地黄多糖在制备调节人体肠道菌群药物中的应用 |
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| 申请号 | CN202410093035.8 | 申请日 | 2024-01-23 | 公开(公告)号 | CN118005814A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 中国药科大学; | 发明人 | 闻晓东; 赵洁; 陈伊梦; 杨杰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种地黄多糖在调节肠道菌群功能中的应用。所述的地黄多糖可以通过提高 益生菌 的数量，降低致病菌的数量，从而调节人体肠道菌群。本发明利用三代测序对肠道菌群结构变化进行了深度阐述，为开发和利用地黄多糖提供了新的思路。 | ||||||
| 权利要求 | 3 |
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| 说明书全文 | 地黄多糖在制备调节人体肠道菌群药物中的应用技术领域[0001] 本发明属于人体肠道菌群调节技术领域，具体涉及地黄多糖在制备调节人体肠道菌群药物中的应用。 背景技术[0002] 人体肠道微生物群是一个庞大的、复杂的微生态系统，与人体健康息息相关。研究发现，人体肠道微生物群中有超过99%的微生物分属于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形杆菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，其中厚壁菌门和拟杆菌门在健康成人的肠道微生物群中占主导地位。在人体肠道环境中，微生物群 不仅可以利用自身及自身代谢产物调节人体相关疾病，还可以通过膳食纤维来改善宿主健 康。肠道微生物群的失调会引起多种人类慢性疾病，包括炎症性肠病、二型糖尿病、肥胖和心血管病。因此，可以通过调节肠道菌群中有益菌与致病菌的占比，从而改善相应的疾病。 如Phocaeicola属是人体肠道菌群的组成之一，可以通过产生短链脂肪酸盐来促进肠屏障 完整性，同时在调节炎症反应方面也发挥着作用；Blautia属作为肠道菌群组成之一，可以通过产生细菌素来防止病原体的定植，同时也可以产生多种代谢产物参与脂质代谢、炎症 及氧化应激。而Fusobacterium属作为肠道菌群中的一种致病菌，通常在结肠癌患者中高度富集，可以破坏肠黏膜屏障完整性，加重肠道炎症浸润，从而加剧患者炎症和致癌反应； Clostridium属也是肠道菌群中一类会破坏人体肠道屏障，从而引起相应的肠道疾病的致 病菌。在正常的生理状态下，肠道菌群中的有益菌与致病菌处于相互制约的动态平衡状态，而在疾病状态下，动态平衡被破坏，致病菌丰度提高，抑制有益菌的生长。因此，了解疾病状态下的肠道微生物丰度的变化，可以为治疗疾病提供理论依据。 [0003] 现研究表明，可以通过补充益生元与益生菌来改善肠道菌群的紊乱现象。常见的益生菌主要有乳酸菌和双歧杆菌。益生元是指宿主微生物选择性利用的赋予健康益处的底 物，它们进入人体后，在肠道中被相应的有益菌所利用，增加有益菌在微生物群中的丰度，以此增强肠道的免疫通道，从而维持宿主的健康生理环境。常见的益生元有低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、多糖等。 [0004] 地黄（Rehmannia glutinosa Libosch，RG）是玄参科、地黄属多年生草本植物。因其地下块根为黄白色而得名地黄，其根部为传统中药之一，最早出典于《神农本草经》。地黄的化学成分中含有大量糖类：D‑葡萄糖，D‑半乳糖，D‑果糖，蔗糖，蜜二糖，蜜三糖，水苏糖，甘露三糖，以水苏糖的含量最高，达64.9%。现代研究表明，多糖是与地黄的生物活性和药理性质有关的主要化学成分。据报道，地黄多糖具有抗肿瘤、抗焦虑、抗疲劳、抗氧化活性、增强免疫、抗肥胖糖尿病以及改善糖脂代谢等作用，地黄多糖（RGP）的药用价值值得深入研究。中药多糖可以被肠道微生物群分解发酵，具有调节肠道微生物群、改善肠道疾病的作用。据文献报道，地黄多糖可以调节人体肠道菌群中的Bifidobacterium属、Lactobacillus属以及Faecalibacterium属。本发明发现，地黄多糖不仅可以调节Bifidobacterium属、 Lactobacillus属、Faecalibacterium属，还可以调节Dorea、Phocaeicola、Blautia、 Leuconostoc、Lactiplantibacillus、Weissella、Paeniclostridium、Parasutterella、Fusobacterium、Bilophila、Alistipes、Streptococcus、Clostridium等细菌。这为探究地黄多糖调节肠道菌群的变化提供了新的思路。