一种具有抗炎活性的胡椒精油及其制备方法 |
|||||||
| 申请号 | CN202210152457.9 | 申请日 | 2022-02-18 | 公开(公告)号 | CN114574286B | 公开(公告)日 | 2024-03-22 |
| 申请人 | 中国热带农业科学院香料饮料研究所; 海南兴科热带作物工程技术有限公司; | 发明人 | 谷风林; 吴桂苹; 段梦雅; 李鑫; 朱红英; 宗迎; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种具有抗炎活性的胡椒精油及其制备方法。胡椒精油的制备方法包括：将胡椒鲜果超低温冷冻、 微波 解冻、磨浆、酶解、 水 蒸气蒸馏、油水分离，得到胡椒精油。实验证明，胡椒精油对抑制RAW 264.7细胞释放一 氧 化氮(NO)、 肿瘤 坏死 因子(TNF‑ɑ)、白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、前列腺素E2(PGE2)和表达环氧合酶‑2(COX‑2)具有抑制作用，说明胡椒精油具有抗炎活性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种胡椒精油的制备方法，其特征在于，包括：将胡椒鲜果超低温冷冻、微波解冻、磨浆、酶解、水蒸气蒸馏、油水分离，得到胡椒精油； |
||||||
| 说明书全文 | 一种具有抗炎活性的胡椒精油及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及天然产物提取技术领域，特别涉及一种具有抗炎活性的胡椒精油及其制备方法。 背景技术[0003] 常用的精油提取方法有水蒸气蒸馏法、压榨法、有机溶剂萃取法以及后来出现的超声波辅助萃取、超临界CO2萃取和微波辅助水蒸气蒸馏等方法。其中，水蒸气蒸馏设备简单、易操作、成本低、精油品质好，是提取精油最常用的方法。但由于要在较高温度下操作很长时间，容易引起精油中热敏性化合物和易水解成分的热分解或水解，造成精油有效成分的损失，导致提取率不高。 [0005] 胡椒精油的提取方法及应用有待进一步研究。 发明内容[0006] 本发明提供一种具有抗炎活性的胡椒精油及其制备方法。本方法以胡椒鲜果为原料，经超低温冷冻、微波快速解冻、磨浆、超声波辅助酶解、水蒸气蒸馏，油水分离，无水硫酸钠除水，得到具有抗炎活性的胡椒精油。 [0007] 具体而言，一种胡椒精油的制备方法，包括：将胡椒鲜果超低温冷冻、微波解冻、磨浆、酶解、水蒸气蒸馏、油水分离，得到胡椒精油。 [0008] 根据本发明实施例，所述胡椒鲜果的成熟度为5‑7成。研究发现，5‑7成熟的胡椒鲜果精油含量更高，且更有利于胡椒精油的提取。 [0009] 根据本发明实施例，所述超低温冷冻的温度为‑60至‑80℃，具体例如‑80℃。通常冷冻的时间为24‑60h，例如24‑48h。研究发现，通过超低温冰冷冻胡椒鲜果，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，最大限度地抑制了生理代谢强度，较好地保存了原料的挥发性成分。 [0010] 根据本发明实施例，所述微波解冻时微波功率为600‑800W，例如800W。通常解冻至中心温度为4℃。研究发现，微波快速解冻过程中细胞内的水等极性物质吸收微波后产生热量，胞内温度迅速上升，水气化产生压力使细壁破裂，产生微孔和裂痕，从而使细胞内物质更易溶出。 [0011] 根据本发明实施例，所述磨浆过程可加入适量的水，例如加水量可为胡椒鲜果重量的5‑10倍。可采用常规方法磨浆。在一些具体实例中，磨浆至细度为5‑20目。研究发现，通过磨浆处理，原料破碎更充分，有利于胡椒鲜果成分充分提取。 [0012] 根据本发明实施例，所述酶解所用的酶为由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶所组成的复合酶，三者重量比例优选为(1‑2):(1‑2):(1‑3)，例如1:1:2。研究发现，采用上述复合酶酶解，引起细胞间质局部疏松、膨松等变化，减小细胞间质等传质屏障对挥发性成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力。 [0013] 本发明中，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶均可市售购得。 [0014] 在一些实例中，纤维素酶的酶活为50u/mg。 [0015] 在一些实例中，半纤维素酶的酶活为20000u/mg。 [0016] 在一些实例中，果胶酶的酶活为500u/mg。 [0017] 根据本发明实施例，所述复合酶的添加量为胡椒鲜果重量的0.05％‑1％。 [0018] 根据本发明实施例，所述酶解时的温度为40‑60℃，例如45‑50℃。酶解时间通常为1‑2h。 [0020] 本发明中，可采用常规水蒸气蒸馏及油水分离方法。例如可采用无水硫酸钠除水。 [0021] 根据本发明实施例，水蒸气蒸馏的方法包括：将酶解后的物料装入圆底烧瓶中，加玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，置于电热套中加热，蒸馏至精油不再增加，停止加热，冷却至室温后读取精油体积，收集精油，无水硫酸钠除水。 [0022] 根据本发明实施例，所述胡椒精油的制备方法，包括以下步骤： [0023] 1)原料预处理 [0024] 将胡椒鲜果于‑80℃超低温冷冻储存；600‑800W微波快速解冻，加入蒸馏水磨浆处理得到混合物A； [0025] 2)超声波辅助酶解 [0026] 在混合物A中，添加胡椒鲜果质量0.05％～1％的复合酶，在40‑60℃条件下，超声波超声频率为400‑500W辅助酶解1‑2h得到混合物B；所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶按重量比1:1:2组成； [0027] 3)水蒸气蒸馏提取 [0028] 将混合物B水蒸气蒸馏提取，收集精油，无水硫酸钠除水。 [0029] 在一些具体实例中，步骤3)包括：将混合物B装入圆底烧瓶中，加玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，置于电热套中加热，蒸馏至精油不再增加，停止加热，冷却至室温后读取精油体积，收集精油，无水硫酸钠除水。 [0030] 本发明方法通过超低温冰冷冻储存胡椒鲜果，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，最大限度地抑制了生理代谢强度，较好地保存了原料的挥发性成分；通过微波快速解冻、匀浆、超声波辅助酶解相结合的方法，具体原因是微波快速解冻过程中细胞内的水等极性物质吸收微波后产生热量，胞内温度迅速上升，水气化产生压力使细壁破裂，产生微孔和裂痕，从而使细胞内物质更易溶出；通过匀浆处理，原料破碎更充分，有利于胡椒鲜果成分充分提取；接着向其中加入复合酶，引起细胞间质局部疏松、膨松等变化，减小细胞间质等传质屏障对挥发性成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力；超声波辅助酶解加速了酶解时间，以上整体步骤均有利于胡椒鲜果精油提取。 [0031] 本发明是利用复合酶分解胡椒鲜果细胞壁，减小传质阻力，促进精油释放，再利用水蒸气回流提取精油的一种方法。本方法制得的胡椒鲜果精油呈淡黄色，具有明显的胡椒香，无异味，精油得率高达3.14％，是传统黑胡椒和白胡椒的水蒸气蒸馏法精油得率的2倍多。 [0032] 本发明方法采用胡椒鲜果为原料直接进行天然产物的提取，相比传统的白胡椒、黑胡椒提取省去了加工过程，有效提高了胡椒鲜果的利用率，且胡椒在一定程度上促进了胡椒资源附加值产业发展。 [0033] 本发明还包括上述方法制备得到的胡椒精油。该胡椒精油至少含有下文表1中的序号1‑28中的成分中的一种或几种。特别地，该胡椒精油中含有α‑侧柏烯，相对含量为0.32％‑0.34％，例如0.34％。 [0034] 本发明所述相对含量是指某个化合物的峰面积除以所有积分到的峰面积的和，也就是该化合物的百分比含量。 [0035] 本发明还研究发现，胡椒精油具有较好的抗炎效果。所述胡椒精油尤其是指上述方法制备得到的胡椒精油。