[0001] 本发明大体涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种先导编辑系统及其应用。

[0002] 先导编辑器（Prime editor, PE）是最为先进的二代CRISPR/Cas9基因组编辑技术之一，可实现任意类型的单碱基替换以及短DNA片段的插入和删除。典型的先导编辑器由Cas9‑H840A突变体、MMLV逆转录酶以及提供引物和模板的pegRNA组成，其中Cas9负责介导双链DNA的解链和非靶向链的切割，进而诱导结合引物的产生，随后pegRNA中的PBS（Prime binding sequence）与引物结合，并借由逆转录酶的作用引导PCR产物的生成，最后经过真核细胞的DNA修复机制插入目的突变（Anzalone, A. V., et al. (2019). "Search‑and‑replace genome editing without double‑strand breaks or donor DNA." Nature 576(7785): 149‑157.）（图1）。目前PE已经由最初的PE2/3发展至现有的PE6版本，PE3相较于PE2引入了一条引导靶向链切割的gRNA，可促进编辑效率的提升；PE4/5在既往基础上引入了抑制细胞MMR（Mismatch repair）修复的负向调控因子MLH1dn，进一步优化现有PE的编辑效率（Chen, P. J., et al.  (2021). "Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes." Cell 184(22): 5635‑
5652.e5629.）；PE6将MMLV替换至高效率的小体积逆转录酶，并通过Cas9的突变实现PE的再优化（Doman, J. L., et al. (2023). "Phage‑assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors." Cell 186(18): 3983‑
4002.e3926.）。虽然PE的编辑效率已经实现大幅提升，但PE技术仍存在诸多局限性。

[0003] 本发明的第一方面在于提供一种融合蛋白，包含Cas9切口酶，以及逆转录酶，且所述Cas9切口酶仅切割目的DNA的靶向链。

[0004] 本发明的第二方面在于提供一种先导编辑系统，其为组合物或复合物，包含第一方面所述的融合蛋白，以及配合所述融合蛋白实现先导编辑功能的逆向pegRNA；

[0005] 所述逆向pegRNA的引物结合序列与靶向链切口处3’端DNA链的至少部分序列互补，逆转录模板序列基于靶向的gRNA进行设计。

[0006] 本发明的第三方面在于提供一种核酸构建体，其编码第一方面所述的融合蛋白，和第二方面中所提及的逆向pegRNA。

[0007] 本发明的第四方面在于提供一种载体，其包含第三方面所述的核酸构建体。

[0008] 本发明的第五方面在于提供一种递送系统，其包含i) 第二方面所述的先导编辑系统，以及ii）递送媒介物。

[0009] 本发明的第六方面在于提供一种药物组合物，其包含第五方面所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。

[0010] 本发明的第七方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统的以下至少一项应用：

[0011] a) 用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

[0012] b) 用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品；

[0013] c) 通过在蛋白质中引入不同的突变构建文库，以筛选实现蛋白质的定向进化。

[0014] 本发明的第八方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统在制备诱导通用型的用于过继免疫细胞疗法的肿瘤杀伤细胞中的应用。

[0015] 本发明的第七方面在于提供第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的先导编辑系统，或第三方面所述的核酸构建体，或第四方面所述的载体，或第五方面所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。

[0016] 发明人意外的发现，通过替换仅切割目的DNA靶向链的Cas9切口酶，构建得到的逆向先导编辑系统（rPE）能够特异性编辑切口处5’端DNA链的编辑，从而实现了显著降低的脱靶效应，同时进一步降低了潜在的indel副产物比例。附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0018] 图1为现有技术中PE的工作原理示意图；

[0019] 图2为PE和rPE工作原理的比较示意图；

[0020] 图3为rPE在FANCF和VEGFA的编辑效率；

[0021] 图4为rPE2和rPE2‑TR诱导单碱基突变、短DNA片段插入和删除的编辑结果；

[0022] 图5为rPE2和rPE3诱导基因编辑的结果；

[0023] 图6为rPE2和rPE3诱导TRBC、B2M及PDCD1基因编辑的结果；

[0024] 图7为rPE2和PE2诱导脱靶编辑结果比较。

[0025] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0026] 除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

