结合FGFR2B的抗体及其用途 |
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| 申请号 | CN202211299274.6 | 申请日 | 2022-10-21 | 公开(公告)号 | CN117917435A | 公开(公告)日 | 2024-04-23 |
| 申请人 | 北京天广实生物技术股份有限公司; | 发明人 | 李江美; 胡稳奇; 李锋; | ||||
| 摘要 | 本 申请 涉及一种分离的与FGFR2B特异结合的单克隆 抗体 或其 抗原 结合部分。本申请还涉及编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法，以及使用该抗体或其抗原结合部分、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞的 治疗 方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与FGFR2B结合，包含： |
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| 说明书全文 | 结合FGFR2B的抗体及其用途发明领域 背景技术[0002] 成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路，在促分裂(胚胎发生、生长发育等)和非促分裂(神经调节、代谢调节等)等的生物学过程中起着重要作用。FGF与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合，形成亲和FGF受体(FGFR)的复合体，进而与FGFR结合。FGFR包含胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域和胞内酪氨酸激酶结构域，配体依赖的FGFR聚体化会引发酪氨酸的磷酸化(Katoh M.(2008)Int J Oncol.33(2)：233‑7)。 [0003] FGFR2存在两种剪切异构体，FGFR2 IIIB(FGFR2B)和FGFR2 IIIC(FGFR2C)，两者的结构差异在于第三胞外Ig样结构域的一部分由不同外显子编码。FGFR2B主要表达于上皮细胞，为FGF1、FGF3、FGF7、FGF10和FGF22的高亲和受体，而FGFR2C主要表达于间充质细胞，为FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF16、和FGF20的高亲和受体(Ornitz DM et al.，(1996)J Biol Chem 271(25)：15292‑15297；Zhang X et al.，(2006)J Biol Chem 281(23)：15694‑15700)。此外，FGFR2B存在两种亚型，FGFR2Bα和FGFR2Bβ，其中FGFR2Bα包含IgI、IgII和IgIII三个胞外Ig结构域，而FGFR2Bβ只含有IgII和IgIII两个胞外Ig结构域。FGF7‑FGFR2b信号通路在成体的伤口愈合和粘膜修复中发挥作用，FGF10‑FGFR2b信号通路则在胚胎发育中不可或缺。 [0004] 在促分裂通路中，FGFR2的高表达、突变等会导致FGF‑FGFR2信号通路的异常激活，使得促分裂作用不受控制，随之产生肿瘤。例如，FGFR2b可以经由FGFR2基因扩增或FGFR2b转录上调而在癌组织，例如胃癌、鳞状非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肝内胆管癌中高表达。在FGFR2基因扩增中，可能因外显子21的缺失而形成非正常FGFR2b转录子，以非配体依赖性方式磷酸化FRS2，组成性地激活MAPK和PI3K信号通路(Moffa AB et al.，(2004)Mol Cancer Res 2(11)：643‑652)。另外，通常集中在FGFR2的铰链区和第三Ig样结构域、或酪氨酸激酶结构域的错义突变，可能影响配体结合的特异性和/或非配体依赖型的磷酸化，引起FGFR2的癌变激活。例如，S252W等错义突变常发生在子宫癌中。目前，已发现错义突变与乳癌、胃癌、肺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌等存在一定关联(Jang JH et al.，(2001)Cancer Res 61(9)：3541‑3543；Davies H et al.，(2005)Cancer Res 65(17)：7591‑7595；Pollock PM et al.，(2007)Oncogene 26(50)：7158‑7162)。不管何种原因引起的FGF‑FGFR2信号通路的异常激活，都有导致肿瘤细胞的增殖、生存和上皮‑间质转化的可能，是多种肿瘤较差预后的标志。 [0005] 贝马妥珠单抗(Bemarituzumab)，又称FPA144，是由Five Prime研制的FGFR2b单抗。该抗体可以通过抑制FGFR2通路和多种下游促肿瘤信号通路，以及对于FGFR2阳性肿瘤细胞的增强ADCC，延缓癌症的进展(Xiang H et al.，(2021).MAbs 13(1)：1981202)。目前，贝马妥珠单抗正针对FGFR2b过度表达肿瘤，如胃癌和胃食管交界癌，进行测试。在一项全球性、随机、双盲、安慰剂对照的研究中，对于亚美欧等15个国家入组的155例新诊断的FGFR2b+HER2‑晚期胃或胃食管交界癌患者，评估了贝马妥珠单抗联合化疗(mFOLFOX6)用于一线治疗的疗效和安全性。结果显示，与安慰剂组相比，贝马妥珠单抗组患者在无进展生存期(PFS)主要终点、总生存期(OS)和总缓解率(ORR)次要终点上有统计学显著性和临床意义的+ 改善，且治疗获益与FGFR2b肿瘤细胞的百分比呈正相关。 [0006] 然而，贝马妥珠单抗在安全性方面有进一步提升的空间。例如，在上述临床研究中，观察到例如干眼症、角膜炎、点状角膜炎、口腔炎和转氨酶升高等。找到这些副作用的原因，开发新的具有更合适的特性的治疗抗体，对于同类癌症治疗来说非常紧迫和重要。上述更合适的特性包括例如具有差异化的结合亲和力、阻断活性等。 发明内容[0008] 本申请提供一种分离的单克隆抗体，例如，与FGFR2B(例如，人、猴、和/或小鼠FGFR2B)特异结合的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与现有技术抗体例如FPA144相比，具有相当或更高的人、猴、和/或小鼠FGFR2B(包括FGFR2Bα、FGFR2Bβ、FGFR2Bα‑S252W变体)结合亲和力/结合活性、相当或更高的FGFR2B阳性细胞结合力、相当或更佳的引发对于FGFR2B阳性细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、相当或更佳的引发对于FGFR2B阳性细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)、相当或更佳的FGF‑FGFR2B阻断活性、和/或相当或更高的体内抗肿瘤效力。本申请的单克隆抗体或其抗原结合部分还能被FGFR2B阳性细胞内吞。 [0009] 本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括FGFR2B的体外检测、FGFR2B相关疾病如癌症的治疗等。 [0010] 因此，在一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合、或人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与FGFR2B特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、2和3；或(2)SEQ ID NOs：7、8和9具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：4、5和6；或(2)SEQ ID NOs：10、11和12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。 [0011] 本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：1、2、3、4、5和6；或(2)SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。 [0012] 本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ ID NOs：13、15(X1＝M、X2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝T、X6＝V；X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝T、X6＝V；X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝V；X1＝I、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝A)、17或19(X1＝M、M2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝V、X6＝A；X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝V、X6＝A；X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝V、X6＝T；X1＝I、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝A、X6＝T)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。 [0013] 本申请抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ ID NOs：14、16(X1＝I、X2＝F；X1＝N、X2＝Y)、18或20(X1＝L、X2＝F；X1＝W、X2＝Y)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。 [0014] 本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NOs：13和14；(2)SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(3)SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(4)SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝N、X2＝Y)；(5)SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(6)SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝V)和16(X1＝N、X2＝Y)；(7)SEQ ID NOs：15(X1＝I、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝A)和16(X1＝I、X2＝F)；(8)SEQ ID NOs：15(X1＝I、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝A)和16(X1＝N、X2＝Y)；(9)SEQ ID NOs：17和18；(10)SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝L、X2＝F)；(11)SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝L、X2＝F)；(12)SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝W、X2＝Y)；(13)SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝V、X6＝T)和20(X1＝L、X2＝F)；(14)SEQ ID NOs： 19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝V、X6＝T)和20(X1＝W、X2＝Y)；(15)SEQ ID NOs：19(X1＝I、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝A、X6＝T)和20(X1＝L、X2＝F)；或(16)SEQ ID NOs：19(X1＝I、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝A、X6＝T)和20(X1＝W、X2＝Y)具有至少80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。 [0015] 在另一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合、或人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与FGFR2B特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区分别与选定的VH序列的VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3具有同一性，和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有VL CDR1区、VLCDR2区和VLCDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区分别与选定的VL序列的VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区具有同一性；其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列为下面中的一种：(1)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：13和14；(2)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(3)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(4)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝T、X6＝V)和16(X1＝N、X2＝Y)；(5)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝V)和16(X1＝I、X2＝F)；(6)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝M、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝V)和16(X1＝N、X2＝Y)；(7)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝I、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝A)和16(X1＝I、X2＝F)；(8)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：15(X1＝I、X2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝K、X6＝A)和16(X1＝N、X2＝Y)；(9)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：17和18；(10)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝V、X3＝M、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝L、X2＝F)；(11)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝L、X2＝F)；(12)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝R、X5＝V、X6＝A)和20(X1＝W、X2＝Y)；(13)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝V、X6＝T)和20(X1＝L、X2＝F)；(14)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQIDNOs：19(X1＝M、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝V、X6＝T)和20(X1＝W、X2＝Y)；(15)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝I、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝A、X6＝T)和20(X1＝L、X2＝F)；(16)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs：19(X1＝I、M2＝A、X3＝L、X4＝A、X5＝A、X6＝T)和20(X1＝W、X2＝Y)。 [0016] 在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。其中，重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区、或其功能片段如Fc区。进一步地，可以对重链恒定区进行工程化改造，例如改造成具有加强的FcR和/或补体系统蛋白结合力，以加强对于FGFR2B阳性细胞的抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖型细胞毒性(CDC)作用。在一个实施方式中，重链可变区可以是具有SEQ ID NO：21(X＝K或R)氨基酸序列的人IgG1恒定区，其中SEQ ID NO：21(X＝K)的重链恒定区和具有SEQ ID NO：21(X＝R)的重链恒定区都是自然存在的，在功能上没有差别。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如具有SEQ ID NO：22氨基酸序列的人κ恒定区或其功能片段。其中，重链恒定区的N端与重链可变区的C端连接，轻链恒定区的N端与轻链可变区的C端连接。 [0017] 本申请的抗体或其抗原结合部分可以例如在某些哺乳动物细胞系中重组表达，以去岩藻糖化。可表达去岩藻糖化抗体或其抗原结合部分的细胞系包括但不限于，Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系以及共表达β‑1,4‑N‑乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α‑甘露糖苷酶II。 [0018] 本申请的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列和/或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列和/或CDR序列。在一些实施方式中，本申请的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或F(ab′)2片段。 [0019] 本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素或抗癌剂相连接。本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)或基因改造T细胞受体(TCR)的一部分。本申请还提供含有上述CAR和/或TCR的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞等。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。 [0020] 本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、和/或CAR/TCR的核酸分子。在一个实施方式中，本申请表达载体包括一个或多个上述核酸。在又一个实施方式中，本申请表达载体包括两种上述核酸，其分别编码本申请抗体或其抗原结合部分的VH和VL。在另一个实施方式中，本申请涉及一对载体，其中每个载体包括上述核酸中的一种，该成对载体共同编码本申请抗体或其抗原结合部分上的VH和VL。 [0021] 本申请还提供包含上述核酸的表达载体、包含该表达载体或使上述核酸整合入基因组的宿主细胞，以及使用该宿主细胞来制备本申请抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或CAR/TCR的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体、其抗原结合部分、双特异性分子、或CAR/TCR，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体、其抗原结合部分、双特异性分子、或CAR/TCR。 [0022] 本申请还提供一种试剂盒，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、核酸分子、表达载体、或宿主细胞。任选地，该试剂盒还可以包含合适的载体，如合适的溶剂。任选地，该试剂盒还包含使用说明书。该试剂盒可以是检测试剂盒，用于检测样本中FGFR2B的存在或含量。在某些实施方式中，检测试剂盒可以包含用于FGFR2B含量测定的标准品。 [0023] 本申请还提供药物组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。 [0024] 另一方面，本申请提供在受试者中治疗或减缓FGFR2B相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。FGFR2B相关疾病可以为与FGFR2B相关的癌症。癌症可以为实体癌，包括但不限于，胃癌、胃食管交界癌、肺癌(例如非小细胞肺癌，如鳞状非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌(如肝内胆管癌)、子宫癌、和子宫内膜癌。在一些实施方式中，本申请抗体或其抗原结合部分可以与至少一种其他抗癌抗体一起施用，例如PD‑1抗体、PD‑L1抗体等。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL‑2和/或IL‑21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。本申请的抗体可以是例如小鼠源、嵌合、和人源化抗体。 [0025] 本申请还提供一种用于检测样本中FDFR2B的存在或含量的方法，包括将本申请的检测试剂盒应用至该样本。在检测样本中FDFR2B的含量的实施方式中，还可包括使用检测试剂盒中的标准品进行标准曲线制作，以及根据该标准曲线确定样本中FDFR2B的含量。 [0026] 在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。附图说明 [0027] 以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。 [0028] 图1示出嵌合FGFR2B抗体对过表达人FGFR2Bα的细胞CHO/人FGFR2B(A)、过表达猴FGFR2B的细胞CHO/猴FGFR2B(B)、过表达小鼠FGFR2B的细胞CHO/小鼠FGFR2B(C)、和过表达人FGFR2C的细胞CHO/人FGFR2C(D)的结合活性。 [0029] 图2示出人源化FGFR2B抗体对过表达人FGFR2Bα的细胞CHO/人FGFR2B(A、B)、过表达人FGFR2Bβ的细胞CHO/人FGFR‑β2B(C)、过表达人FGFR2Bα突变体的细胞CHO/人FGFR2B‑S252W(D)、过表达猴FGFR2B的细胞CHO/猴FGFR2B(E)、过表达小鼠FGFR2B的细胞CHO/小鼠FGFR2B(F)、FGFR2B阳性肿瘤细胞SNU‑16(G)、KATOIII(H)、和OCUM‑1(I)、以及过表达人FGFR2C的细胞CHO/人FGFR2C(J)的结合活性，其中抗体名称中的“CM”表示嵌合。 [0030] 图3示出去岩藻糖化的人源化FGFR2B抗体引发NK细胞对CHO/人FGFR2B细胞(A)、CHO/人FGFR2C细胞(B)、以及SNU‑16细胞(C)的杀伤的能力。 [0031] 图4示出去岩藻糖化的人源化FGFR2B抗体引发人血清补体对CHO/人FGFR2B细胞(A)和CHO/人FGFR2C细胞(B)的杀伤的能力。 [0032] 图5示出去岩藻糖化的人源化FGFR2B抗体在SNU‑16细胞中的内吞效应。 [0033] 图6示出人源化FGFR2B抗体113F4VH3VL0(A)、113F4VH4VL0(B)、B18B6VH4VL0(C)、B18B6VH4VL2(D)与FPA144的表位结合竞争。 [0034] 图7示出去岩藻糖化的人源化FGFR2B抗体对分别由FGF7(A)和FGF10(B)诱导的FGFR2磷酸化的抑制作用。 [0035] 图8示出去岩藻糖化的人源化FGFR2B抗体在小鼠体内的抗肿瘤效力(A、B)，其中图8(B)是图8(A)的局部放大图。 [0036] 图9示出嵌合FGFR2B抗体对CHO细胞以及过表达FGFR2Bα或FGFR2C的CHO细胞的免疫组化染色结果。 具体实施方式[0037] 为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。 [0038] 术语“FGFR2B”是指成纤维细胞生长因子受体2的IIIb剪切异构体，又称为角质形成细胞生长因子(KGF)受体，包括FGFR2Bα和FGFR2Bβ。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人FGFR2B特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的FGFR2B蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人FGFR2B蛋白特异的抗体可以完全地对人FGFR2B蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的FGFR2B蛋白交叉反应。 [0039] 术语“人FGFR2B”是指具有人氨基酸序列的FGFR2B蛋白，例如具有SEQ ID NO：23(X＝S)的氨基酸序列的FGFR2Bα蛋白、具有SEQ ID NO：23(X＝W)的氨基酸序列的FGFR2Bα蛋白变体、或具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的FGFR2Bβ。术语“猴FGFR2B”是指具有猴氨基酸序列的FGFR2B蛋白，例如具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的FGFR2B。术语“小鼠FGFR2B”是指具有小鼠氨基酸FGFR2B蛋白，例如具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的FGFR2B蛋白。 [0040] 本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体恒定区的“功能片段”是指恒定区中保留有某些所需功能的片段，例如重链恒定区中保留有FcR/补体系统组分结合活性的片段如Fc片段。 [0041] 本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，FGFR2B蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)分离的互补决定区(CDR)；以及(vi)纳米抗体，一种包含单可变结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。 [0042] 本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与FGFR2B蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合FGFR2B蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人FGFR2B蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的FGFR2B蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。 [0043] 术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。 [0044] 术语“小鼠源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“小鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。 [0045] 术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。 [0047] 在本文中，“特异结合人FGFR2B”的抗体是指与人FGFR2B(以及其他非人物种的FGFR2B)结合但是基本不与非FGFR2B蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人‑8FGFR2B蛋白，即KD值为2.0x10 M以下。 [0048] 术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与‑6 ‑5 ‑4其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x10 M以上，更优选1.0x10 M以上，更优选1.0x10 M‑3 ‑2 以上、1.0x10 M以上，更优选1.0x10 M以上。 [0049] 术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。 [0051] 术语“抗体依赖性细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如本申请的FGFR2B抗体，结合的靶细胞裂解。 [0052] 术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与靶细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。 [0053] 术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。 [0054] 术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。 [0055] 本文中提到的“序列同一性”是指在进行序列比对后，一条序列中与参照序列中核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸百分比，如果需要的话，在序列对比中引入空格来达到两条序列间最大的序列一致性百分比。本领域技术人员可以通过多种方法，例如使用计算机软件，来进行两两序列对比或多序列比对，以确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间的序列一致性百分比，此类计算机软件为例如ClustalOmega、T‑coffee、Kalign和MAFFT等。 [0056] 本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。 [0057] 本申请的抗体或其抗原结合部分与FGFR2B(例如，人、猴、和/或小鼠FGFR2B)特异结合。与现有技术抗体例如FPA144相比，本申请的抗体或其抗原结合部分具有相当或更高的人、猴、和/或小鼠FGFR2B(包括FGFR2Bα、FGFR2Bβ、FGFR2Bα‑S252W变体)结合亲和力/结合活性、相当或更好的FGFR2B阳性细胞结合力、相当或更佳的引发对于FGFR2B阳性细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、相当或更佳的引发对于FGFR2B阳性细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)、相当或更佳的FGF‑FGFR2B阻断活性、和/或相当或更高的体内抗肿瘤效力。本申请的单克隆抗体或其抗原结合部分还能被FGFR2B阳性细胞内吞，部分抗体或其抗原结合部分的内吞速率较FPA144高。 [0058] 本申请的示例性抗体或其抗原结合部分是结构和化学特性在以下描述的那些。 [0059] 本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定，且CDR区氨基酸序列的SEQ ID号，连同重/轻链氨基酸序列的SEQ ID号，列于表1中。本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR还可通过Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统而确定。 [0060] 本申请抗体可以具有重链恒定区，例如可以是IgG1恒定区，例如包含如SEQ ID NO：21(X＝K或R)所示氨基酸序列的人IgG1恒定区。恒定区可以经改造为具有增强的FcR和/或补体系统蛋白结合力。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如人κ恒定区，其可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。 [0061] 与人FGFR2B结合的其他FGFR2B抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。 [0062] 因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括： [0063] (a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一FGFR2B抗体的VL，其中该抗体特异结合人FGFR2B。 [0064] 在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括： [0065] (a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一FGFR2B抗体的CDR，其中该抗体特异结合人FGFR2B。 [0066] [0067] 在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括FGFR2B抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人FGFR2B的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一FGFR2B抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。 [0068] 此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252‑260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833‑849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910‑8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161‑2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529‑2533(1995)。 [0069] 在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请FGFR2B抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180‑8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835‑41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864‑26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605‑12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862‑35；Adib‑Conquy et al.，(1998) Int.Immunol.10：341‑6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835‑43。 [0070] 因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中： [0071] (a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或 [0072] (b)重链可变区CDR2包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或 [0073] (c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或 [0074] (d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且 [0075] (e)该抗体特异结合人FGFR2B。 [0076] 本申请的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人、猴FGFR2B的高亲和力和高特异结合性，阻断FGF‑FGFR2B的能力、以及引发对于FGFR2B阳性肿瘤细胞的ADCC和/或CDC的能力。 [0077] 在多个实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合、或人源化的。 [0078] 本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β‑支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。 [0079] 本申请的抗体可以以具备本申请FGFR2B抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。 [0080] 在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体‑抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323‑327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522‑525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029‑10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。 [0081] 因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VLCDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。 [0082] 这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc‑cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776‑798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827‑836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1‑69(NG‑0010109、NT‑‑024637&BC070333)、3‑33(NG‑‑0010109&NT‑‑024637)和3‑7(NG‑‑0010109&NT‑‑024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1‑69(NG‑‑0010109、NT‑‑024637&BC070333)、5‑51(NG‑‑0010109&NT‑‑024637)、4‑34(NG‑‑0010109&NT‑‑024637)、3‑30.3(CAJ556644)和3‑23(AJ406678)。 [0083] 通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.，(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。 [0084] 用于本申请抗体的优选骨架序列是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。 [0085] 另一类的可变区修饰是将VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。 [0086] 此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的FGFR2B单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。 [0087] 本申请的基因改造抗体包括在VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。 [0088] 此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。 [0089] 在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。 [0090] 在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以增加或降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2‑CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc‑铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。 [0091] 在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。 [0092] 此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，包括但不限于，Slc35c1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β‑1,4‑N‑乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α‑甘露糖苷酶II的细胞系。它们可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。Slc35c1基因剔除细胞系例如采用天广实自主研发的岩藻糖敲除平台技术，参见美国专利No.10377833B2中保藏号为CGMCC No.14287的CHO细胞系。 [0093] 本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1‑C10)烷氧基‑或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。 [0094] 本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。 [0095] 例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673‑702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489‑94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099‑109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R‑56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452‑7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697‑706)。糖基化已知发生在含有N‑X‑S/T序列的基序中。在一些情况下，优选FGFR2B抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。 [0096] 在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N‑G或D‑G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。 [0097] 各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6‑9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7‑9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6‑8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选FGFR2B抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。 [0098] 在另一方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。 [0099] 本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。 [0100] 优选的本申请核酸分子包括编码FGFR2B单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。 [0101] 编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。 [0102] 编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。 [0103] 为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423‑426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879‑5883；McCafferty et al.，(1990)Nature 348：552‑554)。 [0104] 本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。 [0105] 本申请的抗体或其抗原结合部分还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。 [0106] 术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β‑珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466‑472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。 [0107] 抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。 [0108] 除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。 [0109] 对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE‑右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。 [0110] 优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β‑1,4‑N‑乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α‑甘露糖苷酶II、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr‑CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216‑4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601‑621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。 [0111] 本申请的抗体或其抗原结合部分可以与治疗剂偶联，形成免疫偶联物，例如抗体‑药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val‑Cit、Ala‑Val、Val‑Ala‑Val、Lys‑Lys、Ala‑Asn‑Val、Val‑Leu‑Lys、Ala‑Ala‑Asn、Cit‑Cit、Val‑Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600、6,989,452、和7,129,261；PCT公开WO02/096910、WO07/038,658、WO07/051,081、WO07/059, 404、WO08/083,312、和WO08/103,693；美国专利公开20060024317、20060004081、和 20060247295中描述般进行制备。 [0112] 另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。 [0113] 双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry,9(6)，635‑644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391‑397(2000)。 [0114] 本申请还提供包含FGFR2B单链抗体scFv的嵌合抗原受体，该scFv包含本申请中所述的重链和轻链CDR、或重链和轻链可变区。 [0115] FGFR2B嵌合抗原受体可以包含(a)含有FGFR2B scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。 [0116] 溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体或其抗原结合部分可以与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本申请抗体或其抗原结合部分的溶瘤病毒可以引入人体中。 [0117] 在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种抗体或其抗原结合部分、抗体或抗原结合部分编码载体、免疫偶联物、免疫细胞、双特异抗体、和/或溶瘤病毒，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、或免疫增强抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、或免疫增强剂。本申请的药学组合物可以与例如另一抗癌剂、或另一免疫增强剂联合使用。 [0118] 药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。 [0119] 优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。 [0120] 药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。 [0121] 与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01‑约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分。 [0122] 给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。 [0123] 对于抗体的施用，剂量可以为约0.001‑100mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案涉及每周施用一次。 [0124] “治疗有效量”的本申请FGFR2B抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。 [0125] 药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯‑醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker,Inc.，New York，1978。 [0126] 药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。 [0127] 在某些实施方式中，本申请的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811、5,374,548、5,416,016、和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269： 9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。 [0128] 本申请的药物组合物具有多种体外和外内应用，例如体外的FGFR2B蛋白的检测、以及体内的癌症治疗。药物组合物可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。 [0129] 考虑到本申请药物组合物的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本申请的药物组合物，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本申请抗体治疗的肿瘤可以是实体瘤，非限制性例子包括，但不限于，胃癌、胃食管交界癌、肺癌(例如非小细胞肺癌，如鳞状非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌(如肝内胆管癌)、子宫癌、和子宫内膜癌，不管是原发还是转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤也可能可以用本申请的药物组合物进行治疗。 [0130] 本申请提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用本申请药物组合物以及一种或多种其他抗体，例如PD‑1抗体、和/或PD‑L1抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本申请提供癌症治疗方法，其中本申请的药物组合物与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。其他可以与本申请药物组合物联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(IL‑2)施用、放疗、手术或激素去除。 [0131] 本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。 [0132] 此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。 [0133] 本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。 [0134] 实施例 [0135] 实施例1.稳定表达人FGFR2B、猴FGFR2B、小鼠FGFR2B、人FGFR2C以及人FGFR2B变体的CHO细胞株的构建 [0136] 使用CHO细胞来构建稳定过表达人FGFR2B、猴FGFR2B、小鼠FGFR2B、人FGFR2C以及人FGFR2B变体的细胞系。 [0137] 简单而言，合成编码人FGFR2Bα、人FGFR2Bβ、猴FGFR2B或小鼠FGFR2B(氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：23(X＝S)、27、24和25所示)、人FGFR2C(氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)以及人FGFR2Bα变体(人FGFR2B‑S252W，氨基酸序列如SEQ ID NOs：23(X＝W)所示)的cDNA序列，并经酶切克隆到pLV‑EGFP(2A)‑Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)的EcoRI和BamHI酶切位点之间。将得到的pLV‑EGFP(2A)‑Puro‑FGFR2B或者pLV‑EGFP(2A)‑Puro‑FGFR2C与psPAX以及pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染CHO细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达上述蛋白的CHO细胞，分别称为CHO/人FGFR2B、CHO/人FGFRβ2B、CHO/猴FGFR2B、CHO/小鼠FGFR2B、CHO/人FGFR2C、和CHO/人FGFR2B‑S252W。转染的CHO细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138‑03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。各种属FGFR2B和变体的表达使用市售可得的FGFR2抗体(Cat#：13042‑1‑AP，Thermo Fisher，美国)通过流式分析仪经FACS分析。 [0138] 实施例2.抗人FGFR2B单克隆抗体的产生 [0139] 小鼠抗人FGFR2B单克隆抗体通过4种不同的免疫方案经常规杂交瘤融合技术获得，具体方案参见表2，不同免疫方案中用的免疫抗原的信息总结在表3中。每次加强免疫后1周，从每只小鼠鼠尾取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人FGFR2B‑a‑his(Cat#： FGR‑HM1BD，恺佧生物，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠FGFR2B的CHO细胞经FACS进行滴度测试。 [0140] 基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，选出血清滴度较高的小鼠用于下一步的杂交瘤细胞系制备。 [0141] 杂交瘤细胞系的制备 [0142] 通过常规的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。 [0143] 在最后一次免疫加强4天后，处死小鼠，取脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(CRL‑1581，ATCC，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG(Cat#：P7181，Sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬于细胞生长培养基(RPMI 1640(Cat#：C22400500CP，Gibco)+10％4 FBS+1XHAT(H0262，Sigma))。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×10 细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO2的潮湿细胞培养箱培养7天。之后，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1X HAT)。2‑3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤细胞。 [0144] 通过ELISA筛选杂交瘤细胞系 [0145] 使用人FGFR2B‑α‑his(Cat#：FGR‑HM1BD，恺佧生物，中国)，通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人FGFR2B全长蛋白结合的杂交瘤克隆。 [0146] 表2.免疫方案 [0147] [0148] 表3.小鼠免疫中用到的抗原 [0149] [0150] 对筛选出的杂交瘤克隆，进一步通过使用人FGFR2C(Cat#：FGR‑HM1BC，恺佧生物，中国)的ELISA，来测试其与人FGFR2C全长结合的能力。 [0151] 经上述ELISA，筛选出5个与FGFR2B结合、但不与FGFR2C结合的杂交瘤细胞系。 [0152] 通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系 [0153] 对筛选出的5个杂交瘤细胞系进一步测试其与CHO细胞上表达的人、猴或小鼠FGFR2B以及人FGFR2C的结合能力，使用实施例1中制备的CHO/人FGFR2B、CHO/猴FGFR2B、CHO/小鼠FGFR2B、和CHO/人FGFR2C细胞。 [0154] 基于上述FACS筛选，得到5个与CHO/人FGFR2B、CHO/猴FGFR2B、CHO/小鼠FGFR2B细胞有高结合力，但不与CHO/人FGFR2C细胞结合的杂交瘤克隆。 [0155] 产生FGFR2B抗体的杂交瘤细胞的亚克隆 [0156] 对上述5个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到5个对人FGFR2B呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。 [0157] 实施例3.FGFR2B单克隆抗体的纯化和分型 [0158] 对实施例2得到的5个克隆的单克隆小鼠源抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(Gibco，美国，Cat#：12045‑076)和1％HT补充液(Gibco，Cat#：11067‑030)。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白‑A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0‑pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。 [0159] 通过使用κ和λ‑小鼠快速分型试剂盒(Thermal，美国，Cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma，美国，Cat#：IS02‑1KT)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。 [0160] 大部分克隆，包括113F4和B18B6，产生IgG1/κ抗体，而少量其他克隆产生IgG2a/κ抗体。 [0161] 实施例4.FGFR2B单克隆抗体与CHO细胞表达的FGFR2B结合 [0162] 为进一步确定FGFR2B抗体是否与CHO细胞表达的人、猴或小鼠FGFR2B以及人FGFR2C结合，分别使用实施例1构建的CHO细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，将100μl5 培养基中的10 个CHO细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的FGFR2B抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC‑山羊抗小鼠IgG(Cat#： 405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。靶向FGFR2B的单克隆抗体FPA144用作阳性对照，其根据专利 WO2015017600A1里的重链序列(所引用专利里的SEQ ID NO：2)和轻链序列(所引用专利里的SEQ ID NO：3)制备。 [0163] 两种代表性抗体的结合力的EC50总结在表4中。数据表明，所有小鼠源FGFR2B单克隆抗体均对人、猴和小鼠FGFR2B表现出高结合力，但不与人FGFR2C结合。 [0164] 表4.FGFR2B抗体与人、猴、小鼠FGFR2B以及人FGFR2C的结合 [0165] [0166] 实施例5.嵌合FGFR2B抗体的表达和纯化 [0167] 选取113F4和B18B6进行进一步的研究。首先通过PCR方法对选定抗体的杂交瘤细胞进行重链/轻链可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(Juste et al.