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种地黄多糖在人体肠道菌群中的调节作用。所述的地黄3 多糖的分子量主要分布在2.61‑8.97×10K Da和250Da‑10K Da两分子量段。这种地黄多糖 中所含单糖摩尔比为甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=0.90：0.14：358.81： 43.4：4.62。通过提高肠道微生物群中益生菌的数量、降低致病菌的数量，从而改善肠道微生物群的结构。本发明为开发和利用地黄多糖提供了新的思路。 [0006] 本发明的技术方案：本发明提供了一种地黄多糖在人体肠道菌群结构中的应用，利用三代测序可以更 加精确阐明肠道菌群的变化。 [0007] 进一步地，所述地黄多糖的分子量主要分布在2.61‑8.97×103K Da和250Da‑10K Da两分子量段。 [0008] 进一步地，所述地黄多糖中所含单糖摩尔比为甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=0.90：0.14：358.81：43.4：4.62。 [0009] 进一步地，所述地黄多糖显著提高了益生菌的数量，降低致病菌的数量，改善人体肠道菌群结构。 [0010] 进一步地，所述益生菌包括Dorea、Phocaeicola、Blautia、Leuconostoc、Lactiplantibacillus、Weissella、Oxalobacter、Coprobacter属水平细菌。 [0011] 进一步地，所述益生菌包括Dorea _ formicigenerans、Phocaeicola _ vulgatus、Phocaeicola _ dorei、Blautia _ obeum、Leuconostoc _ lactis、 Lactiplantibacillus _ plantarum、Weissella _ confus、Ruminococcaceae _ bacterium、Oxalobacter _ formigenes、Coprobacter _ fastidiosus种水平细菌。 [0012] 进一步地，所述致病菌包括Paeniclostridium、Parasutterella、Fusobacterium、Bilophila、Alistipes、Streptococcus、Clostridium属水平细菌。 [0013] 进一步地，所述致病菌包括Paeniclostridium _ ghonii、Parasutterella _ excrementihominis、Fusobacterium _ ulcerans、Bilophila _ wadsworthia、Alistipes _ onderdonkii、Streptococcus _ australis、Streptococcus _ thermophilus、 Clostridium _ fessum、Clostridium _ perfringens种水平细菌。 有益效果 [0014] 本发明提供了一种全新的地黄多糖，其组成和分子量分布未见文献报道，另外发明人发现其调节肠道菌群结构，具体而言，通过全长微生物多样性测序和统计分析方法，本申请发明人发现了地黄多糖具有调节人体肠道菌群的功能，可以改变肠道菌群中微生物的 组成丰度，地黄多糖可以显著升高益生菌：拟杆菌与厚壁杆菌比值，以及Dorea _ formicigenerans、Phocaeicola _ vulgatus、Phocaeicola _ dorei、Blautia _ obeum、Leuconostoc _ lactis、Lactiplantibacillus _ plantarum、Weissella _ confus、 Ruminococcaceae _ bacterium、Oxalobacter _ formigenes、Coprobacter _ fastidiosus等益生菌的丰度，降低致病菌丰度：Paeniclostridium _ ghonii、 Parasutterella _ excrementihominis、Fusobacterium _ ulcerans、Bilophila _ wadsworthia、Alistipes _ onderdonkii、Streptococcus _ australis、Streptococcus _ thermophilus、Clostridium _ fessum、Clostridium _ perfringens。地黄多糖可以通过调节肠道菌群中益生菌与致病菌的丰度比例，调节肠道内的PH值，促进短链脂肪酸的产生，从而提高肠道免疫力，维持机体健康状态。 [0015] 综上所述，本发明证实了地黄多糖可以作为一种益生元调节人体肠道菌群，通过全长微生物多样性测序为地黄多糖调节人体肠道菌群提供更为精确的实验依据，同时也为 进一步研究地黄多糖调节肠道菌群提供了新的思路。 