[0027] 术语描述

[0028] 本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

[0029] 本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

[0030] 本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

[0031] 本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。

[0032] 本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

[0033] 如本文所用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指的是线性或支化的、单链或双链或者其杂合体的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂合体。当以合成方式产生crRNA或gRNA时，不太常见的碱基，如肌苷、5‑甲基胞嘧啶、6‑甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于合成。例如，已经证明含有尿苷和胞苷的C‑5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA。还可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架或RNA核糖糖基团中的2'‑羟基的修饰。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中还可互换使用。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以从左至右的5'至3'方向显示，并使用如世界知识产权组织(WIPO)ST.26标准中规定的用于表示核苷酸符号的标准代码来表示。

[0034] 如本文所用的术语“逆转录酶”是指将RNA转化成DNA并且含有影响其活性效率的特定突变的蛋白质或其活性片段，或具有上述活性的突变体。逆转录酶可以包括莫洛尼鼠白血病病毒(M‑MLV)逆转录酶或禽成髓细胞血症病毒(AMV)逆转录酶等。

[0035] 本文所采用的先导编辑系统（本文中也称为逆向先导编辑系统，rPE；与其对应的逆向pegRNA称之为rpegRNA）可基于本领域先导编辑器包括任何现有的（例如PE1 PE6）基础~上进行改进。典型的rpegRNA沿5'到3'方向为依次拼接的gRNA‑模板‑PBS（引物结合序列）；
也可以配合其他gRNA载体组成rPE3系统。

[0036] 如本文所用的“引导核酸”、“指导RNA”、“引导RNA”、“gRNA”、“CRISPR RNA/DNA”、意指一种核酸，其包含至少一个与靶核酸互补(并杂交)的序列。

[0037] 如本文所用的，“靶核酸”、“靶RNA”、“靶区域”或“基因组中的靶区域”指的是生物体基因组中与本发明gRNA中的间隔序列完全互补(100％互补)或基本上互补(例如，至少70％互补(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高，以及其中的任何范围或值))的区域。在一些实施方案中，靶区域长度为至少15个连续核苷酸(例如，长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30个或更多个核苷酸，以及其中的任何范围或值；例如，约19至约25个核苷酸、约20至约
24个核苷酸等)。所述靶RNA可以是任何合适形式的RNA，包括但不限于mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、干扰RNA(siRNA)、核酶、核糖开关、卫星RNA、微开关、微酶(microzyme)或病毒RNA。在一些实施方式中，所述靶核酸与病症或疾病相关。

[0038] 术语“突变”指的是点突变(例如，错义或无义，或者导致移框的单碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列中的一个残基取代为另一个残基，或者是序列中一个或多个残基的缺失或插入时，通常通过确定原始残基，然后是确定残基在序列中的位置，并确定新取代的残基的身份，来描述该突变。

[0039] 如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口上是相同的(即，在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来计算的，确定在两个序列中相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基出现的位置的数量，从而得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100得到序列同一性的百分比。如本文所用，术语“可观同一性(substantial identity)”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中所述多核苷酸或氨基酸包含在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，通常在至少24‑48个核苷酸(8‑16个氨基酸)位置的窗口上，与参考序列相比具有至少85％序列同一性、优选至少90％至95％序列同一性、更通常至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性的百分比是通过将参考序列与可能包括缺失或添加的序列(在比较窗口内总计为参考序列的20％或更少)进行比较来计算。参考序列可以是更大序列的子集。