实验证明，在脂多糖(LSP)诱导的细胞模型中，胡椒精油对抑制RAW 264.7细胞释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF‑ɑ)、白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、前列腺素E2(PGE2)和表达环氧合酶‑2(COX‑2)具有抑制作用，说明胡椒精油具有抗炎活性。 [0036] 本发明还包括胡椒精油在制备具有抗炎作用的药物方面的应用。具体地，所述抗炎作用包括抑制RAW 264.7细胞释放一氧化氮(NO)，抑制肿瘤坏死因子(TNF‑ɑ)释放，抑制白细胞介素‑6(IL‑6)释放，抑制白细胞介素‑1β(IL‑1β)释放，抑制前列腺素E2(PGE2)释放，抑制环氧合酶‑2(COX‑2)表达中的一种或几种。 [0038] 图1：本发明实验例中胡椒精油对细胞活力的影响。 [0039] 图2：胡椒精油对RAW 264.7细胞释放一氧化氮(NO)的影响。 [0040] 图3：胡椒精油对RAW 264.7细胞释放肿瘤坏死因子(TNF‑ɑ)、白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、前列腺素E2(PGE2)的影响。 [0041] 图4：胡椒精油对RAW 264.7细胞表达环氧合酶‑2(COX‑2)的影响。 具体实施方式[0042] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0043] 若无特殊指明，以下胡椒品种为印尼大叶种，由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。 [0044] 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶均购自源叶生物，酶活分别为50u/mg、20000u/mg、500u/mg。 [0045] 实施例1胡椒精油制备方法(胡椒鲜果) [0046] 将胡椒鲜果(5‑7成熟)放入‑80℃超低温冷冻储存24h，微波(功率800W)快速解冻10min，加入胡椒鲜果6倍重量蒸馏水，磨浆处理得到混合物A；在混合物A中，添加胡椒鲜果重量1％复合酶(由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶按重量比1:1:2组成)，在50℃条件下，超声波(功率500W)辅助酶解1h得到混合物B；将混合物B装入圆底烧瓶中，加玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，置于电热套中加热，蒸馏至精油不再增加，停止加热，冷却至室温后读取精油体积，收集精油，无水硫酸钠除水，得胡椒精油。 [0047] 胡椒鲜果精油干基提取得率的计算公式为： [0048] [0050] 对比例1 [0051] 黑胡椒精油的制备及含量测定：采用GB/T 17527‑2009《胡椒精油含量的测定》。 [0052] 对比例2 [0053] 白胡椒精油的制备及含量测定：采用GB/T 17527‑2009《胡椒精油含量的测定》。 [0054] 实验1 [0055] 结果显示，实施例1胡椒鲜果精油干基提取得率为3.511mL/100g，为对比例1黑胡椒(1.710mL/100g)、对比例2白胡椒(1.853mL/100g)的两倍左右，说明本发明的胡椒鲜果精油干基提取得率显著高于黑胡椒、白胡椒。 [0056] GC‑MS方法测定：正己烷将精油稀释50倍经无水硫酸钠脱水后过0.45μm微孔膜，待测。色谱柱：J&W DB‑5石英毛细柱(30m×0.25mm，0.25μm)。升温程序：柱温50℃，以3℃/min升至75℃，再以1.5℃/min升至140℃，然后以10℃/min升至230℃，保持2min，最后以20℃/min升至280℃，保持3min。载气(He)流速1mL/min，进样量1μL，不分流。电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度280℃；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z 35～450amu。 [0057] 实施例1胡椒鲜果、对比例1黑胡椒、对比例2白胡椒精油成分见表1，从表1中可知，胡椒鲜果精油成分与黑、白胡椒均以萜烯类化合物为主，但相对含量有所差异，且在胡椒鲜果精油中检测出了α‑侧柏烯，在黑、白胡椒中未检测到。 [0058] 表1胡椒精油成分表 [0059] [0060] [0061] 注：“‑”表示未检测出。 [0062] 实验2抗炎活性检测 [0063] 1.仪器与材料 [0064] 1.1仪器 [0065] 表2仪器 [0066] [0067] 1.2实验材料 [0068] 地塞米松(DXMS)购自源叶生物，脂多糖(LPS)，购自美国Sigma公司，巨噬细胞RAW264.7购买自上海赛柏慷生物，胎牛血清购买自BOVOGEN(南美)，胰酶‑EDTA购买自GIBCO，PBS购买自博士德生物，CCK‑8购买自MCE，NO比色法测试盒、TNF‑αELISA Kit、IL‑6ELISAKit、IL‑1βELISAKit、PGE2ELISAKit均购买自Elabscience。 [0069] 2实验内容 [0070] 细胞复苏： [0071] 将‑80℃冻存的RAW264.7细胞置于37℃的水浴锅中，快速晃动至融化。将融化后的细胞和7mL培养基加入到15mL无菌离心管，1000rpm离心5min，弃去上清液，转移至含有5mL 10％FBS培养基的全新25T细胞培养瓶中；7.5％CO2，37℃条件下，培养8h后弃去旧培养基更换新培养基，继续培养。等到细胞长满培养瓶即可进行实验。 [0072] 2.1胡椒精油对细胞活力的影响 [0073] 将实施例1制备的胡椒精油样品(下同)经0.22μm过滤器过滤除菌。种板前弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS洗后加入0.25％胰蛋白酶消化细胞。倒掉胰蛋白酶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打细胞，并转入加样槽中吹匀。用细胞计数板计数，加入完全3 培养基稀释，用排枪吸取100μL，把细胞接种到96孔板上(5×10个/孔)，在37℃，5％CO2恒温培养箱内培养过夜。弃去96孔板中的旧培养基，加入样品至工作浓度，继续培养120h。吸走原有培养基，PBS冲洗2次，把96孔板中的培养基换成100μL新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，在每孔中分别加入10μL CCK‑8溶液。在培养箱中培养3h后，在450nm测吸光度。细胞存活率的计算公式如下： [0074] 细胞存活率(％)＝(A sample)/(Blank)×100％ [0075] 结果见图1。control表示对照组，即添加0μg/mL胡椒精油。结果表明，200μg/mL地塞米松(DXMS)对细胞活性无明显影响，当胡椒精油浓度在0～30μg/mL时，对RAW 264.7细胞的生长抑制无显著影响，当胡椒精油浓度大于30μg/mL时，对RAW 264.7细胞的生长抑制有显著影响。因此，后续实验选择胡椒精油浓度为7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL。 [0076] 2.2胡椒精油对RAW 264.7细胞释放一氧化氮(NO)的影响 [0077] 将精油样品经0.22μm过滤器过滤除菌。种板前弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS洗后加入0.25％胰蛋白酶消化细胞。倒掉胰蛋白酶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打细胞，并转入加样槽中吹匀。用细胞计数板计数，加入完全培养基稀释，用排枪吸取5 1mL，把细胞接种到12孔板上(2×10个/孔)，在37℃，5％CO2恒温培养箱内培养过夜。吸去培养基，加入样品至工作浓度，预处理细胞1h。加入1μg/mL的LPS继续培养24h。用胰酶将细胞消化，并用PBS清洗细胞，最后用ripa裂解细胞，收集细胞裂解液。利用NO比色法测试盒检测胞内NO含量。 [0078] 结果见图2。Blank表示空白组，未采用1μg/mL LSP诱导刺激(下同)；Model表示模型组，采用1μg/mL LSP诱导刺激(下同)。 [0079] 结果表明，模型组NO分泌量明显增加，与空白组相比，具有显著性差异，说明LSP炎症模型建立成功。