以作为非组 蛋白甲基转移酶,参与许多重要的生物学过程。例如SETD2放大细胞内干扰素信号通路,抑 制了B型乙肝病毒的复制,进而发挥抗病毒的作用;SETD2通过甲基化tubulin促进细胞的正 常分裂。 [0064] 在本发明中,当提及SETD2蛋白或SETD2的氨基酸序列时,其包括SETD2蛋白的全长,还包括其融合蛋白。然而,本领域技术人员理解,在SETD2蛋白的氨基酸序列中,可天然 产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换,缺失和/或添加),而不影响其生物学功 能。在本发明的一个实施方案中,SETD2蛋白为人SETD2蛋白。 [0065] 人SETD2蛋白的氨基酸序列如下:(2564AA) [0066] MKQLQPQPPPKMGDFYDPEHPTPEEEENEAKIENVQKTGFIKGPMFKGVASSRFLPKGTKTKVNLEEQGRQKVSFSFSLTKKTLQNRFLTALGNEKQSDTPNPPAVPLQVDSTPKMKMEIGDTLSTAEESSPPKSRVELGKIHF KKHLLHVTSRPLLATTTAVASPPTHAAPLPAVIAESTTVDSPPSSPPPPPPPAQATTLSSPAPVTEPVALPHTPIT VLMAAPVPLPVDVAVRSLKEPPIIIVPESLEADTKQDTISNSLEEHVTQILNEQADISSKKEDSHIGKDEEIPDSS KISLSCKKTGSKKKSSQSEGIFLGSESDEDSVRTSSSQRSHDLKFSASIEKERDFKKSSAPLKSEDLGKPSRSKTD RDDKYFSYSKLERDTRYVSSRCRSERERRRSRSHSRSERGSRTNLSYSRSERSHYYDSDRRYHRSSPYRERTRYSR PYTDNRARESSDSEEEYKKTYSRRTSSHSSSYRDLRTSSYSKSDRDCKTETSYLEMERRGKYSSKLERESKRTSEN EAIKRCCSPPNELGFRRGSSYSKHDSSASRYKSTLSKPIPKSDKFKNSFCCTELNEEIKQSHSFSLQTPCSKGSEL RMINKNPEREKAGSPAPSNRLNDSPTLKKLDELPIFKSEFITHDSHDSIKELDSLSKVKNDQLRSFCPIELNINGS PGAESDLATFCTSKTDAVLMTSDDSVTGSELSPLVKACMLSSNGFQNISRCKEKDLDDTCMLHKKSESPFRETEPL VSPHQDKLMSMPVMTVDYSKTVVKEPVDTRVSCCKTKDSDIYCTLNDSNPSLCNSEAENIEPSVMKISSNSFMNVH LESKPVICDSRNLTDHSKFACEEYKQSIGSTSSASVNHFDDLYQPIGSSGIASSLQSLPPGIKVDSLTLLKCGENT SPVLDAVLKSKKSSEFLKHAGKETIVEVGSDLPDSGKGFASRENRRNNGLSGKCLQEAQEEGNSILPERRGRPEIS LDERGEGGHVHTSDDSEVVFSSCDLNLTMEDSDGVTYALKCDSSGHAPEIVSTVHEDYSGSSESSNDESDSEDTDS DDSSIPRNRLQSVVVVPKNSTLPMEETSPCSSRSSQSYRHYSDHWEDERLESRRHLYEEKFESIASKACPQTDKFF LHKGTEKNPEISFTQSSRKQIDNRLPELSHPQSDGVDSTSHTDVKSDPLGHPNSEETVKAKIPSRQQEELPIYSSD FEDVPNKSWQQTTFQNRPDSRLGKTELSFSSSCEIPHVDGLHSSEELRNLGWDFSQEKPSTTYQQPDSSYGACGGH KYQQNAEQYGGTRDYWQGNGYWDPRSGRPPGTGVVYDRTQGQVPDSLTDDREEEENWDQQDGSHFSDQSDKFLLSL QKDKGSVQAPEISSNSIKDTLAVNEKKDFSKNLEKNDIKDRGPLKKRRQEIESDSESDGELQDRKKVRVEVEQGET SVPPGSALVGPSCVMDDFRDPQRWKECAKQGKMPCYFDLIEENVYLTERKKNKSHRDIKRMQCECTPLSKDERAQG EIACGEDCLNRLLMIECSSRCPNGDYCSNRRFQRKQHADVEVILTEKKGWGLRAAKDLPSNTFVLEYCGEVLDHKE FKARVKEYARNKNIHYYFMALKNDEIIDATQKGNCSRFMNHSCEPNCETQKWTVNGQLRVGFFTTKLVPSGSELTF DYQFQRYGKEAQKCFCGSANCRGYLGGENRVSIRAAGGKMKKERSRKKDSVDGELEALMENGEGLSDKNQVLSLSR LMVRIETLEQKLTCLELIQNTHSQSCLKSFLERHGLSLLWIWMAELGDGRESNQKLQEEIIKTLEHLPIPTKNMLE ESKVLPIIQRWSQTKTAVPPLSEGDGYSSENTSRAHTPLNTPDPSTKLSTEADTDTPKKLMFRRLKIISENSMDSA ISDATSELEGKDGKEDLDQLENVPVEEEEELQSQQLLPQQLPECKVDSETNIEASKLPTSEPEADAEIEPKESNGT KLEEPINEETPSQDEEEGVSDVESERSQEQPDKTVDISDLATKLLDSWKDLKEVYRIPKKSQTEKENTTTERGRDA VGFRDQTPAPKTPNRSRERDPDKQTQNKEKRKRRSSLSPPSSAYERGTKRPDDRYDTPTSKKKVRIKDRNKLSTEE RRKLFEQEVAQREAQKQQQQMQNLGMTSPLPYDSLGYNAPHHPFAGYPPGYPMQAYVDPSNPNAGKVLLPTPSMDP VCSPAPYDHAQPLVGHSTEPLSAPPPVPVVPHVAAPVEVSSSQYVAQSDGVVHQDSSVAVLPVPAPGPVQGQNYSV WDSNQQSVSVQQQYSPAQSQATIYYQGQTCPTVYGVTSPYSQTTPPIVQSYAQPSLQYIQGQQIFTAHPQGVVVQP AAAVTTIVAPGQPQPLQPSEMVVTNNLLDLPPPSPPKPKTIVLPPNWKTARDPEGKIYYYHVITRQTQWDPPTWES PGDDASLEHEAEMDLGTPTYDENPMKASKKPKTAEADTSSELAKKSKEVFRKEMSQFIVQCLNPYRKPDCKVGRIT TTEDFKHLARKLTHGVMNKELKYCKNPEDLECNENVKHKTKEYIKKYMQKFGAVYKPKEDTELE(SEQ ID NO:1) [0067] 编码人SETD2蛋白的核酸序列(7695bp) [0068] ATGAAGCAGCTGCAGCCGCAGCCGCCTCCGAAGATGGGGGATTTCTACGACCCGGAGCACCCGACCCCTGAAGAAGAAGAAAATGAGGCAAAGATTGAAAATGTGCAGAAAACAGGTTTCATCAAAGGACCAATGTTCAAAGGT GTTGCTTCTAGTCGATTTTTGCCCAAAGGCACCAAAACAAAAGTTAATTTGGAAGAACAGGGACGACAGAAGGTGT CATTCAGCTTCAGCCTTACAAAGAAAACTTTGCAGAATAGGTTTCTCACTGCACTTGGCAATGAAAAGCAAAGTGA TACTCCAAACCCTCCAGCTGTACCTCTTCAGGTAGACTCGACTCCTAAAATGAAAATGGAAATTGGTGATACCTTA TCTACTGCAGAAGAATCTTCCCCACCAAAGTCAAGGGTGGAATTGGGCAAAATTCATTTTAAGAAACATCTGCTTC ATGTAACATCCAGGCCACTGCTGGCTACTACCACAGCAGTAGCATCTCCACCTACTCATGCAGCACCATTACCAGC AGTGATAGCAGAATCAACAACTGTAGACTCACCGCCCTCATCTCCGCCTCCACCGCCTCCACCTGCCCAAGCCACA ACACTCTCATCACCAGCACCAGTAACAGAGCCAGTGGCCTTGCCACATACACCAATAACAGTTCTAATGGCAGCAC 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CCCAAGAAACTAATGTTTCGCAGACTGAAAATTATAAGTGAAAATAGCATGGACAGTGCAATCTCTGATGCAACCA GTGAGCTAGAAGGCAAGGATGGCAAAGAGGATCTTGATCAATTAGAAAATGTCCCTGTAGAGGAAGAGGAAGAATT