附图说明 [0016] 图1 HPGPC法测定地黄多糖分子量分布色谱图；图2 PMP柱前衍生化法测定地黄多糖单糖组成色谱图（1.甘露糖 2.半乳糖醛酸 3.葡萄糖 4.半乳糖 5.阿拉伯糖）； 图3 发酵液中总多糖的含量变化； 图4 发酵液中还原糖的含量变化； 图5 发酵液中多糖分子量的变化 图6 发酵液中pH值的变化； 图7 发酵液中短链脂肪酸含量变化（A.乙酸 B.丙酸 C.异丁酸 D.丁酸 E.2‑甲基 丁酸 F.戊酸 G.异戊酸 H.3‑甲基戊酸 I.4‑甲基戊酸 J.己酸 ）； 图8 三组发酵液中菌群组成属水平分析（A.给药组发酵液中相对丰度升高菌群 B.给药组发酵液中相对丰度降低菌群）； 图9 三组发酵液中菌群组成种水平分析（A.给药组发酵液中相对丰度升高菌群 B.给药组发酵液中相对丰度降低菌群）。 具体实施方式[0017] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。 [0018] 本发明中所用地黄多糖（RGP）购买自陕西百川科技有限公司。实施例1：本发明中地黄多糖分子量及单糖组成表征 [0019] 1.1多糖分子量测定称取地黄多糖2mg，1ml蒸馏水溶解制成2mg/ml溶液，8000rpm离心5min，取上清100 μl进行分子量分析。另称取适量各分子量葡聚糖标准品同法制样，根据不同分子量葡聚糖的分子量对数及保留时间绘制回归方程，计算样品多糖分子量分布。 [0020] 色谱柱：PL aquagel‑OH MIXED‑H (7.5×300 mm，8 µm，Agilent Technologies，CA，USA)和PL aquagel‑OH MIXED‑M (7.5×300 mm，8 µm，Agilent Technologies，CA，USA)，流动相：纯水，流速：0.6 mL/min，柱温：25 ℃，洗脱时间：45 min，进样量：10μL。 [0021] 样品分析结果如图1所示，根据标准曲线RT = ‑0.2679 LgMw + 11.775，地黄多糖3 分子量主要分布在2.61‑8.97×10K Da和250Da‑10K Da 两分子量段。 [0022] 1.2多糖单糖组成测定取地黄多糖10mg，1ml蒸馏水溶解制成10mg/ml溶液，8000rpm离心5min后取上清 1ml，加入2ml 2M TFA于安瓿瓶中，酒精喷灯封口，混匀。110℃，4h水解，冷却，氮吹。完全吹干后再加入2ml甲醇氮吹，重复3次，除去残余的TFA。残渣加入2ml超纯水溶解。12000rpm离心5min。取100μl上清液与100μl 0.5M PMP甲醇溶液混匀，加入100μl 0.3M NaOH涡旋混匀， 70℃水浴30min，冷却至室温后加入100μl 0.3M HCl中和。取300μl反应液，900μl氯仿萃取3次，8000rpm离心5min，取上层水相100μl进样。另取阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、甘露糖、葡萄糖标准品制成混标溶液，制作标准曲线。 [0023] 色谱柱：Morphling C18T。流动相：A相（20mM乙酸铵水溶液），B相（乙腈），洗脱程序：0‑30min，16%（B）；30‑50min，16‑24%（B）；50‑55min，24‑16%（B）；55‑58min，16%（B）。检测波长：250nm。进样量20μl。 [0024] 分析结果如图2所示，地黄多糖单糖摩尔比为甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=0.90：0.14：358.81：43.4：4.62。 实施例2：本发明中地黄多糖调节人体肠道微生物的作用 [0025] 收集四名健康志愿者(两名男性两名女性)空腹晨便并置于厌氧袋中保存，志愿者均没有胃肠道疾病，在过去3个月内没有接受任何抗生素治疗。每个样本取等量混合，加入灭菌生理盐水(0.9%，w/v)，制成10% (w/v)的粪便悬浮液，剧烈震荡使其均质化，3层纱布过滤，得到粪菌液。 [0026] 配置基础培养基，取2.0g蛋白胨，2.0g酵母提取物，0.1g NaCl，0.04g K2HPO4，0.01g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2·6H2O，2.0g NaHCO3，0.025g氧化血红素，10uL维生素 K1，0.5g半胱氨酸，0.5g胆汁盐，2.0mL吐温‑80，4ml 0.025g/L刃天青，溶于1L蒸馏水中，并用0.1M HCl调节至pH6.8‑7.0。将基础培养基分成三组，空白组不另外添加碳源，地黄多糖组每100ml基础培养基中加入1g地黄多糖，阳性对照组每100ml基础培养基中加入1g菊粉。 115℃灭菌20min。