[0001] 本发明涉及农业微生物技术领域，具体而言，涉及一种生防促生的米氏假单胞菌及其应用。

[0002] 天麻，兰科天麻属真菌异养型植物，是我国名贵的传统中药材，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，具有较高的药用和经济价值。由于市场需求增加，野生天麻采挖至资源枯竭，目前天麻主要以人工栽培为主。天麻为腐生植物，无根无叶不能进行光合作用，因此在其生长发育过程中，对根际环境具有很强的依赖性。

[0003] 在陕西汉中略阳县，天麻种植过程中采用“三下窝”的方式，包括天麻、蜜环菌、青冈木树棒。天麻依靠蜜环菌从青冈木菌材中吸收营养，因此青冈木的品质对天麻根际环境和生长发育至关重要。随着天麻栽培面积的不断扩大，对菌材的需求也日渐增多。实地调研和当地种植户反应，青冈木菌材滋生的一种白腐类真菌，会严重制约天麻的生长发育，导致产量降低或绝收。甚至在青冈木育棒期滋生了大量的白腐类真菌病害，种植户不得已弃用很多已砍伐的青冈木树棒，造成了巨大的经济和森林资源损失。

[0004] 植物根际有益菌在根际环境中起着防治植物病害和促进植物生长的作用，是目前绿色、可持续农业提倡的病害生物防治的主要应用策略。一些被报道的植物根际促生细菌，能够固氮、增磷和产生植物生长激素的作用，并且通过合成铁载体、抗生素、水解酶、调节乙烯、诱导系统抗性来减少病原体对植物的伤害。考虑到常用的化学杀菌剂易残留和对蜜环菌潜在的伤害性，利用有益微生物防治是最好的选择。

[0005] 因此，筛选具有生防和促生潜力的有益细菌尤为重要。生防菌和促生菌有助于为天麻种植用菌材滋生的白腐类真菌提供绿色可持续的生物防治策略，在天麻种植中具有较好的应用价值和广泛的应用前景。

[0006] 鉴于此，特提出本发明。

[0007] 本发明的目的在于提供一种生防促生的米氏假单胞菌及其应用以解决上述技术问题。

[0008] 本发明是这样实现的：

[0009] 第一方面，本发明提供了一种米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)物种的细菌在防治植物白腐病害中的应用，米氏假单胞菌的保藏号为CGMCC No.27061。

[0010] 发明人从天麻表面和青冈木棒表面的根际土壤中分离筛选获得一株细菌(R10GS1)，经过鉴定，该菌株的16S rDNA近缘序列为Pseudomonas migulae strain CIP105470，相似度达99.25％。因此该菌株R10GS1为米氏假单胞菌。经过实验，该菌株对天麻菌材青冈木滋生的平丝变色卧孔菌(Physisporinus lineatus)LyqgmZhao病害具有较好的抑制效果，在天麻筐载试验中防病率为54.55％。菌株R10GS1为革兰氏阴性菌，能够分泌IAA、溶解无机磷和有机磷，具有潜在的促生作用。因此，R10GS1菌株兼具促生和防病作用，施用后可有效防治天麻种植木白腐病害，降低化学农药的使用量，促进天麻产业绿色发展，具有广阔的应用前景。

[0011] 米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)R10GS1，于2023年04月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27061。鉴定结果为存活，分类命名为Pseudomonas migulae。

[0012] 在本发明应用较佳的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌的16s rRNA与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少96％的同一性。

[0013] 例如具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。SEQ ID NO.1所示的序列为保藏号为CGMCC No.27061的菌的16s rRNA序列。

[0014] 对于微生物而言，菌种是微生物分类的基本单位，由于微生物的种是一个基本分类单元，它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内的其他物种有着明显差异的一大群菌株的总称。同一微生物，会具有该种微生物共有相同或高度类似的表型特征和作用性质；且同一种微生物的不同菌株在作为分类鉴定上，其基因组是高度相似的，其在主要性状上是相同的，功能也是高度类似的。因此，同属于米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)物种的细菌也具有类似的生防效果。