GCAGTCACAACAGCTACTCCCACAACAGCTGCCTGAATGCAAAGTTGATAGTGAAACCAACATAGAAGCTAGTAAG CTACCTACATCTGAACCAGAAGCTGACGCTGAAATAGAGCCCAAAGAGAGCAACGGCACAAAACTAGAAGAACCTA TTAATGAAGAAACACCATCCCAAGATGAAGAGGAGGGTGTGTCTGATGTGGAGAGTGAAAGGAGCCAAGAACAGCC AGATAAAACAGTGGATATAAGTGATTTGGCCACCAAACTCCTGGACAGTTGGAAAGACCTAAAGGAGGTATATCGA ATTCCAAAGAAAAGTCAAACTGAAAAGGAAAACACAACAACTGAACGAGGAAGGGATGCTGTTGGCTTCAGAGATC AAACACCTGCCCCGAAGACTCCTAATAGGTCAAGAGAGAGAGACCCAGACAAGCAAACTCAAAATAAAGAGAAAAG GAAACGAAGAAGCTCCCTCTCACCACCCTCTTCTGCCTATGAGCGGGGAACAAAAAGGCCAGATGACAGATATGAT ACACCAACTTCTAAAAAGAAAGTACGAATTAAAGACCGCAATAAACTTTCTACAGAGGAACGCCGGAAGTTGTTTG AGCAAGAGGTGGCTCAACGGGAGGCTCAGAAACAACAGCAACAGATGCAGAACCTGGGAATGACATCACCACTGCC CTATGACTCTCTTGGTTATAATGCCCCGCATCATCCCTTTGCTGGTTACCCACCAGGTTATCCCATGCAGGCCTAT GTGGATCCCAGCAACCCTAATGCTGGAAAGGTGCTCCTGCCCACACCCAGCATGGACCCAGTGTGTTCTCCTGCTC CTTATGATCATGCTCAGCCCTTGGTGGGACATTCTACAGAACCCCTTTCTGCCCCTCCACCAGTACCAGTGGTGCC ACATGTGGCAGCTCCTGTGGAAGTTTCCAGTTCCCAGTATGTGGCCCAGAGTGATGGTGTAGTACACCAAGACTCC AGCGTTGCTGTCTTGCCAGTGCCGGCCCCCGGCCCAGTTCAGGGACAGAATTATAGTGTTTGGGATTCAAACCAAC AGTCTGTCAGTGTACAGCAGCAGTACTCTCCTGCACAGTCTCAAGCAACCATATATTATCAAGGACAGACATGTCC AACAGTCTATGGTGTGACATCACCTTATTCACAGACAACTCCACCAATTGTACAGAGTTATGCCCAGCCAAGTCTT CAGTATATCCAGGGGCAACAGATTTTCACAGCTCATCCACAAGGAGTGGTGGTACAGCCAGCCGCAGCAGTGACTA CAATAGTTGCACCAGGGCAGCCTCAGCCCTTGCAGCCATCTGAAATGGTTGTGACAAATAATCTCTTGGATCTGCC GCCCCCCTCTCCTCCCAAACCAAAAACCATTGTCTTACCTCCCAACTGGAAGACAGCTCGAGATCCAGAAGGGAAG ATTTATTACTACCATGTGATCACAAGGCAGACTCAGTGGGATCCTCCTACTTGGGAAAGCCCAGGAGATGATGCCA GCCTTGAGCATGAAGCTGAGATGGACCTGGGAACTCCAACATATGATGAAAACCCCATGAAGGCCTCGAAAAAGCC CAAGACAGCAGAAGCAGACACCTCCAGTGAACTAGCAAAGAAAAGCAAAGAAGTATTCAGAAAAGAGATGTCCCAG TTCATCGTCCAGTGCCTGAACCCTTACCGGAAACCTGACTGCAAAGTGGGAAGAATTACCACAACTGAAGACTTTA AACATCTGGCTCGCAAGCTGACTCACGGTGTTATGAATAAGGAGCTGAAGTACTGTAAGAATCCTGAGGACCTGGA GTGCAATGAGAATGTGAAACACAAAACCAAGGAGTACATTAAGAAGTACATGCAGAAGTTTGGGGCTGTTTACAAA CCCAAAGAGGACACTGAATTAGAGTGA(SEQ ID NO:2) [0069] 小鼠SETD2蛋白的氨基酸序列如下:(2537AA) [0070] MKPLPSQQPPPKMGDFYDPEHPTPEEEENEAKIENVQKTGFIKGPVFKGVASSRFLPKGTKTKVNLEEQGRQKVSFSFSFTKKTLQNRFLTALSNEKQSDSPNSPAPPLQVDSNPKVKMDAGDTFPATEESSPPKSRVELGRIH FKKHLLHVTSRPQLAASTTAASPLPPTTQLPAVLAESMIDSPPSSPPPPPPPPQASSPSPPAQISEPVALPQPPAT ALMTSPPGPLPGDVAVRAQKESPVKSGPEVLEVDTKQDIVSNSLEEHTVQTLKEQADHLLQKEDSHIGKEEEVSDG SKISLSSKKASSKKKSSQFEGTFLGSESDEDSVRTSSSQRSHDLKSSTSIDKERDFKKSSAPSKSEDLGKSSRSKT ERDDRYCSYSKLERDTRYVSSRCRSERDRRRSRSRSRSDRASRTSLSYSRSERSHYYDSERRYHRSSPYRERTRYS RPYTDNRARESSDSEDEYKKTYPRRTSAHSYRDLRTSSSYSKFDRDCKTETSYLEMERRGKYTSKLERESKRTSEH ETIKRCCSPPNELGFRRGSSYSKHDNSTSRYKSALSKSISKNDKFKNSFCCTELNEENKQSHSFSLQTPCSKGSEL RTINKISEREKTGSPTPSNQLNDSPTFKKLDESPVLKPEFIGHDGRESIKELELSKVKNDQLRNFCSIELNVNGSP ETEADVATFCTSKTDAISMTSDDSVTGSEVSPLIKACMLSSNGFQNVGRCRERDSDDTCRQHNTSKSPFREMEPLL SPHHDKLMSLPVKTIDYPKTLIKEPVDKRHSCCKTKDSDIYCSPNENPEAENAEPSAMTISSHSFVNVHLESKTVI CDNREPTDRHSENTCDEYKQSIGSTSSASHNHFDGLYEPIGSSGISSLQSPPSGIRCEENTSPTLDAVESKKGIDF LKYARKETDVGSALPDSGKGFSWENRHNNVLSGQSLQEAQEEGNSILHERRGRPEIPLDEEQRGHTHISDDSEVVF PYDLNLTMEDSDGITYTLKCDSSGNAPEIVSTVHEDYSGSSASSSDESDSEDTESDDSSIPRNRLQSVVVVPKNST LPMEETSPCSSRSSQSYKHYSDRWEDGLETRRHAYEEEYESKGCSQTEKYFLHKGTERSAESCYSQFGRKADNHLP DIAHAQSDGVDSTSQTDSRSDHLGHLNPEDTLRAKTSRPQELPVYSDDFEDLPNKSRQQMIFSNRPDSSRLGKTEL SFSSSCDISRMDGLHSSEELRNLGWDFSQQERPTTTYQQPDSSYGTCGTHKYQQSTEHYGGTHNYWQGNGYWDPRS AGRPPGTGLAYDRIQGQVPDSLTDDREEEEHWDQRSGSHFSSPSNKFFFHQKDKGSVQAPEISSNSIKDALVMNER KDFSKNFEKNDIKERGPPKKRRQELESDSESDGELQARKKVRVEMEQGESSVPQHSELMGPSCAMDDFRDPQRWKE FAKLGKMPCYFDLIEENVYLTERKKNKSHRDIKRMQCECTPLSKDERAQGEVACGEDCLNRLLMIECSSRCPNGDY CSNRRFQRKQHADVEVILTEKKGWGLRAAKDLPSNTFVLEYCGEVLDHKEFKARVKEYARNKNIHYYFMALKNDEI IDATQKGNCSRFMNHSCEPNCETQKWTVNGQLRVGFFTTKLVPSGSELTFDYQFQRYGKEAQKCFCGSANCRGYLG GENRVSIRAAGGKMKKERSRKKDSVDGELEALMENGEGLSDKNQVLSLSRLMVRIETLEQKLTCLKLIQNTHSQSC LKSFLERHGLSLLWIWMAELGDGRESNQKLQEEIIKTLEHLPIPTKNMLEESKVLPIIQRWSQTKTAVPQLSEGDG YSSENTSRAHTPLNTPDPSAKPSTEMDTDTPKKLIFRRLKIISENSMDSAVSDVTSELECKDGKEDLDQLETVTVE