褐变被抑制的含酸型槐糖脂的组合物 |
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| 申请号 | CN202080042585.7 | 申请日 | 2020-01-15 | 公开(公告)号 | CN113966378B | 公开(公告)日 | 2024-03-26 |
| 申请人 | 莎罗雅株式会社; | 发明人 | 荒木道阳; 平田善彦; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了褐变被抑制的含酸型槐糖脂的组合物和用于生产所述组合物的方法。根据本发明的褐变被抑制的含酸型槐糖脂的组合物的特征在于包含内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的组合物的 水 解 产物的滤液，即所述含酸型槐糖脂的组合物的滤液具有以下特征(1)和(2)中的至少一者：(1)色相值(Abs.440)：5或更小；以及(2) 乙醇 不溶性含量：小于3 质量 ％。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于生产包含内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的组合物的水解产物的方法，所述方法包括以下步骤(a)： |
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| 说明书全文 | 褐变被抑制的含酸型槐糖脂的组合物技术领域[0001] 本发明涉及褐变被抑制的含酸型槐糖脂的组合物和用于生产所述含酸型槐糖脂的组合物的方法。此外，本发明涉及用于抑制含酸型槐糖脂的组合物的褐变的方法。 背景技术[0002] 已知为生物来源的表面活性剂的生物表面活性剂(“Biosurfactant”，“BS”)是可生物降解且安全的。为糖脂型BS的槐糖脂(“Sophorolipid”，“SL”)是通过酵母由发酵获得的发酵产物。SL可以例如通过将酵母接种到包含碳源(例如糖如葡萄糖，以及植物油和脂肪)的液体培养基上，并在温和的温度下和在压力下对该培养基充气的同时搅拌该培养基来容易地生产。SL具有比其他BS更高的生产率(例如，约100g/L)。 [0003] 然而，由于在SL发酵生产过程期间也同时产生发酵副产物(各种有机酸及其盐、色素等)，因此在发酵完成之后提取的未经纯化的SL具有呈褐色的颜色以及奇怪的气味。此外，由于通过发酵获得的SL是内酯型SL和酸型SL的混合物，因此使该混合物进一步经受碱水解(皂化)以形成更安全的酸型SL(参见例如专利文献(Patent Literature，PTL)1至专利文献(PTL)3等)。另一方面，通过常规皂化获得的酸型SL具有比处理之前更深的褐色或与处理之前一样深的褐色。当使酸型SL静置在50℃至100℃的温度下时，虽然酸型SL中没有发生结构变化，但是也出现褐变进一步发展和增加的问题。因此，由于向诸如药物、准药物、食品和化妆品的产品中并入这样的未经纯化的酸型SL对产品的外观和储存稳定性具有不利影响，因此需要进一步纯化。 [0004] 通常，发酵产品的生产的最困难且昂贵的部分是纯化过程。许多先前报道的用于纯化SL的方法包括通过将等量的己烷和乙酸乙酯添加至液体培养基中来提取(例如非专利文献(Non‑Patent Literature，NPL)1)。然而，通过该方法获得的SL保留了奇怪的气味。也报道了用于将SL纯化为白色物质的方法(非专利文献(NPL)2)。在NPL 2中，将液体培养基自身冷冻干燥，向经干燥的材料中添加乙酸乙酯，并将所得混合物在30℃下搅拌2天。在蒸馏出乙酸乙酯之后，使混合物在己烷中结晶。然而，该方法难以实施，因为需要添加易燃的有机溶剂，然后使溶液静置数天。此外，这些方法需要从回收的液体中除去或回收有机溶剂。这需要用于处理包含机溶剂的废液的特殊设备和能量，从而导致更高的成本。此外，从环境影响和不利健康影响的角度来看，使用这样的有机溶剂需要对其进行严格管理。此外，如果有机溶剂残留在获得的SL中，则其应用于食品产品和化妆品变得困难。另一方面，也提出了使用反相色谱法作为纯化方法的方法(参见例如专利文献(PTL)2和专利文献(PTL)3)。然而，该方法是费时且昂贵的。因此，到目前为止已知的方法可以用于基础研究，但不足以用于工业应用或一般工业用途，并且需要进一步研究。 [0005] 从一般工业用途的角度来看，SL的生产和纯化必须是价廉且安全的过程。在通用化学产品的情况下，成本方面变得特别重要。此外，目前，除产品在使用之后的生物降解性之外，从生命周期评估(life‑cycle assessment，LCA)的角度来看，建立包括用于原材料的更安全的制造过程是重要的。出于该原因，也期望建立在不使用或排放有害有机溶剂的情况下制造来源于生物体的SL的方法。 [0006] 因此，建立用于在不使用有害有机溶剂的情况下以高收率和低成本生产酸型SL的方法预计将显著地推进SL作为来源于生物体、安全且具有优异生物降解性的新材料的工业应用。 [0007] 引用列表 [0008] 专利文献 [0009] PTL 1：JP2006‑70231A [0010] PTL 2：WO2013/129667 [0011] PTL 3：WO2015/034007 [0012] 非专利文献 [0013] NPL 1：D.G.Cooper and D.A.Paddock,Appl.Environ.Microbiol.,47,173‑176,1984 [0014] NPL 2：R.D.Ashby,D.K.Y.Solaiman,and T.A.Foglia,Biotechnol.Lett.,30,1093‑1100,2008 发明内容[0015] 技术问题 [0016] 本发明的一个目的是提供具有被抑制的褐变的含酸型SL的组合物和用于生产所述组合物的方法。更具体地，本发明的一个目的是提供用于更容易且价廉地制备褐变被抑制的含酸型SL的组合物的水解方法。 [0017] 技术方案 [0018] 为了解决以上问题，本发明人进行了深入研究。结果，本发明人发现，当以相对于组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量的量使用碱性试剂在80℃或更低的温度条件下使在发酵生成过程中所获得的未经纯化的含酸型SL的产物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物)水解时，获得的水解产物为基于被视为100质量％的内酯型SL和酸型SL的总量以78质量％或更大的比例包含酸型SL的组合物，并且具有显著被抑制的褐变使得水解产物的滤液的色相值(Abs.440)为5或更小。本发明人进一步发现，获得的含酸型SL的组合物具有随时间推移而稳定地被抑制的褐变，如由以下事实显而易见：即使在使滤液在黑暗中于50℃下静置1个月之后，滤液的色相值(Abs.440)也没有显著增加。此外，本发明人确定，当将水解产物(含酸型SL的组合物)调节成6至9的pH时，获得的组合物(pH为6至9的组合物)具有甚至更稳定地被抑制的褐变。本发明人基于这些发现进行了进一步研究，并完成了本发明。 [0019] 更具体地，本发明提供了褐变被抑制的含酸型SL的组合物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物)和用于生产所述组合物的方法。本发明还提供了用于制备褐变被抑制的含酸型SL的组合物的水解方法。此外，本发明提供了用于抑制含酸型SL的组合物的褐变的方法。本发明的褐变被抑制的含酸型SL的产物在下文中也被称为“具有褐变抗性的含酸型SL的组合物”或“具有褐变抗性的水解产物”。 [0020] (I)褐变被抑制的含酸型SL的组合物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物) [0021] (I‑1)包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物，基于被视为100质量％的所述内酯型SL和所述酸型SL的总量，所述酸型SL以78质量％或更大的比例存在，其中所述水解产物的滤液具有以下特征(1)和(2)： [0022] (1)色相值(Abs.440)为5或更小，优选为2或更小，更优选为1.5或更小；以及[0023] (2)乙醇不溶性含量小于3质量％，优选为2质量％或更小，更优选为1.5质量％或更小。 [0024] 如本文中所提到的“水解产物的滤液”意指通过将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物调节至室温(25±5℃)并将所得水解产物通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤而获得的滤液。 [0025] “色相值(Abs.440)”为通过将滤液溶解在蒸馏水中以实现3质量％的乙醇可溶性含量，将经稀释的水溶液通过孔径为0.45μm的过滤器过滤，通过使用红外/UV‑可见分光光度计在440nm的波长下测量获得的滤液的吸光度，并将吸光度(Abs.440)乘以10而获得的值。 [0026] (I‑2)根据(I‑1)的水解产物，其中所述水解产物的所述滤液还具有以下特征(3)： [0027] (3)在50℃下静置1个月之后的色相值(Abs.440)为10或更小，优选为5或更小，更优选为3或更小。 [0028] (I‑3)根据(I‑1)或(I‑2)的水解产物，其中所述水解产物的所述滤液还具有以下特征(4)： [0029] (4)液体特性(pH)为6至9的pH，优选为7至9的pH，更优选为7.5至8.5的pH。 [0030] (I‑4)根据(I‑1)至(I‑3)中任一项的水解产物，其中所述水解产物的所述滤液还具有选自(5)和(6)中的至少一种物理特性： [0031] (5)皂化值：1mg KOH/g至25mg KOH/g；以及 [0032] (6)灼烧残余物：16质量％或更少。 [0033] (II)用于生产褐变被抑制的含酸型SL的组合物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物)的方法 [0034] (II‑1)用于生产包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的方法，该方法包括以下步骤(a)： [0035] (a)以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量的量使用碱性试剂在80℃或更低下使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解以获得水解产物，所述水解产物的滤液具有以下特征(1)和(2)： [0036] (1)色相值(Abs.440)为5或更小，优选为2或更小，更优选为1.5或更小；以及[0037] (2)乙醇不溶性含量小于3质量％，优选为2质量％或更小，更优选为1.5质量％或更小， [0038] 其中 [0039] “水解产物的滤液”是指通过将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物调节至室温(25±5℃)并将经调节的水解产物通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤而获得的滤液，以及 [0040] “色相值(Abs.440)”为通过将滤液溶解在蒸馏水中以实现3质量％的乙醇可溶性含量，将经稀释的水溶液通过孔径为0.45μm的过滤器过滤，使用红外/UV‑可见分光光度计在440nm的波长下测量获得的滤液的吸光度，并将吸光度(Abs.440)乘以10而获得的值。 [0041] (II‑2)根据(II‑1)的生产方法，还包括以下步骤(b)： [0042] (b)将在步骤(a)中获得的所述水解产物或所述水解产物的所述液调节成6至9的pH。 [0043] (II‑3)根据(II‑1)或(II‑2)的生产方法，其中基于被视为100％的内酯型SL和酸型SL的总量，所述水解产物为以78质量％或更大的比例包含酸型SL的含酸型SL的组合物。 [0044] (III)用于生产褐变被抑制的含酸型SL的组合物的水解方法 [0045] (III‑1)用于使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解以生产褐变被抑制的含酸型SL的组合物的方法，该方法包括以下步骤(a)： [0046] (a)以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量的量使用碱性试剂在80℃或更低下使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解以获得水解产物，所述水解产物的滤液具有以下特征(1)和(2)： [0047] (1)色相值(Abs.440)为5或更小，优选为2或更小，更优选为1.5或更小；以及[0048] (2)乙醇不溶性含量小于3质量％，优选为2质量％或更小，更优选为1.5质量％或更小。 [0049] 如本文中所提到的“水解产物的滤液”为通过将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物调节至室温(25±5℃)并将经调节的水解产物通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤而获得的滤液。 [0050] “色相值(Abs.440)”为通过将滤液溶解在蒸馏水中以实现3质量％的乙醇可溶性含量，将所得溶液通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤，通过使用红外/UV‑可见分光光度计在440nm的波长下测量获得的滤液的吸光度，并将吸光度(Abs.440)乘以10而获得的值。 [0051] (III‑2)根据(III‑1)的方法，还包括以下步骤(b)： [0052] (b)将在步骤(a)中获得的所述水解产物或所述水解产物的所述滤液调节成6至9的pH。 [0053] (IV)褐变被抑制的含酸型SL的组合物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物)的用途 [0054] (IV‑1)阴离子表面活性剂，包含根据(I‑1)至(I‑4)中任一项的水解产物(褐变被抑制的含酸型SL的组合物)或其加工产物作为活性成分。 [0055] (IV‑2)香料或化妆品、食品或饮料、清洁剂、准药物、药物、或用于其的添加剂，包含(I‑1)至(I‑4)中任一项的水解产物(褐变被抑制的含酸型SL的组合物)或其加工产物作为活性成分。 [0056] (IV‑3)用于生产香料或化妆品、食品或饮料、清洁剂、准药物、或药物的方法，该方法包括以下步骤： [0057] 将用于香料和化妆品、食品和饮料、清洁剂、准药物、或药物的制造中的第三组分混合到(I‑1)至(I‑4)中任一项的水解产物(褐变被抑制的含酸型SL的组合物)或其加工产物中；以及 [0058] 将所得混合物形成为产品。 [0059] (IV‑4)(IV‑2)的香料或化妆品、食品或饮料、清洁剂、准药物、药物、或其添加剂，其中所述香料或化妆品、食品或饮料、清洁剂、准药物、和药物全部适用于人体。 [0060] 有益效果 [0061] 根据本发明的生产方法和水解方法，可以容易地以低成本作为包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物来获得褐变被抑制的含酸型SL的组合物。具体地，本发明的方法与常规方法例如以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为2g当量至4g当量的量使用碱性试剂在室温下使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解的方法相比，可以生产具有更稳定地被抑制的褐变的含酸型SL的组合物。由于本发明可以在不使用利用有机溶剂或柱色谱法的纯化法的情况下生产具有稳定地被抑制的褐变的含酸型SL的组合物，因此可以方便且价廉地获得具有褐变抗性的高度安全的含酸型SL的组合物。 具体实施方式[0062] (I)槐糖脂 [0063] 槐糖脂(SL)通常是由槐糖或者其一个或更多个羟基被乙酰化的槐糖、和羟基脂肪酸组成的糖脂。槐糖是由通过β1→2键键合的两个葡萄糖分子组成的糖。羟基脂肪酸是具有羟基的脂肪酸。SL大致分为酸型SL和内酯型SL。酸型SL是其中羟基脂肪酸的羧基是游离的槐糖脂。内酯型SL是其中羟基脂肪酸的羧基与分子中的槐糖键合的槐糖脂。由一种酵母(产生SL的酵母)通过发酵获得的SL通常为由下式(1)表示的SL和由下式(2)表示的SL的混合物，并且获得为30种或更多种类型的结构同系物(例如具有不同脂肪酸链长度(R2)的那些，在槐糖的6'位置(R3)和6"位置(R4)处被乙酰化或质子化的那些，以及在槐糖的3'位置、4'位置、2”位置、3”位置和4”位置中的一者(R5)处被酯化的那些)的集合。 [0064] [0065] (在式(1)中，R1表示氢原子或甲基； [0066] R3和R4相同或不同，并且独立地表示氢原子或乙酰基； [0067] 全部R5为氢原子，或者5个R5中的一者为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基，并且其余4个R5全部为氢原子； [0068] R2为饱和脂族烃链或具有至少一个双键的不饱和脂族烃链，其可以具有一个或更多个取代基；以及 [0069] R6为羟基)。 [0070] [0071] (在式(2)中，R1至R4如式(1)中所限定。) [0072] 由产生SL的酵母通过发酵获得的SL可以包含这样的二聚体，在所述二聚体中，由式(1)表示的酸型SL中的为其中一个R5基团可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基的酸型SL的C‑1位置处的R6键合至由式(3)表示的酸型SL中的一个R7以形成单键。 [0073] [0074] (在式(3)中，R1'为氢原子或甲基； [0075] R3'和R4'相同或不同，并且表示氢原子或乙酰基； [0076] R2'为饱和脂族烃链或具有至少一个双键的不饱和脂族烃链，并且可以具有一个或更多个取代基；以及 [0077] 一个R7键合至由式(1)表示的酸型SL的R6以形成单键，并且其余R7全部为氢原子。)[0078] 在式(1)至(3)中，由R2或R2'表示的饱和或不饱和脂族烃链中的碳数没有限制，但通常为9至20，优选为9至18，更优选为11至16，并且特别优选为14至16。饱和脂族烃链可以为例如线性或支链亚烷基，并且优选为线性亚烷基。不饱和脂族烃链的实例包括具有1至3个双键的亚烯基。不饱和脂族烃链优选为具有1至2个双键的亚烯基，并且更优选为具有1个双键的亚烯基。对由R2或R2'表示的饱和或不饱和脂族烃链的取代基没有限制。