[0040] 如本文所用，术语“AAV”是指腺相关病毒。术语AAV可用于指病毒本身或其衍生物，例如但不限于病毒衣壳、病毒基因组、病毒颗粒、病毒片段及其组合。术语“AAV”包括所有天然存在和重组形式的亚型及其变体，另有要求除外。天然存在形式的AAV是指任何腺相关病毒或其衍生物，其包含由天然存在的病毒衣壳蛋白组成的病毒衣壳。天然存在的AAV的非限制性实例包括AAV 1型(AAV‑1)、AAV 2型(AAV‑2)、AAV 3型(AAV‑3)、AAV 4型(AAV‑4)、AAV 5型(AAV‑5)、AAV 6型(AAV2‑6)、AAV 7型(AAV1‑7)、AAV 8型(AAV6‑8)、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、rh10中的任一种或多种。此外，AAV的来源可以是禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。“重组AAV”或“rAAV”包括在其病毒基因组中包含异源多核苷酸序列的任何AAV。可用作载体的AAV血清型和变体的其他实例包括但不限于AAVDJ、AAV‑PHP.S、AAV‑PHP.B、AAV‑PHP.eB、AAV‑pan和Anc80中的任一种或多种。

[0041] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

[0042] 发明详述

[0043] 本发明涉及一种融合蛋白，包含Cas9切口酶以及逆转录酶，且所述Cas9切口酶仅切割目的DNA的靶向链。

[0044] 目前PE系统编辑窗口局限于切口处3’端DNA链的编辑，且诱导的脱靶效应也有待优化。

[0045] 在本发明之前，从未有研究尝试改变Cas9蛋白切割位点、结合引物、结合位点实现切口处5’端DNA链的编辑。本发明发明人通过例如将Cas9蛋白切割位点通过蛋白突变（例如：Cas9‑H840A—Cas9‑D10A）实现切割位点的改变；引物结合序列通过对pegRNA的特定设计改变实现；逆转录反应依赖于单链RNA引物竞争性结合双链DNA中的单链DNA发生。然而，由于PE中单链RNA引物结合DNA序列为单链DNA序列，而rPE中单链RNA引物结合DNA序列为双链DNA序列，在原理上rPE的编辑难以实现。

[0046] 本发明意外性地发现单链RNA引物结合序列同样可结合双链DNA中的单链DNA诱导RNA‑DNA的结合，促使逆转录反应，进而诱导最终的基因组突变形成。此外，本发明中，由于切口处5’端DNA链的编辑会直接影响gRNA的结合，从而降低Cas9蛋白切割频率，明显提高基因组编辑的安全性。

[0047] 在一些实施方式中，所述逆转录酶位于所述Cas9切口酶的N端。

[0048] PE系统中逆转录酶常位于所述Cas9蛋白的C端，以实现更高编辑效率。本发明发现在改变Cas9切口酶切割位点的前提下，改变逆转录酶和Cas9切口酶的位置能够进一步提升切割效率。

[0049] 在一些实施方式中，所述Cas9切口酶为D10A。序列优选为SEQ ID NO：1所示。

[0050] 在一些实施方式中，所述逆转录酶为MMLV（序列优选为SEQ ID NO：2所示）或其具有逆转录酶活性的截短体（序列优选为SEQ ID NO：3所示）。

[0051] 在一些实施方式中，所述MMLV具有D200N、L603W、T330P、T306K、W313F突变。

[0052] 融合蛋白中可包含一些惯用的元件，例如一个或多个连接子，或者一个或多个核定位序列。

[0053] 本发明还涉及一种先导编辑系统，其为组合物或复合物，包含如上所述的融合蛋白，以及配合所述融合蛋白实现先导编辑功能的逆向pegRNA；

[0054] 所述逆向pegRNA的引物结合序列与靶向链切口处3’端DNA链的至少部分序列互补，逆转录模板序列基于靶向的gRNA进行设计。

[0055] 本文所采用的先导编辑系统（rPE与rpegRNA）可基于本领域先导编辑器包括任何现有的（例如PE1 PE6）基础上进行改进，具有普适性。~

[0056] 众所周知，存在脱靶效应是目前活性Cas9和单碱基编辑技术面临的重大问题；PE系统相比于传统基因编辑工具本身就具备更高的精度，而本发明中，由于编辑功能的发挥不仅依赖于gRNA与靶向链的特异性结合，同时依赖于逆向pegRNA的引物结合序列与特异性非靶向DNA序列的结合，识别精度相较于PE系统显著增强，从而获得更加优秀的防脱靶效应效果，这对于基因治疗的生物安全性具有重大意义。