EDEELQSQQLLPQQLCESKVESEATIEVSKLPTSEPEADTETEPKDSNGTKLEETIAEETPSQDEEEGVSDVESER SQEPPDKTVDISDLATKLLDSWKDLKEVYRIPKKSQTEKESTVAERGRDAAAFRDQTAPKTPNRSRERDPDKQSQN KEKRKRRGSLSPPSSAYERGTKRPDDRYDTPTSKKKVRIKDRNKLSTEERRKLFEQEVAQREAQKQQQQMQNLGMT SPLPFDSLGYNASHHPFAGYPPGYPMQAYVDPSNPNAGKVLLPTPSMDPVCSPAPYDHAQPLVGHSTESLAAPPSV PVVPHVAASVEVSSSQYVAQNESVVHQDSNVPVMPVQAPGPVQGQNYNVWESNQQSVSVQQQYSPAQSQTTIYYQG QTCSTVYSVTSPYSQTTPPIVQSYAQPSLQYIQGQQIFTAHPQGVVVQPTAAVTSIVAPGQPQSLQPPEMVVTNNL LDLPPPSPPKPKTIVLPPNWKTARDPEGKIYYYHVITRQTQWDPPTWESPGDDASLEHEAEMDLGTPTYDENPMKT SKKPKTAEADTSSELAKKSKEVFRKEMSQFIVQCLNPYRKPDCKVGRITTTEDFKHLARKLTHGVMNKELKYCKNP EDLECNENVKHKTKEYIKKYMQKFGAVYKPKEDTELE(SEQ ID NO:3) [0071] 编码小鼠SETD2蛋白的核酸序列(7614bp) [0072] ATGAAGCCGCTGCCGTCGCAGCAGCCGCCACCGAAGATGGGGGATTTCTACGATCCCGAGCACCCGACCCCTGAAGAAGAAGAAAATGAGGCAAAGATTGAAAATGTGCAGAAAACAGGTTTCATCAAAGGACCAGTGTTCAAA GGTGTTGCTTCAAGTCGATTTTTGCCCAAAGGCACGAAGACAAAAGTTAATTTGGAGGAACAGGGACGGCAAAAGG TGTCATTCAGCTTCAGTTTTACAAAGAAAACTTTACAGAATAGATTTCTCACTGCGCTTAGCAATGAAAAGCAAAG TGATTCTCCAAACTCCCCAGCTCCCCCTCTTCAAGTAGACTCAAACCCTAAAGTTAAAATGGACGCTGGAGATACT TTTCCTGCTACAGAAGAATCTTCGCCACCAAAATCGAGAGTGGAATTGGGCAGAATTCATTTTAAGAAACATTTGC TTCATGTGACATCTAGGCCACAGCTGGCTGCAAGTACAACAGCAGCATCTCCCCTTCCTCCTACAACACAGTTACC AGCAGTCTTAGCAGAGTCGATGATAGACTCACCACCTTCATCTCCACCCCCACCTCCTCCACCTCCCCAGGCCTCA TCACCCTCACCACCAGCACAGATATCAGAGCCAGTGGCCTTGCCGCAACCCCCAGCAACAGCACTAATGACATCAC CACCAGGACCTTTACCAGGAGACGTAGCCGTGAGAGCTCAGAAAGAATCACCAGTTAAAAGTGGACCCGAAGTTTT AGAGGTGGATACAAAGCAAGATATTGTATCTAATAGTTTGGAAGAACACACAGTTCAAACTTTGAAGGAACAAGCA GATCATCTCCTGCAAAAAGAAGATTCCCATATTGGGAAGGAAGAAGAGGTTTCAGATGGCTCTAAGATAAGCCTCA GTTCTAAAAAAGCAAGTTCTAAGAAGAAATCTTCACAATTTGAAGGCACATTTCTTGGTTCAGAGTCTGATGAAGA TTCTGTACGGACTTCTTCCAGTCAAAGATCACATGATTTAAAATCTTCAACAAGCATTGACAAGGAAAGAGATTTT AAGAAGAGCTCAGCACCTTCAAAAAGTGAGGATTTGGGGAAATCATCAAGATCGAAAACAGAGAGAGATGATAGAT ATTGTAGCTACTCAAAACTTGAACGAGATACTCGGTATGTATCTTCCCGATGTCGGTCCGAAAGAGATCGAAGGCG AAGCCGATCTCGTTCTAGATCTGACAGAGCCTCTAGAACTAGTTTGTCTTATTCTCGCTCAGAAAGATCTCATTAT TATGATTCTGAACGGCGCTACCATAGGAGTTCCCCTTATCGTGAGAGGACACGCTATTCTCGGCCATATACTGATA ACAGGGCACGGGAGAGCTCAGACTCTGAAGATGAGTATAAGAAGACATACCCACGGCGTACCTCAGCCCATTCCTA CAGAGACCTAAGGACATCATCATCTTACTCTAAATTTGATCGGGACTGTAAAACTGAGACCTCTTACTTAGAGATG GAGAGAAGAGGAAAGTATACTTCAAAACTAGAAAGAGAATCCAAACGGACTTCAGAGCATGAAACCATAAAAAGAT GTTGTTCTCCCCCAAATGAACTGGGATTCCGACGGGGGTCATCATATTCCAAGCATGATAACAGTACTTCCCGTTA TAAATCTGCCCTTTCAAAATCTATATCCAAGAATGATAAATTTAAAAATTCTTTCTGTTGTACAGAATTAAATGAG GAAAACAAACAATCTCATTCGTTTAGTTTGCAGACTCCTTGTTCAAAAGGTAGTGAATTAAGAACAATTAATAAGA TTTCTGAAAGAGAAAAGACTGGGTCTCCAACTCCATCAAATCAATTAAACGATTCACCTACTTTTAAAAAGCTAGA TGAATCTCCTGTTCTTAAGCCTGAATTTATAGGACACGATGGCCGTGAAAGTATTAAAGAATTGGAGTTATCAAAA GTGAAAAATGATCAATTAAGAAATTTTTGTTCCATTGAATTAAATGTAAACGGATCTCCAGAGACAGAAGCTGATG TGGCAACATTTTGTACTTCTAAGACAGATGCTATATCAATGACTTCTGATGATAGTGTGACTGGATCAGAGGTATC CCCTTTGATCAAGGCTTGCATGCTTTCATCAAATGGATTTCAGAATGTTGGTAGATGCAGAGAAAGGGACTCAGAT GATACTTGTAGGCAGCATAATACGTCAAAAAGTCCATTTAGGGAAATGGAACCTTTGTTGTCACCACACCATGATA AACTCATGTCTTTGCCAGTTAAGACTATAGATTATCCCAAAACATTAATTAAAGAACCAGTTGATAAGAGACATTC TTGCTGCAAAACCAAAGATTCAGATATATACTGTTCTCCAAATGAAAACCCTGAAGCTGAGAACGCTGAACCTTCA GCTATGACGATTTCTTCACATAGCTTTGTGAATGTGCATTTGGAATCCAAGACAGTTATATGTGATAATAGGGAGC CGACAGACCGGCACTCAGAGAATACATGTGATGAATATAAGCAGAGCATTGGTAGCACTAGTTCAGCTTCTCATAA CCATTTTGATGGTTTGTATGAGCCTATAGGGAGTTCAGGTATTTCATCTCTCCAGAGTCCTCCGTCAGGAATAAGA TGTGAAGAAAACACATCTCCAACTCTAGATGCAGTGGAGAGTAAAAAAGGCATAGATTTTTTAAAGTATGCACGGA AAGAAACAGATGTTGGTAGTGCCCTTCCTGATTCAGGAAAAGGATTTTCTTGGGAAAACAGGCATAATAATGTGTT ATCTGGGCAGTCTTTGCAAGAGGCTCAAGAAGAAGGGAATTCCATATTGCATGAGAGAAGAGGAAGACCAGAAATC CCCTTAGATGAGGAACAAAGAGGCCATACACATATTTCTGATGATTCAGAAGTGGTATTTCCTTATGATTTGAACT TGACCATGGAAGACAGTGATGGTATAACCTACACCTTAAAATGTGATAGTAGTGGAAATGCTCCAGAGATTGTATC TACTGTCCATGAAGACTATTCTGGATCTTCTGCAAGTTCAAGCGATGAAAGTGATTCTGAAGATACAGAGTCTGAT GATAGCAGTATTCCAAGAAACCGACTCCAGTCTGTTGTGGTTGTGCCAAAGAATTCTACTTTGCCCATGGAAGAGA