取代基的实例包括卤素原子、羟基、低级(C1‑6)烷基、卤代低级(C1‑6)烷基、羟基低级(C1‑6)烷基、卤代低级(C1‑6)烷氧基等。卤素原子或者与烷基或烷氧基键合的卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。 [0079] 由式(1)中的R5表示的饱和脂肪酸残基的实例包括C12‑20线性脂肪酸残基(月桂酸残基、肉豆蔻酸残基、十五酸残基、棕榈酸残基、十七酸残基、硬脂酸残基、和花生酸残基)，优选C14‑20线性脂肪酸残基，更优选C16‑20线性脂肪酸残基，甚至更优选C16‑18线性脂肪酸残基，并且特别优选C16棕榈酸残基和C18硬脂酸残基。不饱和脂肪酸残基的实例包括具有1至3个双键的C12‑20线性脂肪酸残基。双键的数目优选为1个至2个，并且更优选为1个。碳原子数优选为16至20，更优选为16至18，并且特别优选为18。不饱和脂肪酸残基的优选实例包括具有一个双键的C16棕榈油酸残基；具有一个双键的C18油酸残基或异油酸残基(优选油酸残基)；具有两个双键的C18亚油酸残基；具有三个双键的C18亚麻酸残基(9、12、15)、亚麻酸残基(6、9、12)和桐酸残基；以及具有两个双键的C20亚麻酸残基(9、12、15)、亚麻酸残基(6、9、12)和桐酸残基。更优选地，不饱和脂肪酸残基为具有一个双键的C16棕榈油酸残基和具有一个双键的C18油酸残基，特别优选为具有一个双键的C18油酸残基。 [0080] 这些脂肪酸残基可以具有羟基或者可以不具有羟基。当脂肪酸残基具有羟基时，羟基的数目为1个或2个，优选为1个。此外，羟基可以存在于例如脂肪酸残基中的ω位置或ω‑1位置处。在酸型SL(1)中，当R5为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基时，‑OR5可以存在于槐糖环的3'位置、4'位置、2”位置、3”位置和4”位置中的任一者处。更具体地，酸型SL(1)包括其中具有为上述脂肪酸残基的R5的‑OR5基团存在于这些位置中的一者处的SL化合物。更优选地，酸型SL(1)为其中具有为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基的R5的‑OR5存在于槐糖环的4”位置处的化合物(1)。 [0081] 如上所述，在由产生SL的酵母通过发酵获得的液体培养物中，SL通常作为酸型SL(式(1)中所示的单体SL)和内酯型SL(式(2)中所示的单体SL)的混合物而存在。其中，由于内酯型SL为非离子油性物质，并且其自身极不溶于水，因此不期望具有高比例的内酯型SL，因为其在整体上使槐糖脂混合物不溶于水。另一方面，优选具有高比例的酸型SL，因为其与内酯型SL相比，是化学上稳定的。液体培养物中的酸型SL与内酯型SL的比率没有限制，但是典型地使得基于被视为100质量％的包含在培养基中的酸型SL和内酯型SL的总量，酸型SL的量小于65质量％以及内酯型SL的量为35质量％或更大(干重比)。优选地，培养基中的酸型SL与内酯型SL的比率可以在40:60至10:90(干重比)的范围内。 [0082] 优选的产生SL的酵母的实例包括熊蜂生假丝酵母(Candida bombicola)。假丝酵母(Candida)属已被重命名为斯塔莫酵母(Starmerella)属。这种酵母是已知产生显著量的(酸型和内酯型)SL的产生SL的酵母(Canadian Journal of Chemistry,39,846(1961)(注意：文献中所述的球拟酵母(Torulopsis)属属于假丝酵母属，但目前被分类为如上所述的斯塔莫酵母属)；Applied and Environmental Microbiology,47,173(1984)；等等)。熊蜂生假丝酵母(斯塔莫酵母)已保藏在作为生物资源库的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(熊蜂生假丝酵母ATCC22214)，并且可从该美国典型培养物保藏中心获得。也可以使用属于假丝酵母属(斯塔莫酵母属)并且已知产生(酸型和内酯型)SL的另外的产生SL的酵母。这样的产生SL的酵母的实例包括木兰假丝酵母(Candida magnoliae)、腹股沟假丝酵母(Candida gropengisseri)、蜜生假丝酵母(Candida apicola)、嗜石油假丝酵母(Candida petrophilum)、假丝酵母bogoriensis(Candida bogoriensis)、巴蒂斯塔假丝酵母(Candida batistae)等。 [0083] 本发明中的这样的产生SL的酵母的培养物使用包含糖(例如葡萄糖)(亲水性底物)以及脂肪酸、脂肪酸酯(例如脂肪酸甘油三酯)或者油和脂肪(例如包含脂肪酸作为组分的植物油)(疏水性底物)作为碳源的培养基。培养基的其他组分没有特别限制，并且可以适当地选自通常用于酵母的培养基组分。 [0084] 作为本发明的目标的含酸型SL的组合物是指其中基于被视为100质量％的包含在组合物中的内酯型SL和酸型SL的总量，由式(1)表示的酸型SL以78质量％或更大的比例存在以及由式(2)表示的内酯型SL以小于22质量％的比例存在的组合物；优选其中酸型SL的比例为85质量％或更大以及内酯型SL的比例小于15质量％的组合物；并且更优选其中酸型SL的比例为90质量％或更大以及内酯型SL的比例小于10质量％的组合物。 [0085] 在例如产生SL的酵母培养物或其加工产物中的含SL的组合物中酸型SL与内酯型SL的比率可以通过例如WO2015/020114中描述的测量方法来确定，其内容在此通过引用并入。具体地，可以使用以下方法：使通过将酸型SL和内酯型SL的混合物(含SL的组合物)与等体积的50体积％乙醇溶液混合而制备的溶液经受如下所述的反相柱色谱，并使获得的部分进一步经受高效液相色谱(HPLC)以定量分析各洗脱级分的SL含量。 [0086] 通过反相柱色谱进行分馏 [0087] (1)使通过将600g的含SL的组合物与等体积的50体积％乙醇溶液混合而获得的溶液(样品溶液)在以下条件下经受反相柱色谱。 [0088] 固定相：C18柱( 40C18‑PREP，由Nacalai Tesque,Inc.生产，7.5kg) [0089] 填充柱的尺寸：15cm×90cm [0090] 流动相：乙醇浓度为50体积％至95体积％的乙醇水溶液 [0091] (2)依次使10L的50％乙醇水溶液、10L的80％乙醇水溶液、15L的90％乙醇水溶液和15L的95％乙醇水溶液经受具有样品溶液的固定相，并且各自收集用80％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液洗脱的级分。 [0093] 通过HPLC进行定量分析 [0094] 条件 [0095] 设备：Shimadzu Corporation LC‑10AD‑VP [0096] 柱：Inertsil ODS‑3(4.6mm×250mm) [0097] 柱温：40℃ [0098] 流动相：[A]蒸馏水， [0099] [B]包含0.1体积％甲酸的甲醇梯度 [0100] 梯度：0分钟→60分钟：[B]70体积％→100体积％ [0101] 60分钟→70分钟：[B]100体积％→70体积％。 [0102] 流量：1.0mL/分钟 [0103] 进样体积：10μL [0104] 检测器：蒸发光散射检测器(ELSD‑LTII，由Shimadzu Corporation生产)[0105] 检测器温度：40℃ [0106] 增益：5 [0107] 气体压力：350kpa(N2气) [0108] 在由式(1)表示的酸型SL中，用80％乙醇水溶液洗脱的级分包含由下式(1a)表示的酸型SL。在由式(1)表示的酸型SL中，这种类型的酸型SL为由式(1)表示的酸型SL，其中所有R5都为氢原子。在以上条件下的HPLC中，酸型SL(1a)在10分钟至25分钟的保留时间区中洗脱。 [0109] [0110] (在式(1a)中，R1至R4与式(1)中的限定相同。) [0111] 用80％乙醇水溶液洗脱的级分不仅包含酸型SL(1a)，而且还包含由上式(2)表示的内酯型SL。在以上条件下的HPLC中，内酯型SL(2)在25分钟至40分钟的保留时间区中洗脱。 [0112] 用90％乙醇水溶液洗脱的级分包含酸型SL(1b)，其为由式(1)表示的酸型SL中的其中一个R5为可以具有羟基的饱和或不饱和脂肪酸残基并且其余R5都为氢原子的酸型SL。在以上条件下的HPLC中，酸型SL(1b)在45分钟至60分钟的保留时间区中洗脱。 [0113] 用95％乙醇溶液洗脱的级分包含由式(3)表示的二聚体SL。在以上条件下的HPLC中，二聚体SL(3)在60分钟至70分钟的保留时间区中洗脱。 [0114] 因此，包含在含SL的组合物中的酸型SL与内酯型SL的比率可以由在以上条件下的HPLC中的各保留时间区中检测到的峰的面积比确定。 [0115] 在本说明书中，在通过产生SL的酵母的发酵而生产的含SL的组合物(包括液体培养物及其加工产物)中，其中基于被视为100质量％的包含在含SL的组合物中的酸型SL和内酯型SL的总量，酸型SL的比例为78质量％或更大的组合物被统称为“含酸型槐糖脂的组合物”(“含酸型SL的组合物”)。另一方面，其中基于被视为100质量％的包含在含SL的组合物中的酸型SL和内酯型SL的总量，酸型SL的比例小于65质量％以及内酯型SL占剩余35质量％或更大的组合物被统称为“包含内酯型槐糖脂和酸型槐糖脂的组合物”(“包含内酯型SL和酸型SL的组合物”)。