一种辛夷挥发油及其提取方法、质量检测方法和辛夷挥发油微乳 |
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| 申请号 | CN202311788800.X | 申请日 | 2023-12-25 | 公开(公告)号 | CN117695331A | 公开(公告)日 | 2024-03-15 |
| 申请人 | 咸阳职业技术学院; | 发明人 | 果秋婷; 张小飞; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种辛夷挥发油的提取方法。本发明还提供了该方法制备的挥发油在制备 治疗 过敏性鼻炎的鼻腔 给药 的药物中的用途。本发明还提供了一种检测所述的挥发油的方法。本发明还提供了一种治疗过敏性鼻炎的辛夷挥发油微乳。本发明辛夷挥发油通过调节PPAR‑γ/NF‑κB 信号 通路上的相关蛋白发挥治疗过敏性鼻炎的作用；本发明辛夷挥发油微乳的制备工艺稳定、简单可控，辛夷挥发油微乳具有较强的抗炎、抗过敏作用，对过敏性鼻炎大鼠模型的疗效确切，且 稳定性 和安全较好。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种辛夷挥发油的提取方法，其特征在于：它是以辛夷为原料，采用纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取，它包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种辛夷挥发油及其提取方法、质量检测方法和辛夷挥发油微乳 技术领域[0001] 本发明涉及一种辛夷挥发油及其提取方法、质量检测方法和辛夷挥发油微乳。 背景技术[0002] 过敏性鼻炎(AR)是世界性健康问题，其全球平均发病率为10％～25％，被视为“21世纪的流行病”。近十年来，中国过敏性鼻炎患病率也呈上升趋势。AR患病率与遗传因素、个人饮食和居住环境以及神经精神因素等多种因素均有显著影响。虽然该疾病远不会危害生命健康，但是由其引起的相关不适症状如鼻部的间歇性鼻塞，眼部的过敏性结膜炎，及其他器官症状如哮喘、咽喉肿痛等过敏现象，均会使患者出现睡眠质量下降、食欲不振和情绪失调等一系列问题，严重影响人们的身心健康、工作和学习生活情况。总之，过敏性鼻炎的预防和治疗已成为全球性共同面临的公共卫生问题。 [0003] 辛夷具有多种药理作用，已在实验研究中得到证实，但临床药物侧重于治疗鼻部疾病研究，而较少关注其他方面。目前，辛夷的近代研究主要侧重于挥发油方面，尤其是其化学组成与药理学方面的研究。挥发油类是具有治疗价值的辛夷的主要活性成分，具有丰富的化学成份和广泛的药理作用，其中以抗炎和抗过敏作用的研究开发为主，在临床上主要用于治疗急慢性鼻炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎及哮喘等呼吸系统疾病。但辛夷挥发油在临床中的实际应用却很少，作用机制的研究尚未完全明确。而且辛夷品种较多，来源也比较复杂，其成分和含量因采收种植地、品种等原因差异较大，同时，由于对辛夷化学特征的研究较少，给辛夷或相关产品的鉴别和质量控制带来了困难，影响了药材资源的利用。 [0004] 辛夷的化学成分主要分为脂溶性成分和水溶性成分两大类。包括有挥发油类、木脂素类、生物碱类等。辛夷挥发油作为辛夷药材的主要药用成分，化学成分丰富，药用作用广泛，主要侧重于抗炎和抗过敏作用方面的研究。通常与苍耳子、薄荷和细辛等药材联合使用，主要用于治疗鼻炎、鼻窦炎、过敏性鼻炎及相关疾病如哮喘等，有良好的治疗效果，可显著改善临床不适症状。 [0005] 文献报道以及大量实验表明辛夷挥发油具有明显的抗炎作用。熊天琴等人以豚鼠过敏性鼻炎模型为基础，研究表明：辛夷挥发油可缓解豚鼠过敏性鼻炎症状如鼻痒、打喷嚏等，并能减轻鼻腔内局部粘膜的充血和肿胀。吴敏等人将辛夷挥发油制备成纳米脂质体滴鼻剂，用于治疗小儿过敏性鼻炎的临床研究，并观察检测疗效。结果表明，治疗组在治疗期间的主要症状如打喷嚏、鼻塞等方面的总疗效优于对照组，同时患儿的鼻黏膜水肿和苍白、鼻甲肿胀程度在给药治疗后都有不同程度的下降。管政等研究发现Th1、Th2细胞调控失调与过敏性鼻炎的发生有一定关系，研究结果表明，辛夷挥发油可以通过提高白介素‑12(IL‑12)和干扰素‑γ(IFN‑γ)的水平，降低组织胺的释放，保持Th1/Th2的动态平衡状态，从而达到治疗过敏性鼻炎的目的。 [0006] 目前提取挥发油的传统方法为水蒸气蒸馏法。该方法将水作为溶剂，可以避免在提取过程中某些有机溶剂对挥发油成分或含量造成的影响，同时提取设备较为简单，操作简便安全，成本较低，也不会对环境造成污染等特点。但是水蒸气蒸馏法仅用于提取那些可以被水蒸汽蒸馏而不被破坏、不溶或难溶于水的挥发性物质，这些成分的沸点一般在100℃以上。 发明内容[0007] 本发明的技术方案提供了一种辛夷挥发油及其提取方法、质量检测方法和辛夷挥发油微乳。 [0010] b、将a步骤的酶解液加入挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油。 [0011] 其中，a步骤所述的酶添加量为0.125％～0.250％，酶解时间为45～65min，酶解温度为30～50℃。 [0012] 其中，a步骤所述的酶添加量为0.125％，酶解时间为65min，酶解温度为50℃。 [0013] 所述的挥发油中含有金合欢醇和桉叶油醇，其百分含量为： [0014] 金合欢醇不低于12.0％、桉叶油醇不低于8.0％。 [0015] 本发明提供了所述的挥发油在制备治疗过敏性鼻炎的鼻腔给药的药物中的用途。 [0016] 本发明提供了一种检测所述的挥发油的方法，它是采用GC‑MS分析检测，具体步骤为： [0018] b、GC‑MS检测，色谱条件为： [0019] 气相色谱条件：安捷伦HP‑5ms(30m×250μm×0.25μm)毛细管柱，高纯He，进样量‑13.0μL，流量为1mL·min ，分流比40:1，程序升温55℃，8℃·min‑1升温至176℃，保持时间： 3min，20℃·min‑1升温至250℃保持时间：20min； [0021] 本发明提供了一种治疗过敏性鼻炎的辛夷挥发油微乳，它是由所述的挥发油、乳化剂、油相、助乳化剂制备而成，其中，所述的乳化剂为吐温‑80、吐温‑20、EL‑40、RH‑40中的一种或两种以上的混合；所述的助乳化剂为聚乙二醇400、丙三醇、无水乙醇、1,2‑丙二醇一种或两种以上的混合；所述的油相为：油酸、IPP、IPM一种或两种以上的混合；其中乳化剂与混合油相的体积比为：7‑9：1‑3；挥发油与油相的体积比为：1‑3:1‑3；乳化剂与助乳化剂的质量比为：1‑4:1‑2。 [0022] 其中，所述的乳化剂为EL‑40，助乳化剂为聚乙二醇400，油相为IPM，其中，EL‑40与聚乙二醇400的质量比为2:1。 [0023] 其中，所述的辛夷挥发油微乳粒度为14.27±0.03nm(n＝3)，PDI的平均值为0.0941±0.31(n＝3)；测得挥发油微乳Zeta电位为‑0.3585±0.12mV(n＝3)。 [0024] 本发明提供了一种制备所述的微乳的方法，它包括如下步骤： [0025] a、制备混合油相：取辛夷挥发油与IPM等质量比混合作为油相，Km值＝2:1，温度为30℃； [0026] b、将EL‑40与PEG‑400按照2:1的比例混合均匀，作为混合乳化剂； [0027] c、将混合乳化剂与混合油相的质量比为9:1，混合均匀； [0028] d、将水相滴入混合油相中，加滴边搅拌，制备成O/W型微乳； [0029] 其中混合油相占比2.63％，水相占微乳总量的73.69％，混合乳化剂占23.68％。 [0030] 本发明辛夷挥发油通过调节PPAR‑γ/NF‑κB信号通路上的相关蛋白发挥治疗过敏性鼻炎的作用；所制备的辛夷挥发油微乳制备工艺稳定、简单可控，具有较强的抗炎、抗过敏作用，对过敏性鼻炎大鼠模型的疗效确切，且稳定性和安全较好。附图说明 [0031] 图1不同方法提取辛夷挥发油得油率( n＝3)； [0032] 图2辛夷挥发油提取工艺影响因素响应面图； [0033] 图3乳化剂形成的伪三元面积图( n＝3)； [0034] 图4助乳化剂形成的伪三元面积图( n＝3)； [0035] 图5辅助油相的伪三元面积图( n＝3)； [0036] 图6不同Km值的伪三元面积图( n＝3)； [0037] 图7不同制备温度下的伪三元面积图( n＝3)； [0038] 图8透射电镜图； [0039] 图9微乳类型鉴别图； [0040] 图10微乳粒径及Zeta电位分布图(n＝3)； [0041] 图11 IL‑1β、IL‑6和TNF‑α在大鼠血清中的表达量( n＝6)(注：##：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.01)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05))； [0042] 图12大鼠鼻黏膜组织相关蛋白表达量( n＝3)；(注：#：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.05)；**：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.01)；▲：与微乳制剂组相比，有显著性差异(p＜0.05)； [0043] 图13 IL‑1β、IL‑6和TNF‑α在大鼠鼻腔冲洗液中的表达量( n＝6)； [0044] 图14 IL‑1β、IL‑6和TNF‑α在大鼠血清中的表达量( n＝6)(注：#：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.05)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05))； [0045] 图15大鼠鼻黏膜组织相关蛋白表达量和条带图( n＝3)(注：#：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.05)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05))。 具体实施方式[0046] 实施例1本发明辛夷挥发油的提取工艺 [0047] 选择金合欢醇、桉叶油醇以及提油率等指标进行综合评分。 [0048] 一、不同方法提取辛夷挥发油 [0049] 采用4种方法提取辛夷挥发油。通过不同提取工艺提取辛夷挥发油，并对其提取工艺进行优化，以期提高药效成分的含量及挥发油提油率，得到更加省时节能、高效、简便的工艺参数，为挥发油提取工艺参数确定及相关质量标准的控制提供依据。 [0050] 1实验方法 [0051] 1.水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油 [0052] 称取50g辛夷(木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾)、药材粉碎成粗粉，置于2000mL圆底烧瓶中，加10倍量水，以及碎瓷片(防止暴沸)；圆底烧瓶分别连接挥发油提取器和冷凝管，然后将其放置于电热套中缓慢加热，提取过程中一直保持微沸状态；当第一滴液体滴出，开始记录不同时间段得油量(5、10、20、40、60、90、120、180、240、300min)，直至挥发油体积不再变化，停止加热，静置冷却后，收集挥发油，得到样品X1。 [0053] 2.超声法辅助水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油 [0054] 称取50g辛夷(木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾)、药材粉碎成粗粉，置于2000mL圆底烧瓶，加入10倍量水，超声功率80％，超声20min，在该预处理之后，自“圆底烧瓶分别连接挥发油提取器和冷凝管”起按步骤1)项下方法操作，得到样品X2。 [0055] 3.微波萃取辛夷挥发油 [0056] 称取50g辛夷(木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾)、药材粉碎成粗粉，置于2000mL圆底烧瓶，加入10倍量水，设置微波功率300w(前期研究优化工艺结果)，放入碎瓷片(防止暴沸)，置于超声微波萃取仪中，接入冷凝管，向挥发油提取器保温夹套中加入适量水，提取至挥发油体积不再变化，停止加热，静置冷却后，收集挥发油，得到的样品为X3。 [0057] 4.纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油 [0058] 称取50g辛夷(木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾)、药材粉碎成粗粉，置于2000mL圆底烧瓶，加入10倍量水，纤维素酶量0.25％，pH调至5.0～5.5范围内，酶解时间30min，酶解温度35℃(前期研究优化工艺结果)，放入碎瓷片(防止暴沸)，自“圆底烧瓶分别连接挥发油提取器和冷凝管”起按本章第一节“2.1”项下方法操作，得到的样品为X4。 [0059] 2.挥发油GC‑MS分析 [0060] 2.1样品的制备 [0061] 精密吸取上述分离提取的挥发油样品X1、X2、X3和X4各100μL，无水乙醚定容至10mL棕色容量瓶中，加适量无水硫酸钠去除水分，用1mL注射器吸取样品溶液，过0.22μm的滤膜，滤液置于进样瓶，备用。 [0062] 2.2 GC‑MS条件的建立 [0064] 气相色谱条件：安捷伦HP‑5ms(30m×250μm×0.25μm)毛细管柱，高纯He，进样量‑1 ‑13.0μL，流量为1mL·min ，分流比40:1，程序升温55℃，8℃·min 升温至176℃(保持时间： ‑1 3min)，20℃·min 升温至250℃(保持时间：20min)。 [0065] 质谱条件：EI离子源；电子能量70ev；离子源温度230℃；MS四极体温度；溶剂延迟3min；质谱扫描模式全扫描，扫描范围30～400amu。 [0066] 2.3辛夷挥发油化合物的鉴定 [0067] 所分辨的质谱在标准NIST14库及Database数据库标准谱库中检索，根据匹配度、保留指数和文献已报道物质进行核对。保留指数的测定采用相同的气相色谱条件测定正构烷烃(C8～C40)的保留时间，根据正构烷烃的保留时间，计算出辛夷挥发油中各挥发性化合物的保留指数，公式如下： [0068] [0069] 式中：tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分别表示待测正构烷烃的保留时间、碳数n和碳数n+1以及tR(n) [0070] 3.结果与分析 [0071] 3.1不同工艺的提取率 [0072] 提取工艺提取挥发油后计算提取率，公式为： [0073] [0074] 其中水蒸气蒸馏法提取率为3.00％；超声辅助水蒸气蒸馏法提取率为3.40％；微波法提取率为1.20％；纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取率为3.60％，见图1。 [0075] 3.2辛夷挥发油成分分析 [0076] 运用Database和NIST14标准数据库分别鉴定了四种不同提取方法的成分组成，其指标性成分金合欢醇和桉叶油醇的相对含量均比较高，分别占水蒸气蒸馏法(11.108％、9.349％)、超声辅助水蒸气蒸馏法(12.536％、10.548％)、微波法(6.647％、16.884％)和纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法(12.298％、8.803％)，结果见表1到表4。 [0077] 表1水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油成分分析 [0078] [0079] 表2超声辅助水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油成分分析 [0080] [0081] 表3微波法提取辛夷挥发油成分分析 [0082] [0083] [0084] 表4纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油成分分析 [0085] [0086] [0087] 表5不同提取方法提取辛夷挥发油的共有成分分析 [0088] [0089] [0090] 4小结与讨论 [0091] 辛夷挥发油成分复杂，采用不同的提取工艺，其成分组成和含量也存在一定的差别。根据实验结果表明：四种不同提取方法的得油率依次为纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法(T4)＞超声辅助水蒸气蒸馏法(T2)＞水蒸气蒸馏法(T1)＞微波法(T3)。四种方法均可提高辛夷挥发油得油率，其中纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法较为显著，与传统提取方法水蒸气蒸馏法相比，是其的1.2倍。使用这4种方法制得辛夷挥发油共有成分16个，分别占鉴定总成分的60.725％(水蒸气蒸馏法)、66.344％(超声辅助水蒸气蒸馏法)、72.890％(微波法)和64.870％(纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法)。通过表5可以发现辛夷挥发油的化学组分及相对含量根据其提取方法有一定的差别，主要差别体现于指标性成分金合欢醇和桉叶油醇的含量差异上，水蒸气蒸馏法、超声辅助水蒸气蒸馏法和纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法这三种方法，金合欢醇相对含量均在第一位，其次为桉叶油醇，而微波法中相对含量排在首位的是桉叶油醇，而后为金合欢醇。在提取过程中，发现除微波法的其他3种方法提取的辛夷挥发油可散发出浓烈的香味，颜色为淡黄色，而微波法在提取的过程中味道不是很浓烈，挥发油液体颜色介于乳白色与微黄色之间。综上所述，综合考虑以金合欢醇和桉叶油醇成分含量变化和得油率作为考察指标，发现纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取工艺最佳。 [0092] 二、辛夷挥发油提取工艺优化 [0093] 采用纤维素酶酶解辅助水蒸气蒸馏法对辛夷挥发油的加酶量、酶解时间、酶解温度等影响因素进行单因素考察，结合Box‑Behnken响应面，筛选并验证对得油率影响较大的工艺参数，优化最佳提取工艺。 [0094] 1实验方法 [0095] 1.1提取辛夷挥发油单因素考察 [0096] 称取50g辛夷药材粗粉，置于2000mL圆底烧瓶中，加10倍量水，以及碎瓷片(防止暴沸)，圆底烧瓶分别连接挥发油提取器和冷凝管，然后将其放置于电热套中缓慢加热，提取过程中一直保持微沸状态；直至第一滴液体滴出，开始记录不同时间段的得油量(5、10、20、40、60、90、120、180、240、300min)，当提取器内挥发油体积不再变化，停止加热，静置冷却后，收集挥发油。 [0097] 1.1.1酶添加量的影响 [0098] 首先固定酶解时间为30min、酶解温度35℃，酶添加量分别为0.125％、0.250％、0.500％、1.000％、2.000％，按照本节“2.1”项下的方法提取挥发油。 [0099] 1.1.2酶解时间的影响 [0100] 首先固定酶添加量0.250％、酶解温度35℃，酶解时间分别为30min、50min、70min、90min、110min，按照本节“2.1”项下的方法提取挥发油。 [0101] 1.1.3酶解温度的影响 [0102] 首先固定酶添加量0.250％、酶解时间30min，酶解温度分别为35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，按照本节“2.1”项下的方法提取挥发油。 [0103] 1.2总综合评分F的建立 [0104] 根据前期研究，最终确定为金合欢醇和桉叶油醇作为抗炎指标性成分，以10分制作为总评分，指标性成分含量占比60％(两个指标性成分各占比30％)，提取率占比40％作为考察指标进行加权计算，叠加三者的分值作总综合评分F，从而优化最佳提取工艺。总综合评分F的计算公式如下： [0105] F＝30％×X金合欢醇成分含量+30％×X桉叶油醇成分含量+40％×X得油率 [0106] 1.3Box‑Behnken响应面法优化最佳提取工艺 [0107] 在Box‑Behnken试验设计的基础上，结合单因素试验的结果，用Design‑Expert.v‑11软件设计了3因素3水平的优化试验，以酶的添加量(A)、酶解时间(B)和酶解温度(C)为自变量，以得油率为响应值。因素水平设计见下表6。 [0108] 表6响应面设计因素水平表 [0109] [0110] 2 结果与分析 [0111] 2.1 单因素考察结果 [0112] 2.1.1加酶量对挥发油提油率的影响 [0113] 如表7，以指标性成分金合欢醇和桉叶油醇含量百分比、得油率作为评价指标，最佳添加酶量范围为0.125％～0.250％。 [0114] 表7不同加酶量提取辛夷挥发油‑指标性成分含量以及得油率 [0115] [0116] 2.1.2酶解温度对挥发油提油率的影响 [0117] 如表8，以指标性成分金合欢醇和桉叶油醇含量百分比、得油率作为评价指标，最佳酶解温度范围为45℃～55℃。 [0118] 表8不同酶解温度提取辛夷挥发油‑指标性成分含量以及得油率 [0119] [0120] [0121] 2.1.3酶解时间对挥发油提油率的影响 [0122] 如表9，以指标性成分金合欢醇和桉叶油醇含量百分比、得油率作为评价指标，最佳酶解时间范围为30min～50min。 [0123] 表9不同酶解时间提取辛夷挥发油‑指标性成分含量以及得油率 [0124] [0125] 2.2 Box‑Behnken响应面分析 [0126] 2.2.1响应面设计结果 [0127] 将各因素与水平输入到Design‑Expert v‑11软件，拟合出17组数据进行实验，对酶添加量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)三个显著性因子进行响应面试验设计，结果见表10。 [0128] 采用Design‑Expert v‑11软件对实验数据进行方差分析，对实验数据进行拟合，得到多元二次回归模型方程： [0129] Y＝3.01+1.7816A+0.0659B+0.0985C‑0.0101AB‑0.0112AC‑0.0003BC‑0.4030A2‑2 2 0.0003B‑0.0007C [0130] 结果见表11，模型P＝0.0002<0.001，所选择的二次回归方程模型是非常显著的，2 可以用来预测实验的结果。失拟项显示不显著，说明误差对实验没有明显影响。确定系数R 2 ＝0.9687，调整系数Radj＝0.8285，意味着响应值的82.85％的变化来自变量。 [0131] 表10响应面法试验设计与结果 [0132] [0133] 表11 Box‑Behnken响应面法试验方差分析 [0134] [0135] 注：*表示显著(P<0.05)，表示极显著(P＜0.001) [0136] 2.2.2响应面的影响因素分析 [0137] 各因素之间的相互作用可以通过响应面的三维图和相应的等高线图来说明，如图2所示，等高线几乎是椭圆形，表明酶添加量、酶解时间以及酶解温度彼此在不同程度上相互影响。根据软件分析结果所得的最佳试验条件为：酶添加量为0.1250％，酶解时间为 65.1252min，酶解温度为53.7056℃，挥发油综合评分预测结果为7.94769。考虑实际情况，最佳试验条件调整为：酶添加量为0.125％，酶解时间为65min，酶解温度为50℃。 [0138] 2.2.3响应面试验验证 [0139] 用调整后的最佳试验条件进行三组平行试验，测量3次提取的挥发性油的体积。综合评分(n＝3)分别为7.9663、8.0031和8.1769，平均值为8.0487±0.1125，试验结果接近预测值7.9476，说明本试验中优选的工艺参数是稳定可靠的，可以为预测辛夷挥发油的提取工艺提供参考。 [0140] 3小结 [0141] 以得油率和指标性成分的相对含量作为共同评价指标，对单因素进行考察。酶添加量为0.125％～0.250％之间，金合欢醇和桉叶油醇的相对成分含量较高，得油率也相对较高，当酶添加量为0.125％时，金合欢醇的相对成分含量达19.527％。酶解时间在30min～50min时综合评分较高，其中金合欢醇和得油率差别不明显，明显的差别体现于酶解50min时桉叶油醇的相对成分含量高于酶解30min，酶解温度在55℃的时候综合评分均高于其他酶解温度。 [0142] 本节通过纤维素酶酶解法辅助水蒸气蒸馏法提取辛夷挥发油，并考察其单因素影响，设计Box‑Behnken响应面，分析了酶添加量、酶解时间和酶解温度三者之间的交互作用，从而优化出最佳的试验条件：酶添加量为0.125％，酶解时间为65min，酶解温度为50℃。平行提取三次结果显示，实验有较好的重复性、可提高得油率，而且工艺参数准确可靠，为大规模化提取辛夷挥发油提供指导意义。 [0143] 综上所述，辛夷挥发油的提取工艺为：称取50g辛夷(木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾)、药材粉碎成粗粉，置于2000mL圆底烧瓶，加入10倍量水，纤维素酶量0.125％，pH调至5.0～5.5范围内，酶解时间65min，酶解温度50℃，放入碎瓷片(防止暴沸)，圆底烧瓶分别连接挥发油提取器和冷凝管，然后将其放置于电热套中缓慢加热，提取过程中一直保持微沸状态。在此提取工艺下，辛夷挥发油总综合评分最高，为8.0487±0.1125，是一种最优的提取工艺。 [0144] 试验例2本发明辛夷挥发油微乳制剂的制备 [0145] 微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按一定的比例形成的一种透明或半透明的、黏度较低的、热力学稳定的溶液系统，目前大致可分为油包水(W/O)型、水包油(O/W)型和双相连续型微乳，作为一种新型的药物载体，具有极大的发展潜力。考虑辛夷挥发油为脂溶性，且为难溶于水性中药挥发油，因此本章将辛夷挥发油与微乳药物传递系统相结合，在尽量减少乳化剂的前提下，通过考察各因素对微乳的影响，筛选出乳化剂量少，同时稳定的处方组成和比例。 [0146] 一、微乳制备工艺研究 [0147] 微乳形成受多种因素影响，在本节研究中主要考察乳化剂、油相、助乳化剂、Km值和温度等因素，利用伪三元相图经典方法加水滴定，通过形成微乳面积的大小以及相关参数变化，从而确定辛夷挥发油微乳制剂的最佳工艺组成。 [0148] 1实验方法 [0149] 1.1辛夷挥发油微乳的制备 [0150] 在前期预实验中对其制备过程进行研究，初步将处方质量固定为5.0g。将挥发油和混合乳化剂分别以一定的比例进行实验(9:1到1:9一系列梯度变化比)，每次边滴加超纯水边搅拌，混合体系随着水相的不断加入会表现出一系列状态变化；通过测定电导率变化，确定微乳的临界点，当电导率出现峰点开始呈现下降趋势，此时的峰点就是微乳的临界点，同时根据临界点的各组分百分比绘制伪三元相图。 [0151] 1.2辛夷挥发油微乳溶液体系的筛选 [0152] 1.2.1乳化剂的考察 [0153] 乳化剂是一类具有亲水性和亲油性的表面活性剂。一般认为，“亲水亲油平衡值(HLB值)”越低，其亲油性越强；反之，HLB值越高，亲水性越强。不同的乳化剂具有不同的HLB值，要得到较好的乳化效果，需要选用适当的乳化剂。因此选用吐温‑80、吐温‑20、EL‑40和RH‑40作为乳化剂，考察其对辛夷挥发油微乳形成的影响。 [0154] 1.2.2助乳化剂的考察 [0155] 助乳化剂能调节乳化剂的HLB值，使其在精细乳液聚合中具有较大的稳定性。因此选用聚乙二醇400、丙三醇、无水乙醇和1,2‑丙二醇作为助乳化剂，考察其对辛夷挥发油微乳形成的影响，筛选出最佳助乳化剂。 [0156] 1.2.3油相的考察 [0157] 在前期预实验中，发现如果只以辛夷挥发油作为油相时，微乳无法形成均一透明状态，因此考虑加入辅助油相，选用油酸、IPP和IPM分别与辛夷挥发油按1:1比例作混合油相，考察其对辛夷挥发油微乳形成的影响。 [0158] 1.3制备条件的筛选 [0159] 1.3.1 Km值的影响 [0160] Km值是乳化剂与助乳化剂的质量之比，形成微乳的能力会随Km值不同而有所不同。因此本文分别考察Km值为4:1、3:1、2:1、1:1时，对微乳形成的影响，筛选出最佳的Km值。 [0161] 1.3.2温度的影响 [0162] 对于中药挥发油类药物来说，制备温度对其有影响。因此，在初步建立基本处方的基础上，最后分别考察制备温度在25℃、30℃、40℃、50℃时的微乳状态，筛选出最佳制备温度。 [0163] 2结果与分析 [0164] 2.1最佳乳化剂的筛选 [0165] 制备温度初步拟定25℃，辅助油相拟定IPM，并与辛夷挥发油等比例混合，按照本节“2.1”项下方法考察吐温‑80、吐温‑20、EL‑40和RH‑40四种不同乳化剂的乳化能力。记录数据导入到Origin 8.0绘图软件绘制伪三元相图，考察结果如下图3所示，形成微乳区域的面积分别为SEL‑40＝0.00351＞STween‑80＝0.00204＞SRH‑40＝0.00196＞STween‑20＝0.00009。结果表明，以EL‑40作为乳化剂时，形成微乳面积最大，乳化效果最佳，同时微乳外观清澈透明、均一，测量的粒径大小也符合要求。 [0166] 表12乳化剂对制备微乳的影响( n＝3) [0167] [0168] 2.2最佳助乳化剂的筛选 [0169] 通过对乳化剂的筛选，确定了以EL‑40为乳化剂，IPM与辛夷挥发油1:1比为混合油相，Km的初始暂定为2:1，制备温度为25℃进行配制，在此基础上研究了聚乙二醇400、丙三醇、无水乙醇和1,2‑丙二醇作为助乳化剂对乳液合成的影响，结果见下图4。 [0170] 形成微乳区域的面积分别为SPEG‑400＝0.00044＞S1,2‑丙二醇＝0.00034＞S丙三醇＝0.00027＞S无水乙醇＝0.00013，结果表明，以聚乙二醇400作为助乳化剂时，形成微乳面积最大，助乳化能力较强，同时微乳外观澄清透明、均一，测量的粒径大小也符合要求。 [0171] 表13助乳化剂制备微乳的影响( n＝3) [0172] [0173] 2.3最佳辅助油相的筛选 [0174] 根据上述筛选结果，乳化剂为EL‑40、助乳化剂为聚乙二醇400，Km值为2:1，并在25℃下进行配制，油酸、IPP和IPM分别与辛夷挥发油以1:1比例作为混合油相，观察对微乳制备的影响，选择对辛夷挥发油影响最小的辅助油相，如图5，形成微乳区域的面积分别为SIPM＝0.00394＞SIPP＝0.00278＞S油酸＝0.00233。结果表明，以IPM作为辅助油相，形成微乳面积最大，同时微乳外观澄清透明、均一，测量的粒径大小也符合要求。 [0175] 表14辅助油相制备微乳的影响( n＝3) [0176] [0177] 2.4最佳Km值的筛选 [0178] 依据上述筛选结果，将乳化剂、助乳化剂和辅助油相分别定为EL‑40，聚乙二醇400和IPM，在25℃条件下配置，考察Km分别为4:1、3:1、2:1、1:1时，对制备微乳的影响，筛选最佳的Km值，如图6。 [0179] 形成微乳区域的面积分别为S2:1＝0.00232＞S1:1＝0.00135＞S4:1＝0.00028＞S3:1＝0.00025，结果表明，Km值为2:1，形成微乳面积最大，同时微乳外观澄清透明、均一，测量的粒径大小也符合要求。 [0180] 表15不同Km值对制备微乳的影响( n＝3) [0181] [0182] 2.5最佳制备温度的筛选 [0183] 根据前期影响因素的筛选结果，确定最佳处方比例，考察在25℃、30℃、40℃、50℃时配置微乳的影响，筛选出最佳制备温度。形成微乳区域的面积分别为S30℃＝0.00097＞S25℃＝0.00070＞S40℃＝0.00044＞S50℃＝0.00006，结果见图7，在30℃配置微乳制剂时形成微乳面积最大，同时微乳外观澄清透明、均一，测量的粒径大小也符合要求。 [0184] 表16不同制备温度下对微乳的影响( n＝3) [0185] [0186] [0187] 4小结与讨论 [0188] 辛夷挥发油属于脂溶性液体，不易溶于水且生物利用度较差。