CAAGTCCCTGTTCTTCTCGGAGCAGTCAGAGCTACAAACATTATTCTGACCGCTGGGAAGATGGATTAGAGACCAG GAGACATGCATATGAGGAAGAGTATGAGAGTAAAGGCTGTTCTCAAACTGAAAAATACTTCCTTCATAAAGGAACA GAGAGAAGTGCAGAAAGTTGTTATTCACAGTTTGGCAGGAAAGCAGATAATCACCTGCCTGACATTGCTCATGCTC AGAGTGACGGGGTTGATAGTACAAGTCAGACAGACTCGAGATCTGACCATCTAGGTCACCTGAATCCAGAGGACAC ATTAAGAGCCAAAACATCTAGGCCACAAGAGCTACCAGTTTATTCTGACGATTTTGAAGATCTCCCAAATAAGTCT CGGCAGCAGATGATTTTCTCTAATCGGCCAGATAGTAGTAGACTAGGAAAAACAGAGCTGAGTTTTTCTTCCTCTT GTGACATTTCCCGAATGGATGGCTTGCACTCATCAGAAGAGCTCAGAAACCTAGGGTGGGACTTTTCCCAACAGGA AAGGCCCACCACCACATACCAGCAGCCTGACAGCAGCTATGGAACCTGTGGTACACATAAGTATCAACAAAGTACT GAACACTATGGTGGGACCCATAATTACTGGCAAGGCAATGGCTATTGGGATCCAAGATCAGCAGGTAGACCTCCAG GAACTGGGCTTGCTTATGATCGAATCCAAGGGCAAGTACCAGATTCTCTAACAGACGATCGTGAAGAAGAGGAACA TTGGGATCAACGAAGTGGATCACATTTTTCAAGCCCGTCCAATAAATTTTTCTTCCATCAGAAGGACAAGGGATCA GTGCAAGCACCGGAAATAAGCAGCAATTCAATTAAAGACGCTTTAGTTATGAACGAAAGGAAAGATTTTTCGAAAA ACTTTGAAAAAAATGATATAAAAGAGAGAGGGCCTCCTAAAAAACGAAGGCAAGAGTTGGAGAGTGATTCTGAAAG TGATGGTGAACTACAGGCTAGAAAGAAAGTTAGAGTGGAGATGGAGCAGGGAGAATCATCTGTGCCCCAGCACTCA GAACTGATGGGGCCTTCGTGTGCTATGGATGACTTCAGGGACCCACAGCGGTGGAAAGAATTTGCCAAGCTGGGGA AGATGCCATGTTACTTTGATCTTATTGAAGAAAATGTTTATTTAACAGAAAGGAAGAAGAACAAATCCCACCGGGA TATTAAGCGAATGCAGTGTGAGTGTACACCTCTTTCTAAGGATGAAAGAGCTCAAGGTGAAGTAGCATGTGGAGAA GATTGCCTTAATCGTCTCCTCATGATTGAATGTTCCTCTCGATGTCCAAATGGAGATTACTGTTCAAACAGACGGT TTCAGAGAAAACAGCATGCAGATGTAGAAGTCATACTTACAGAAAAGAAAGGCTGGGGCTTAAGGGCTGCTAAGGA TCTTCCTTCGAACACCTTTGTCCTGGAATACTGTGGAGAGGTACTTGATCATAAAGAGTTTAAAGCTCGGGTGAAA GAATATGCACGGAACAAAAACATCCACTACTACTTCATGGCCCTGAAAAATGACGAGATAATAGATGCCACTCAAA AAGGGAATTGCTCTCGTTTCATGAATCATAGCTGTGAACCAAACTGTGAAACCCAGAAATGGACTGTGAATGGACA GCTGAGGGTTGGATTTTTTACCACCAAACTAGTTCCTTCAGGCTCAGAATTAACTTTTGACTACCAGTTCCAAAGA TATGGCAAAGAAGCTCAGAAGTGTTTCTGTGGGTCAGCCAACTGCCGGGGCTACTTGGGAGGAGAAAACAGAGTCA GTATCAGAGCTGCAGGAGGGAAGATGAAAAAGGAACGCTCTCGAAAGAAGGATTCAGTGGATGGAGAACTTGAAGC ACTGATGGAAAATGGTGAAGGCCTCTCTGATAAGAACCAGGTTCTTAGTTTATCCCGGCTCATGGTTAGAATTGAA ACTTTGGAACAGAAACTTACCTGTCTTAAGCTCATTCAGAACACACACTCACAGTCCTGCCTCAAGTCATTTCTGG AACGTCATGGGTTGTCACTGTTGTGGATCTGGATGGCAGAGCTTGGCGACGGCCGGGAAAGTAACCAGAAGCTTCA GGAAGAGATTATAAAGACTTTGGAGCATTTGCCCATTCCTACTAAAAATATGTTGGAAGAAAGCAAAGTACTTCCA ATTATTCAGCGCTGGTCTCAAACTAAGACTGCTGTTCCTCAGTTAAGTGAAGGAGACGGGTATTCTAGTGAGAATA CATCACGTGCTCACACACCGCTTAATACACCGGACCCTTCTGCCAAGCCGAGCACGGAAATGGATACAGATACTCC CAAGAAACTCATATTCCGCAGACTGAAGATTATAAGTGAAAATAGCATGGACAGTGCAGTCTCGGACGTCACTAGT GAGCTAGAATGCAAGGATGGCAAAGAGGACCTTGATCAGTTAGAGACTGTCACTGTGGAAGAGGATGAAGAGCTGC AGTCCCAGCAGCTCCTCCCACAGCAGCTGTGCGAGTCCAAAGTTGAGAGTGAAGCCACTATTGAAGTCAGTAAGTT ACCCACATCTGAACCGGAGGCAGACACGGAGACAGAGCCCAAAGACAGCAATGGCACAAAACTAGAAGAAACTATT GCTGAGGAAACACCATCCCAAGATGAAGAAGAGGGAGTGTCTGATGTTGAAAGTGAGAGAAGCCAGGAGCCACCAG ATAAAACAGTGGATATAAGTGATTTGGCTACCAAGTTACTAGACAGTTGGAAAGATCTAAAGGAGGTGTATCGGAT TCCAAAGAAAAGTCAAACTGAAAAGGAGAGCACAGTAGCTGAACGAGGAAGAGATGCTGCTGCCTTCAGAGATCAA ACAGCTCCAAAGACTCCTAACAGGTCTAGAGAGAGAGACCCAGACAAGCAGTCTCAAAATAAAGAGAAAAGGAAAC GACGGGGCTCTCTGTCACCACCCTCTTCTGCATATGAGCGGGGAACAAAAAGGCCAGATGACAGATATGATACACC AACTTCTAAAAAGAAAGTACGAATTAAAGACCGAAACAAACTTTCTACAGAGGAGCGCAGGAAGTTGTTTGAACAA GAGGTGGCACAGAGGGAAGCTCAGAAGCAACAGCAACAGATGCAGAACTTGGGGATGACATCACCACTCCCCTTTG ACTCTCTGGGATATAATGCCTCTCATCACCCCTTTGCTGGGTACCCACCAGGTTACCCCATGCAAGCCTATGTGGA TCCCAGCAACCCTAATGCTGGAAAGGTGCTTCTGCCCACACCTAGCATGGACCCTGTGTGCTCCCCTGCTCCTTAT GATCACGCTCAGCCCTTGGTAGGACATTCTACAGAATCCCTTGCTGCTCCCCCATCTGTGCCAGTGGTGCCGCATG TGGCAGCCTCTGTGGAAGTTTCCAGTTCTCAGTATGTAGCTCAGAATGAAAGTGTTGTACACCAAGACTCCAATGT TCCTGTAATGCCAGTACAAGCTCCAGGCCCAGTCCAAGGACAGAATTACAATGTCTGGGAGTCAAACCAACAGTCT GTCAGTGTACAACAGCAGTATTCTCCTGCACAATCTCAAACAACCATATATTATCAAGGACAGACATGTTCAACTG TCTATAGTGTGACCTCGCCTTATTCACAGACAACTCCTCCAATTGTGCAGAGTTATGCCCAGCCAAGTCTTCAGTA TATCCAGGGACAGCAGATTTTCACAGCTCACCCACAAGGAGTGGTGGTACAGCCAACTGCAGCCGTGACTTCAATA GTTGCACCAGGGCAGCCTCAGTCCTTACAGCCACCTGAAATGGTTGTAACAAATAATCTACTGGACCTGCCACCAC