由于前者含酸型SL的组合物可以通过后者包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解来生产，因此通过该方法生产的含酸型SL的组合物在本文中被称为“包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物”(其也可以被简称为“本发明的水解产物”或“具有褐变抗性的水解产物”)。虽然这不是限制性的，但是认为由包含在包含内酯型SL和酸型SL的组合物中的脂质、多酚、氨基酸、碳水化合物等引起的褐变反应在本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)中得到抑制。 [0116] 在本发明中，含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以根据例如存在或不存在含酸型SL的组合物的纯化处理、纯化程度(酸型SL的纯度)、液体特性、皂化度或酸型SL的比例进一步分类为经粗纯化的含酸型SL的组合物和经纯化的含酸型SL的组合物。 [0117] 如本文中所提到的经粗纯化的含酸型SL的组合物包括在产生SL的酵母加工产物(其中大多数是水解产物，尤其是碱性水解产物)中未经历除固‑液分离(例如离心或过滤)之外的任何纯化处理的含酸型SL的组合物。相反，经纯化的含酸型SL的组合物意指无论纯化的程度如何，已经经受纯化处理(例如用有机溶剂等的萃取处理以及柱色谱)的含酸型SL的组合物。 [0118] (II)含酸型SL的组合物(本发明的水解产物) [0119] 本发明的含酸型SL的组合物是通过使包含内酯型SL和酸型SL的组合物(包括产生SL的酵母的液体培养物及其固‑液分离产物)水解而获得的组合物(水解产物)。含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)与在水解处理之后通过诸如用有机溶剂等萃取或柱色谱的处理而纯化的经纯化的含酸型SL的组合物的区别在于其为未经历除固‑液分离(例如离心和过滤)之外的任何高级纯化处理的经粗纯化的含酸型SL的组合物。 [0120] 水解处理通常包括碱水解(皂化)、酸水解和酶处理。在本发明中，优选碱水解(皂化)。 [0121] 此外，本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)与先前已知的经粗纯化的含酸型SL的组合物的不同之处在于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液具有至少以下特征(1)和(2)： [0122] (1)色相值(Abs.440)：5或更小；以及 [0123] (2)乙醇不溶性含量：小于3质量％。 [0124] 色相值(Abs.440)(1)反映了通过使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解而获得的水解产物的褐变程度(着色程度)。该值越高，褐变(着色)程度越高。该值越低，褐变(着色)程度越低。如本文中所提到的“包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液”意指例如通过使包含内酯型SL和酸型SL的组合物(其为产生SL的酵母的液体培养物或其固‑液分离产物)水解，使获得的水解产物回到室温(25±5℃)，使水解产物静置1周，然后通过经由孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤除去所得不溶物质，并收集滤液而获得的滤液。“包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液”是待用作用于测量和评估限定本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)中的下述特征(2)至(6)以及色相值(Abs.440)(1)的参照物的标准样品。这不旨在意指本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)限于该标准样品。 [0125] 色相值(Abs.440)(1)可以如下确定。将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液溶解在蒸馏水中以实现3质量％的乙醇不溶性含量。将获得的经稀释的水溶液通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤，并使用红外/UV‑可见分光光度计测量滤液在440nm的波长下的吸光度。将吸光度(Abs.440nm)乘以10，从而获得色相值。乙醇可溶性含量可以根据JIS K 3362‑2008测量。详细内容描述于实施例部分中。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液的色相值(Abs.440)优选为2或更小，更优选为1.5或更小，甚至更优选为1.3或更小。 [0126] 乙醇不溶性含量(质量％)(2)是指包含在包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液中的乙醇不溶性物质的量。乙醇不溶性含量可以根据JIS K 3304:2006“皂测试方法(Soap Testing Method)”中规定的用于乙醇不溶性含量的测量方法来测量。将在实施例部分中说明详细内容。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得包含内酯型SL和酸性SL的组合物的水解产物的滤液的乙醇不溶性含量优选为2质量％或更小，更优选为1.5质量％或更小，甚至更优选为1.3质量％或更小。 [0127] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的特征在于，包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液除以上特征(1)和(2)之外还具有以下特征(3)至(6)中的至少一者： [0128] (3)在黑暗中于50℃下放置1个月之后的色相值(Abs.440)：10或更小； [0129] (4)液体特性(pH)：6至9的pH； [0130] (5)皂化值：1mg KOH/g至25mg KOH/g；以及 [0131] (6)灼烧残余物：16质量％或更少。 [0132] 除以上特征(1)和(2)之外，本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)优选地还具有当使包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液在黑暗中于50℃下静置1个月(30天)时的特征(3)。如该特征中所示，具有特征(3)的含酸型SL的组合物具有长时间被抑制的褐变。从这个意义上讲，也从优异的储存稳定性(褐变抗性)方面来看，这种含酸型SL的组合物可以与先前已知的经粗纯化的含酸型SL的组合物区分开。该特征也可以根据上述测量色相值(Abs.440)的方法测量。在实施例部分中说明了详细内容。本发明的合适的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得在将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物过滤并使获得的水解产物的滤液在以上条件下静置之后，滤液的色相值(Abs.440)为9或更小，更优选为5或更小，甚至更优选为3或更小，特别优选为2或更小。 [0133] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)更优选地使得包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液除以上特征(1)和(2)或特征(1)至(3)之外还具有特征(4)。具有特征(4)的含酸型SL的组合物可以随时间推移以及甚至在被加热时保持相对稳定的褐变被抑制状态，并且可以提供为具有浅的着色或褐变抗性的经粗纯化的含酸型SL的组合物。本发明的合适的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得当将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物过滤时，获得的水解产物的滤液具有6至9的pH，优选地7至9的pH，更优选地7.5至8.5的pH(pH调节产物)。如果包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液从开始就具有6至9的pH，则不需要调节。然而，当pH不在该范围内时或者如果pH应设定为更合适的pH范围，则可以通过向滤液中添加并混合已知的pH调节剂来进行pH调节。这可以稳定地抑制褐变(褐变的发展和增加)，并且使得能够生产具有浅的着色或褐变抗性的包含经粗纯化的酸型SL的组合物。pH调节剂的实例包括但不限于：硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、硼酸和氢氟酸；有机酸，例如甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、谷氨酸和天冬氨酸。优选使用无机酸例如硫酸。 [0134] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)更优选地使得包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液除以上特征(1)和(2)、特征(1)至(3)或特征(1)至(4)之外还具有特征(5)和(6)中的至少一者。皂化值(5)是指在使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解之后包含在滤液中的游离酸(脂肪酸和羟基脂肪酸)和酯(SL的酯键和SL的内酯环)的量。该值越小，残留在含酸型SL的组合物中的游离酸、SL的乙酰基和内酯型SL的量越少。换言之，该值越小，酸型SL的比例越高以及由游离酸(脂肪酸和羟基脂肪酸)和SL的乙酰基引起的细胞毒性越低。皂化值可以根据JIS K 0070:1992“用于化学产品的酸值、皂化值、酯值、碘值、羟值和不可皂化物质的测试方法(Test methods for acid value，saponification value,ester value,iodine value,hydroxyl value and unsaponifiable matter of chemical products)”中规定的用于测量皂化值的中和滴定法来测量。在实施例部分中说明了详细内容。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液的皂化值优选为25mg KOH/g或更小，更优选为20mg KOH/g或更小，甚至更优选为15mg KOH/g或更小。该值的下限为0，优选为10mg KOH/g，更优选为7mg KOH/g。 [0135] 灼烧残余物(6)是指包含在包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液中的无机化合物的量(就硫酸盐而言)。该值越低，作为杂质被包含的无机化合物的量越少。灼烧残余物可以根据JIS K 0067:1992JIS K 0067‑1992“用于化学产品的损失和残余的测试方法(Test Methods for Loss and Residue of Chemical Products)”中规定的“灼烧残余物测试方法4”来测量。详细内容描述于实施例部分中。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)使得包含内酯型SL和酸型SL的组合物的水解产物的滤液的灼烧残余物优选为16质量％或更少，更优选为13质量％或更少，甚至更优选为11质量％或更少。灼烧残余物的量优选为小的，因为其可能引起沉淀并使乳液在乳液制剂中不稳定。下限为0，并且优选为例如1.5质量％，更优选为1.3质量％。 [0136] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)在形式上没有特别限制并且可以呈液体、乳液或固体的形式。固体形式的实例包括干固体例如冷冻干物、喷洒干燥产品和蒸发干燥产品；以及片剂、丸剂、散剂、颗粒剂和胶囊剂。 [0137] (III)含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的用途 [0138] 具有上述特征的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以在其原始状态下或在如下所述的任何处理之后用作浅着色或抗褐变的阴离子表面活性剂。含酸型SL的组合物也可以用作食品和饮料、药物、准药物、香料和化妆品以及清洁剂中的添加剂。当如此使用含酸型SL的组合物时，如有必要，可以进一步进行纯化处理(例如，固‑液分离例如过滤、溶剂萃取、吸附和色谱法)以除去杂质并减少着色和/或毒性。此外，可以进行诸如pH调节或者添加防腐剂、抗氧化剂或储存稳定剂的任何处理，只要不妨碍本发明的效果即可。 [0139] 如本文中所用的短语“食品和饮料”除一般的食品产品和饮料之外还包括具有特定功能并且例如为了维持健康而消费的食品和饮料，例如保健品、功能性健康食品、用于特定健康用途的食品以及补充剂。如本文中所用的短语“香料和化妆品”包括化妆品和香氛产品(例如清香剂、古龙水和香水)的概念。化妆品是指为了诸如清洁、美化和增加人身体的吸引力的目的，通过擦、喷洒或类似于那些的其他方法(例如，涂抹)施加至身体上以改变人的身体外观或者保持皮肤或头发的健康的那些化妆品；以及化妆品的实例包括彩妆化妆品(粉底、口红等)、基础化妆品(爽肤水、乳液等)、头发护理产品(生发剂、头发洗剂、发乳等)和洗漱产品(牙膏、香波、护发素、香皂、洗面奶、沐浴香氛等)。清洁剂是每天使用的清洁剂，无论其用于商业用途还是家庭用途。清洁剂包括用于手、脚和身体(包括用于动物和人)、衣服、餐具、家具、水区域(水槽、盆、浴室、马桶等)和微波炉(包括用于油脂的那些)的清洁剂。 [0140] 具有特征(5)的本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)除褐变抗性之外还具有低细胞毒性和低刺激性，并因此可以适当地用作需要低刺激性(或无刺激性)的外用组合物。这样的外用组合物的具体实例包括用于过敏性皮肤的香料和化妆品(化妆品和香氛产品)；应用于具有创伤或炎症的皮肤的外用药物产品或准药物；应用于眼睛、鼻腔、口腔等的粘膜的药物或准药物(例如，鼻喷洒剂、滴眼液、眼药膏、洗眼剂、洗鼻液、隐形眼镜配戴液等眼部护理产品)；等等。 [0141] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以按原样或在根据需要进一步进行任何处理之后用作如上所述的阴离子表面活性剂。可以添加用于阴离子表面活性剂的制备(制剂)中的第三组分，只要提供表面活性剂效果并且不损害本发明的特征例如浅的着色以及优选的褐变抗性即可。这样的第三组分的实例包括但不限于：溶剂，例如蒸馏水、离子交换水和乙醇；添加剂，例如氯化钠和氯化钾；增溶剂，例如甘油、丙二醇和己二醇；增稠剂，例如黄原胶、藻酸盐和葡聚糖；pH调节剂，例如盐酸、硫酸、硼酸、氢氧化钠和氢氧化钾；螯合剂，例如磷酸化合物、次氮基三乙酸(NTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)；以及其他组分，例如染料、防腐剂、储存稳定剂和酶。当使用第三组分时，包含在阴离子表面活性剂的制剂中的本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的量没有限制，只要其产生表面活性剂效果即可。就酸型SL的量而言，本发明的含酸型SL的组合物的量可以为例如0.005质量％至99.9质量％，优选为0.01质量％至50质量％，更优选为1质量％至50质量％，特别优选为5质量％至50质量％。 [0142] 如上所述，本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以按原样或在根据需要经受任何进一步处理之后用作用于食品和饮料、药物、准药物、清洁剂添加剂、或香料和化妆品的添加剂(食品添加剂、药物添加剂、准药物添加剂、清洁剂添加剂、香料或化妆品添加剂)。在这种情况下，可以添加用于以上各添加剂的制备(制剂)中的第三组分，只要实现期望的表面活性剂效果并且不损害本发明的特征例如浅的着色以及优选的褐变抗性即可。这样的第三组分可以根据目标产品(例如，食品和饮料、药物、准药物、清洁剂、或香料和化妆品)以常规方式设定。当混入第三组分时，包含在添加剂中的本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的量没有限制，只要其产生期望的表面活性剂效果即可。就酸型SL的量而言，本发明的含酸型SL的组合物的量可以为例如0.005质量％至99.9质量％，优选为0.01质量％至50质量％，更优选为0.02质量％至10质量％，特别优选为0.1质量％至5质量％。 [0143] 当通过添加将本发明的含酸型SL的组合物(水解产物)按原样或在根据需要进一步经受任选处理之后用于食品和饮料、药物、准药物、清洁剂、或香料和化妆品的制造中时，即，当本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)用于生产食品和饮料、药物、准药物、清洁剂、或香料和化妆品时，本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的量根据各产品的目的和特性在提供期望的表面活性剂效果的范围内适当地设定。在生产中，可以添加通常用于食品和饮料、药物、准药物、清洁剂、或香料和化妆品的生产中的第三组分。虽然这不是限制性的，但是本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以例如以这样的比例使用，所述比例使得当添加至食品和饮料、药物、准药物、清洁剂、或香料和化妆品中时，这些产品的CMC为300ppm或更大。例如，就包含在这些产品中的酸型SL的量而言，所述比例可以为例如0.005质量％至99.9质量％，优选为0.01质量％至50质量％，更优选为0.02质量％至10质量％，特别优选0.1质量％至5质量％。 [0144] (IV)用于生产含酸型SL的组合物的方法 [0145] (IV‑1)起始材料(包含内酯型SL和酸型SL的组合物或其加工产物)的制备[0146] 待用作用于生产本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)的起始材料的包含内酯型SL和酸型SL的组合物可以为例如产生内酯型SL和酸型SL的酵母(“产生SL的酵母”)的培养物或其加工产物。