[0057] 不仅如此，PE系统目前编辑窗口均局限于切口处3’端DNA链的编辑，gRNA和靶向链的反复结合会提升indel副产物比例。本发明构建的rPE编辑器可特异性编辑切口处5’端DNA链的编辑，且通过rPE发生编辑后，gRNA和靶向链不再发生结合，因此会进一步降低潜在的indel副产物比例。

[0058] 根据本发明的再一方面，还涉及核酸构建体，其编码如上所述的融合蛋白，和如上所提及的逆向pegRNA。

[0059] 在本文描述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体均可以与多种调控元件可操作性相关联，以便在细胞中表达。因此，在一些实施方案中，所述调控元件包含以下元件中的一种或多种：启动子、内含子、增强子、终止子、5'和3'非翻译区、核定位信号(NLS)序列或核输出信号(NES)。且每种的数量可以为一个或多个；优选至少包含启动子。启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而变化，也可以根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体的启动子是本领域众所周知的。基于本领域中存在的已有知识，可以为感兴趣的特定宿主生物体选择合适的启动子。因此，例如，对模式生物（如拟南芥、线虫、酵母、果蝇、小鼠、大鼠等）中高度组成型表达基因上游的启动子了解很多，并且这些知识可以很容易获取并在适当情况下在其他系统中实施。

[0060] 本发明的任何核苷酸序列（包括核酸构建体）都可以进行密码子优化，以便在任何感兴趣的生物体中表达。密码子优化在本领域中是众所周知的，并且涉及使用物种特异性密码子使用表针对密码子使用偏好性对核苷酸序列进行修饰。密码子使用表是基于对感兴趣的生物体/物种的最高表达基因的序列分析而生成的。当核苷酸序列要在细胞核中表达时，密码子使用表是基于对感兴趣物种的高表达核基因的序列分析而生成的。通过将物种特异性密码子使用表与天然多核苷酸序列中存在的密码子进行比较来确定核苷酸序列的修饰。如本领域所理解的那样，核苷酸序列的密码子优化导致核苷酸序列与天然核苷酸序列（或称优化前的核苷酸序列）具有小于100％的序列同一性(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％，以及其中的任何范围或值)，但其仍编码与原始天然核苷酸序列编码的多肽具有相同功能的多肽。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的gRNA、核酸构建体、以及表达特定蛋白（例如腺嘌呤脱氨酶结构域、enIscB核酸酶）的基因是经密码子优化的，用于在感兴趣的特定物种中表达，例如特定植物物种、特定细菌物种、特定动物物种等。

[0061] 本发明还涉及载体，其包含如上所述的核酸构建体。

[0062] 载体可以是组合物，例如其是包含负载不同多核苷酸的病毒或质粒（分别表达碱基编辑器和其他成分，如gRNA）。

[0063] 本文所用的术语“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合的大分子或生物大分子缔合物，其可用于介导多核苷酸向细胞的转移、递送或导入。用于转化宿主生物体的载体在本领域是众所周知的。通用载体类别的非限制性实例包括病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬细菌体、人工染色体、微环载体(minicircle)或者农杆菌属(Agrobacterium)双元载体，呈双链或单链线性或环状形式，它们可能是或可能不是自我传递或移动的。在一些实施方式中，所述的载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体可包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述的载体是AAV载体。在一些实施方案中，核酸构建体或载体可以包含顺式调节元件。这样的顺式调节元件可以包含特定的RNA序列。在一些情况下，顺式调节元件可以调节核酸构建体的RNA丰度、RNA合成、RNA稳定性、RNA降解或RNA定位。这样的顺式调节元件可以包括Malat1、Xist、Neat1或snoRNA序列。Malat1序列可以将多核苷酸定位于细胞核。Malat1、Xist、Neat1或snoRNA序列也可以为多核苷酸提供核滞留信号。