CCTCCCCTCCAAAACCAAAAACGATTGTTTTACCTCCCAACTGGAAGACAGCCCGAGACCCTGAGGGGAAGATCTA CTACTACCACGTGATCACAAGACAGACTCAGTGGGATCCTCCTACTTGGGAAAGCCCAGGAGATGATGCCAGCCTT GAGCATGAAGCTGAAATGGACCTGGGAACCCCAACCTATGATGAAAACCCCATGAAGACATCAAAAAAGCCCAAGA CAGCAGAAGCAGACACCTCCAGTGAGCTGGCAAAGAAAAGCAAAGAAGTATTCAGAAAAGAGATGTCTCAGTTCAT TGTCCAGTGCCTGAATCCTTACCGGAAACCTGACTGCAAGGTGGGCAGGATCACCACCACTGAAGATTTCAAGCAC CTCGCCCGAAAGCTGACTCATGGAGTTATGAATAAGGAGCTGAAGTACTGTAAGAACCCCGAGGACCTGGAGTGCA ATGAGAATGTGAAACACAAAACCAAGGAGTACATCAAGAAGTACATGCAGAAGTTTGGGGCTGTTTACAAACCTAA AGAGGACACTGAACTAGAGTGA(SEQ ID NO:4) [0073] 本发明中, [0074] 术语“诱导性多潜能干细胞(iPSCs)”,2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4、Sox2、c‑Myc 和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体,然后引入小鼠成纤维细胞,发现可诱导其发 生转化,产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚 体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。随后世界各地不同科学家陆 续发现其它方法,用特定的基因组合与转染也可以将已分化的体细胞诱导重编程为多潜能 干细胞。 [0075] 术语“造血干细胞(HSC)”是指血液系统中的成体干细胞,是一个异质性的群体,具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。在一个实施方式中,所述造血干 + 细胞为人脐血CD34细胞。 [0076] 术语“MEG‑01”或“MEG‑01细胞”(人成巨核细胞白血病细胞细胞系)源自一位CML患者成巨核细胞转换期的骨髓细胞,具有长期增殖能力,在TPO诱导下具有分化为巨核细胞的 潜能。MEG‑01细胞是一种巨核细胞。 [0077] 本优选地,发明涉及的诱导性多潜能干细胞,造血干细胞或人巨核细胞源自哺乳动物例如人的细胞。 [0078] 本发明中,术语“高倍体巨核细胞”是指染色体倍数大于等于8倍体的巨核细胞。 [0079] 本发明中,术语“前血小板”(proplatelet)是指,巨核细胞在细胞骨架驱动下细胞质凸起形成伪足伸入血管内,这些凸出的细胞质逐渐延伸变成细长的串珠样结构,被称为 前血小板。 [0080] 术语“核酸构建体”,在文中定义为单链或双链核酸分子,优选是指人工构建的核酸分子。可选地,所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。 [0081] 在本发明中,术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。 [0082] 在本发明中,术语“载体”指的是,可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说,载体包括:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体如酵母人工染色体 (YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体 及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病 毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如 SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。 [0083] 在本发明中,术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞,包括如下许多细胞类型,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等昆 虫细胞,或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞,或动物细胞例如人细胞。 [0084] 术语“有效量”,当对象为个体时,是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。当对象为细胞时,是指产生目标效果或者发挥目标作用 的剂量,例如细胞中的加药量为1μM-100μM、5μM-50μM、5μM-30μM、5μM-25μM、5μM-20μM、5μM-15μM、5μM-10μM、10μM-25μM、10μM-15μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、50μM或100μM,或者1μg/mL或2μg/mL等。 [0085] 术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态,该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。 [0087] 本发明中,对于DNA或RNA的敲低包括但不限于,完全敲除和部分敲除。完全敲除是指将目标DNA或目标RNA的水平或其表达的蛋白的水平降低至几乎检测不到的水平(事实 上,一般而言,很难将目标DNA或目标RNA 100%地敲除掉)。部分敲除是指敲除的程度大于 零,小于完全敲除的情况。 [0088] 本发明中,如果没有特别说明,浓度单位μM表示μmol/L,mM表示mmol/L,nM表示nmol/L。 [0089] 本发明中,提到细胞中的加药量时,如果没有特别说明,一般是指加药后药物的终浓度。 [0090] 发明的有益效果 [0091] 下调SETD2基因表达水平,或者抑制SETD2蛋白能够显著地促进体外成熟巨核细胞产生,有利于提高体外巨核细胞的多倍体化,降低成本。本发明人还发现,SETD2抑制剂主要 是促进了成熟巨核细胞生成。本发明为干细胞临床转化、体外产生巨核细胞用于临床移植、 用于治疗巨核细胞/血小板异常的相关疾病,提供新的解决方案。 附图说明 [0092] 图1A至图1G:人的CD34+诱导分化产生MK体系中敲低SETD2后的检测结果。比例尺:20μm。结果分别来自三次独立重复实验。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。其中: [0093] 图1A:利用shRNA敲低CD34+细胞中SETD2后,检测SETD2基因和蛋白水平; [0094] 图1B:对照组(shSCR)和敲低SETD2(shSETD‑1和shSETD2‑2)产生的巨核祖细胞MKP+ + + + + + (CD34 CD41),成熟MK(CD41CD42)和具有产板潜能的成熟巨核细胞MK(CD61CD62p)细胞 群体的检测结果; [0095] 图1C:对照组(shSCR)和敲低SETD2(shSETD‑1和shSETD2‑2)形态学检测结果; [0096] 图1D:利用流式检测对照组(shSCR)和敲低SETD2(shSETD‑1和shSETD2‑2)细胞大小结果; [0097] 图1E:利用细胞计数仪检测对照组(shSCR)和敲低SETD2(shSETD‑1和shSETD2‑2)细胞直径的统计结果; [0098] 图1F:SETD2敲低脐血CD34+细胞诱导分化体系中,巨核细胞的倍性分布流式图; [0099] 图1G:SETD2敲低脐血CD34+细胞诱导分化体系中,巨核细胞的倍性分布统计结果。 [0100] 图2A至图2F:人巨核细胞系敲低SETD2后MK的流式图及统计图。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。其中: [0101] 图2A至图2C:正常情况下人巨核细胞系MEG‑01细胞分化过程中表达成熟巨核细胞分子特征和MK倍性; [0102] 图2D:MEG‑01分化体系中SETD2的表达情况; [0103] 图2E:MEG‑01体系中利用shRNA敲低SETD2情况; [0104] 图2F:MEG‑01体系中敲低SETD2后巨核细胞倍性分布。 [0105] 图3A至图3J:人的造血干细胞CD34+诱导分化体系敲低SETD2后血小板的功能检测。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。