产生内酯型SL和酸型SL的酵母的实例包括已知酵母，以及优选的实例包括熊蜂生假丝酵母等。 [0147] 用于培养产生SL的酵母的优选方法为例如通过同时提供高浓度的糖和疏水油性底物来培养酵母的方法。所述方法不限于该方法。可以使用本领域中已知的各种方法(例如JP2002‑045195A、WO2013/129667、WO2015/034007和WO2015/020114中描述的那些)，只要不妨碍本发明的效果即可。更具体地，可以使用通过使用葡萄糖作为糖并且使用包含脂肪酸和植物油的碳源作为疏水油性底物来培养产生SL的酵母的方法。 [0148] 培养基组成没有特别限制。已知SL的脂肪酸部分取决于脂肪酸链长度和作为培养基组分而添加的疏水性底物的比例，并因此可以控制至一定程度。例如，油酸或包含高比例油酸的脂质适合于用作疏水性底物。实例包括：植物油，例如棕榈油、米糠油、菜籽油、橄榄油和红花油；以及动物油，例如猪油和牛脂肪。为了以稳定的高收率发酵生产SL，优选亲水性糖和疏水性脂肪/油的混合物作为碳源。葡萄糖经常用作亲水性底物。 [0149] 在通过使用已知的固‑液分离法(例如离心分离或倾析)从获得的培养物中分离并除去液体组分之后，将所得固体用水洗涤以获得含SL的级分(含SL的培养物)。通过培养产生SL的酵母而获得的含SL的级分(含SL的培养物)为内酯型SL和酸型SL的混合物(包含内酯型SL和酸型SL的组合物)。基于内酯型SL和酸型SL的总量，酸型SL含量小于65质量％(以固体为基础)。 [0150] 用于从产生SL的酵母的培养物中回收包含内酯型SL和酸型SL的组合物的方法可以为已知方法，例如JP2003‑9896A或其他出版物中描述的方法。这样的方法通过调节产生SL的酵母培养物或由该培养物制备的含SL的级分的pH来控制SL在水中的溶解度。具体地，例如，用例如NaOH溶液将产生SL的酵母的培养物调节成约6至7的pH以使SL溶解，然后离心以收集上清液。随后，将硫酸溶液等添加至上清液中以将上清液调节成约2至3的pH以使SL不溶。将所得混合物静置，然后倾析以获得水含量为约50％的包含内酯型SL和酸型SL的组合物。 [0151] (IV‑2)含酸型SL的组合物的制备 [0152] 通常，含酸型SL的组合物可以通过从上述包含内酯型SL和酸型SL的组合物中除去内酯型SL以减少内酯型SL来制备。用作起始材料的包含内酯型SL和酸型SL的组合物可以通过使用以上方法自身来制备或者通过第三方来制备，或者可以为市售产品。这样的起始材料可例如从Evonik Industries AG(德国)和Wheatoleo(法国)商购。 [0153] 含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以通过使包含内酯型SL和酸型SL的组合物经受下述水解处理来制备。根据该水解方法，可以有效地从包含内酯型SL和酸型SL的组合物中除去内酯型SL，从而获得以每100质量％的内酯型SL和酸型SL的总量78质量％或更大的期望比例包含酸型SL并且具有被抑制的褐变的含酸型SL的组合物。根据该方法，可以通过使组合物经受皂化处理(碱水解)而无需结合纯化处理(例如溶剂萃取处理、吸附处理和色谱法)来获得被除去内酯型SL并且具有被抑制的褐变的期望的含酸型SL的组合物。然而，该描述不旨在限制进行除本发明的水解处理之外的任何处理，包括纯化处理。 [0154] 本发明中使用的水解处理的特征在于，在80℃或更低的温度条件下使用相对于包含内酯型SL和酸型SL的目标组合物的皂化值(mg KOH/g)为0.8g当量至1.5g当量的碱性试剂来使包含内酯型SL和酸型SL的目标组合物经受水解。 [0155] 包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值表示所包含的游离酸(脂肪酸和羟基脂肪酸)和酯(SL的内酯环的酯键和SL的乙酰基)的量。皂化值可以根据JIS K 0070：1992“用于化学产品的酸值、皂化值、酯值、碘值、羟值和不可皂化物质的测试方法”中规定的用于测量皂化值的中和滴定法来测量。对于详细内容，参考实施例部分中的描述。 [0156] 由获得的皂化值(mg KOH/g)计算相当于1克皂化值的碱性试剂的量。例如，相当于用作起始材料的包含酮型SL和酸型SL的组合物的1克皂化值的碱性试剂的量可以根据下式来计算。 [0157] 数学式1 [0158] 对应于1g当量的碱性试剂的量(g)＝S×皂化值×(B/C)/1000 [0159] S：用作起始材料的包含酮型SL和酸型SL的组合物的质量(g) [0160] B：碱性试剂的分子量(例如，在NaOH的情况下为40) [0161] C：氢氧化钾的分子量(56.11) [0162] 使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解以制备本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)所需的碱性试剂的比例相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量。使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解所需的碱性试剂的比例可以通过将通过上式获得的碱性试剂的量(g)乘以0.8至1.5来计算。碱性试剂的比例优选为 0.8g当量至1.2g当量，更优选为0.8g当量至1.1g当量，甚至更优选为0.9g当量至1.1g当量，特别优选为1g当量。 [0163] 用于水解处理中的碱性试剂没有限制，但可以包括氢氧化物的金属盐(例如钠、钾、钙和镁)、碳酸盐、磷酸盐、或碱例如链烷醇胺。优选地，其为氢氧化物的金属盐，更优选为氢氧化钠。碱性试剂优选为氢氧化物的金属盐，更优选为氢氧化钠。 [0164] 用于水解处理的温度、压力和时间没有特别限制，只要可以在抑制褐变的同时实现包含在包含内酯型SL和酸型SL的组合物中的内酯型SL的内酯环的开环的目的和效果即可。温度、压力和时间优选使得可以在抑制目标酸型SL的诸如分解和化学改性的副反应(包括色素组分的形成)的同时有效地进行内酯环的开环。根据所使用的碱性试剂的量，反应温度可以适当调节在80℃或更低，优选地20℃至80℃的范围内。例如，当碱性试剂以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至0.9g当量的量使用时，温度可以在80℃或更低，优选地20℃至80℃，更优选地30℃至80℃的范围内。当碱性试剂以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.9g当量至1g当量的量使用时，温度优选在20℃至60℃，更优选地25℃至50℃的范围内。此外，当碱性试剂以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为1g当量至1.2g当量的量使用时，温度优选在20℃至50℃，更优选地25℃至40℃的范围内。当碱性试剂以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为1.2g当量至1.5g的量使用时，温度优选在20℃至50℃，更优选地25℃至35℃的范围内。 [0165] 压力，虽然没有限制，但是通常可以选自1个大气压至10个大气压，优选地1个大气压至2个大气压的范围，并且特别优选1个大气压(大气压)。反应时间通常在10分钟至5小时，优选地约1小时至约3小时的范围内。 [0166] 本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)可以通过这样的水解处理来制备。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)也可以通过将通过上述处理获得的水解产物进一步调节至室温(25±5℃)并过滤出该过程中产生的不溶物质来制备。此外，含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)也可以通过将水解产物调节至室温(25±5℃)，然后将水解产物调节成6至9的pH，并过滤出该过程中产生的不溶物质来制备。调节至室温和调节pH的顺序不限于此顺序，并且可以在pH调节之后将水解产物调节至室温。通过将水解产物的pH调节成6至9的pH的范围，可以抑制着色随时间的发展，并且可以制备具有良好的储存稳定性的抗褐变含酸型SL的组合物。优选的pH条件为7至9的pH，更优选7.5至8.5的pH的范围。 [0167] 由此可以制备其水解之后的滤液(水解产物的滤液)具有以上(1)至(2)的特征的含酸型SL的组合物。如本文中所提到的“水解之后的滤液”(“水解产物的滤液”)意指通过在调节至室温或pH调节之后，使用孔径为0.45μm的过滤器将水解产物中产生的不溶物质过滤出并收集滤液而获得的滤液。本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)优选地除特征(1)至(2)之外还具有特征(3)，并且更优选地除特征(1)至(2)或特征(1)至(3)之外还具有以上特征(4)。根据以上生产方法，可以制备除特征(1)至(2)、特征(1)至(3)、特征(1)至(2)和(4)或特征(1)至(4)之外还具有以上特征(5)和/或(6)的含酸型SL的组合物。