[0015] 在一种可选的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌的16srRNA与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少99％的同一性，例如100％的同一性。

[0016] 在本发明应用较佳的实施方式中，植物白腐病为天麻种植时天麻种植植物上的白腐病。

[0017] 天麻种植植物选自植物的树干、树枝和树叶中的至少一种。在其他实施方式中，天麻种植植物也可以是植物的锯末、植物基质等。

[0018] 在本发明应用较佳的实施方式中，天麻种植植物选自青冈、栎树、槲栎、桦树、水冬瓜、樱桃树、合欢树、化香树、栗树、槐树、杨树、榆树、柳树、桑树和果树中的任一种。

[0019] 樱桃树包括不限于野樱桃，桦树包括不限于白桦树。

[0020] 在一种可选的实施方式中，将米氏假单胞菌物种的细菌对天麻种植植物进行浸泡、将米氏假单胞菌物种的细菌喷施到天麻种植植物上。

[0021] 通过浸泡能够对天麻种植植物的病原菌进行有效防治，本领域的技术人员容易实施：将天麻种植物完全浸没在生防菌液中，或者先对天麻种植物的其中一端或其中一部分进行浸泡，然后对天麻种植物的另外一端或另外一部分进行浸泡。

[0022] 喷施的方式包括不限于：将待喷施菌的菌粉制备菌液，然后进行喷施；或者将菌液与溶剂配伍后，用于喷施。配伍比例根据病害的严重情况进行调整。

[0023] 在一种可选的实施方式中，浸泡时间为10‑120min；浸泡时间为10‑60min；在一种可选的实施方式中，天麻种植植物表面干燥后进行天麻的有性种植或无性种植。

[0024] 浸泡时间例如是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、60min、70min、90min、100min或120min，也可以是选自10‑120min之间的任意一个点值。

[0025] 在一种可选的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌的活菌数为1×106CFU/mL‑18 5
×10CFU/mL。在一种可选的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌的活菌数为1×10CFU/
6 7 8
mL、1×10CFU/mL、1×10CFU/mL或1×10CFU/mL。

[0026] 在本发明应用较佳的实施方式中，天麻种植植物白腐病害是指由平丝变色卧孔菌(Physisporinus lineatus)引起的白腐病。

[0027] 在本发明应用较佳的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌是指：米氏假单胞菌物种的细菌或其培养物。

[0028] 在一种可选的实施方式中，培养物是指米氏假单胞菌物种的细菌的发酵液、发酵上清液、菌泥或发酵液的溶出物。

[0029] 在一种可选的实施方式中，上述米氏假单胞菌物种的细菌包括不限于米氏假单胞菌物种的细菌的浓缩物、糊化物、干燥物、液态物、稀释物和破碎物中的至少一种。干燥物包括不限于喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等。

[0030] 第二方面，本发明还提供了一种米氏假单胞菌物种的细菌在促进天麻生长中的应用，米氏假单胞菌的保藏号为CGMCC No.27061。

[0031] 在一种可选的实施方式中，米氏假单胞菌通过如下至少一种方式促进天麻生长：

[0032] (1)分泌IAA；(2)溶解有机磷；和(3)溶解无机磷。

[0033] 发明人发现，米氏假单胞菌能够分泌IAA、溶解无机磷和有机磷，具有潜在的促生作用。上述促生包括不限于：略微或明显提高天麻的数量，和/或，略微或明显重量(包括不限于单个天麻的重量)。

[0034] 在一种可选的实施方式中，将米氏假单胞菌物种的细菌对天麻种植植物进行浸泡、将米氏假单胞菌物种的细菌喷施到天麻种植植物上。

[0035] 在一种可选的实施方式中，浸泡时间为10‑120min；在一种可选的实施方式中，浸泡时间为10‑60min；在一种可选的实施方式中，天麻种植植物表面干燥后进行天麻的有性种植或无性种植。