考虑将挥发油制备成微乳，可解决其不溶于水、液体制剂质量部均一等问题；并将微乳作为载体，制备成其他剂型，从而发挥提高生物利用度以及增加稳定性的作用。 [0189] 因此，本节采用加水滴定法制备辛夷挥发油微乳制剂，绘制伪三元相图，比较形成微乳面积大小，以及观察微乳外观、粒径等因素，筛选出制备辛夷挥发油微乳制剂的最佳组分。通过测量电导率值，准确地控制加水量，探讨微乳制备过程中电导率的变化趋势，优化最佳配方，得到最优的制备条件为：乳化剂为EL‑40，助乳化剂为聚乙二醇400，辛夷挥发油与IPM等质量比混合作为油相，Km值＝2:1，制备温度为30℃，总乳化剂与混合油相的质量比为9:1，其中混合油相占比2.61％，水相占微乳总量的71.22％，混合乳化剂占26.17％。制备的微乳为O/W型，其外观呈现澄清透明、均一状态，符合微乳质量要求。 [0190] 二、辛夷挥发油微乳制剂的质量评价 [0191] 微乳作为纳米级的小液滴，具有透明、稳定、吸收完善、靶向释药等特点，是新型理想的药物释放载体，具有提高药物疗效的作用，具有广阔发展前景。因此本节通过研究微乳的基本性质和理化参数等方面，初步评价辛夷挥发油微乳的质量体系。 [0192] 1实验方法 [0193] 1.1观察微乳外观 [0194] 取15μL的微乳试样，将其滴入到镀碳支撑薄膜铜网中，停留大约8～12min后，用滤纸将剩余微乳试样溶液吸走。完全干燥后，滴入TEM磷钨酸溶液，染色90s，用滤纸将残余的染液吸干，将其置于滤纸上晾干8h，然后用透射电子显微镜观察其外观性状。 [0195] 1.2鉴定微乳类型 [0196] 通过观察微乳液中水溶性染料和油溶性染料的扩散速率，判断微乳类型，当水溶性染料扩散速度快于油溶性染料时，微乳为O/W型；反之，则为W/O型；本研究所用染料分别为亚甲基蓝(水溶性)和苏丹III(油溶性)染料。 [0197] 1.3测定微乳理化参数 [0198] 1.3.1测定微乳pH值 [0199] 取3批制备时间不同的微乳，取样量各1.0mL，用纯净水稀释，室温下测定微乳pH值。 [0200] 1.3.2测定微乳粒径、Zeta电位 [0202] 1.4测定微乳稳定性 [0203] 1.4.1微乳物理稳定性 [0204] [0205] 取3份等量的微乳于离心管中，置于转速10000r·min‑1的高速离心机中离心15min，观察微乳的透明度以及是否出现分层现象，以此判定微乳离心稳定性。 [0206] 1.4.2微乳加速稳定性试验 [0207] 取3份等量的辛夷挥发油微乳放入称量瓶内密封，于温度为30℃±2℃，湿度为65％±5％的条件下保存3个月，每月末取样检测微乳的外观、电导率、粒径等指标，以此判定微乳的稳定性。 [0208] 2结果与分析 [0209] 2.1微乳的外观性状 [0210] 将辛夷挥发油微乳置于透射电镜下，见图8，扫描结果表明：辛夷挥发油微乳呈圆形，轮廓清晰，粒径均匀分布的球体。 [0211] 2.2微乳类型的鉴别 [0212] 由图9可直观的观察到，亚甲基蓝(蓝色)扩散速度明显快于苏丹III(红色)的扩散速度，判断制备微乳为O/W型。 [0213] 2.3微乳理化参数的测定 [0214] 2.3.1微乳pH值 [0215] 室温下测得辛夷挥发油微乳pH值最终均值为6.33±0.23(n＝3)，为弱酸性微乳。 [0216] 2.3.2微乳粒径及其Zeta电位 [0217] 利用马尔文粒度仪测得辛夷挥发油微乳粒度为14.27±0.03nm(n＝3)，PDI的平均值为0.0941±0.31(n＝3)，测得挥发油微乳Zeta电位为‑0.3585±0.12mV(n＝3)，结果见图10。 [0218] 2.4微乳的稳定性研究 [0219] 2.4.1微乳的外观性状 [0220] 根据筛选出最佳处方工艺制得的辛夷挥发油微乳制剂外观为均一、清澈透明液体。微乳物理稳定性3份辛夷挥发油微乳于高速离心机中以转速为10000r·min‑1，离心15min后其外观均为澄清透明，且未出现分层现象，故辛夷挥发油微乳离心稳定性良好。 [0221] 2.4.2加速稳定性试验 [0222] 将辛夷挥发油微乳在温度30℃±2℃，湿度为60％±5％环境中放置3个月，每个月末取样检测，结果提示，微乳的离心稳定性稳定，外观澄清透明、均一、无分离分层现象，电导率、pH值和粒径随着放置时间的延长无明显变化，说明该微乳在此实验条件下较为稳定。 [0223] 表17加速实验结果( n＝3) [0224] [0225] 3小结与讨论 [0226] 本节通过透射电镜观察微乳的形貌，发现其表面呈圆整状态和分布较为均匀的粒径大小。在确定微乳的类型时，发现亚甲基蓝的扩散速度明显快于苏丹III扩散速度，故鉴定为O/W型微乳。对微乳进行理化参数的测定，结果表明，微乳的pH值较为稳定，粒径大小一致，符合要求。在微乳的稳定性试验中，通过高速离心，发现微乳本身外观仍然呈澄清透明状态，而且未见分层，未出现油水分离等不稳定的现象。在加速稳定性试验过程中，进行了为期3个月的稳定性考察，分别考察pH值、粒径和电导率变化，结果表明微乳液在考察期内呈澄清均一液体，其他理化参数均无明显变化。 [0227] 本研究制备辛夷挥发油微乳的技术可行、方法准确、可重复，为开发新型辛夷挥发油微乳制剂奠定了良好的基础。 [0228] 以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。 [0229] 试验例1辛夷挥发油微乳制剂与油溶液组疗效对比 [0230] 通过建立过敏性鼻炎大鼠模型，考察微乳制剂与挥发油溶液的治疗效果，检测血清中IL‑6、TNF‑α和IL‑1β的分泌量，同时通过免疫组化技术检测相关蛋白表达量。 [0231] 1材料与仪器 [0232] 1.1动物 [0233] SPF级雄性Wistar大鼠，共30只，体重110～120g，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(川)2020‑030。动物饲养于陕西中医药大学中药药理学实验室，在温度为20±2℃，相对湿度65±2％，通风良好的环境中，适应性饲养5天后进行实验。 [0234] 2实验方法 [0235] 2.1建立大鼠过敏性鼻炎模型 [0236] 同第五章第二节“2.1”项下的造模方法进行造模实验。 [0237] 2.2分组与给药 [0238] 适应性饲养5天后，大鼠体质量较为均一，因此按随机分配原则，分为5组，每组6只，分别设置挥发油溶液组、微乳制剂组、模型组、空白组和辅舒良(丙酸氟替卡松鼻喷雾剂)组，其中挥发油溶液在临用时用橄榄油配成0.25％的油溶液滴鼻给药。