特征(1)至(6)及其测量方法如上所述，其详细描述在此通过引用整体并入。 [0168] (V)用于生产具有褐变抗性的含酸型SL的组合物(具有褐变抗性的水解产物)的水解方法 [0169] 本发明还提供了用于生产具有褐变抗性的含酸型SL的组合物(具有褐变抗性的水解产物)的水解方法。本发明也提供了用于抑制含酸型SL的组合物的褐变的方法。所述方法可以通过使包含内酯型SL和酸型SL的组合物经受步骤(a)来进行： [0170] 步骤(a)：以基于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量的量使用碱性试剂在80℃或更低的条件下使包含内酯型SL和酸型SL的组合物反应。 [0171] 根据该方法，可以获得含酸型SL的组合物，所述含酸型SL的组合物的在水解之后的滤液具有至少以下特征(1)和(2)： [0172] (1)色相值(Abs.440)：5或更小；以及 [0173] (2)乙醇不溶性含量：小于3质量％。 [0174] 根据该方法，可以生产除以上特征(1)和(2)之外还具有以下特征(3)至(6)中的至少一者的含酸型SL的组合物。 [0175] 本发明的方法还可以包括在以上步骤(a)之后的以下步骤(b)： [0176] 步骤(b)：将在步骤(a)中获得的水解产物或该水解产物的滤液调节成6至9的pH。 [0177] 由此可以制备随时间而稳定地抑制着色的抗褐变含酸型SL的组合物(具有褐变抗性的水解产物)。 [0178] 本发明的水解方法中的各步骤、所使用的起始材料(包含内酯型SL和酸型SL的组合物)、获得的具有褐变抗性的含酸型SL的组合物(具有褐变抗性的水解产物)、其特征、其评估方法等如以上在(I)至(IV)中所述，并且各描述在此通过引用并入。 [0179] 如本文中所用的术语“包含”和“含有”包括基本上由…组成和由…组成的含义。 [0180] 实施例 [0181] 为了帮助理解本发明的结构和效果，下面参照实验例描述了本发明。然而，本发明不限于这些实验例(实施例和比较例)。本领域技术人员可以在本发明的精神内进行各种修改。除非另有说明，否则以下实验均在室温(25±5℃)和大气压条件下进行。 [0182] 下述生产例1和2中所制备的含酸型SL的组合物的各种物理特性(色相值(Abs.440)、乙醇可溶性含量、乙醇不溶性含量、皂化值和灼烧残余物)根据以下方法确定。 [0183] (a)水解产物的滤液的色相值(Abs.440) [0184] 将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的在水解之后的滤液放置在量瓶中，并用蒸馏水稀释以实现3质量％的乙醇可溶性含量。将获得的经稀释的水溶液迅速通过孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤以收集滤液，并使用红外/UV‑可见分光光度计在440nm的波长下测量获得的滤液的吸光度。将获得的滤液的吸光度(Abs.440nm)乘以10，并将获得的值限定为组合物的在水解之后的滤液的色相值(Abs.440)。滤液的乙醇可溶性含量可以通过以下(c)中描述的方法确定。 [0185] (b)水解产物的滤液的在50℃下静置1个月之后的色相值(Abs.440) [0186] 将包含内酯型SL和酸型SL的组合物的在水解之后的滤液放置在50℃的遮光培养箱中1个月(30天)，然后转移至量瓶中。将滤液用蒸馏水稀释以实现10质量％的乙醇可溶性含量。将获得的经稀释的水溶液用孔尺寸为0.45μm的过滤器过滤以收集滤液。使用红外/UV‑可见分光光度计测量滤液在440nm的波长下的吸光度。将获得的滤液的吸光度(Abs.440nm)乘以10，并将获得的值限定为标题化合物的水解产物的滤液的在50℃下静置1个月之后的色相值(Abs.440)。滤液的乙醇可溶性含量可以通过以下(c)中描述的方法来确定。 [0187] (c)乙醇可溶性含量 [0188] 乙醇可溶性含量是指当将测试样品溶解在乙醇中时溶解在乙醇中的物质的量，并且可以根据JIS K3362‑2008的规定测量。 [0189] 测量方法 [0190] 将锥形瓶和玻璃过滤器精确称重。这些仪器的重量在105℃下干燥至少2小时并在干燥器中冷却之后测量。精确称出约5g测试样品(水解产物的滤液或在50℃下静置1个月之后的滤液)至一毫克，并放入锥形瓶中。在向测试样品中添加100mL乙醇之后，将烧瓶配备上玻璃管，并在水浴中加热30分钟，同时不时地摇动以进行溶解。对于液体或糊状样品，使用99.5体积％乙醇。在将温热溶液按原样通过玻璃过滤器过滤之后，再次向锥形瓶中的残余物中添加50mL乙醇以溶解残余物。使用玻璃过滤器过滤所得温热溶液，并用热乙醇充分洗涤锥形瓶和玻璃过滤器。在使其冷却至室温之后，将滤液和洗液转移至250mL容量瓶中，并添加乙醇至标线。使用移液管，将液体的100mL部分等分到两个已知质量的200mL烧杯中。在将烧杯中的一者在水浴中加热以除去乙醇之后，将残余物在调节至105±2℃的干燥器中干燥1小时，并使其在干燥器中冷却，然后精确称重干燥残余物(g)。 [0191] 数学式2 [0192] 乙醇可溶性含量的计算方法 [0193] 乙醇可溶性含量(质量％)＝(A/[S×100/250])×100＝([250×A]/S) [0194] A：干残余物(g)的量(g) [0195] S：测试样品(g)的质量(g) [0196] (d)乙醇不溶性含量(质量％) [0197] 乙醇不溶性含量是指通过将测试样品溶解在99.5体积％乙醇(99.5)中并将溶液过滤而获得的不溶物质的量。乙醇不溶性物质根据JIS K 3304：2006“皂测试方法(Soap Test Method)”中规定的乙醇不溶性含量通过以下方法来测量。 [0198] 测量方法 [0199] (a)将约5g测试样品(水解之后的滤液)放置在500mL锥形瓶中，并称重至1mg的精度(S：测试样品的质量)。向其中添加200mL乙醇(95)，并连接回流冷却器以在水浴中加热测试样品并使测试样品溶解。 [0200] (b)将该溶液通过滤纸或玻璃过滤器过滤。待使用的滤纸或玻璃过滤器预先在调节至105±2℃的干燥器中干燥，冷却，然后称量质量。 [0201] (c)将锥形瓶中残余的不溶物质用少量被加热至接近沸点的乙醇(95)洗涤两次或三次，并完全转移至滤纸或玻璃过滤器上。 [0202] (d)此外，将不溶物质用温热乙醇(95)充分洗涤并过滤。 [0203] (e)将过滤乙醇不溶物的滤纸或玻璃滤器用调节至105±2℃的干燥器干燥1小时，然后使其在干燥器中冷却并称量质量。 [0204] (f)重复(e)的步骤直到两个连续测量的重量之差为1mg或更小。 [0205] (g)将获得的质量除以预先已测量的滤纸或玻璃过滤器的质量，从而获得乙醇不溶物的质量(A)。 [0206] 数学式3 [0207] 乙醇不溶物的计算方法 [0208] 乙醇不溶物(质量％)＝(A/S)×100 [0209] S：样品的质量(g) [0210] A：乙醇不溶物的质量(g) [0211] (e)皂化值(mg KOH/g) [0212] 皂化值是指就为了中和1g测试样品中的游离酸(脂肪酸和羟基脂肪酸)并使该1g测试样品中的酯(内酯型SL的酯键和SL的乙酰基)皂化所需的氢氧化钾的mg而言的量。根据JIS K 0070:1992“用于化学产品的酸值、皂化值、酯值、碘值、羟值和不可皂化物质的测试方法”中规定的中和滴定法通过以下方法来确定皂化值。 [0213] 测量方法 [0214] (a)在200mL至300mL锥形瓶中称量1.5g至2.0g测试样品(水解之后的滤液)至1mg的精度(S：测试样品的质量)。待收集的测试样品的量为这样的量，所述量使得滴定样品所需的0.5mol/L盐酸的体积大致为空白测试所需的体积的一半。 [0215] (b)通过使用移液管向样品中添加25mL 0.5mol/L氢氧化钾乙醇溶液。0.5mol/L氢氧化钾乙醇溶液可以通过以下制备：将35g氢氧化钾溶解在20mL水中，添加乙醇(95)以制成1L，在阻隔二氧化碳的同时使所得混合物静置2至3天，然后进行过滤。 [0216] (c)将空气冷却器连接至锥形瓶。在不时地摇动并使内容物混合的同时，将内容物在水浴、沙浴中或热板上平缓地加热以反应30分钟。 [0217] (d)在反应完成之后立即进行冷却。在内容物硬化成琼脂状状态之前，在从空气冷却器的顶部喷洒少量水的同时洗涤内壁。然后移除空气冷却器。 [0218] (e)添加1mL酚酞溶液(10g/L)作为指示剂，并用0.5mol/L盐酸进行滴定。将反应终点限定为在指示剂的淡红色不再出现约1分钟时的时间(C：测试样品的滴定量)。 [0219] (f)对于空白测试，在不使用任何测试样品的情况下进行步骤(a)至(e)，并确定空白测试中的滴定量(B)。 [0220] 数学式5 [0221] 皂化值的计算方法 [0222] 皂化值＝([B‑C])×f×28.05)/S [0223] B：用于空白测试中的滴定的0.5mol/L盐酸的量(mL) [0224] C：用于测试样品的滴定的0.5mol/L盐酸的量(mL) [0225] F：0.5mol/L盐酸因子 [0226] S：测试样品的质量(g) [0227] 28.05：相当于包含在1mL0.5mol/L盐酸中的盐酸的量的量的氢氧化钾的毫克数(mg/mL) [0228] (f)灼烧残余物(质量％) [0229] 灼烧残余物是指包含在测试样品中的无机化合物的百分比(就硫酸盐而言)。