，(2006)，Anal Biochem.349(1)：159‑61)，并测序。序列总结在表1和表10中。通过将编码可变区和人IgG1/κ恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：21(X＝K，用于113F4，X＝R，用于B18B6)和22)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI之间来构建表达嵌合抗体的载体。 [0168] 将上述获得的表达载体PEI转染HEK‑293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK‑TM293F细胞在Free Style 293表达培养基(Cat#：12338‑018，Gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK‑293F细胞在37℃、5％CO2的培养箱中以120RPM转速培养。10‑12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化抗体。 [0169] 实施例6.嵌合FGFR2B抗体与CHO细胞表达的人、猴、小鼠FGFR2B结合 [0170] 根据实施例4的方法步骤，对获得的嵌合抗体检测其与实施例1制备的CHO/人FGFR2B、CHO/猴FGFR2B、CHO/小鼠FGFR2B、以及CHO/人FGFR2C细胞的结合力。结果显示在图1。 [0171] 如图1所示，嵌合抗体对人FGFR2B(图1，A)、猴FGFR2B(图1，B)和小鼠FGFR2B(图1，C)均有高结合力，且不结合人FGFR2C(图1，D)。 [0172] 实施例7.FGFR2B抗体的人源化改造 [0173] 基于上述相关的功能试验，对113F4和B18B6进行人源化改造和进一步研究。小鼠源抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。 [0174] 为选出小鼠源抗体113F4和B18B6的人源化受体框架，将113F4和B18B6的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与113F4和B18B6同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。对于113F4，所选择的重链种系受体序列是人IGHV1‑46*01，所选择的轻链种系受体序列是人IGKV3‑11*01。对于B18B6，所选择的重链种系受体序列是人IGHV1‑46*01，所选择的轻链种系受体序列是人IGKV3‑11*01。 [0175] 对113F4和B18B6的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。 [0176] 基于上述的结构建模，113F4重链鉴定出6个潜在的回复突变(M48I、V68A、M70L、R72A、T74K、V79A)，轻链鉴定出2个潜在的回复突变(12N、F70Y)。B18B6重链鉴定出6个潜在的回复突变(M48I、V68A、M70L、R72A、V79A、A97T)，轻链鉴定出2个潜在的回复突变(L46W、F70Y)。基于这些潜在的回复突变，对抗体框架区进行人源化设计。 [0177] 如表5所示，对于FGFR2B抗体113F4，共设计出示例性的4个人源化重链可变区和2个轻链可变区。 [0178] 表5.设计用于FGFR2B抗体113F4的回复突变 [0179] 重链可变区 重链回复突变 轻链可变区 轻链回复突变VH0 FR区全人源，无回复突变 VL0 FR区全人源，无回复突变 VH2 V68A、M70L VL2 12N、F70Y VH3 V68A、M70L、R72A、T74K VH4 M48I、V68A、M70L、R72A、T74K、V79A [0180] 如表6所示，对于FGFR2B抗体B18B6，共设计出示例性的4个人源化重链可变区和2个轻链可变区。 [0181] 对于113F4，共得到7个人源化抗体。对于B18B6，共得到7个人源化抗体。所有序列信息总结在表1和表10中。 [0182] 表6.设计用于FGFR2B抗体B18B6的回复突变 [0183] [0184] 合成编码人源化重链可变区加人IgG1恒定区的序列、以及编码轻链可变区加人κ恒定区的序列，重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：21(X＝K，用于113F4，X＝R，用于B18B6)和22，并分别利用EcoRI/Xho I和Cla I/HindIII限制性酶切位点克隆到GS表达载体(Invitrogen，美国)中。所有表达构建均经测序证实。用表达载体转染EXPiCHO表达系统(Invitrogen，美国)，并在SLC35c1基因敲除的CHO‑K1‑AF细胞系中瞬时表达上述14个示例性人源化FGFR2B抗体，其中SLC35c1基因敲除的CHO‑K1‑AF细胞由天广实公司构建，具体构建方法参见US10377833B2。由该细胞系表达的蛋白基本上没有岩藻糖化修饰。抗体表达和纯化的方法步骤如实施例5所述。 [0185] 实施例8.人源化FGFR2B抗体与表达人、猴、小鼠FGFR2B、人FGFR2B变体、人FGFR2C的CHO细胞以及FGFR2B阳性肿瘤细胞的结合力测试 [0186] 根据实施例4的方法步骤，对获得的人源化抗体检测其与实施例1制备的CHO/人FGFR2B细胞、CHO/猴FGFR2B细胞、CHO/小鼠FGFR2B细胞、CHO/人FGFR2C细胞、CHO/人FGFRβ2B细胞、以及CHO/人FGFR2B‑S252W细胞的结合，以及与本底表达FGFR2B的肿瘤细胞系SNU‑16细胞、KATOIII细胞、以及OCUM‑1细胞的结合力。结果显示在图2中。 [0187] 如图2所示，嵌合和人源化抗体对人FGFR2Bα(图2，A和B)、人FGFR2Bβ(图2，C)、人FGFR2Bα‑S252W突变体(图2，D)、猴FGFR2B(图2，E)、小鼠FGFR2B(图2，F)、以及SUN‑16(图2，G)均有高结合力，对KATOIII(图2，H)和OCUM‑1(图2，I)有弱结合力，但是不结合人FGFR2C(图2，J)。 [0188] 实施例9.人源化FGFR2B抗体对人、猴和小鼠FGFR2B抗原结合亲和力的鉴定[0189] 通过BIAcoreTM8K(GE Life Sciences，美国)来定量测定人源化FGFR2B抗体对人、猴和小鼠FGFR2B的结合亲和力。 [0190] 具体地，分别将100‑200RU(反应单位)的人FGFR2B(ECD)‑his蛋白(恺佧生物，中国，Cat#：FGR‑HM1BD)、猴FGFR2B(ECD)‑hFc蛋白(ACRO，中国，Cat#：FGB‑C52H6)和小鼠FGFR2B(ECD)‑hFc蛋白(ACRO，中国，Cat#：FGB‑M52H5)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR‑1005‑30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片上的未反应基团。 [0191] 表7.FGFR2B抗体对人FGFR2B的结合亲和力 [0192]抗体 Ka Kd KD 113F4VH3VL0 7.99E+04 3.73E‑04 4.67E‑09 113F4VH4VL0 9.21E+04 4.33E‑04 4.70E‑09 113F4VH3VL2 1.58E+05 1.84E‑03 1.17E‑08 B18B6VH4VL0 1.67E+05 8.73E‑04 5.21E‑09 B18B6VH4VL2 1.38E+05 4.31E‑04 3.13E‑09 B18B6VH3VL0 1.54E+05 8.15E‑04 5.29E‑09 FPA144 7.73E+04 4.28E‑04 5.54E‑09 113F4‑CM 2.44E+05 1.65E‑03 6.75E‑09 B18B6‑CM 1.14E+05 1.57E‑04 1.38E‑09 [0193] 表8.FGFR2B抗体对猴FGFR2B的结合亲和力 [0194] 抗体 Ka Kd KD113F4VH3VL0 1.67E+05 2.55E‑04 1.52E‑09 113F4VH4VL0 2.07E+05 3.72E‑04 1.80E‑09 113F4VH3VL2 3.09E+06 6.81E‑03 2.21E‑09 B18B6VH4VL0 4.27E+05 7.51E‑04 1.76E‑09 B18B6VH4VL2 3.57E+05 3.06E‑04 8.55E‑10 B18B6VH3VL0 4.51E+05 5.26E‑04 1.17E‑09 FPA144 1.53E+05 3.37E‑04 2.20E‑09 113F4‑CM 5.71E+05 1.35E‑03 2.37E‑09 B18B6‑CM 3.23E+05 7.21E‑05 2.24E‑10 [0195] 表9.FGFR2B抗体对小鼠FGFR2B的结合亲和力 [0196] 抗体 Ka Kd KD113F4VH3VL0 3.26E+04 1.72E‑04 5.28E‑09 113F4VH4VL0 3.17E+04 1.10E‑04 3.46E‑09 113F4VH3VL2 3.56E+04 6.88E‑05 1.93E‑09 B18B6VH4VL0 3.96E+04 1.81E‑04 4.58E‑09 B18B6VH4VL2 3.23E+04 8.21E‑05 2.54E‑09 B18B6VH3VL0 3.98E+04 1.77E‑04 4.46E‑09 FPA144 2.53E+04 1.25E‑04 4.96E‑09 113F4‑CM 3.52E+04 8.75E‑05 2.48E‑09 B18B6‑CM 2.66E+04 5.88E‑05 2.21E‑09 [0197] 将梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS‑EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR‑1006‑69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数KD通过kd/ka计算得到。 [0198] 通过BIAcoreTM测量的人源化抗体的结合亲和力显示在表7、8和9中，各人源化抗体对人、猴、小鼠的FGFR2B都有较强的亲和力，且亲和力相当。 [0199] 实施例10.人源化FGFR2B抗体的ADCC活性 [0200] 进一步检测人源化FGFR2B抗体对CHO/人FGFR2B细胞、CHO/人FGFR2C细胞和SNU‑16细胞引发的抗体依赖性细胞毒性效应(ADCC)。简而言之，CHO/人FGFR2B细胞、CHO/人FGFR2C细胞、SNU‑16细胞、和效应细胞NK92MI‑CD16a(Huabo Bio)分别以1200rpm离心5分钟。