[0036] 在一种可选的实施方式中，米氏假单胞菌物种的细菌的活菌数为1×106CFU/mL‑18
×10CFU/mL。

[0037] 第三方面，本发明还提供了一种米氏假单胞菌，其保藏号为CGMCC No.27061。

[0038] 第四方面，本发明还提供了一种菌剂，其包括上述的米氏假单胞菌。

[0039] 在一种可选的实施方式中，菌剂为固体、液体或半固体；

[0040] 在一种可选的实施方式中，菌剂还包括载体和/或辅助材料；

[0041] 在一种可选的实施方式中，载体或辅助材料选自：

[0042] 保护剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、香料、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、分散剂和稀释剂中的至少一种。

[0043] 示例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。

[0044] 第五方面，本发明还提供了一种菌剂的制备方法，将上述的米氏假单胞菌进行活化培养后，在28±0.5℃培养。

[0045] 在一种可选的实施方式中，活化培养是将米氏假单胞菌接种于LB液体培养基中，28±0.5℃培养20‑24h制成种子液。

[0046] 第六方面，本发明还提供了一种组合物，其包括上述的米氏假单胞菌。

[0047] 组合物的形态包括不限于固体、液体或半固体。半固体例如是膏剂等。将该组合物用于天麻种植植物的生物防治和/或促生。

[0048] 本发明具有以下有益效果：

[0049] 本发明从天麻表面和青冈木棒表面的根际土壤中分离筛选获得一株细菌(R10GS1)，经过鉴定，该菌株的16S rDNA近缘序列为Pseudomonas migulae strain CIP105470，相似度达99.25％。因此该菌株R10GS1为米氏假单胞菌。经过实验，该菌株对天麻菌材青冈木滋生的平丝变色卧孔菌(Physisporinus lineatus)LyqgmZhao病害具有较好的抑制效果，在天麻筐载试验中防病率为54.55％。菌株R10GS1为革兰氏阴性菌，能够分泌IAA、溶解无机磷和有机磷，具有潜在的促生作用。因此，R10GS1菌株兼具促生和防病作用，施用后可有效防治天麻种植木白腐病害，降低化学农药的使用量，促进天麻产业绿色发展，具有广阔的应用前景。附图说明

[0050] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0051] 图1为本发明中从天麻根际分离出的米氏假单胞菌R10GS1鉴定图，其中A图为米氏假单胞菌R10GS1在NA培养基上的菌落形态，B图为革兰氏染色结果，C图为电镜图，D图为基于16S rDNA构建的系统发育树；

[0052] 图2为本发明中对青冈木菌材滋生白腐类真菌鉴定图，其中A图为青冈木表面滋生的白腐类真菌形态，B图为平丝变色卧孔菌LyqgmZhao的rDNA‑ITS基因序列系统进化树构建；

[0053] 图3为本发明中米氏假单胞菌R10GS1抑制青冈木菌材白腐类真菌的防治效果图，其中A图为防治白腐病菌的青冈木菌材图，B图为防治作用的发病率和发病程度统计图；

[0054] 图4为米氏假单胞菌R10GS1分泌IAA的实验效果；

[0055] 图5为米氏假单胞菌R10GS1溶解无机磷的实验效果；

[0056] 图6为米氏假单胞菌R10GS1溶解有机磷的实验效果。

[0057] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0058] 除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

[0059] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0060] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例提供了天麻根际细菌的分离与鉴定过程。