根据JIS K 0067:1992“用于化学产品的损失和残余的测试方法”中规定的用于灼烧残余物测试方法的方法4通过以下方法来测量灼烧残余物。 [0230] 测量方法 [0231] (a)在坩埚或具有恒定重量的蒸发皿中称量各样品至0.1mg的精度。 [0232] (b)向容纳样品的坩埚或蒸发皿中添加约0.2ml硫酸，并在不沸腾的情况下将样品在热板上逐渐加热以使样品蒸发或碳化，并继续加热直到不再产生白烟。 [0233] (c)随后，将容纳灰色样品的坩埚放入电炉中，并在500±50℃下强烈加热1小时。 [0234] (d)将从电炉中取出的坩埚迅速转移至干燥器中，并使其冷却，然后从干燥器中取出。称量质量至0.1mg的精度(测量值(残余物))。 [0235] (e)重复步骤(c)和(d)直到达到恒定量。 [0236] (f)根据下式由测量值(残余物)和预先测量的收集量计算灼烧残余物(％)。 [0237] 灼烧残余物的计算方法 [0238] 灼烧残余物(硫酸盐)(质量％)＝(W2–W3)/[W1–W3])×100 [0239] W1：灼烧之前的测试样品和坩埚的质量(取样的量)(g) [0240] W2：灼烧之后的测试样品和坩埚的质量(测量的量)(g) [0241] W3：坩埚的质量(g) [0242] 参照生产例1：槐糖脂的提取(包含内酯型SL和酸型SL的组合物的制备) [0243] 使用每升包含10g水性葡萄糖(由Nihon Shokuhin Kako Co.,Ltd.生产，产品名称：Nisshoku Gansui Kessho Budoto)、10g蛋白胨(由Oriental Yeast Co.,Ltd.生产，产品名称：Peptone CB90M)和5g酵母提取物(由Asahi Food&Healthcare Co.,Ltd.生产，产品名称：Meast Powder N)的液体培养基作为培养基。在30℃下摇动的同时将熊蜂生假丝酵母ATCC22214在培养基中培养2天。将其用作液体预培养物。 [0244] 将液体预培养物以4％的比例接种到置于5升发酵罐中的主培养基(3L)中，然后在30℃下以0.6vvm的充气量培养6天以进行发酵。主培养基每升包含100g水性葡萄糖、50g棕榈油精(由NOF Corporation生产，产品名称：Palmary 2000)、50g油酸(由Acid Chem生产，产品名称：Palmac760)、1g氯化钠、10g磷酸二氢钾、10g七水合硫酸镁、2.5g酵母提取物(由Asahi Food&Healthcare Co.,Ltd.生产，产品名称：Meast Powder N)和1g尿素(灭菌之前的pH为4.5至4.8)。 [0245] 从培养开始后第6天，停止发酵。将从发酵罐中取出的液体培养物加热，然后回到室温并使其静置2至3天。结果，液体培养物从底部按此顺序分成以下三层：液体褐色沉淀物层、可能主要包含真菌细胞的乳白色固体层、和上清液。在除去上清液之后，以等于除去的上清液的量的量添加工业用水或地下水。在搅拌所得混合物的同时，逐渐添加48质量％氢氧化钠水溶液以将混合物调节至6.5至6.9的pH，从而使包含在液体培养物中的SL溶解。将所得产物用台式离心机(Westfalia，由Westfalia Separator AG生产)离心以使乳白色固体沉淀，并收集上清液。在搅拌收集的上清液的同时，逐渐添加62.5质量％硫酸水溶液以将上清液调节成2.5至3.0的pH，从而再次使SL不溶解。在使所得混合物静置2天之后，通过倾析尽可能多地除去上清液。获得残余物作为经粗纯化的含SL的组合物(水含量为约50％，参照例1)。包含内酯型SL和酸型SL的组合物包含少于65质量％的酸型SL和35质量％或更多的内酯型SL。 [0246] 生产例1：经粗纯化的含酸型SL的组合物的制备(No.1) [0247] 测量了以上在参照生产例1中获得的包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值。以一定量添加48质量％氢氧化钠水溶液以实现相对于表1至3中所示的皂化值的碱当量，并在表1至3中所示的温度下进行处理2小时以进行碱水解(皂化)2小时。在反应之后，使水解产物回到室温(25℃)，并使其静置1周。然后使用孔径为0.45μm的过滤器通过过滤除去产生的不溶物质。获得收集的滤液(水解产物的滤液)作为经粗纯化的含酸型SL的组合物(实施例1至13和比较例1至11)。基于被限定为100质量％的酸型SL和内酯型SL的总和，经粗纯化的含酸型SL的组合物包含78质量％或更多的酸型SL和少于22质量％的内酯型SL。 [0248] 使用收集的水解产物的滤液(经粗纯化的含酸型SL的组合物)作为测试样品，通过上述方法测量各种物理特性(pH、色相值(Abs.440)、乙醇不溶性含量(质量％)、皂化值(mg KOH/g)和灼烧残余物(质量％))。进一步使水解之后的滤液在黑暗中于50℃下静置1个月(30天)。然后通过上述方法测量色相值(Abs.440)。表1至3示出了结果。 [0249] 表1至3还示出了基于以下标准进行的评估的结果。 [0250] 评估标准 [0251] +++：水解产物的滤液的色相值(Abs.440)为1.5或更小，并且在50℃下1个月之后的色相值(Abs.440)为1.7或更小。 [0252] ++：水解产物的滤液的色相值(Abs.440)为2或更小，并且在50℃下1个月之后的色相值(Abs.440)大于1.7且为3或更小。 [0253] +：水解产物的滤液的色相值(Abs.440)为5或更小，并且在50℃下1个月之后的色相值(Abs.440)大于3且为10或更小。 [0254] ‑：水解产物的滤液的色相值(Abs.440)大于5，或者在50℃下1个月之后的色相值(Abs.440)大于10。 [0255] 表1 [0256] [0258] (1)水解之后的滤液的色相值(Abs.440nm) [0259] (2)滤液的在50℃下静置1个月之后的色相值(Abs.440nm)(以下同样适用)。 [0260] 表2 [0261] [0262] 表3 [0263] [0264] 如表1至3中所示，结果确定了当通过以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为0.8g当量至1.5g当量的量使用碱性试剂在特定温度条件下使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解时，可以获得褐变被抑制的含酸型SL的组合物(水解产物)，其中包含内酯型SL和酸型SL的组合物的在水解之后的滤液的色相值为5或更小，以及滤液的在50℃下储存1个月之后的色相值为10或更小。 [0265] 用于水解的温度条件可以根据待使用的碱性试剂的克当量来设定。具体地，如表1至3中所示，当碱性试剂以0.8g当量或更大但小于1.0g当量，优选地0.8g当量至0.9g当量的量使用时，温度条件优选为20℃至80℃。当碱性试剂以0.9g当量至1.0g当量的量使用时，温度条件优选为20℃至60℃。当碱性试剂以1.0g当量至1.5g当量的量使用时，温度条件优选为20℃至50℃。当以相对于包含内酯型SL和酸型SL的组合物的皂化值为1g当量或更大的量使用碱性试剂来使包含内酯型SL和酸型SL的组合物水解时，温度优选为60℃或更低，并且更优选为低于50℃。 [0266] 此外，通过PTL2的参照生产例2中描述的方法制备的经粗纯化的含酸型SL的产物对应于以上比较例2的组合物。为了将参照生产例1中所制备的包含内酯型SL和酸型SL的组合物调节成12的pH，需要对应于1.0g当量的量的碱性试剂。在碱性试剂的存在下在80℃下处理2小时之后获得的水解产物的滤液的色相值(Abs.440)为8.20，其大于5。在50℃下1个月之后获得的滤液的色相值(Abs.440)为13.01，其大于10。由此，确定了获得的产物不对应于具有褐变抗性的特征的本发明的含酸型SL的组合物(本发明的水解产物)。 [0267] 生产例2：经粗纯化的含酸型SL的组合物的制备(No.2) [0268] 向以上在参照生产例1中获得的包含内酯型SL和酸型SL的组合物中添加氢氧化钠的水溶液以实现表4中所示的克当量。将组合物在表4中所示的温度下处理2小时以进行碱水解(皂化处理)。在反应之后，使水解产物回到室温(25℃)并通过使用9.8M硫酸溶液将其调节成8的pH。随后将获得的水解产物通过孔径为0.45μm的过滤器过滤以除去产生的不溶物质。获得所得滤液(水解产物的滤液)作为经粗纯化的含酸型SL的组合物(实施例14至17)。当酸型SL和内酯型SL的总和被限定为100质量％时，经粗纯化的含酸型SL的组合物包含78质量％或更多的酸型SL和少于22质量％的内酯型SL。 [0269] 使用获得的水解产物的滤液(经粗纯化的含酸型SL的组合物)作为测试样品，通过上述方法测量各种物理特性(pH、色相值(Abs.440)、乙醇不溶性含量(质量％)、皂化值(mg KOH/g)和灼烧残余物(质量％))。进一步使水解之后的滤液在黑暗中于50℃下静置1个月(30天)。然后通过上述方法测量色相值(Abs.440)。表4示出了结果。 [0270] 表4 [0271] [0272] 如表4中所示，结果确定了当使包含内酯型SL和酸型SL的组合物经受碱水解然后调节成6至9的pH，优选地调节成中性pH时，即使在50℃下静置1个月之后，色相值也可以被抑制成1.7或更小，并且可以显著地抑制随时间而发展的褐变现象。 |
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