其中: [0106] 图3A:SETD2缺失后巨核细胞延展能力增加,在凝血酶thrombin的刺激下细胞骨架可以铺展更大面积,比例尺,20μm; [0107] 图3B至图3C代表利用透射电镜观察巨核细胞的分界膜系统,SETD2缺失促进分界膜系统形成,比例尺,1μm; [0108] 图3D至图3F:SETD2敲低促进前血小板的形成,利用活细胞成像系统观察shSCR(对照)或shSETD2敲低(shSETD2‑1)细胞第十到十二天前血小板的形成过程。柱形图表示统计 不同视野下产生前血小板巨核细胞所占百分比,比例尺,50μm; [0109] 图3G至图3H:SETD2敲低后产生的血小板(CD61+CD62p+)增加; [0110] 图3I至图3J:SETD2敲低后产生的血小板具有凝血功能,可以在凝血酶thrombin的刺激下高表达CD62p。 [0111] 图4A至图4D:在正常iPSC细胞BC1体外巨核谱系分化体系不同时间点加入不同SETD2抑制剂后检测结果。其中: [0112] 图4A:分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,在第十四天统计细胞扩增的数量; [0113] 图4B至图4D:分别为不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,第十四天检测分化+ + + + + + 产生的MKP(CD34CD41)、成熟MK(CD41CD42)、具有产板潜能的成熟MK(CD61CD62p)细胞 群体的绝对数量。 [0114] 图5A至图5B:在脐血来源的CD34+细胞诱导分化不同时间点加入SETD2抑制剂后,流式细胞术检测结果的统计图。其中: [0115] 图5A的纵坐标表示不同时间点加了抑制剂以后,不同的倍性比对照组增加的倍数;对照组加入DMSO,设为1; [0116] 图5B为选择最佳的分化第6天加入抑制剂后产生的MKP(CD34+CD41+)、成熟MK(CD41+ + + + CD42)、具有产板潜能的成熟MK(CD61CD62p)细胞群体的百分比绝对数量。 具体实施方式[0117] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄 培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试 剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。 [0118] 本发明中,下列缩写的含义是: [0119] bFGF:Basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子。 [0120] BMP4:Bone morphogenetic protein 4,骨形态发生蛋白4。 [0121] SCF:Stem cell factor,干细胞因子。 [0122] VEGF:Vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子。 [0123] TPO:Thrombopoietin,促血小板生成素。 [0124] DAPI:4',6‑diamidino‑2‑phenylindole,4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚。 [0125] DMS:Demarcation membrane system,分界膜系统。 [0126] Taq聚合酶购自Takara公司。 [0127] 流式检测所用抗体:购自eBioscience。 [0128] PBS与胎牛血清购自Gibco公司。 [0129] 实施例1:体外敲低实验研究SETD2基因在体外巨核分化中的作用 [0130] 1.实验材料 [0131] 脐血来自正常健康的足月新生儿,通过了新生儿家长的知情同意。 [0132] 人巨核细胞系(Human megakaryoblastic cell line,MEG‑01)由中国科学院动物研究所陈佺教授实验室惠赠。 [0133] Ficoll‑Paque PLUS购自GE Healthcare Life Sciences公司。CD34MicroBead Kit购自Miltenyi Biotec公司。 [0134] StemSpanTMSFEMII,BIT购自STEMCELL Technologies公司。 [0135] IMDM购自ThermoFisher SCIENTIFIC。 [0136] 细胞因子购自Peprotech和R&D Systems。 [0137] SETD2敲低质粒(可购自Sigma)的shRNA的序列如下: [0138] shRNA‑1: [0139] CCGGCCTGAAGAATGATGAGATAATCTCGAGATTATCTCATCATTCTTCAGGTTTTT(SEQ ID NO:5) [0140] shRNA‑2: [0141] CCGGAGTAGTGCTTCCCGTTATAAACTCGAGTTTATAACGGGAAGCACTACTTTTTTG(SEQ ID NO:6) [0142] psPAX2质粒、MD2.G质粒来自于美国辛辛那提儿童医院医学中心(Cincinnati Children’s Hospital Medical Center,CCHMC)黄刚老师实验室;也可从Sigma购买。 psPAX2质粒和MD2.G质粒均为慢病毒辅助质粒。包装质粒psPAX2形成核心蛋白;包膜质粒 pMD2.G,形成包膜糖蛋白。 [0143] 反转录试剂盒:购自Applied Biosystems。 [0144] 流式检测所用抗体:购自eBioscience和BioLegend。 [0145] 瑞氏‑姬姆萨染色液试剂盒:购自BASO。 [0146] 免疫印迹抗体:购自Abcam。 [0147] 2.实验方法 [0148] (1)CD34+细胞常规培养:利用人脐血CD34阳选试剂盒提取CD34+细胞后,以0.5million/mL密度种下,培养2天,待细胞扩增至足够数量进行实验。培养基配方为IMDM+ 20%BIT+10ng/mL TPO+10ng/mL SCF+10ng/mL IL‑6+10ng/mL IL‑3+10ng/mL FLT‑3+2×双 抗。 [0149] (2)CD34+诱导巨核细胞分化体系:巨核细胞诱导分化培养基采用SFEM作为基础培养基,添加终浓度均为50ng/mL的SCF、TPO、IL‑6以及终浓度为20ng/mL IL‑3,培养至第7天 向巨核细胞分化;然后换成血小板诱导培养基,血小板诱导培养基以SFEM为基础培养基,加 入终浓度50ng/mL TPO和20ng/mL IL‑11,每3天换液一次,培养条件为37℃,5%CO2。 [0150] (3)MEG‑01细胞系诱导巨核细胞分化体系:MEG‑01细胞系加入TPO诱导分化7天可获得MK。 [0151] (4)利用shRNA技术敲低SETD2:常规培养293T细胞株作为包装细胞。按比例将含目的序列的质粒和病毒辅助质粒混合转染293T细胞,转染72h后收集上清,将含慢病毒颗粒的 + 上清离心并过滤,‑80℃保存备用。CD34细胞在无血清培养基中培养2天,在有TPO、SCF、IL‑ 6(终浓度均为50ng/mL)和IL‑3(终浓度50ng/mL)存在下进行转导,慢病毒颗粒处理6小时, 再继续二次感染。48h后对于敲低的细胞,用嘌呤霉素筛选三天获得转染成功的细胞。同时 裂解细胞提取RNA和蛋白检测SETD2的敲低效率。 [0152] RNA水平检测:在SETD2功能结构域对应的5’端和3’端设计引物,如下: [0153] SETD2‑F:TCAACGCTGGTCTCAGACTAAGAC(SEQ ID NO:7) [0154] SETD2‑R:GCACGCGATGTATTCTCACTAGA(SEQ ID NO:8) [0155] 提取RNA后利用反转录试剂盒获得cDNA,用F+R引物进行q‑PCR,检测对照组shSCR、分别在细胞中引入敲低SETD2的shSETD2‑1、shSETD2‑2(shSETD2‑1和shSETD2‑2是平行的两 个样品,证明实验重复性和平行性)细胞中cDNA扩增情况。其中(shSCR与shRNA采用同样的 载体构架,但是打靶序列是随机打乱的序列,因此不靶向生物体内的任何基因,仅仅为了排 除引入shRNA的载体带来的影响,使得实验更加严谨。shSCR‑CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAA CTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG(SEQ ID NO:9)。 [0156] 蛋白水平检测:取相同细胞数加入裂解液超声,用6%的SDS‑page胶进行电泳。