以菌液：培养基=1：10的比例向培养基中添加粪菌液，每组设6个平行，放入厌氧箱37℃培养，在0，6，12，24，48h五个时间点取样。 [0027] 2.1发酵液总多糖与还原糖测定测定0，6，12，24，48h五个时间点发酵液中的总多糖与还原糖含量。 [0028] 采用苯酚‑硫酸法测定发酵液中的总多糖。每个样本用蒸馏水稀释100倍后，取0.2ml加入到玻璃试管中，加入0.1ml 5%苯酚溶液后置于冰上加0.55ml浓硫酸，冰上静置 5min后，于100℃水浴锅中加热20min，于490nm波长下测定其吸光度。另取葡萄糖于100℃烘干1h后，称取5.44g于容量瓶中加蒸馏水定容至50ml，配成0.1088mg/ml标准溶液。取0、 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2ml于玻璃试管中，加蒸馏水补齐至0.2ml，制成不同浓度的标准溶液，同法制样检测得标准曲线。结果如图3所示。 [0029] 采用DNS法测定发酵液中的还原糖。1g二硝基水杨酸、0.2g苯酚、0.5%亚硫酸钠和1g氢氧化钠溶于100ml水中制成DNS试剂，取0.2ml样品加入0.1mlDNS试剂，100℃水浴加热 5min，冷却至室温，于540nm波长下测定其吸光度。另取葡萄糖配制成2mg/ml标准溶液，取0、 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2ml于玻璃试管中，加蒸馏水补齐至0.2ml，制成不同浓度的标准溶液，同法制样检测得标准曲线。结果如图4所示。 [0030] 总糖量与还原糖量均随时间逐渐降低，表明培养基中的糖类物质随时间逐渐被肠道菌群利用。 [0031] 2.2发酵过程中多糖分子量变化测定0，6，12，24，48h五个时间点发酵液中的多糖分子量，结果如图5所示，再次证 明发酵液中的地黄多糖可以被肠道菌群发酵利用。 [0032] 2.3发酵液pH值的测定使用pH计测定0，6，12，24，48h五个时间点发酵液的pH值，结果如图6所示。从0h到 48h，所有组的PH值均有一定的下降，发酵48h后，地黄多糖发酵培养液的PH值从8.43±0.02显著降低到4.26±0.07，菊粉发酵培养液的PH值从8.94±0.05显著降低到3.91±0.03。除 初始时间外，地黄多糖发酵培养液与菊粉发酵培养液的pH值显著低于空白组，说明肠道菌 群可能利用多糖生成了短链脂肪酸类物质。 [0033] 2.4发酵液中短链脂肪酸测定取0.05ml发酵液于1.5ep管中，加入0.15ml乙腈除蛋白，12000rpm离心10min，取 0.04ml上清或对照品（乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、2‑甲基丁酸、戊酸、异戊酸、3‑甲基戊酸、4‑甲基戊酸、正己酸）溶液，加入0.02ml 175mM 3‑NPH、0.02ml 105mM EDC衍生化试剂以及 0.02ml内标（5mM AA‑d4以及0.1mM leu‑d7），封口后涡旋，40℃、60rmp反应30min。冰上静置 1min，加入10%乙腈水定容至1ml，涡旋，12000rpm离心10min，取上清进样。通过内标法分别绘制各个短链脂肪酸的标准曲线，并根据所建立的标准曲线计算各个样本中短链脂肪酸的 含量。 [0034] 仪器：AB Sciex Triple QuadTM。色谱柱：BEH‑C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。流动相：A相（0.1%甲酸水），B相（0.1%甲酸乙腈），洗脱程序：0‑1min，5%B；1‑5min，5‑25%B；5‑16min，25‑40%B；16‑17min，40‑95%B；17‑18min，95‑100%，B；18‑20min，100%B；20‑21min， 100‑5%B。流速：0.3mL/min。柱温：40°C。进样量：2μL。采用MRM质谱检测模式对目标化合物进行定量分析。 [0035] 发酵液中短链脂肪酸含量变化如图7所示，各类短链脂肪酸含量均有不同程度的升高。与空白组相比，乙酸、丙酸和丁酸含量有明显升高，异丁酸、2‑甲基丁 酸、戊酸、异戊酸、3‑甲基戊酸、4‑甲基戊酸、正己酸则无明显变化。结果表明，地黄 多糖可以促进肠道菌群产生短链脂肪酸。大部分肠道微生物可以通过发酵多糖来产生乙酸 和丙酸。据报道，乙酸可以抑制脂质堆积，丙酸可以减轻肥胖相关的炎症反应。总之，这些结果表明，地黄多糖与菊粉可以促进短链脂肪酸的产生，有益于宿主健康。 [0036] 2.5发酵液菌群DNA提取及全长微生物多样性测序取第48h的发酵液，12000rmp离心10min，收集沉淀用于提取菌群DNA及全长微生物 多样性测序。取均质化处理的菌群沉淀，采用天根粪便DNA提取试剂盒，按照说明书提取总菌群DNA。 [0037] 所提取的DNA送至北京百迈客生物科技有限公司进行三代全长微生物多样性测序。该测序基于PacBio测序平台。