一种艾叶发酵滤液及其制备方法和应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202410330845.0 | 申请日 | 2024-03-22 | 公开(公告)号 | CN117942291A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 珠海远大美业生物科技有限公司; 广州珍颜堂医药生物科技有限公司; | 发明人 | 严忠星; 郭兵; 汪婷婷; 严加威; 王凤; 黄秋荣; 李建昕; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种 艾 叶 发酵 滤液及其制备方法和应用，属于 化妆品 领域。本发明在 发酵罐 中添加β‑环状糊精，以及添加铵盐、维生素和 氨 基酸等组分作为发酵助剂，能够显著提高发酵效率，使艾叶发酵更彻底，有效成分溶出量更多；并且能够使 酵母 粉在添加量比较少的 基础 上快速繁殖，提高发酵效果；且意外地发现在发酵过程中添加β‑环状糊精得到的艾叶发酵滤液中黄 酮 类成分含量明显提高，使得滤液具有更好的自由基清除和抑菌效果。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种艾叶发酵滤液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： |
||||||
| 说明书全文 | 一种艾叶发酵滤液及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyiLevl. et Vant.)的干燥叶，于每年夏季花未开时采摘，除去杂质，晒干或阴干而得。艾叶为我国传统中药，其味苦、辛、性温，具有温经止血、散寒止痛、祛湿止痒等功效。现代研究表明，艾叶在抗氧化、抗肿瘤、抗菌等领域具有显著的药理活性。艾叶的化学物质多而复杂，主要化学成分包括挥发油、黄酮类、鞣质类、桉叶烷类、多糖类、三萜类及微量元素类等。其中艾叶中研究应用较多的为挥发油成分，含有桉叶油醇、右旋龙脑、左旋樟脑和石竹烯等多种活性成分，具有显著的抗炎和抑菌作用。 [0003] 但是目前针对中草药提取常用的方法有：水提法、醇提法、有机溶剂提取法，或配合超声波提取技术，如中国专利CN111588741A中公开了一种艾叶提取物的制备方法，包括以下步骤，获得脱脂艾叶：将粉碎的艾叶与石油醚按照一定料液比充分浸泡，在超声辅助下提取获得脱脂艾叶；制备艾叶提取浓缩液：将脱脂艾叶与固定浓度的乙醇按照一定料液比充分浸泡，在超声辅助下提取，收集提取液并过滤，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至一定比重；制备非挥发性艾叶提取物：取一定量的浓缩液，按照一定的体积比与水充分混合，将混合液放入高速离心机中离心，离心后收集上清液，将上清液过滤后，进行冷冻，然后放入冻干机中将水分去除，制得艾叶非挥发性提取物。但是在浸提过程中多种的生物活性物质在高温、有机溶剂中易被破坏和分解，生物活性物质难以保存并发挥效用。超声波提取在车间生产过程中要求特定条件及设备进行处理，普适性及设备周转效率差的问题。 [0004] 而相较来说，微生物发酵技术在生产中具有投资少、见效快、环境污染小、活性物质高效表达等显著优点，如中国专利CN108531526B中公开了一种艾叶提取物及其制备方法与应用，制备方法包括如下步骤：(1)取干燥的艾叶粉碎，经杀菌处理后，置于无菌的发酵罐中，然后加入葡萄糖和酵母粉，混合均匀后，将发酵罐密封，于20‑25℃下，自然发酵，20‑25天，得发酵物；(2)将步骤(1)得到的发酵物用丙酮浸泡，过滤，滤液浓缩后，经大孔树脂吸附，用体积分数为60‑70％的乙醇溶液洗脱，收集5‑6倍柱体积洗脱液，再经活性炭脱色、浓缩、干燥得所述艾叶提取物，但是该发明中采用丙酮对发酵物进行浸泡，其试剂残留存在一定风险，在化妆品行业的安全评估中受限，并且该方法得到的艾叶提取物收率比较低。 [0005] 因此，需要开发一种安全指数高，收率高，活性物质表达率高的艾叶发酵滤液制备方法。 发明内容[0006] 基于现有技术中存在的不足，本发明旨在提供一种艾叶发酵滤液及其制备方法，制备过程中采用微生物发酵技术，通过合理选择发酵助剂使得到的艾叶发酵滤液安全指数和活性成分的表达率高，将其用于化妆品中能够具有良好的自由基清除效果及抗氧化活性和抑菌能力。 [0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一方面，本发明提供了一种艾叶发酵滤液制备方法，包括如下步骤： （1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将艾叶干粉中加水，充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物转入发酵罐中，然后加入酵母粉、玉米低聚肽粉和发酵助剂，混合均匀后密封发酵，得到发酵物； （4）将得到的发酵物灭菌、离心，过滤得到的艾叶发酵滤液粗品； （5）艾叶发酵滤液粗品经乙醇溶液浸泡后分离，再经过活性炭的脱色和浓缩，得到所述艾叶发酵滤液。 [0008] 上述步骤（2）中所述艾叶干粉与水的质量体积比为1:4‑6mg/mL；优选为1:5mg/mL。 [0009] 上述步骤（3）中所述的发酵助剂为铵盐、维生素和氨基酸中的一种或几种；其中， 所述的铵盐选自氯化铵、硫酸铵和硫酸氢铵中的一种或几种； 所述的维生素选自叶酸、维生素B1和烟酰胺中的一种或几种； 所述的氨基酸选自精氨酸和/或脯氨酸。 [0010] 优选地，所述的发酵助剂为氯化铵、烟酰胺和精氨酸的混合物；再优选地，所述的发酵助剂质量比1‑2:3:1‑2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸； 进一步优选地，所述的发酵助剂质量比1:3:2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸。 [0011] 本发明在发酵罐中添加铵盐、维生素和氨基酸等组分作为发酵助剂，能够显著提高发酵效率，使艾叶发酵更彻底，有效成分溶出量更多。 [0012] 作为一些优选地实施方案，所述的发酵罐中还添加了β‑环状糊精；本发明在实施过程中意外地发现β‑环状糊精的加入能够使发酵助剂更好的发挥作用从而加快艾叶的发酵过程，促进酵母菌繁殖，使艾叶发酵更彻底；且意外地发现在发酵过程中添加β‑环状糊精得到的艾叶发酵滤液中异泽兰黄素和棕矢车菊素成分含量更高，具有更好的自由基清除效果和抑菌效果。 [0013] 作为一些优选地实施方案，所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.5‑3.5%；优选地，所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.8‑3.2%；再优选地，酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.8‑3.0%；再进一步优选地，酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.8%。 [0014] 本发明在实施过程中意外地发现在发酵罐中加入所述的发酵助剂能够使酵母粉在添加量比较少的基础上快速繁殖，并达到更好的发酵效果。 [0015] 所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量得5‑10%；优选地，所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量的6‑8%；再优选地，所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量的8%。 [0016] 所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.4‑0.8%；优选地，所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.5‑0.7%；再优选地，所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.5%.所述的β‑环状糊精的添加量为艾叶干粉质量的0.1‑0.2%。 [0017] 上述步骤（3）所述的发酵条件为：温度为35‑37℃，时间为3‑5天。 [0018] 上述步骤（5）所述的乙醇溶液的体积分数为60‑95%；优选为85%。所述的艾叶发酵滤液粗品与乙醇溶液的体积比为1:2‑3；优选为1:2。 [0019] 另一方面，本发明还提供了一种由上述方法制备得到的艾叶发酵滤液。 [0020] 再一方面，本发明还提供了艾叶发酵滤液在制备护肤产品或洗发产品中的应用。 [0021] 所述的护肤产品包括但不限于面霜、乳液、精华、乳霜。 [0022] 所述的洗发产品保护但不限于洗发水、护发素。 [0023] 一种护肤产品，包括上述艾叶发酵滤液以及常用的辅料。 [0024] 一种洗发产品，包括上述艾叶发酵滤液以及常用的辅料。 [0025] 与现有技术相比，本申请的有益效果在于：（1）本发明在发酵罐中添加铵盐、维生素和氨基酸等组分作为发酵助剂，尤其是以质量比为1‑2:3:1‑2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸作为发酵助剂，能够显著提高发酵效率，使艾叶发酵更彻底，有效成分溶出量更多；并且能够使酵母粉在添加量比较少的基础上使艾叶中异泽兰黄素和棕矢车菊素成分溶出度明显增加，使得到的发酵产物具有更好的抗炎效果； （2）本发明在实施过程中意外地发现β‑环状糊精的加入能够使发酵助剂更好的发挥作用从而加快艾叶的发酵过程，使艾叶发酵更彻底；且意外地发现在发酵过程中添加β‑环状糊精得到的艾叶发酵滤液中黄酮类成分含量更高，使得到的发酵产物具有更好的抗氧化效果。 [0026] （3）本发明使用乙醇进行纯化分离，回收效率高，绿色环保；使用活性炭的脱色和浓缩，工艺简单成熟，可重复性高，普遍适用性好；使用本方法处理得到的艾叶发酵滤液有效保留了艾叶的生物活性成分，具有良好的自由基清除作用及抗氧化活性能力。 具体实施方式[0027] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同，各种组分均为可通过商业购买形式获得的常规组分。 [0028] 实施例1一种艾叶发酵滤液制备方法，包括如下步骤：（1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将1kg艾叶干粉中加水（质量体积比为1:4kg/L），充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物转入发酵罐中，然后加入酵母粉、玉米低聚肽粉和发酵助剂（质量比1:3:1的氯化铵、烟酰胺和精氨酸），混合均匀后密封发酵，发酵温度为35℃，时间为5天，得到发酵物； （4）将得到的发酵物灭菌、离心，过滤得到的艾叶发酵滤液粗品； （5）艾叶发酵滤液粗品经65%乙醇溶液（体积比为1:2）浸泡后分离，再经过活性炭的脱色后浓缩至固含量为1.5%，得到所述艾叶发酵滤液。 [0029] 所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.5%；所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量得5%；所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.4%。 [0030] 实施例2一种艾叶发酵滤液制备方法，包括如下步骤：（1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将1kg艾叶干粉中加水（质量体积比为1:6kg/L），充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物转入发酵罐中，然后加入酵母粉、玉米低聚肽粉和发酵助剂（质量比2:3:2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸），混合均匀后密封发酵，发酵温度为37℃，时间为3天，得到发酵物； （4）将得到的发酵物灭菌、离心，过滤得到的艾叶发酵滤液粗品； （5）艾叶发酵滤液粗品经95%乙醇溶液（体积比为1:3）浸泡后分离，再经过活性炭的脱色后浓缩至固含量为1.5%，得到所述艾叶发酵滤液。 [0031] 所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的3.5%；所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量得10%；所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.8%。 [0032] 实施例3一种艾叶发酵滤液制备方法，包括如下步骤：（1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将1kg艾叶干粉中加水（质量体积比为1:6kg/L），充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物转入发酵罐中，然后加入酵母粉、玉米低聚肽粉和发酵助剂（发酵助剂质量比1:3:2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸），混合均匀后密封发酵，发酵温度为36℃，时间为5天，得到发酵物； （4）将得到的发酵物灭菌、离心，过滤得到的艾叶发酵滤液粗品； （5）艾叶发酵滤液粗品经85%乙醇溶液（体积比为1:2.5）浸泡后分离，再经过活性炭的脱色后浓缩至固含量为1.5%，得到所述艾叶发酵滤液。 [0033] 所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.8%。所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量的8%；所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.5%。 [0034] 实施例4一种艾叶发酵滤液制备方法，包括如下步骤：（1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将1kg艾叶干粉中加水（质量体积比为1:5kg/L），充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物转入发酵罐中，然后加入酵母粉、玉米低聚肽粉、β‑环状糊精和发酵助剂（发酵助剂质量比1:3:2的氯化铵、烟酰胺和精氨酸），混合均匀后密封发酵，发酵温度为36℃，时间为4天，得到发酵物； （4）将得到的发酵物灭菌、离心，过滤得到的艾叶发酵滤液粗品； （5）艾叶发酵滤液粗品经85%乙醇溶液（体积比为1:2）浸泡后分离，再经过活性炭的脱色后浓缩至固含量为1.5%，得到所述艾叶发酵滤液。 [0035] 所述的酵母粉的用量为艾叶干粉质量的2.8%。所述的玉米低聚肽粉的用量为艾叶干粉质量的8%；所述的发酵助剂的用量为酵母粉质量的0.5%；所述的β‑环状糊精的添加量为艾叶干粉质量的0.15%。 [0036] 实施例5一种艾叶发酵滤液制备方法与实施例4的区别在于：发酵助剂为氯化铵，其他组分与制备方法与实施例4相同。 [0037] 实施例6一种艾叶发酵滤液制备方法与实施例4的区别在于：发酵助剂为精氨酸，其他组分与制备方法与实施例4相同。 [0038] 实施例7一种艾叶发酵滤液制备方法与实施例4的区别在于：发酵助剂为烟酰胺，其他组分与制备方法与实施例4相同。 [0039] 对比例1与实施例4的区别在于：将β‑环状糊精替换为葡萄糖，其他组分与制备方法与实施例4相同。 [0040] 对比例2与实施例4的区别在于：将β‑环状糊精替换为抗性糊精，其他组分与制备方法与实施例4相同。 [0041] 对比例3采用专利CN104152514A中的方法，即： （1）将干燥的艾叶清洗干净晾干后粉碎，得到艾叶干粉； （2）将1kg艾叶干粉中加水，充分混匀，得到待发酵物； （3）将待发酵物放入发酵罐中，将灭菌后的硫酸铵、磷酸二氢铵、碳酸氢铵、玉米浆干粉的水溶液加入所述发酵罐中，所述发酵罐的成分为：按质量百分比计，待发酵物60％、硫酸铵2.1％、磷酸二氢铵0.8％、碳酸氢铵1.3％、玉米浆干粉0.7％，余量为水，发酵罐内含有的物质占发酵罐体积的2/3；密封发酵，发酵温度为36℃，时间为4天，得到发酵产物。 [0042] 效果测试：1、异泽兰黄素和棕矢车菊素含量检测 检测方法： 对照品溶液：分别密称取异泽兰黄素和棕矢车菊素标准品10.012mg、置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容至刻度，制成异泽兰黄素和棕矢车菊素的对照品母液；精密吸取异泽兰黄素和棕矢车菊素的对照品母液1mL，置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容至刻度，制成每1mL含异泽兰黄素和棕矢车菊素0.1mg的溶液，作为对照品溶液。 [0043] 供试品溶液：取实施例1‑7和对比例1‑3得到的艾叶发酵滤液，作为对照品。 [0044] 色谱柱：Kromasil100‑5C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：乙腈‑磷酸二氢钠缓冲溶液（2.72g无水磷酸二氢钠溶于1L纯水，用85%磷酸调节pH至3.0）（30：70，V/V）； 检测波长345nm； 流速1.0mL/min； 柱温30℃； 进样量：10μL。 [0045] 理论塔板数按异泽兰黄素算不低于5000。 [0046] 上述色谱条件下各组分分离度良好，检测结果见下表1。 [0047] 表1 [0048] 根据上表1的检测数据可以看出，实施例1‑7制备的艾叶发酵滤液中异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量较高，均在0.19mg/g、0.11mg/g以上，而实施例4制备的艾叶发酵滤液中异泽兰黄素和的棕矢车菊素含量最高，可以达到0.278mg/g和0.138mg/g；对比例1‑2中将β‑环状糊精替换为葡萄糖或抗性糊精，在一定程度上会影响酵母菌的发酵效果，从而使异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量相较于实施例4明显降低，对比例3采用现有技术公开的方法制备的艾叶发酵滤液中异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量最低。 [0049] 2、刺激性检测2.1实验原理： 鸡胚尿囊膜实验主要分为鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（CAMVA）和鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET‑CAM）。鸡胚尿囊膜具有丰富的血管网络，与眼结膜的结构相似，鸡胚尿囊膜试验是一种灵敏度很高的刺激实验体外代替方法。本实验操作严格按照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2309‑2009》执行，详见此标准。 2.2、实验结果： 实验结果判断选择反应时间法。 [0050] 取实施例1‑7以及对比例1‑3制备的艾叶发酵滤液2g涂抹于绒毛尿囊膜表面，范围约为1.5cm直径，接触30S后用生理盐水轻轻冲洗，然后观察5min内CAM血管变化，并记录出现出血、溶血和凝血的初始时间，根据观察结果应用式(1)计算刺激评分（IS），结果保留小数点后两位： [0051] 式中：sec H（出血时间）‑CAM 膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)； sec L（血管融解时间）‑CAM 膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒(s)； sec C（凝血时间）‑CAM 膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)。 ps：出血：血液从 CAM 膜血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或絮状的弥漫性出血等多种形式。 凝血：血管内和血管外蛋白的变性，表现为血管内血流变慢或血栓形成，血管呈现棕黑色，血管外出现混浊和不透明。 血管融解：CAM 膜上小血管壁破裂，小血管融解消失。 根据计算的IS数值按下表2对受试物眼刺激性进行分类。 [0052] 表2刺激评分法结果评价 [0053] 本发明实施例1‑7以及对比例1‑3制备的艾叶发酵滤液的刺激性检测结果，如下表3所示。 [0054] 2.3、测试结果表3实施例1‑7以及对比例1‑3制备的组合物刺激性评分结果 [0055] 根据上表3的检测数据可以看出，本发明实施例1‑7以及对比例1‑2制备的艾叶发酵滤液检测实验结果显示均为 IS＜1，对比例3中制备的艾叶发酵滤液检测实验结果显示为 1≤IS＜5，均为轻刺激或者无刺激，说明本发明提供的艾叶发酵滤液具有安全性，不会给人体带来不良反应。 [0056] 3、抑菌性检测向实施例1‑7以及对比例1‑3得到的艾叶发酵滤液中分别添加适当体积的原始金 6 黄色葡萄球菌菌悬液和大肠杆菌菌悬液，使其细菌总数均为1×10CFU/mL，同样使用PBS溶 6 液分别将原始菌悬液稀释为1×10 CFU/mL作为空白对照组，于37℃培养3h。随后移取100μＬ上述样品和空白菌悬液于平板涂布，在37℃培养24h，记录菌落数，分别记为A和A0，按式（2）计算抑菌率，检测结果见下表4。 （2） 式中： Y‑抑菌率，％； A0‑空白样品菌落数，CFU/mL； A‑试验样品对应菌落数，CFU/mL。 [0057] 表4 [0058] 根据上表4的检测数据可以看出，本发明实施例1‑7制备的艾叶发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的抑菌效果，抑菌率在75%以上，而对比例1‑3以及艾叶水提物的抑菌率明显降低，这与艾叶发酵液中黄酮类成分的含量有关，因为黄酮类化合物通过影响菌体细胞膜通透性而发挥其抑菌作用。 [0059] 4、抗氧化性测试4.1、ABTS+清除能力的测定 将 ABTS+溶液用磷酸缓冲液（10mmol/L，pH7.4）稀释，使其在734nm波 长下的吸光度为0.700±0.020，即得到ABTS+工作液。 分别取1 mL 2mg/mL的艾叶发酵滤液样品至试管中，加入ABTS+工作液3mL，充分混合均匀，室温避光保存10min，在734nm处测定吸光度磷酸缓冲液为空白对照），每个样品做3个平行样，清除率计算公式如下： [0060] 其中，Ai为1 mL样品溶液+3mL ABTS+ 液的吸光度值；Aj 为 1 mL 样品 溶液+3 mL 磷酸缓冲液的吸光度值；Ac 为1 mL磷酸缓冲液+3 mLABTS+溶液的吸光度值。4.2、羟自由基清除能力的测定 在0.40mL 6mmol/L硫酸亚铁溶液中，加入1mL 8.8mmol/L的过氧化氢溶液， 再加入1mL 9mmol/L水杨酸溶液和1.60mL蒸馏水，混合均匀，37℃下水浴加热 15min（蒸馏水为空白对照），在510nm波长下测定吸光度值Ac。Ai为以2.0mg/mL 的艾叶发酵滤液样品代替 1.60mL 蒸馏水测得的吸光度值，取1 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度值为Aj。Vc溶液作为阳性对照，计算样品对羟自由基的清除率。 [0061] 4.3、超氧阴离子自由基清除能力测定向1.40mLTris‑HCl缓冲溶液（0.05 mol/L，pH 8.2）中加入1mL蒸馏水，再加入 0.2mL5 mmol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀，静置5min 后在320nm波长处测定吸光度值Ac。 Ai为以2mg/mL 的艾叶发酵滤液样品代替1mL蒸馏水测得的吸光度值，取0.2mL10 mmol/L盐酸溶液代替邻苯三酚溶液测定吸光度值为Aj。每个样品做3个平行样，计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。 [0062] 结果如表5所示。表5 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