[0063] (1)天麻根际细菌的分离。

[0064] 将林下种植的天麻采集，刷取天麻表面和青冈木棒表面的根际土壤。采用稀释平板涂布法对土壤样品中的细菌进行分离纯化，具体操作为：称取5g土壤样品加入45mL无菌水，220r/min在恒温摇床上震荡30min，之后取出静置10min；轻轻吸取上清液，用无菌水配‑2 ‑3 ‑4制10 、10 和10 的梯度稀释液；各取100μL，涂布R2A培养基琼脂(R2A培养基配制：0.5g蛋白胨，0.3g磷酸氢二钾，0.5g水解酪蛋白，0.5g可溶性淀粉，0.5g酵母提取物，0.5g葡萄糖，
0.5g硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，15g琼脂粉，1L蒸馏水，pH＝7.0)平板上，各3个重复；将平板置于30℃培养箱中孵育；2天后取出，统计菌落数量，根据菌落颜色、形态和大小等，挑出不同的单菌落在Luria‑Bertani琼脂(LB培养基配：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母粉，15g琼脂粉，1L蒸馏水)平板上多次划线纯化；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃过夜摇培后，
20％甘油保存于‑80℃。

[0065] (2)米氏假单胞菌菌株R10GS1的菌落形态特征观察。

[0066] 在LB培养基上划线，封口膜封口，置于28℃的培养箱中培养48h后取出培养皿，观察形态、颜色和质地等菌落特征。菌落在LB培养基上呈淡黄色，边缘无锯齿，表面光滑、无褶皱、不透明、微湿，具体如图1A所示。

[0067] (3)米氏假单胞菌R10GS1的革兰氏染色。

[0068] 将培养的米氏假单胞菌R10GS1菌液滴于载玻片中央，涂布呈直径约1cm的薄层液，并固定。在涂片上滴加草酸铵结晶紫染液，染色1min后，水洗。加碘液染色1min后水洗，用吸水纸吸干水分。用95％的乙醇脱色20‑30s后水洗，吸干水分。用蕃红染液染色10s后，用水冲洗。在光学显微镜下镜检，菌体呈红色，米氏假单胞菌R10GS1为革兰氏阴性菌，具体如图1B所示。

[0069] (4)米氏假单胞菌R10GS1的电镜细胞形态特征。

[0070] 将培养的米氏假单胞菌R10GS1菌液5000×g常温下离心8min离心，用PBS缓冲液重悬，收集沉淀细胞，用4℃预冷的PBS缓冲液清洗细胞2次。用300目碳支持膜附着5min，用3％多聚甲醛溶液在22℃固定15min，分别用PBS缓冲液和无菌水洗涤。附有菌液的碳支持膜浮于2％磷钨酸钠水溶液上3‑5min，后用吸水纸吸去多余水。制备好的样品用场透射电子显微镜检测，电压120kV，细胞形态和大小如图1C所示。

[0071] (5)米氏假单胞菌菌株16S rDNA基因序列分析。

[0072] 纯化的菌株在LB平板上30℃过夜培养，采用EZ‑10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取R10GS1的基因组DNA。

[0073] 使用细菌rDNA‑16S基因的通用引物27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’)和1492R(5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)进行扩增。扩增条件为93℃，4min；30个循环：94℃30s，50℃15s，72℃1min；72℃10min，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

[0074] 将PCR产物低温运送至上海生工生物工程有限公司进行Sanger双向测序，利用Seqman软件进行序列拼接，获得的16S rDNA序列列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库中利用BLAST比对，并利用Mega7软件进行Neighbor‑Joining法构建系统发育树，结果如图1D所示，菌株R10GS1的16S rDNA近缘序列为Pseudomonas migulae strain CIP105470，相似度达99.25％。

[0075] 因此该菌株R10GS1为米氏假单胞菌，于2023年04月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏名Pseudomonas migulae R10GS1，为编号为CGMCC No.27061。

[0076] 以下为测序序列拼接结果(如SEQ ID NO.1所示)：

[0077] CTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGTAAAGTATTAAGTTAATGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCCTTTCGAGACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATTCGGGAGCAAGCTCCCGTC。

