一种少根根霉-淀粉-仙草胶的复合物胶球及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202410114710.0 | 申请日 | 2024-01-29 | 公开(公告)号 | CN117965521A | 公开(公告)日 | 2024-05-03 |
| 申请人 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所(广西亚热带农产品加工研究所); | 发明人 | 黄秋伟; 韦祖生; 檀小辉; 黄秋岚; 龙凌云; 毛立彦; 黄欣欣; 艾静汶; 谢朝敏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于菌球制备技术领域，具体涉及一种少根根霉‑ 淀粉 ‑仙草胶的复合物胶球及其制备方法。本发明提供了一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球，包括以下制备用原料：少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和 金属离子 无机盐溶液；本发明通过筛选适合少根根霉 糖化 及产孢的淀粉溶液培养体系获得量化的菌体，然后经过搅碎培养液，完成第1阶段的固定化；之后将根霉菌‑淀粉培养液与仙草胶和海藻酸钠制成混合体系，完成第2阶段的固定化，再加入金属离子无机盐溶液中进行交联，提高了胶球的凝胶强度。本发明制备的少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球根霉菌活化能 力 强，具备较好复用糖化淀粉溶液能力和较强胶体强度。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球，其特征在于，包括以下制备用原料：少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液；所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3):(2～4)； |
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| 说明书全文 | 一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球及其制备方法技术领域[0001] 本发明属于菌球制备技术领域，具体涉及一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球及其制备方法。 背景技术[0002] 少根根霉又称为米根霉，广泛存在于自然环境中，包括土壤、植物器官、食物、人体以及空气。少根根霉发酵能够产生多种代谢产物，包括各种有机酸和酶类。酶类物质包括脂肪酶、纤维素酶及淀粉酶，少根根霉通过自产的多种淀粉酶，可使淀粉底物转化为可发酵性糖如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和果糖等，转化的发酵性糖在有氮元素和无机盐离子参与下被少根根霉利用来产孢，当前少根根霉常应用研究方向为提高糖化发酵能力及糖化产物产量。而少根根霉的保藏是开展少根根霉研究的基础。 [0003] 将菌制备成菌粉是工业上的应用以及菌种保藏方式之一，菌粉主要具备运输方便、易于保藏、安全性高等优点。此外，将菌体固定化也是一种常见的应用研究技术手段，一般是通过大孔或者多孔材料(淀粉、网布、丝瓜瓢等)吸附菌体以及包埋等形式实现。 [0004] 菌体包埋主要是将菌体与海藻酸钠溶液体系混合后，再将其混合体系溶液滴入至金属离子溶液中，发生高分子交联反应从而形成表面多孔结构的胶球而将菌体包裹在里面。为了获得凝胶性能比较好的胶球，一般是要提高海藻酸钠浓度，但海藻酸钠水溶性较差，提高浓度会加大溶解难度，同时浓度变大会使得溶液粘度增大，从而使得菌体在混合体系中混合均匀较为困难。仙草胶是仙草中含有的一种组成较为复杂的具有凝胶性的水溶性粗多糖，其具备很好的凝胶性能和热稳定性，形成的凝胶弹性和韧性都很好。而当前仙草胶应用于食品方面居多，用于菌体包埋的研究暂未见报道。 发明内容[0005] 本发明的目的提供一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球及其制备方法，该复合物胶球制备时加入仙草胶，使菌体在混合体系中易混合均匀。 [0006] 本发明提供了一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球，包括以下制备用原料：少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液；所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3):(2～4)； [0007] 所述海藻酸钠溶液的质量浓度为4％～6％； [0008] 所述金属离子无机盐溶液的质量浓度为2％～6％； [0009] 所述金属离子无机盐溶液的体积为少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液总体积的2.5倍以上。 [0010] 优选的，所述少根根霉‑淀粉培养液包括少根根霉‑旱藕淀粉培养液。 [0011] 优选的，所述少根根霉‑淀粉培养液的制备方法包括： [0013] 所述淀粉培养液以MS无机盐培养液为溶剂制备得到；所述淀粉培养液中淀粉的质量浓度为8％～14％。 [0014] 优选的，以淀粉培养液和少根根霉菌孢液的总溶液体积计，少根根霉菌孢液的接种量为总溶液体积的30％～40％。 [0015] 优选的，所述金属离子无机盐溶液包括氯化钙溶液。 [0016] 优选的，所述仙草胶溶液的制备方法包括： [0018] 将所述静提液进行加热提取后过滤，得到滤液； [0019] 将所述滤液与无水乙醇混合，得到沉淀后的仙草胶溶液； [0020] 将所述沉淀后的仙草胶溶液离心，得到沉淀； [0021] 将所述沉淀烘干后与碳酸氢钠溶液混合，得到仙草胶溶液；所述仙草胶溶液的固形物浓度为4％±0.2％。 [0022] 优选的，所述仙草与碳酸氢钠溶液的料液比为1g:18mL～1g:22mL。 [0023] 优选的，所述加热提取的温度为90℃；所述加热提取的时间为55～65min。 [0024] 本发明提供了一种复合物胶球的制备方法，包括以下步骤： [0025] 将少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液混合，得到凝胶溶液； [0026] 将所述凝胶溶液滴加到金属离子无机盐溶液中，得到复合物胶球。 [0027] 本发明提供了上述技术方案复合物胶球在少根根霉菌种保藏和/或糖化淀粉中的应用。 [0028] 本发明的有效效果：本发明提供了一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球，包括以下制备用原料：少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液；所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3):(2～4)； [0029] 所述海藻酸钠溶液的质量浓度为4％～6％； [0030] 所述金属离子无机盐溶液的质量浓度为2％～6％； [0031] 所述金属离子无机盐溶液的体积为少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液总体积的2.5倍以上。 [0032] 本发明利用海藻酸钠和仙草胶的凝胶性能，包埋少根根霉‑淀粉培养液得到凝胶液，凝胶液加入金属离子无机盐溶液中进行交联，制备得到凝胶球，提高了胶球的凝胶强度。 [0033] 本发明在包埋过程中利用仙草胶较好的凝胶性能，能够减少海藻酸钠的使用量，降低少根根霉在混合体系中混合难度，同时使制备得到的胶球内根霉菌活化能力强，少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球具备较好复用糖化淀粉溶液能力和较强胶体强度、复水性，为后期木薯少根根霉的应用提供方向。附图说明 [0035] 图1为40倍物镜下少根根霉孢液中根霉菌孢子在计数板内的形态及大小； [0036] 图2为糖化组中不同培养温度和培养时间少根根霉糖化效果图； [0037] 图3为30％接种量培养管中的溶液液面少根根霉褐色孢子囊长势图； [0038] 图4为加入无水乙醇后析出沉淀的仙草胶图； [0039] 图5为10倍物镜下淀粉液中根霉菌孢子在计数板内的分布及形态； [0040] 图6为10倍物镜下淀粉液中根霉菌菌丝在计数板内的分布及形态； [0041] 图7为用于制备4.00mm左右含菌胶球的特制1mL注射器； [0042] 图8为不同浓度海藻酸钠制取得到的胶球；图8中的上排从左到右的浓度依次为2％、3％、4％，图8中的下排从左到右的浓度依次为5％、6％； [0043] 图9为实施例2中“胶球凝胶验证试验”部分制备得到的含菌胶球球径和凝胶强度； [0044] 图10为制备得到的含菌胶球形态； [0045] 图11为接入根霉菌胶球24h后的淀粉液与新鲜淀粉液的对比，其中左边为新鲜淀粉液，右边为接入根霉菌胶球24h后的淀粉液； [0046] 图12为菌胶球复用糖化淀粉溶液的效果图； [0047] 图13为复用糖化4次后的胶球形态； [0048] 图14为实施例4中的PDA试管斜面培养情况； [0049] 图15为实施例4中的菌胶球保存40d后PDA平板培养情况； [0050] 图16为实施例5中的干燥脱水后的菌胶球形态； [0051] 图17为实施例5中的干燥菌球接种于PDA平板培养前状态； [0052] 图18为实施例5中的干燥菌球接种于PDA平板培养48h后状态。 