[0064] 以本公开申请中使用的载体为例，AAV是感染人类和一些其他灵长类物种的腺病毒。目前的研究尚未发现腺相关病毒会导致疾病，而且在感染时，已经证明仅会引起轻微免疫反应。腺相关病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞，并可将其基因组并入宿主细胞的基因组。此外，腺相关病毒大多保持游离状态(也就是说，它可以在宿主体内复制，而不会将其有效载荷并入到宿主染色体中)；进行长时间稳定的表达。这些特征使腺相关病毒成为创建用于基因治疗的病毒载体的合适候选物。因此，在一个实例中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在另一个实例中，AAV载体是但不限于AAV 1型(AAV‑1)、AAV 2型(AAV‑2)、AAV 3型(AAV‑3)、AAV 4型(AAV‑4)、AAV 5型(AAV‑5)、AAV 6型(AAV‑6)、AAV 7型(AAV‑7)、AAV 8型(AAV‑8)、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、rh10、AAVDJ、AAV‑PHP.S、AAV‑PHP.B、AAV‑PHP.eB、AAV‑pan和Anc80。AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，WO 2018002719A1的表2列出了可以被指定的AAV血清型转导的示例性细胞类型(通过引用并入本文)。

[0065] 载体滴度通常表示为病毒基因组/ml(vg/ml)。在某些实施方式中，病毒滴度高于19 10 11 11 12 12
×10 、高于5×10 、高于1×10 、高于5×10 、高于1×10 、高于5×10 、或高于1×
13
10 vg/ml。

[0066] 本发明还涉及递送系统，其包含i) 如上所述的先导编辑系统，以及ii）递送媒介物。

[0067] 在一些实施方式中，所述递送媒介物包括一种或多种脂质体、一种或多种外泌体、一种或多种微囊泡、一种或多种树状大分子、一种或多种无机纳米粒子、一种或多种细胞穿膜肽、基因枪、一种或多种质粒、一种或多种病毒载体，以及它们所组成的组。

[0068] 在一些实施方式中，所述病毒载体如上所定义。

[0069] 脂质体可以为阳离子脂质体或中性脂质体，其可通过公知的方法进行制备或修饰，例如加入聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体可以有效防止脂质体载体的聚集并增加其稳定性。脂质体或脂质转染配制品可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法描述于例如WO 2016205764和美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将各个文献通过引用以其全文并入本文。

[0070] 树枝状大分子是一种具有明确的分子结构、可精确控制的化学结构和独特的多价性质的特殊聚合物家族，逐渐成为基因传递的非病毒载体。典型的树枝状大分子例如聚（酰氨基胺）（PAMAM）树枝状聚合物，其可做进一步修饰，例如在PAMAM表面修饰核碱基类似物2‑氨基‑6‑氯嘌呤构建衍生物 AP‑PAMAM，或者通过硫酸软骨素(CS)与PAMAM偶联制备CS‑PAMAM等等。

[0071] 无机纳米粒子可选择金纳米粒子（AuNPs）、磁性纳米粒子、介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）等。

[0072] 细胞穿膜肽(cell‑penetrating peptides，CPPs)是一类具有较强跨膜转运能力的小分子肽，可携带多肽、蛋白质和核酸等多种大分子物质进入细胞。其可以为阳离子型CPPs（如TAT，Penetratin，Polyarginine，P22N，DPV3和DPV6等）、两亲型CPPs（可以由疏水性肽序列和NLSs共价连接而成，或者从天然蛋白质中分离获得，如pVEC，ARF(1‑22)和BPrPr(1‑28)）、疏水型CPPs（一般只含有非极性氨基酸残基，净电荷量约低于氨基酸序列总电荷量的20%）。

[0073] 在一些实施方式中，所述递送经由质粒进行。所述剂量可以是足够数量的质粒以引发响应。在一些情况下，质粒组合物中质粒DNA的合适量可以是从约0.1至约2mg。质粒将通常包括(i)启动子；(ii)编码靶向核酸的碱基编辑器和/或辅助蛋白的序列，每个序列与启动子(例如，相同的启动子或不同的启动子)可操作地连接；(iii)可选择标志物；(iv)复制起点；以及(v)位于(ii)的下游并与其可操作地连接的转录终止子。质粒还可以编码碱基编辑器复合物的RNA组分，但这些组分中的一种或多种可以替代地在不同的载体上编码。施用频率在医学或兽医学从业者(例如，医师、兽医师)或本领域技术人员的范围内。