[0078] 实施例2

[0079] 本实施例对青冈木菌材上滋生的白腐类真菌平丝变色卧孔菌LyqgmZhao的分子生物学鉴定。

[0080] 收集青冈木菌材上滋生的白腐菌丝(如图2A所示)，在研钵中加入液氮研磨，后续采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取基因组DNA。采用ITS1(5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3’)和ITS4(5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’)的通用引物进行ITS基因片段扩增。扩增条件为93℃，4min；30个循环：94℃30s，54℃15s，72℃1min；72℃10min。

[0081] 将PCR扩增产物低温运送至上海生工生物工程有限公司进行Sanger双向测序，采用Seqman拼接序列，获得序列如SEQ ID NO.2所示，在NCBI数据库获取近缘序列，利用Mega7构建系统发育树，如图2B所示。其近缘序列为Physisporinus lineatus voucher Dai 6592，相似度达99.81％。因此该天麻菌材青冈木表面滋生的白腐类真菌LyqgmZhao被鉴定为平丝变色卧孔菌(Physisporinus lineatus)，命名为Physisporinus lineatus LyqgmZhao。

[0082] 以下为测序序列拼接结果(如SEQ ID NO.2所示)：

[0083] CTACCTGATTTGAGGTCAGAAGTCAAATGAATTGTCTTGACGACAGTTTGAAGCATGAATTTATGACACTCAGACACAGTGCAGATAATTATCTCACTGAGCATGAAGTGAACATTCATACTGATACATTTGAGAGGAGCAGGTACCTGCAAGGTTCCAGCAATAGCCTCCAAGTCCAATATCACCAGAGTCTTACAAAAGACCTAGAGAATTGAGAATACCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAAAAATGTGTATTTACACAATAAACATTCTGAACTAATTTATAAGTTTGTAAAAACACAGAGCAGCTGCAAACCAAGTGACACAGGTCACCCAATCTACAAGCTATTCTATGAAAGGTGCACAGAGGTTTGAATGCTTATGAGCAGGCGTGCACTTGCTTTTCAGCCAGCACAACCTGACCCAAT。

[0084] 实施例3

[0085] 本实施例对实施例1分离获得的米氏假单胞菌R10GS1进行平丝变色卧孔菌LyqgmZhao的防治实验。

[0086] (1)制备米氏假单胞菌R10GS1生防菌剂。

[0087] 将生防菌株米氏假单胞菌R10GS1单菌落接种于LB液体培养基中，28℃180rpm摇培24h制成种子液。按1％的量接种于LB液体培养基中，28℃180rpm震荡培养2‑3d，得到活菌数为1×108CFU/mL以上的产物，5000×g/min离心10min收集菌体。应用时用血球计数板在光
6 7
学显微镜下观察计数，用自来水稀释至1×10‑1×10CFU/mL即生防菌剂。

[0088] (2)菌剂对天麻菌材青冈木白腐病的处理。

[0089] 选取表面滋生平丝变色卧孔菌LyqgmZhao青冈木菌材作为实验对象，使得每个青冈木菌材的发病程度一致，且前一年已育棒。用上述步骤(1)制备的R10GS1生防菌剂浸泡30min，之后取出晾30min至表面干燥后，进行天麻有性种植的筐栽试验。

[0090] 每框用青冈木菌材8根，共种植两层，每个处理有3筐重复组。对照组(CK)为在同等条件下用无菌剂的自来水浸泡。

[0091] (3)评价米氏假单胞菌R10GS1菌剂对平丝变色卧孔菌LyqgmZhao的防治效果。

[0092] 在种植有性繁殖期天麻11个月以后将菌棒取出，观察R10GS1菌株处理和对照对青冈木菌材表面白腐病的防治效果。用上述分子生物学技术再次鉴定，验证青冈木表面的白腐类真菌为平丝变色卧孔菌LyqgmZhao。统计每一个青冈木菌材滋生的白腐真菌的发病数量和发病面积，利用发病菌材的数量/菌材的总数量×100％＝发病率(％)和菌材表面滋生白腐菌的面积/菌材总面积×100％＝发病程度(％)的计算公式，定量分析米氏假单胞菌R10GS1对青冈木菌材的白腐真菌的防治效果。