提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有 Barcode 的特异引物（F:AGRGTTTGATYNTGGCTCAG; R:TASGGHTACCTTGTTASGACTT），进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 PacBio Sequel II进行测序。 [0038] 本测序中，微生物多样性分析包括以下操作：（1）从原始数据中导出 CCS 序列，对 CCS 序列进行 Barcode 识别，长度过滤，去 除嵌合体，得到 Effective CCS； （2）将 Effective CCS 序列进行聚类/去噪，划分OTUs/ASVs（后面统一称之为 Feature），并根据Feature的序列组成得到其物种分类； （3）基于特征(Feature)分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获 得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、分类学水平系统进化发生树及分类学树状图； （4）通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了各样品的Ace、 Chao1、Shannon及Simpson指数，绘制了样品稀释曲线及等级丰度曲线； （5）通过 Beta多样性分析来比较不同样品在物种多样性方面（群落组成及结构） 存在的差异大小。根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类（UPGMA）树、NMDS分析、样品聚类热图及样品PCA、PCoA图、基于多种距离的箱线图等； （6）在物种分类学组成层面，通过组间差异显著性分析，进一步衡量不同样本(组) 间的物种丰度组成差异，在不同组间寻找具有统计学差异的 Biomarker； （7）根据物种在各样本中的组成分布，构建关联网络，进行网络分析、相关性热图、 RDA/CCA分析、环境因子排序回归分析； （8）根据16S rRNA或ITS基因测序结果，通过功能预测分析，对样品进行基因功能 或表型预测并计算功能基因或者表型丰度。 [0039] 对三组发酵液中菌群组成进行属水平分析，结果如图8所示。与地黄多糖共孵育的发酵液中的Dorea、Phocaeicola、Blautia、Leuconostoc、Lactiplantibacillus、 Weissella、Oxalobacter、Coprobacter等菌种的丰度显著提高，Paeniclostridium、 Parasutterella、Fusobacterium、Bilophila、Alistipes、Streptococcus、Clostridium等菌种的丰度显著降低，阳性对照菊粉组中也出现相似的结果。总体来讲，地黄多糖可以促进肠道菌群中有益菌的生长，同时还可抑制有害菌生长，具有调节肠道微生物的作用。 [0040] 对三组发酵液中菌群组成进行种水平分析，结果如图9所示。与地黄多糖共孵育的发酵液中的Dorea _ formicigenerans、Phocaeicola _ vulgatus、Phocaeicola _ dorei、Blautia _ obeum、Leuconostoc _ lactis、Lactiplantibacillus _ plantarum、 Weissella _ confus、Ruminococcaceae _ bacterium、Oxalobacter _ formigenes、 Coprobacter _ fastidiosus等种水平菌种的丰度显著提高，Paeniclostridium _ ghonii、Parasutterella _ excrementihominis、Fusobacterium _ ulcerans、Bilophila _ wadsworthia、Alistipes _ onderdonkii、Streptococcus _ australis、Streptococcus _ thermophilus、Clostridium _ fessum、Clostridium _ perfringens等种水平菌种的丰度显著降低，其发酵结果与阳性对照菊粉组相似。总体来讲，地黄多糖可促进肠道有益菌生长的同时还可抑制有害菌生长，具有调节肠道微生物的作用。 [0041] 通过属水平以及种水平分析可发现地黄多糖与菊粉对肠道菌群的变化大致相同，与空白组有明显差异，说明地黄多糖对于人体肠道菌群的作用与菊粉相似。菊粉是一种可 以调节肠道菌群、稳定血糖、改善减肥等功能的益生元。上述结果提示地黄多糖可能具有与菊粉类似的调节肠道菌群、改善糖尿病、促进人体健康的作用。 |
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