[0074] 递送可以通过本领域已知的任何一种方式，如转染、脂质转染、电穿孔、基因枪、显微注射、超声、磷酸钙转染、阳离子转染、病毒载体递送等来进行。

[0075] 本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的递送系统以及药学上可接受的赋形剂。

[0076] 本文描述的药物组合物可以包含赋形剂。赋形剂可以包括冷冻防腐剂，诸如DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其任何组合。赋形剂可以包括冷冻防腐剂，诸如蔗糖、海藻糖、淀粉、这些中任一种的盐、这些中任一种的衍生物或其任何组合。赋形剂可以包括pH剂(以最小化组合物的组分的氧化或降解)、稳定剂(以防止组合物的组分的修饰或降解)、缓冲剂(以增强温度稳定性)、增溶剂(以增加蛋白的溶解度)或其任何组合。赋形剂可以包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。赋形剂可以包括碳酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、聚乙二醇(PEG)、人类血清白蛋白(HSA)、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚山梨醇酯80、磷酸钠、蔗糖、磷酸氢二钠、甘露醇、聚山梨醇酯20、组氨酸、柠檬酸盐、白蛋白、氢氧化钠、甘氨酸、柠檬酸钠、海藻糖、精氨酸、乙酸钠、乙酸、HCl、依地酸二钠、卵磷脂、甘油、黄原胶、大豆异黄酮、聚山梨醇酯80、乙醇、水、替普瑞酮或其任何组合。

[0077] 根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的融合蛋白，或如上所述的先导编辑系统，或如上所述的核酸构建体，或如上所述的载体，或如上所述的递送系统的以下至少一项应用：

[0078] a) 用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

[0079] b) 用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品；

[0080] c) 通过在蛋白质中引入不同的突变构建文库，以筛选实现蛋白质的定向进化。

[0081] 根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的融合蛋白，或如上所述的先导编辑系统，或如上所述的核酸构建体，或如上所述的载体，或如上所述的递送系统在制备诱导通用型的用于过继免疫细胞疗法的肿瘤杀伤细胞中的应用。

[0082] 在一些实施方式中，所述过继免疫细胞疗法为NK疗法、LAK疗法、DC疗法、CIK疗法、TIL疗法、DC‑CIK疗法、CAR‑T疗法、TCR‑T疗法、CAR‑NK疗法或TCR‑NK疗法。

[0083] 在一些实施方式中，所述肿瘤杀伤细胞选自CAR‑T、TCR‑T。

[0084] 根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的融合蛋白，或如上所述的先导编辑系统，或如上述的核酸构建体，或如上所述的载体，或如上所述的递送系统在制备用于治疗基因变异所引起的疾病的药物中的应用；其中所述疾病由包含一个或多个单碱基突变的变异所引起，或者可通过敲减或敲除某个基因得到治疗。

[0085] 在一些实施方式中，所述疾病是肿瘤；所述肿瘤可以是癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型肿瘤。可以通过本文描述的方法和组合物治疗的肿瘤的非限制性实例包括来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌、或子宫。此外，所述癌症可以特别地属于以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病性腺癌；实体癌；恶性类癌肿瘤；细支气管‑肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化型癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；
乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；和恶性成纤维细胞瘤；支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂质肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；
骨旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；
副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓性肉瘤；浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌和毛细胞白血病。

