一种具有抗菌活性的花椒重油组份及其应用 |
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| 申请号 | CN202311688400.1 | 申请日 | 2023-12-11 | 公开(公告)号 | CN117778102A | 公开(公告)日 | 2024-03-29 |
| 申请人 | 宁夏医科大学; | 发明人 | 王汉卿; 李刚; 刘皓天; 卢有媛; 陈亮; 孔祥凤; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种具有抗菌活性的花椒重油组份及其制备方法，本发明对花椒精油进行深入研究，通过分子蒸馏仪将花椒原精油分离成花椒轻油组份和花椒重油组份。通过抗细菌和抗 真菌 实验结果表明，由蒸馏精制得到的花椒重油组份相比花椒原精油和花椒轻油组份，对 肺 炎克雷伯菌、耐甲 氧 西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、纹带棒状杆菌具有更好的杀菌活性，并且对热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌等真菌具有更好的杀菌活性，取得了很好的技术效果。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种具有抗菌活性的花椒重油组份，其特征在于，它是由下列方法制备得到的： |
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| 说明书全文 | 一种具有抗菌活性的花椒重油组份及其应用技术领域[0001] 本发明属于中医药技术领域，具体地说，本发明涉及具有抗菌活性的花椒重油组份及其制备方法与应用。 背景技术[0002] 花椒，别名：炒花椒、川花椒、川椒。性味：味辛，性热。归胃、脾、肾经。中药药典记载花椒温中、散寒、除湿、止痛、止痒、杀虫，解毒。花椒主含挥发油，油中含柠檬烯、桉叶素、月桂烯、香桧烯、芳樟醇等。此外并含有植物甾醇及不饱和有机酸等多种化合物。 [0003] 花椒有多种功效： [0004] 1.花椒有抑制血小板聚集、抗凝血作用，花椒根液剂具有血栓形成活性，可用作血友病的止血剂。 [0005] 2.花椒有降压和保护应激性心肌损伤的作用。 [0006] 3.花椒油能抑制气管平滑肌收缩，有一定的平喘作用。 [0007] 4.花椒有抗溃疡、保肝、抗炎和抗功能性腹泻及纠正胃肠道功能紊乱的作用。 [0009] 6.花椒有抗癌活性及致突变作用。 [0011] 现代研究，花椒有抗实验性胃溃疡作用；对肠平滑肌有双向调节作用；花椒水提取物有保肝作用；本品还有局部麻醉止痛作用；有抗血小板聚集及实验性脑血栓形成的作用；具有调节胃肠运动、抗溃疡、抗炎、镇痛、抗菌等作用。 [0012] 中国专利202210945055.4公开了一种基于花椒果提取物的仿生抗菌抗氧化纳米粒子及其制备方法和用途、202310047866.7公开了一种抗菌精油的制备方法等。目前，对于花椒挥发油的研究报道，主要侧重于其提取方法、化学成分构成以及药理活性，对于花椒挥发油中的重油和轻油的分离纯化及其活性筛选还没有深入研究报道。本发明对花椒挥发油进行深入研究，筛选出制备花椒重油的最佳工艺，并对其进行抗细菌和抗真菌实验筛选，筛选出抗菌谱广、抗菌效果好的花椒重油组份。 发明内容[0013] 发明目的：本发明的目的是通过大量实验筛选出制备花椒重油的最佳工艺，并对其进行抗细菌和抗真菌活性实验筛选，开发出抗菌谱广、抗菌效果好的花椒重油组份及其新应用。 [0014] 技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为： [0015] 一种具有抗菌活性的花椒重油组份，它是由下列方法制备得到的： [0016] (1)花椒精油的提取： [0017] 取一定量的花椒药材粉末，加水浸泡，然后水蒸气蒸馏提取，离心，收集精油，避光低温保存； [0018] (2)花椒精油精制：将步骤(1)花椒精油装入分子蒸馏仪的进料瓶中，冷阱中装入液氮，打开制冷装置，回流水冷却，调整刮膜转速，设置一定的蒸馏温度和蒸馏压力，收集花椒重油组份和重油组份。 [0019] 作为优选方案，以上所述的一种具有抗菌活性的花椒重油组份，它是由下列方法制备得到的： [0020] (1)花椒精油的提取： [0021] 取一定量的花椒药材粉末，加8～12倍量水，浸泡0.5～1h，然后水蒸气蒸馏提取1～6h，离心，收集精油，避光4℃保存； [0022] (2)花椒精油精制：花椒精油装入分子蒸馏仪的进料瓶中，冷阱中装入液氮，打开制冷装置，回流水装置温度设定为5～10℃，刮膜转速200～240r/min，物料流量1～2mL/min，蒸馏温度50℃～70℃和蒸馏压力60Pa～100Pa，收集花椒轻油组份和重油组份。 [0023] 作为优选方案，以上所述的一种具有抗菌活性的花椒重油组份，它是由下列方法制备得到的： [0024] (1)花椒精油的提取：取花椒药材粉末一定量，加12倍量水，浸泡1h，水蒸气蒸馏提取6h，离心，收集精油，避光4℃保存； [0025] (2)花椒精油精制：花椒精油装入分子蒸馏仪的进料瓶中，冷阱中装入液氮，打开制冷装置，回流水装置温度设定为5℃，刮膜转速240r/min，物料流量1mL/min，蒸馏温度80℃和蒸馏压力80Pa，收集花椒重油组份。 [0026] 本发明经过实验筛选，发现制备得到的花椒重油组份在制备抗菌活性的药物中的应用，特别是在制备抗细菌和抗真菌活性的药物中的应用。 [0027] 作为进一步优选方案，所述的细菌包括肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、纹带棒状杆菌。所述的真菌包括热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌。 [0028] 本发明可将花椒重油组份与药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、合剂、口服液或注射剂。 [0029] 有益效果：本发明与现有技术相比，存在以下优点： [0030] 本发明对花椒精油进行深入研究，通过分子蒸馏仪将花椒原精油分离成花椒轻油组份和花椒重油组份。研究发现，花椒精油中的花椒重油相比花椒轻油和原精油不但有更好的抗细菌和抗真菌的活性，而且抗菌谱更广。经过分子蒸馏后，保留重油组份，不但服用量少，且效果更好，取得了很好的预料不到的技术效果。附图说明 [0031] 图1是不同蒸馏温度和蒸馏压力对花椒重油组份的提取筛选结果图。 [0032] 图2是花椒精油组份对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的MIC图。 [0033] 图3是花椒轻油组份对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的MIC图。 [0034] 图4是花椒重油组份对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的MIC图。 [0035] 图5是花椒精油组份对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的MIC图。 [0036] 图6是花椒轻油组份对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的MIC图。 [0037] 图7是花椒重油组份对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的MIC图。 [0038] 图8是花椒精油组份对鲍曼不动杆菌的MIC图。 [0039] 图9是花椒轻油组份对鲍曼不动杆菌的MIC图。 [0040] 图10是花椒重油组份对鲍曼不动杆菌的MIC图。 [0041] 图11是花椒精油组份对纹带棒状杆菌的MIC图。 [0042] 图12是花椒重油组份对纹带棒状杆菌的MIC图。 [0043] 图13是花椒精油组份对光滑念珠菌、白色念珠菌的MIC图。 [0044] 图14是花椒轻油组份对光滑念珠菌、白色念珠菌的MIC图。 [0045] 图15是花椒重油组份对光滑念珠菌、白色念珠菌的MIC图。 [0046] 图16是花椒精油组份对热带念珠菌、克柔念珠菌的MIC图。 [0047] 图17是花椒轻油组份对热带念珠菌、克柔念珠菌的MIC图。 [0048] 图18是花椒重油组份对热带念珠菌、克柔念珠菌的MIC图。 [0049] 图19是花椒原精油、花椒轻油组份、花椒重油组份对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MBC图。 [0050] 图20是花椒原精油、花椒轻油组份、花椒重油组份对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、纹带棒状杆菌的MBC图。 [0051] 图21是花椒原精油、花椒轻油组份、花椒重油组份对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌的MBC图。 [0052] 图22是花椒原精油、花椒轻油组份、花椒重油组份对克柔念珠菌的MBC图。 具体实施方式[0053] 下面结合具体实施对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。 [0054] 实施例1花椒精油精制工艺条件的筛选 [0055] 1、仪器设备：短程薄膜蒸馏仪(德国UIC GmbH，KDL2) [0056] 2、实验方法 [0057] 通过调节分子蒸馏仪的蒸发温度和蒸馏压力可以改变各组份分子自由程，实现不同组份的分离，分别收集轻油组份和重油组份，通过计算轻油的回收率，确定工艺条件。将花椒精油装入分子蒸馏进料瓶中，冷阱中装入液氮，打开制冷装置，回流水装置温度设定为5℃，刮膜转速240r/min，物料流量1mL/min，改变蒸馏温度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)和蒸馏压力(20Pa、40Pa、60Pa、80Pa、100Pa)对蒸发强度进行调节，确定分子蒸馏适宜条件。基于最适分子蒸馏条件，收集花椒轻油组分和重油组分。如图1所示，调节蒸发温度和蒸馏压力可以改变各组分分子自由程，实现组分分离。