这些细胞随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Gibco，Cat#：12561‑056；1％FBS，EX‑cell，Cat#：FND500；1％BSA，VETEC，Cat#：V900933‑1KG)，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调5 整CHO/人FGFR2B细胞、CHO/人FGFR2C细胞、和SNU‑16细胞的细胞密度为4×10/ml，NK92MI‑ 6 CD16a的细胞密度调整为2×10 /ml。取靶细胞和效应细胞各50μl到96孔板的各孔中，效靶比是5∶1。将待测抗体稀释，加入各孔，使抗体的工作终浓度呈5倍稀释状态，起始终浓度为 10μg/ml，共12个梯度。样本于37℃孵育4小时，然后每孔加入100μl LDH显色液(细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)，Roche，Cat#：04744926001)。避光常温放置20分钟后，板在MD SpectraMax i3上进行读数。HEL同型对照抗体(LifeTein，LLC，Cat#：LT12031)作为阴性对照，FPA144(经SLC35c1基因敲除的CHO‑K1‑AF细胞表达而去岩藻糖化)作为阳性对照。 [0201] 如图3所示，所有的本申请FGFR2B人源化抗体都能显著地诱导NK92细胞对CHO/人FGFR2B细胞和SNU‑16细胞的杀伤(图3，A和C)，且活性与阳性对照FPA144相当。此外，检测抗体均不能诱导NK92细胞对CHO/人FGFR2C细胞的杀伤(图3，B)，表明这些抗体均对FGFR2B亚型有着选择特异性。 [0202] 实施例11.人源化FGFR2B抗体的CDC活性 [0203] 使用细胞毒性LDH检测试剂盒(Roche，Cat#：04744926001)，检测FGFR2B人源化抗体针对细胞引发补体依赖性细胞毒性(CDC)效应的能力。靶细胞，即CHO/人FGFR2B细胞和CHO/人FGFR2C细胞，于1200rpm离心4分钟，然后用DMEM培养基+1％FBS重悬。将各靶细胞的5 密度调整到3×10细胞/ml，在96孔板的各孔内加入100μl细胞悬液。将抗体稀释，加入检测孔，使其工作终浓度呈5倍稀释状态，初始终浓度为100μg/ml，12个梯度。加入终浓度为5％的正常人血清补体(Qμidel，Cat#：A113)，获得的混合物于37℃孵育2小时。LDH显色液以100μl/孔的浓度添加，之后样品避光常温孵育20分钟。用MD SpectraMax i3读板。FPA144抗体作为阳性对照，HEL抗体作为阴性对照。 [0204] 如图4(A)所示，本申请的所有检测抗体，均能以剂量依赖方式诱导强CDC效应，且活性与阳性对照FPA144相当。此外，所有检测抗体均不能诱导补体对CHO/人FGFR2C细胞的杀伤(图4，B)，显示出这些抗体对于FGFR2B亚型的选择特异性。 [0205] 实施例12.人源化FGFR2B抗体的内吞效应 [0206] 进一步使用SNU‑16细胞来确定本申请的人源化FGFR2B抗体是否能够被内吞入细胞内，FPA144作为阳性对照。 [0207] 将待测的人源化FGFR2B抗体与pHAb标记的山羊抗人IgG1 Fc(Cat#：SSA015，北京义翘神州科技股份有限公司)按浓度比1∶1混匀。在96孔板中加入100μl体系，含20000个SNU‑16细胞，FGFR2B抗体与二抗所形成的复合物的工作浓度为25μg/mL，人IgG1蛋白作为空白对照。混合物放于冰上避光孵育1小时，以预冷的FACS缓冲液(90％DMEM+10％FBS)离心洗涤3次，去上清后，加入100μl预热的完全培养基(RPMI1640培养基(Cat#：12‑115F，Lonza)+10％FBS(Cat#：FND500，Excell)+1％青霉素/链霉素(Cat#：SV30010，Hyclone)，放入37℃、 5％CO2细胞培养箱孵育。24小时后取出细胞培养物，放置于冰上避光保存。待样品全部收集后，1200rmp低温离心3分钟去除上清，加入PBS缓冲液洗脱1次。使用流式细胞仪收集与不同抗体共同孵育后的细胞的各项流式原始数据，基于原始数据，分析并导出不同抗体与细胞表面FGFR2B结合后内吞进细胞中发出的荧光MFI。 [0208] 结果如图5所示，所有抗体均可被SNU‑16细胞内吞，其中113F4VH3VL0被内吞的速率最快。 [0209] 实施例13.抗原表位竞争 [0210] 使用实施例1中构建的CHO/人FGFR2B细胞，通过FACS细胞竞争结合来检测抗体之5 间的抗原结合表位竞争。简单而言，将100μl培养基中的10 个CHO细胞在96孔板上铺板，并加入50μl浓度为1μg/ml的FPA144‑mFC(包含mIgG2a Fc(SEQ ID NO：28)作为重链恒定区)或者HEL‑mFc(mIgG2a)抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，向板中加入稀释的本申请中4种人源化FGFR2B抗体(重链恒定区为hIgG1，SEQ ID NO：21(X＝K，用于 113F4，X＝R，用于B18B6))，抗体的工作终浓度呈5倍梯度，起始终浓度为40μg/ml，12个梯度。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。加入500倍稀释的APC‑山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。 [0211] 实验结果如图6所示，本申请4种检测的人源化FGFR2B抗体，113F4VH3VL0(图6，A)、113F4VH4VL0(图6，B)、B18B6VH4VL0(图6，C)、B18B6VH4VL2(图6，D)，与FPA144均存在抗原表位竞争，表明这些抗体与FPA144结合相同或相似的抗原表位。 [0212] 实施例14.人源化FGFR2B抗体阻断FGF7和FGF10引起的细胞信号通路 [0213] 在SNU‑16肿瘤细胞中检测人源化FGFR2B抗体对其FGFR2信号通路的阻断效果。简5 言之，将SNU‑16细胞的密度调整到2×10细胞/ml，在96孔板的各孔内加入100μl细胞悬液。 去掉培养基上清，将培养基换成RPMI 1640培养基(Gibco，美国，Cat#：61870036)+0.05％牛血清白蛋白(Life Technologies，美国，Cat#：15260037)，37℃、5％CO2的培养条件下孵育4小时。随后向细胞加入不同浓度的抗体，使得抗体的工作浓度呈10倍梯度，即100μg/ml‑0.1μg，4个浓度。继续孵育半个小时后，细胞中加入终浓度100ng/mLFGF7(Peprotech，美国，Cat#：100‑19)或者FGF10(Peprotech，美国，Cat#：100‑26)、以及1μg/mL低分子量肝素(Selleck，美国，Cat#：S1346)，继续培养5分钟后，采用冰冻的RIPA裂解液(碧云天，中国，P0013B)对细胞进行裂解。冰上放置10分钟后，3000g离心，取上清，通过ELISA检测试剂盒(R&D Systems，美国，Cat#：DYC684‑2)检测FGFR2的磷酸化水平。用MD SpectraMax i3读板。 FPA144抗体作为阳性对照。 [0214] 实验结果如图7所示，所有抗体对FGF7引起的FGFR2磷酸化都有显著的抑制作用(图7，A)，其中本申请几个示例性抗体在某些浓度下的抑制作用要强于或显著强于FPA114。此外，所有抗体对FGF10(图7，B)引起的FGFR2磷酸化也有一定的抑制作用。 [0215] 实施例15.人源化FGFR2B抗体有体内抗肿瘤效果 [0216] 对抗体113F4VH3VL0、113F4VH3VL2、B18B6VH3VL0、B18B6VH4VL0和FPA144的体内抗肿瘤效果进行研究，这些抗体均为包含人IgG1/K恒定区(分别如SEQ ID NOs：21(X＝K，用于113F4，X＝R，用于B18B6和FPA144)和22所示)、且采用CHO‑K1‑AF细胞表达的去岩藻糖抗体，并通过向BALB/c裸鼠(GemPharmatech Co.Ltd，中国)植入OCUM‑2M人胃癌细胞系(RRID： CVCL_8383，亦康医药科技有限公司，北京，中国)建立动物模型。 [0217] 小鼠于第0天在侧腹部皮下注射1×107细胞/小鼠。待肿瘤生长至平均肿瘤体积3 40‑60mm时，根据肿瘤体积分为6组，每组10只动物，当天记为PG‑D0。各组小鼠在第0、3、7和 10天分别腹腔注射FPA144、113F4VH3VL0、113F4VH3VL2、B18B6VH3VL0、B18B6VH4VL0、和PBS，剂量均为10mg抗体/kg体重。随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边 2 (D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5×D×d 计算肿瘤体积。在抗体组大部分肿瘤出现消退后停止实验，用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。 [0218] 如图8(A、B)所示，所有FGFR2B抗体均能显著抑制裸鼠中OCUM‑2M肿瘤的生长，且抗体113F4VH3VL0、B18B6VH3VL0和B18B6VH4VL0的体内抗肿瘤效果优于FPA144。 [0219] 实施例16.FGFR2B嵌合抗体的免疫组化染色特异性 [0220] 通过免疫组化的方法检测实施例5中制备的嵌合抗体113F4‑CM和B18B6‑CM与免疫组化样品中FGFR2B的特异性结合。简而言之，将实施例1中的CHO/FGFR2B细胞和CHO/人FGFR2C细胞、以及CHO细胞，加入10％福尔马林，固定1小时，将固定好的细胞于4℃，2000rpm，离心15分钟，去除福尔马林固定液，并按照细胞沉淀与凝胶1∶1的体积比加入TM HISTOGEL 样本加工凝胶(Thermo，美国，Cat#：HG‑4000‑012)。将细胞和凝胶的混合液轻轻涡旋，将混合好的细胞置于冰上冷凝2分钟。将冷凝好的细胞凝胶块取出，用擦镜纸包好，放入包埋盒中，用自动脱水机(HistoCore PEARL，Leica)进行脱水，脱水完成后用石蜡包埋机(EG1150，Leica)将样品包埋成石蜡块。细胞蜡块使用石蜡切片机(HistoCore Mμlticμt，Leica)切片，每张切片的厚度为4μm。通过IHC自动染色机(Leica，型号Bond RX)对切片进行染色，具体步骤参照仪器说明书，采用抗免疫组化试剂盒(Leica，DS9800)进行染色和显色，具体操作参见试剂盒说明书，用到的抗体浓度为0.25μg/ml。所有IHC染色的切片采用Pannoramic SCAN切片扫描仪(3DHistech，Pannoramic SCAN)进行全片扫描。 [0221] 实验结果如图9所示，113F4‑CM和B18B6‑CM均能对CHO/人FGFR2B细胞进行特异性染色，而对CHO/人FGFR2C细胞和CHO细胞没有任何染色，表明这两个抗体都可以作为FGFR2B表达检测的IHC检测抗体使用。 [0222] 本申请的重要序列如下所示。 [0223] 表10.本申请的抗体序列 [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] |
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