[0086] 在一些实施方式中，所述疾病为孤儿病。

[0087] 在一些实施方式中，所述疾病进一步选自如下疾病中的一种或多种：

[0088] 戈谢氏病、法布雷病、庞贝病、黏多醣症、苯酮尿症、地中海贫血、成骨不全症、高血氨症、有机酸血症、威尔森氏症。

[0089] 本发明还涉及一种治疗疾病的方法，包括将有效量的先导编辑系统引入细胞以切割靶核酸的步骤。

[0090] 所述先导编辑系统如上文中所描述。

[0091] 所述疾病如上文中所描述。

[0092] 所述先导编辑系统优选通过如上文中所描述的核酸构建体、载体、递送系统或药物组合物的形式进行给药。

[0093] 在某些实施方式中，所述细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞，优选灵长类动物细胞，更优选包括人细胞(原代人细胞或已建立的人细胞系)，更优选是在体细胞。

[0094] 本发明可以通过任何已知的给药方法施用有效量的药物给受试者，以使得所述分子系统进入受试者的细胞。例如，从口服、皮粘膜给药（如表面、舌下、鼻腔内和直肠），非肠道给药（如，经皮下注射、肌内注射、关节内注射、静脉注射、腹腔注射、动脉注射）及吸入法给药等中进行适当地选择。因此，具体的给药方式包括，但不限于例如口服、经皮、粘膜、舌下、肌内、静脉、腹膜内、皮下给药及局部用药。

[0095] 给药可以经由单剂量或多剂量进行。本领域技术人员应理解，本文待递送的实际剂量可取决于多种因素而大幅变化，如载体选择、靶细胞、生物、组织、待治疗受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、施用途径、施用模式、所寻求的转化/修饰的类型等。

[0096] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

[0097] 下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

[0098] 实施例1 rPE的构建和验证

[0099] 本实施例中，构建了基于Cas9‑D10A（SEQ ID NO：1所示）及 MMLV（SEQ ID NO：2所示）的逆向先导编辑器（Reverse prime editor, rPE）（图2），随后设计了对应的rpegRNA（Reverse pegRNA），其中引物结合序列不同于PE和gRNA非靶向链的结合，rpegRNA中引物结合序列将基于靶向链切口处3’端DNA链进行设计，而对应的模板序列将基于靶向的N20序列进行设计。

[0100] 我们通过Gibson克隆方法对Cas9‑D10A和逆转录酶及其突变体的排列组合，构建了不同于PE框架的新型rPE系统，其中PE2‑D10A相较于PE2替换了Cas9‑H840A为Cas9‑D10A；rPE2将MMLV蛋白移至编辑器系统的氨基端，linker序列不变（PE2中的linker蛋白）；由于既往研究显示PE系统中MMLV截断体（SEQ ID NO：3所示）展现出高于全长MMLV的活性，我们还构建了rPE2‑TR，拟进一步提升rPE2系统的活性（图3中A图）。

[0101] 图3中A图中各蛋白的融合方式如下：

[0102] PE2:NLS1‑Cas9‑H840A‑Linker1‑MMLV‑Linker 2‑NLS2；

[0103] PE2‑D10A：NLS1‑Cas9‑D10A‑Linker1‑MMLV‑Linker 2‑NLS2；

[0104] rPE2：NLS1‑ MMLV‑Linker1‑Cas9‑D10A‑Linker 2‑NLS2；

[0105] rPE2‑TR：NLS1‑ MMLV TR‑Linker1‑Cas9‑D10A ‑ Linker 2‑NLS2。

[0106] 其中Cas9‑H840A如Anzalone, A. V., et al, Nature, 2019.中所描述；

[0107] NLS1、NLS2、Linker1、Linker 2的序列依次如SEQ ID NO：4‑7所示。

[0108] 随后我们将rpegRNA和不同构象的编辑系统质粒转染至HEK293T细胞中（编辑器：rpegRNA=2：1），于转染后24 h替换为含有嘌呤霉素的筛选培养基（1:2000），筛选后96 h收集细胞沉淀，裂解细胞进行PCR，并检测对应序列的编辑结果。我们的研究结果显示在FANCF和VEGFA两个位点，构建的四个编辑系统均可诱导切口处5’端DNA链的编辑，其中rPE2编辑效率最高，相较于PE2，差异具有显著统计学意义（P<0.0001）（图3中B图）。