具体步骤亦可参见:Yang X,Lu Y,He F,et al.Benzene metabolite hydroquinone promotes DNA homologous recombination repair via the NF‑κB pathway.Carcinogenesis.2019;40(8):1021‑1030.doi:10.1093/carcin/bgy157。 [0157] 成功构建了SETD2敲低的人脐血CD34+细胞。结果如图1A所示。 [0158] (5)对比对照shSCR、敲低SETD2的shSETD2‑1或shSETD2‑2,在体外分化成巨核祖细胞,成熟巨核细胞以及具有产板潜能成熟巨核细胞的能力。 [0159] 取收集的细胞,通过流式细胞仪检测细胞表面标记(CD34、CD41、CD42、CD61、CD62 p)。检测方法如下: [0160] 分为四管进行检测:第一管为阴性管,未标记任何流式抗体;第二管标记了两种抗体CD34‑APC和CD41‑PE;第三管标记了CD41‑PE和CD42‑APC;第四管标记了CD61‑FITC和 + + + + CD62p‑percp。其中CD34CD41 表示巨核祖细胞群体(MKP),CD41 CD42表示成熟巨核细胞 + + (MK),CD61CD62p表示具有产板潜能的成熟巨核细胞群体(MK)。 [0161] 结果如图1B所示。 [0162] 流式检测结果表明,收集的细胞包含了巨核祖细胞,成熟巨核细胞和具有产板潜能的成熟巨核细胞。重复上述实验,并将得到的流式结果进行统计。 [0163] (6)瑞氏‑吉姆萨染色:按照BASO瑞氏‑姬姆萨染色液试剂盒使用说明进行。结果如图1C所示。 [0164] (7)细胞大小测量:利用自动细胞计数仪统计细胞直径。重复上述实验,并将得到的结果进行统计。结果如图1D至图1E所示。 [0165] (8)倍性检测:取适量的巨核细胞,加入anti‑CD41抗体后4℃,避光染色30min。洗去多余的抗体,用4%的多聚甲醛室温固定。洗去多余的4%的多聚甲醛后,用0.2%Triton‑ X 100打孔。洗去多余的Triton‑X 100后加入含有DAPI室温避光染色15min。重复上述实验, 并将得到的流式结果进行统计。结果如图1F至图1G所示。 [0166] 3.实验结果 [0167] 如图1A至图1G、图2A至图2C所示。 [0168] (1)如图1A所示,SETD2表达显著降低。 [0169] 流式检测统计结果如图1B所示:脐血CD34+细胞诱导分化的第十天,巨核细胞+ + (CD41CD42)的显著增加了约2‑3倍(p<0.05;p<0.01),说明SETD2影响的是巨核细胞成熟阶 段,也就是巨核细胞多倍体化的阶段。此外,如图1C至图1E所示,通过形态学和细胞大小评 估,SETD2敲低的细胞偏大,并且细胞的直径显著增加。巨核细胞的多倍体化主要从细胞的 倍性体现,本发明人进一步用流式检测分化的巨核细胞的倍性,如图1F至图1G所示,发现在 SETD2敲低的巨核细胞中,高倍体巨核细胞(≥8N)的比例增加,而低倍体巨核细胞(2N)的比 例降低(p<0.05)。 [0170] (2)如图2A至图2C所示,巨核细胞系MEG‑01在细胞因子TPO的诱导下,七天可以产+ + 生百分比高达60%的具有产板潜能的成熟巨核细胞(CD61 CD62p)(p<0.001)。通过收集 MEG‑01体系分化不同时间点的细胞,检测细胞倍性后发现,第七天出现高达16N的巨核细胞 (p<0.05;p<0.01)。但同时,如图2D所示,SETD2表达水平也从诱导分化的第一天开始逐降 + 低,到第七天为最低(p<0.01),结果和脐血CD34 细胞诱导体系中的结果一致,两个体系均 说明SETD2的表达和巨核细胞的倍性发育存在负相关性。 [0171] 此外,如图2E和2F所示,在MEG‑01体系中成功敲低SETD2后,通过收集MEG‑01分化不同时间点的细胞,检测细胞倍性后发现多倍体巨核细胞(4N、8N、≥16N)的比例增加,而2N 巨核细胞的比例降低(p<0.05;p<0.01)。 [0172] 上述结果表明,SETD2基因的缺失会促进高倍体巨核细胞的产生。 [0173] 实施例2:体外敲低实验验证SETD2缺失促进功能性血小板的产生 [0174] 1.实验材料 [0175] Calcein AM、PBS、PGE1以及凝血酶试剂购自ThermoFisher SCIENTIFIC。 [0176] 2.实验方法 [0177] (1)MK延展实验:使用与实施例1相同的CD34+诱导分化体系获得的MK。收集脐血+ CD34细胞诱导分化第7天的巨核细胞,种于表面铺有Collagen(胶原蛋白,可促进巨核细胞 贴壁,购自Gibco)的玻片上,用凝血酶刺激后用PBS洗一次,用4%PFA固定,PBS清洗3次, 0.5%TritonX‑100打孔20min后,PBS清洗3次,3%BSA封闭1小时。F‑actin室温孵育1小时, PBS清洗3次。DAPI孵育后封片。用双扫描模式激光共聚焦显微镜100倍油镜观察拍摄。结果 如图3A所示。 [0178] (2)分界膜系统结构检测:收取最少103细胞即可,1000rpm,4min。用PBS洗去培养基,轻轻吹散,防止培养基残留,1000rpm,4min。2.5%戊二醛室温固定半小时,最好4℃过夜固定,进行后续样品处理和电镜观察。结果如图3B至图3C所示。 [0179] (3)前血小板形成实验:使用与实施例1相同的CD34+诱导分化体系。收集脐血CD34+细胞诱导分化巨核细胞第7天的细胞,0.5million/mL种于6孔平底板上,用血小板诱导分化 培养基培养,放置于实时无标记细胞检测系统Incucyte S3(Essen Bioscience),设置 15min为间隔拍摄时间,连续拍摄72h,动态追踪前血小板的产生情况。结果如图3D至图3F所 示。 [0180] (4)诱导分化体系分离血小板方法:收集培养液离心,将沉淀重悬;将混合液加到BSA梯度离心液(10%w/v、7%w/v、5%w/v和2%w/v)顶部;BSA梯度离心80g,15min降速为0; 弃去顶部,0.5mL液体收集4.5mL含血小板的上层液体;加入等体积的1%BSA w/v,含1μM PGE1抗凝,离心1000g,10min;去掉上清,将血小板用0.5mL的PBS缓冲液重悬; [0181] (5)流式检测血小板含量:利用Calcein AM green,37℃染色15min,流式细胞术分群,表达Calcein AM green阳性为血小板; [0182] (6)血小板活化能力:将分离的血小板用凝血酶刺激后,用血小板细胞表面标记CD62p进行标记,活性标记物高表达证明血小板有功能,可以被活化发挥止血凝血功能。 [0183] (7)收集细胞进行流式检测,操作步骤亦参考前面的实施例1。结果如图3G至图3J所示。 [0184] 3.实验结果 [0185] 如图3A至图3J所示。 [0186] (1)前血小板功能如图3A所示,当SETD2敲低时,巨核细胞在胶原蛋白上的扩散面积显著增加,蓝色代表细胞核,选取大小一样的核,代表相同倍体进行比较;红色代表骨架 F‑actin,延展的面积大大增加,说明骨架重排能力优于对照组,因此证明巨核细胞有形成 前血小板的能力,并且能力更强。 [0187] 前血小板功能如图3B至图3C所示,使用透射电子显微镜观察了缺失SETD2是否会+ 促进分界膜系统形成。通过收集脐血CD34细胞分化体系成熟的巨核细胞,经过固定等一系 列前期处理后,利用电子显微镜可以观察到巨核细胞中的微观结构,分界膜系统是条状中 空,层层重叠的膜结构,以便后续伸展到血管中形成伪足的形状。与shSCR对照组相比, SETD2敲低后仍然有大量分界膜系统形成,证明其仍然有足够的膜可形成伪足。 [0188] 前血小板功能如图3D至图3F所示,用活细胞工作站观察脐血来源CD34+细胞分化的巨核细胞形成伪足的能力。通过对巨核细胞实时观测,可以看到当SETD2缺失时,伸出的 伪足更多,更长。通过不同视野的统计,发现SETD2敲低后有更多成熟巨核细胞可以发育为 前血小板(p<0.001)。 [0189] (2)血小板的功能如图3G至图3J所示,脐血CD34+细胞诱导分化体系中巨核细胞产+ + 生的CD61CD62p血小板样颗粒(platelet‑like particles,PLP)被Calcein AM标记,和碎 + + 片进行区分,并通过流式细胞术分析血小板特征分子CD61CD62p。与shSCR对照的巨核细胞 相比,当SETD2敲低时产生的血小板的百分比增加了约2倍(p<0.05;p<0.01)。用凝血酶刺激 血小板,以评估它们为应对凝血释放P‑选择素(CD62p)的能力。SETD2的敲低并没有改变血 小板对激动剂作出反应的能力(p<0.05),因此体外诱导产生血小板的功能是正常的。 [0190] 以上结果表明,SETD2的缺失能够促进巨核细胞正常发育为前血小板以及有凝血功能的血小板。 [0191] 实施例3:SETD2抑制剂能够促进体外干细胞诱导的巨核细胞生成 [0192] 1.实验材料 [0193] 使用与实施例1相同的人脐血CD34+。 [0194] 正常人的iPSCs细胞系BC1:来自美国约翰霍普金斯大学程临钊实验室。BC1细胞系+ 是程临钊实验室自己建立的iPSCs细胞系,来源于正常成人自愿者的骨髓CD34 细胞,通过 episomal质粒转染进行重编程形成的iPSCs细胞系。