激发致敏一周后，于第二周进行药物干预，持续3周，将同一浓度的微乳制剂组和油溶液组滴于试验大鼠双侧鼻腔内，每侧鼻孔100μL，同理阳性对照组给予同等体积的辅舒良(丙酸氟替卡松鼻喷雾剂)(规格：120喷)，空白组和模型组每天滴鼻，等剂量的生理盐水，一天一次。 [0239] 2.3观察动物行为学状态 [0240] 观察大鼠行为学状态。 [0241] 2.4动物样本取材方法 [0242] 2.4.1采集血清 [0243] 在最后一次给药治疗后，禁食24h(不禁水)，通过腹腔注射戊巴比妥钠(30～‑160mg·kg )对大鼠进行麻醉，切开腹部，剥离露出腹主动脉后采集血液，血样在室温下放置‑1 2h，以4000r·min 的速度离心10min，取出上清液，分装，放在‑80℃冷冻储存，备用。 [0244] 2.4.2剥取鼻黏膜组织 [0245] 鼻黏膜组织取材方法。 [0246] 2.5 ELISA检测大鼠血清和鼻腔冲洗液中相关炎症因子的含量表达 [0248] 2.6免疫组化检测大鼠鼻黏膜组织中相关蛋白表达量 [0249] 检测相关蛋白含量。 [0250] 3结果与分析 [0251] 3.1行为学观察 [0252] 空白组的大鼠行动自如，精神状态良好，而其他组的大鼠则有不同程度的抓挠鼻面和打喷嚏情况，造模前后得分如表18。 [0253] 表18造模前后行为学评价得分表 [0254] [0255] 注：###：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.001)；***：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.001) [0256] 3.2ELISA测定大鼠血清中的相关炎症因子的表达量 [0257] 如图11所示，与空白组相比，模型组中血清的IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的含量水平均明显升高(p＜0.01)。与模型组相比，辅舒良组和给药治疗组中血清的IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的含量水平明显降低(p＜0.05)。 [0258] 表19大鼠血清中相关炎症因子分泌量 [0259] [0260] 注：##：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.01)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05) [0261] 3.3免疫组化检测大鼠鼻黏膜组织中相关蛋白的表达量 [0262] 如图12，与空白组相比，辅舒良组、油溶液组及微乳治疗组中NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ蛋白表达差异无统计学意义。与模型组比较，辅舒良组、油溶液组及微乳治疗组NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ蛋白分别呈显著下降和显著升高趋势(p＜0.05)；与挥发油微乳制剂相比，油溶液组相关蛋白均有显著性差异(p＜0.05)，提示辛夷挥发油微乳制剂可能通过调节NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ在PPAR‑γ/NF‑κB信号通路中发挥治疗作用。 [0263] 表20大鼠鼻黏膜组织相关蛋白表达量( n＝3) [0264] [0265] 注：##：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.01)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05) [0266] 4、小结与讨论 [0267] 行为学结果显示，阳性药物对照组、挥发油油溶液组以及微乳制剂组都可以不同程度的缓解过敏性鼻炎大鼠打喷嚏及鼻痒等不适症状；利用ELISA对相关炎症因子进行检测，结果显示，相较于模型组，血清中IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的水平明显降低，具有显著性差异；PPAR‑γ、NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65等相关蛋白检测结果显示：与模型组相比，微乳制剂组和油溶液组NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65的蛋白表达量显著降低，PPAR‑γ蛋白表达量显著升高；与微乳制剂组相比，油溶液组相关蛋白均有显著性差异。挥发油油溶液组虽可发挥治疗作用，但是其属于油性液体，给药困难且难以控制给药量。在实际操作过程中，直接将油溶液滴于大鼠鼻部，会刺激并堵塞大鼠鼻腔，导致鼻腔出血；挥发油易溶于微乳基质，将其制备成微乳制剂，给药时也不会刺激大鼠鼻部而产生不适症状。 [0268] 试验例2辛夷挥发油微乳制剂药效学的初步研究 [0269] 本节通过前期对辛夷挥发油的提取工艺优化、挥发油微乳的制备工艺筛选以及“权重”网络药理学预测结合RNA‑seq技术的基础上，以辛夷挥发油微乳为受试药物采用过敏性鼻炎大鼠模型，根据行为学、血清、鼻腔灌洗液以及鼻黏膜组织中的炎症因子测定等指标对其进行药效学评价。 [0270] 1.动物 [0271] SPF级雄性Wistar大鼠，共36只，体重110～120g，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(川)2020‑030。动物饲养于陕西中医药大学中药药理学实验室，在温度为20±2℃，相对湿度65±2％，通风良好的环境中，适应性饲养5天后进行实验。 [0272] 2实验方法 [0273] 2.1建立大鼠过敏性鼻炎模型 [0274] 同第五章第二节“2.1”项下的造模方法进行造模实验。 [0275] 2.2分组与给药 [0276] 适应性饲养5天后，大鼠体质量较为均一，因此按随机分配原则，分为6组，每组6只，分别设置挥发油微乳高、中、低剂量组、模型组、空白组和阳性药物组。激发致敏一周后，于第二周进行药物干预，持续3周，将挥发油微乳滴于试验大鼠双侧鼻腔内，每侧鼻孔100mL，同理阳性药物组给予同等体积的辅舒良(丙酸氟替卡松鼻喷雾剂)(规格：120喷)，空白组和模型组每天滴鼻，等剂量的生理盐水，一天一次。 [0277] 2.3观察动物行为学状态 [0278] 同第五章第二节“2.1.2”项下的方法观察大鼠行为学状态。 [0279] 2.4动物样本取材方法 [0280] 2.4.1采集血清 [0281] 同本章第一节“2.4.1”项下内容。 [0282] 2.4.2收集鼻腔冲洗液 [0283] 采血之后，立即用浸泡在液体石蜡中的棉絮，塞堵于大鼠咽喉处，目的是阻止冲洗液流出；切开大鼠颈部的皮肤，剥离出气管后切V字形斜口，将橡胶管插入斜口；注入1mL冲‑1洗液，重复三次，收集合并冲洗液，以4000r·min 的速度离心10min，取出上清液，分装，放于‑80℃冷冻储存。 [0284] 2.4.3剥取鼻黏膜组织 [0285] 同第五章第二节“2.1.3”项下的鼻黏膜组织取材方法。 [0286] 2.4.4 ELISA检测大鼠血清和鼻腔冲洗液中相关炎症因子的含量表达 [0287] 按照试剂盒的使用说明进行具体实验操作。 [0288] 2.4.5 Western Blot法检测大鼠鼻黏膜组织中相关蛋白表达量 [0289] 将鼻黏膜组织加入裂解液，置于匀浆器中，进行匀浆，然后置于冰上重复碾几次使组织充分碾碎，裂解30min后，取上清。 [0292] (3)膜转移(冰浴降温)：按以下顺序将膜转移到转膜液中：海绵‑2张滤纸‑海绵‑NC膜‑2张滤纸‑海绵； [0293] (4)免疫活性：将膜移至封闭液中，室温摇床上摇动封闭70min； [0294] (5)加入抗体：滴加一抗后，于4℃下孵育过夜，次日用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min；加入二抗，在室温下孵育50min，然后用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min； [0295] (6)最后，将膜置于ECL试剂中，显示发光。 [0296] 3结果与分析 [0297] 3.1行为学观察 [0298] 行为学结果如表21，模型组、给药组和辅舒良组造模后得分无统计学差异，明显高于空白组；给药组和辅舒良组经过治疗后得分明显降低，具有显著性差异，提示辛夷挥发油微乳和辅舒良(丙酸氟替卡松鼻喷雾剂)可以缓解过敏性鼻炎大鼠鼻部炎症反应。 [0299] 表21造模前后行为学评价得分表 [0300] [0301] 注：###：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.001)；***：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.001) [0302] 3.2ELISA测定大鼠鼻腔冲洗液和血清中的相关炎症因子的表达量 [0303] 如图13到图14所示，与空白组相比，模型组中鼻腔冲洗液、血清的IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的含量水平均明显升高。与模型组相比，阳性药物对照组和给药治疗组中鼻腔冲洗液、血清的IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的含量水平明显降低。 [0304] 表22大鼠鼻腔冲洗液中相关炎症因子分泌量 [0305] [0306] 表23大鼠血清中相关炎症因子分泌量 [0307] [0308] [0309] 注：##：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.01)；*：对模型组相比，有显著性差异(p＜0.05) [0310] 3.3大鼠鼻黏膜组织中相关蛋白的表达量分析 [0311] 如图15，与空白组相比，阳性药物对照组、油溶液组及微乳治疗组中NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ蛋白表达差异无统计学意义。与模型组比较，阳性对照药物组、油溶液组及微乳治疗组NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ蛋白分别呈显著下降和显著升高趋势(p＜0.05，)提示辛夷挥发油微乳制剂可能通过调节NF‑κB‑p65、p‑NF‑κB‑p65和PPAR‑γ在PPAR‑γ/NF‑κB信号通路中发挥治疗作用。 [0312] 表24大鼠鼻黏膜组织中炎症相关蛋白表达量( n＝3) [0313] [0314] 注：#：与空白组相比，有显著性差异(p＜0.05)；*：对模型组相比，有显著性差异(p&＜0.05)；：与阳性对照组比较，(p＜0.05) [0315] 4小结与讨论 [0316] 本节通过建立过敏鼻炎大鼠模型，研究了PPAR‑γ/NF‑κB信号通路相关蛋白PPAR‑γ、NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65的表达情况，分析该通路如何调控相关蛋白发挥治疗过敏性鼻炎的作用。根据大鼠行为学状态变化、ELISA测定大鼠血清和鼻腔冲洗液中炎症因子表达量的变化和Western Blot实验检测相关蛋白表达量情况等，初步研究了辛夷挥发油微乳治疗过敏性鼻炎的药效学过程。 [0317] 前期差异基因测序结果和“权重”网络药理学预测结果相结合，以及相关文献的报道，认为PPAR‑γ/NF‑κB信号通路在过敏性鼻炎的治疗中发挥着重要的治疗调控机制。行为学结果显示，微乳制剂组以及阳性药物对照组都可以不同程度的缓解过敏性鼻炎大鼠打喷嚏和鼻痒等不适症状；利用ELISA对相关炎症因子进行检测，结果显示，相较于模型组，鼻腔灌洗、血清中IL‑1β、IL‑6TNF‑α的水平明显降低，具有显著性差异(p＜0.05)；Western Blot实验就PPAR‑γ/NF‑κB信号通路而言，分别对PPAR‑γ、NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65等相关蛋白进行检测，结果显示：与模型组相比，NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65的蛋白表达量显著降低(p＜0.05)，PPAR‑γ蛋白表达量显著升高(p＜0.05)。 [0318] 本发明揭示辛夷挥发油微乳制剂可以通过调控PPAR‑γ/NF‑κB信号通路中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α、PPAR‑γ、NF‑κB‑p65和p‑NF‑κB‑p65等相关蛋白表达量治疗过敏性鼻炎。 |
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