[0109] 实施例2 rPE2/3在哺乳动物细胞中的鉴定

[0110] 为进一步验证rPE编辑器的编辑功能和效率，我们在HEK293T细胞中进行了多个基因组位点的编辑，随后我们将rpegRNA和rPE2及rPE2‑TR质粒转染至HEK293T细胞中（编辑器：rpegRNA=2：1），于转染后24 h替换为含有嘌呤霉素的筛选培养基（1:2000），筛选后96 h收集细胞沉淀，裂解细胞进行PCR，并检测对应序列的编辑结果。结果显示，rPE2和rPE2‑TR可显著诱导切口处5’端DNA链的任意碱基替换、短DNA片段的插入和删除（图4），显示rPE系统的应用具有普适性。此外，为提升rPE2的编辑效率，我们引入了一条辅助切割非靶向链的gRNA（编辑器：rpegRNA：gRNA=6：3：1），结果显示，rPE3可显著提升编辑效果（图5）。

[0111] 实施例3 rPE在诱导通用型CAR‑T的应用

[0112] 为证实rPE的应用潜力，我们分别在HEK293T细胞中对诱导通用型CAR‑T细胞的关键靶基因TRBC、B2M、PDCD1进行无义突变编辑，我们将设计好的rpegRNA和rPE2、rPE编辑系统质粒转染至HEK293T细胞中（编辑器：rpegRNA：gRNA=6：3：1），于转染后24 h替换为含有嘌呤霉素的筛选培养基（1:2000），筛选后96 h收集细胞沉淀，裂解细胞进行PCR，并检测对应序列的编辑结果。结果显示rPE2和rPE3可高效诱导相关基因的无义突变编辑，rPE3编辑效率更高，提升rPE2编辑效果至约1.5倍（图6）。

[0113] 实施例4 rPE和PE的脱靶分析比较

[0114] 我们选择HEK4这一位点进行脱靶编辑的比较，针对该位点共设计两对PE和rPE诱导的编辑器和靶向gRNA组合，结果显示，PE可诱导HEK4脱靶位点的显著编辑，但rPE再脱靶位点的编辑显著降低（图7）。随后，我们将设计好的pegRNA/rpegRNA以及PE2/rPE2编辑系统质粒转染至HEK293T细胞中（编辑器：rpegRNA =2：1），于转染后24 h替换为含有嘌呤霉素的筛选培养基（1:2000），筛选后96 h收集细胞沉淀，裂解细胞进行PCR，并检测对应序列的编辑结果。结果显示，相较于PE2，rPE2诱导的脱靶效应显著降低，脱靶位点的编辑效率均小于0.01%（图7）。

[0115] 本发明实施例中所涉及的rpgeRNA的序列如表1所示。rpgeRNA（适用于rPE2）的构成为沿5'到3'方向依次拼接的gRNA‑模板‑PBS引物结合序列；对于rPE3系统，则为rPE2 rpgeRNA的基础上配合rPE3‑gRNA使用。

[0116] 表1

[0117] gRNA 引物结合序列 模板 rPE3‑gRNAVEGFA_‑4CAG‑GGT SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：10 NA
FANCF_‑3AGC‑TAG SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13 NA
VEGFA_‑2G‑T SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16 NA
EMX1‑6_‑4_‑8deletion SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19 NA
RP11‑2_‑4ggg_insertion SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 SEQ ID NO：22 NA
RNF2‑3_‑2GA‑CT SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：26UBE3A_‑2A‑T SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：29 SEQ ID NO：30
EMX1‑5_‑3TAA‑GGG SEQ ID NO：31 SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：33 NA
HEK4_+6G‑T SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：35 SEQ ID NO：36 NA
HEK4_‑3AGG‑TTT SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：39 NA
HEK4_+2GG‑TT SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 NA
HEK4_‑2GG‑AA SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 NA
B2M_‑7CT‑AG SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：48 SEQ ID NO：49
PDCD1_‑1C‑T SEQ ID NO：50 SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：53
TRBC1_‑7GG‑AA SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：56 SEQ ID NO：57

[0118] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。