胡椒精油各质量浓度细胞上清液中的NO含量明显低于模型组，呈现剂量依赖性，且30μg/mL胡椒精油比对照组200μg/mL地塞米松抑制NO抑制效果更佳，说明胡椒精油有良好抑制NO释放作用。 [0080] 2.3胡椒精油对RAW 264.7细胞释放肿瘤坏死因子(TNF‑ɑ)、白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、前列腺素E2(PGE2)的影响 [0081] 将精油样品经0.22μm过滤器过滤除菌。种板前弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS洗后加入0.25％胰蛋白酶消化细胞。倒掉胰蛋白酶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打细胞，并转入加样槽中吹匀。用细胞计数板计数，加入完全培养基稀释，用排枪吸取5005 μL，把细胞接种到24孔板上(1×10 个/孔)，在37℃，5％CO2恒温培养箱内培养过夜。吸去培养基，加入样品和DXM至工作浓度，预处理细胞1h。加入1μg/mL的LPS继续培养24h。收集细胞上清。利用ELISA检测试剂盒测上清中TNF‑α、IL‑6、IL‑1β、PGE2的含量。 [0082] 结果见图3。结果表明，LSP作用于RAW264.7细胞，细胞上清液中的TNF‑α、IL‑6、IL‑1β、PGE2含量明显增加，与空白组相比，具有显著性差异，说明LSP炎症模型建立成功。7.5μg/mL胡椒精油细胞上清液中TNF‑ɑ含量明显与模型组无显著差异，15μg/mL和30μg/mL胡椒精油细胞上清液中TNF‑ɑ含量与模型组具有显著差异，呈现剂量依赖性，且15μg/mL胡椒精油与对照组200μg/mL地塞米松TNF‑ɑ含量无显著性差异。胡椒精油各质量浓度细胞上清液中的IL‑6含量显著低于模型组，呈现剂量依赖性，且30μg/mL胡椒精油与对照组200μg/mL地塞米松IL‑6含量无显著性差异。7.5μg/mL胡椒精油细胞上清液中IL‑1β含量明显与模型组无显著差异，15μg/mL和30μg/mL胡椒精油细胞上清液中IL‑1β含量与模型组具有显著差异，呈现剂量依赖性，且30μg/mL胡椒精油与对照组200μg/mL地塞米松TNF‑ɑ含量无显著性差异。7.5μg/mL胡椒精油细胞上清液中PGE2含量明显与模型组无显著差异，15μg/mL和30μg/mL胡椒精油细胞上清液中PGE2含量与模型组具有显著差异，呈现剂量依赖性，且30μg/mL胡椒精油与对照组200μg/mL地塞米松TNF‑ɑ含量无显著性差异。以上整体，说明胡椒精油有良好抑制TNF‑α、IL‑6、IL‑1β、PGE2释放作用。 [0083] 2.4胡椒精油对RAW 264.7细胞表达环氧合酶‑2(COX‑2)的影响 [0084] 将精油样品经0.22μm过滤器过滤除菌。种板前弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS洗后加入0.25％胰蛋白酶消化细胞。倒掉胰蛋白酶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打细胞，并转入加样槽中吹匀。用细胞计数板计数，加入完全培养基稀释，用排枪吸取5 2mL，把细胞接种到6孔板上(5×10 个/孔)，在37℃，5％CO2恒温培养箱内培养过夜；吸去培养基，加入调整好浓度的样品和DXM至工作浓度，预处理细胞1h；加入1μg/mL的LPS继续培养 24h；用PBS清洗细胞后，用ripa裂解细胞，收集细胞裂解液；用BCA定量法调整各组样品蛋白浓度一致，用WB检测COX‑2蛋白含量。 [0085] 结果见图4。结果表明，模型组与空白组COX‑2蛋白含量差异显著，说明LSP炎症模型建立成功。胡椒精油各质量浓度细胞上清液中的COX‑2蛋白含量明显低于模型组，呈现剂量依赖性，且30μg/mL胡椒精油与对照组200μg/mL地塞米松抑制COX‑2蛋白表达效果无显著差异，说明胡椒精油有良好抑制COX‑2蛋白表达作用。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