[0093] 表1米氏假单胞菌R10GS1菌剂对筐载天麻菌材青冈木白腐病的防治效果[0094]

[0095] 结果如图3所示，与对照相比，使用米氏假单胞菌R10GS1生防菌剂处理后，观察到天麻菌材青冈木表面滋生的平丝变色卧孔菌LyqmZhao明显减少(见图3A)。发病率与对照的27.5％相比，R10GS1生防菌剂处理的下降到了12.5％，病害抑制率为54.55％；发病程度也从与对照的14.79％相比，R10GS1生防菌剂处理的下降到了3.13％(见表1)。结果表明，米氏假单胞菌R10GS1生防菌剂对天麻菌材青冈木表面滋生的平丝变色卧孔菌LyqgmZhao具有较好的抑制效果，能够有效防治该白腐病害。

[0096] 实施例4

[0097] 本实施例针对实施例1分离获得的米氏假单胞菌R10GS1菌株进行分泌物IAA的定性测定。

[0098] 挑取LB平板上的单菌落R10GS1至2mL的液体LB培养基中，180rpm在30℃的摇床中孵育24小时，进行菌株活化。吸取活化好的R10GS1菌液10μL至含有200mg/L L‑色氨酸的LB液体培养基中，30℃摇床180rpm孵育4天。吸取50μL菌液滴于白色陶瓷板的凹陷内，加入50μL的Salkowski比色液(Salkowski比色液配制：50mL 30％的HClO4，1mL 0.5mol/L的FeCl3)进行显色反应。取50μL含50mg/L的IAA滴入白色陶瓷板，并加入比色液，作为阳性对照。50μL的LB液体培养基加入白色陶瓷板，并加入比色液作为阴性对照。陶瓷板置于暗处30分钟进行显色，如果颜色变红，则表明R10GS1菌株具有产IAA的能力。

[0099] 实施例5

[0100] 本实施例针对米氏假单胞菌R10GS1菌株进行溶无机磷能力的测定。

[0101] 挑取LB平板单菌落R10GS1至LB液体培养基中摇培活化，吸取活化好的菌液10μL滴于无机磷培养基(无机磷培养基配制：10g葡萄糖，0.5g(NH4)2SO4，0.3g MgSO4·7H2O，0.03g MnSO4·4H2O，0.3g KCl，0.03g FeSO4·7H2O，0.3g NaCl，10g Ca3(PO4)2，15g琼脂粉，1L蒸馏水，pH＝7.0)平板表面。30℃静置培养2至4天后，观察并记录菌落周围是否存在透明圈，判定R10GS1菌株是否具有溶无机磷的能力。

[0102] 结果参照图5所示，R10GS1菌株具有良好溶无机磷能力。

[0103] 实施例6

[0104] 本实施例针对米氏假单胞菌R10GS1菌株的溶有机磷能力进行测定。

[0105] 吸取活化后的R10GS2菌液10μL滴于有机磷培养基(有机磷培养基配制：10g葡萄糖，0.5g(NH4)2SO4，0.3g MgSO4·7H2O，0.03g MnSO4·4H2O，0.3g KCl，0.03g FeSO4·7H2O，0.3g NaCl，5.0g CaCO3，0.2g卵磷脂，15g Agar，1L蒸馏水，121℃灭菌20min，p H＝7.0)平板表面，30℃静置培养2至4天后，观察并记录菌落周围是否存在透明圈，判定R10GS1菌株是否具有溶有机磷的能力。

[0106] 结果参照图6所示，R10GS1菌株具有良好溶有机磷能力。

[0107] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。