具体制备步骤亦可参见:Dowey SN, Huang X,Chou BK,Ye Z,Cheng L,Generation of integration‑free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression,Nat Protoc.2012Nov;7(11):2013‑21. [0195] Stem flex培养基、IMDM以及Ham’s F12:均购自ThermoFisher SCIENTIFIC。 [0196] 流式检测所用抗体:购自eBioscience。 [0197] SETD2的抑制剂EZM0414:购自Selleck公司。 [0198] 2.实验方法 [0199] (1)iPSC体系:将BC1细胞系用E8培养基培养,培养条件为37℃,5%的CO2,每3‑4天根据细胞浓度按(1:5)‑(1:10)传代,用0.5mM EDTA,室温孵育2分钟,然后用E8培养基吹打 均匀,传到提前1小时铺Vitronectin(玻璃粘连蛋白)的培养皿上。 [0200] 分化时,采用spin‑embryoid body(spin‑EB)法(Ng ES,Davis R,Stanley EG,Elefanty AG,A protocol describing the use of arecombinant protein‑based, animal product‑free medium(APEL)for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies,Nat Protoc.2008;3(5):768‑76.)。分化第0天(D0),当iPSCs汇 合度达85%以上(汇合度是指所有细胞聚集起来占整个皿底面的百分比),Accutase消化37 ℃3分钟,用SFM培养基(50% IMDM,50% Ham’s F12,以及添加试剂和因子包括:人血白蛋 白,monothioglycerol,Glutamax,Chemically Defined Lipid Concentrate,L‑Ascorbic acid 2‑phosphate sesquimagnesium salt hydrate,ITS‑X)中和吹打,计数,离心。然后用SFM重悬,加入细胞因子10μM ROCK inhibitor(Rho相关蛋白激酶抑制剂),10ng/mL bFGF, 10ng/mL BMP4。细胞种于圆底的96孔板中,每个孔种3000或5000cells/50μL(每孔种3000或 5000个细胞,并且每孔50μL体积)。第2天,每孔加入50μL SFM培养基+10ng/mL bFGF+10ng/ mL BMP4+100ng/mL SCF+20ng/mL VEGF。第5、第8、第11天每孔加入50μL SFM培养基+10ng/ mL bFGF+10ng/mL BMP4+50ng/mL SCF+10ng/mL VEGF。其中,第8天先吸去100μL旧的培养 基,第11天每孔再添加10ng/mL血小板生成素(thrombopoietin,TPO)。 [0201] 第14天(D14),收集类胚体(embryoid body,EB)周围的单细胞(悬浮细胞)。 [0202] 为了探究SETD2抑制剂发挥作用时间和浓度,将BC1细胞系分为4组,分别在诱导分化的2个时间点,按照2个浓度加药,I‑IV组操作进行: [0203] I.在分化第8天加入1μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0204] Ⅱ.在分化第8天加入10μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0205] Ⅲ.在分化第11天加入1μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0206] Ⅳ.在分化第11天加入10μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0207] 收集细胞进行流式检测,操作步骤亦参考前面的实施例1。 [0208] (2)脐血CD34+细胞向巨核细胞分化体系:使用与实施例1相同的CD34+细胞。 [0209] 为了探究SETD2抑制剂发挥作用时间,将CD34+细胞系分为3组,分别在诱导分化的3个时间点I‑Ⅲ组操作进行: [0210] I.在分化第0天加入1μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0211] Ⅱ.在分化第3天加入1μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0212] Ⅲ.在分化第6天加入1μM的EZM0414,对照孔加入DMSO。 [0213] 收集细胞进行流式检测,操作步骤亦参考前面的实施例1。 [0214] 3.实验结果 [0215] 分别如图4A至图4D、图5A至图5B所示。 [0216] (1)如图4A所示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μM SETD2抑制剂EZM0414与对照组相比,使成熟巨核细胞MK生成数量提高; [0217] 如图4B至4D与对照组相比,第十一天加入SETD2抑制剂EZM0414促进巨核祖细胞+ + + + + + MKP(CD34CD41),成熟MK(CD41CD42)和具有产板潜能的成熟巨核细胞MK(CD61CD62p)数 量的增加。 [0218] 分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,在第14天统计不同倍性的百分比。结果显示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μM SETD2抑制剂EZM0414与对 照组相比,使高倍体成熟巨核细胞MK增加。 [0219] 分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,产生MK的细胞亚显微结构图显示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μM SETD2抑制剂EZM0414,利用电镜观察 产生的MK的微观亚显微结构。 [0220] 分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,产生前血小板百分比。结果显示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μM SETD2抑制剂EZM0414,用活细胞工作 站观察分化的巨核细胞形成伪足的能力,并统计形成前血小板的百分比。 [0221] 分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,产生血小板的百分比。结果显示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μM SETD2抑制剂EZM0414,用流式细胞术 检测产生的血小板的百分比。 [0222] 分化不同时间点加入不同浓度SETD2抑制剂后,产生血小板的功能。结果显示,BC1细胞向巨核细胞分化过程中,在第十一天加入1μMSETD2抑制剂EZM0414,检测血小板的功 能。用流式细胞术检测凝血酶thrombin刺激前后血小板表达CD62p的情况。 [0223] (2)图5A显示了脐血CD34+细胞向巨核细胞分化过程的不同天数(第0天,第3天,第6天)加入1μM SETD2抑制剂EZM0414产生不同倍体巨核细胞的情况,在第6天效果最显著,促 进高倍体巨核细胞增加(p<0.05)。 [0224] 如图5B所示,与对照组相比,第6天加入SETD2抑制剂EZM0414促进巨核祖细胞MKP+ + + + + + (CD34 CD41),成熟MK(CD41CD42)和具有产板潜能的成熟巨核细胞MK(CD61CD62p)数量 (p<0.05)。 [0225] 选择最佳的分化第6天加入抑制剂后产生MK的电镜结果,观察细胞内部亚显微结构。结果显示,第6天加入SETD2抑制剂EZM0414与对照组相比,对产生的MK的影响,利用电镜 观察MK的微观亚显微结构。 [0226] 选择最佳的分化第6天加入抑制剂后产生的前血小板百分比。结果显示,第6天加入SETD2抑制剂EZM0414与对照组相比,用活细胞工作站观察分化的巨核细胞形成伪足的能 力,并统计形成前血小板的百分比。 [0227] 选择最佳的分化第6天加入抑制剂后产生的血小板的百分比。结果显示,第6天加入SETD2抑制剂EZM0414与对照组相比,用流式细胞术检测产生的血小板的百分比。 [0228] 选择最佳的分化第6天加入抑制剂后产生的血小板的功能。结果显示,第6天加入SETD2抑制剂EZM0414与对照组相比,产生的血小板的功能。用流式细胞术检测凝血酶 thrombin刺激前后血小板表达CD62p的情况。 |