分别收集轻油组份和重油组份，通过计算回收率，确定工艺条件。当进料流速1mL/min、刮膜转速240rpm、冷凝温度5℃、蒸馏压力80Pa时，温度升高会降低重油组份的回收率，温度为50℃时重油回收率最高，故蒸馏温度选择为 50℃；当进料流速1mL/min、刮膜转速240rpm、冷凝温度5℃、蒸馏温度为50℃时，较高压力利于提高花椒重油的回收率，当蒸馏压力为80Pa时，重油组分回收率相对较高，因此蒸馏压力选择80Pa。基于以上结果，最终确定花椒精油的精制工艺条件为：进料流速1mL/min、刮膜转速240rpm、冷凝温度5℃、蒸馏温度为50℃、蒸馏压力80Pa。 [0058] 实施例2 [0059] 一种具有抗菌活性的花椒重油组份，它是由下列方法制备得到的： [0060] (1)花椒精油的提取：取花椒药材粉末一定量，加12倍量水，先浸泡1h，然后采用水蒸气蒸馏提取6h，离心，收集精油，避光4℃保存； [0061] (2)花椒精油精制：花椒精油装入分子蒸馏仪的进料瓶中，冷阱中装入液氮，打开制冷装置，回流水装置温度设定为5℃，刮膜转速240r/min，物料流量1mL/min，蒸馏温度80℃和蒸馏压力80Pa，分别收集花椒重油组份和轻油组份。 [0062] 实施例3花椒精油最小抑菌浓度(MIC)测定 [0063] 1、菌种活化：采用划线法将菌种接种到已灭菌的培养基上，细菌置于35℃下培养24h，念珠菌置于28℃培养48h，曲霉菌置于28℃培养3～4d，得已活化的供试菌种，备用。 [0064] 2、供试药液预处理：按实施例2方法分别制备得到的花椒精油、花椒轻油组份和花椒重油组份经0.22μM滤膜过滤除菌，用1％Tween‑80蒸馏水溶液将花椒精油、花椒轻油组份和花椒重油组份分别稀释为128μL/mL(细菌)和64μL/mL(念珠菌)，备用。 [0065] 3、供试菌悬浮液制备：(1)细菌：取单个菌落，用灭菌的0.45％生理盐水稀释为0.58 麦氏单位的菌悬液，即菌液浓度约为10 cfu/mL。将上述菌液用无菌生理盐水再稀释1000 5 倍，即得备用菌悬浮液，浓度约为1×10cfu/mL。(2)念珠菌：取单个菌落，用灭菌的0.85％生理盐水稀释为1.8～2.2麦氏单位的菌悬液；将上述菌液用RPMI 1640培养基稀释1000倍， 3 3 即得备用菌悬浮液，浓度为1×10～5×10cfu/mL。 [0066] 4、MIC测定：采用微量肉汤稀释法(96孔板法)测定MIC。96孔板中每孔各加入50μL灭菌后的MH肉汤培养基(细菌)，或50μL灭菌后RPMI 1640培养基(念珠菌)；第一列为阳性对照，加入MH肉汤培养基和测试菌液各50μL(细菌)，或加入RPMI 1640培养基和测试菌液各50μL(念珠菌)；第二列为阴性对照，加入MH肉汤培养基和吐温80各50μL(细菌)，或加入RPMI 1640培养基和吐温80各50μL(念珠菌)；第3‑12列每孔各加入待测菌液50μL，再依次加入逐倍稀释的花椒精油、花椒轻油组份和花椒重油组份各50μL，其中细菌测试花椒精油、花椒轻油组份和花椒重油组份的浓度依次为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μL/mL，真菌测试花椒精油、花椒轻油组份和花椒重油组份浓度依次为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.03μL/mL；待药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，细菌放置于35℃培养箱培养24h，念珠菌放置于28℃培养48h；以肉眼观察培养基清亮且未见细菌生长的最低浓度判定为该药物的最小抑菌浓度。 [0067] 5、最小杀菌浓度(MBC)测定 [0068] 用无菌棉蘸取96孔板中高于MIC(包括MIC浓度)的孔内混合液，于相应培养基分区涂布，细菌置于35℃下培养24h，念珠菌置于28℃培养48h，肉眼观察结果，菌落数小于5个或无菌落生长的最低样品浓度确定为MBC值。 [0069] 6、实验结果 [0070] 6.1本发明测试的花椒精油、花椒轻油组份、花椒重油组份最小抑菌浓度(MIC)如下表1和图2～图18所示。 [0071] 表1花椒精油、轻油组份和重油组份的MIC(μL/mL) [0072] [0073] [0074] 6.2花椒精油、花椒轻油组份、花椒重油组份最小杀抑菌浓度(MBC)如下表2和图19～图22所示。 [0075] 表2花椒精油、轻油组份和重油组份的MBC(μL/mL) [0076] [0077] 由以上实验结果表明，本发明研究发现，通过再次蒸馏精制得到的花椒重油组份相比花椒原精油和花椒轻油，对肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、纹带棒状杆菌具有更好的杀菌活性。并且对热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌等真菌具有更好的杀菌活性。 [0078] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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