具体实施方式[0053] 本发明提供了一种少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球，包括以下制备用原料：少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液；所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液的体积比为1:(1～3):(2～ 4)；所述金属离子无机盐溶液的体积为少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液总体积的2.5倍以上。 [0054] 在本发明中，所述少根根霉‑淀粉培养液的制备方法优选包括：将少根根霉菌孢液接种于淀粉培养液中进行培养，得到混合液；将所述混合液粉碎后得到少根根霉‑淀粉培养液。本发明对所述少根根霉的来源没有特殊限定，采用常规的菌株即可。在本发明实施例中，优选利用保藏编号为CGMCC NO.19912的少根根霉菌株进行验证。保藏编号为CGMCC NO.19912的少根根霉的基本形态特征为匍匐菌丝及假根褐色，孢囊梗褐色，可长至600μm，孢囊梗直径为5～15μm；孢子囊球形或近球形，孢子囊直径为40～160μm，成熟孢子囊为黑色或者褐色。 [0055] 在制备所述少根根霉‑淀粉培养液之前，本发明优选先制备少根根霉菌孢液。本发明所述少根根霉菌孢液的制备方法优选包括：将少根根霉接种在PDA培养基中进行暗培养，得到少根根霉丝和孢子；将所述少根根霉菌丝和孢子与无菌生理盐水混合后得到悬浊液；将所述悬浊液振荡和抽滤后得到少根根霉菌孢液。本发明制备少根根霉菌孢液暗培养的时间优选为4d～7d，所述制备少根根霉菌孢液暗培养的温度优选为29～31℃，更优选为30℃。 本发明所述暗培养的作用为促进根根霉菌孢子的产生。本发明所述混合的方式优选为利用无菌玻璃棒轻轻搅拌；所述混合的时间优选为1～2min；本发明所述振荡的转速优选为160～190r/min，更优选为170～180r/min；振荡的时间优选为1～1.5h，更优选为1.2～1.3h；振荡的温度优选为30～35℃，更优选为32～33℃；本发明所述振荡优选在摇床中完成。本发明所述振荡利于少根根霉孢囊中的孢子得以释放及成团的孢子散开；本发明所述过滤优选利用无菌擦镜纸抽滤完成，本发明所述抽滤的作用为除去菌丝及培养基杂质，将孢子留在滤液中。本发明制备的少根根霉菌孢液中的孢子形态基本为球形或近球形，孢子平均大小为 7.8μm，具体见图1；本发明制备的菌孢液当天使用，或者尽量于3～7℃冰箱保存4d内使用。 6 6 本发明所述菌孢液的孢子浓度优选为0.50×10～0.85×10CFU/mL。 [0056] 得到少根根霉菌孢液后，本发明优选将少根根霉菌孢液接种于淀粉培养液中进行培养，得到混合液。本发明所述淀粉溶液优选将淀粉与MS无机盐培养液混合后得到；所述淀粉优选包括旱藕淀粉和/或马铃薯淀粉，更优选为旱藕淀粉。本发明所述淀粉作为碳源，促进少根根霉的孢子萌发和菌丝生长。本发明所述淀粉培养液中淀粉的质量浓度优选为8％～14％，进一步优选为9％～13％，更优选为12％。本发明以MS无机盐培养液作为溶剂制备淀粉溶液是为了促进少根根霉产生孢子。以淀粉培养液和少根根霉菌孢液的总溶液体积计，本发明少根根霉菌孢液的接种量优选为总溶液体积的30％～40％，更优选为30％～35％。本发明所述少根根霉菌孢液接种于淀粉培养液中进行培养优选为暗培养；所述暗培养的温度优选为30～35℃，进一步优选为33～35℃，更优选为35℃；所述暗培养的时间优选为72～120h，更优选为96h。本发明所述暗培养温度和时间的选择在于利于少根根霉的孢子囊的产生。得到混合液，本发明优选将所述混合液进行粉碎后得到少根根霉‑淀粉培养液。 本发明所述粉碎优选利用匀浆机完成，所述粉碎的时间优选为30s。本发明所述粉碎的作用为少根根霉和淀粉培养液均质混匀。本发明通过筛选适合少根根霉糖化及产孢的淀粉溶液培养体系获得量化的菌体，然后经过搅碎培养液，使得培养液中的淀粉底物充分吸附少根根霉菌体，完成第1阶段的固定化。 [0057] 在本发明中，所述仙草胶溶液的制备方法优选包括：将仙草与碳酸氢钠溶液混合后进行静置提取，得到静提液；所述仙草优选包括的茎部和/或带叶片的分枝；将所述静提液进行加热提取后过滤，得到滤液；将所述滤液与无水乙醇混合，得到沉淀后的仙草胶溶液；将所述沉淀后的仙草胶溶液离心，得到仙草胶沉淀；将所述仙草胶沉淀烘干后与碳酸氢钠溶液混合，得到仙草胶溶液。本发明将仙草的茎部和/或带叶片的分枝与碳酸氢钠溶液混合前，优选将所述仙草的茎部和/或带叶片的分枝剪成小段之后依次进行干燥、粉碎和过筛；本发明优选将仙草地上部的茎部和/或带叶片的分枝冲洗之后用剪刀剪成小段；本发明所述小段的长度优选为4～8cm。本发明所述干燥优选包括鼓风干燥；所述鼓风干燥优选在鼓风干燥箱中完成；本发明所述干燥优选至仙草的茎部变脆且可轻易折断停止；本发明所述过筛优选利用20目筛完成。 [0058] 过筛后得到筛下物仙草干粉，本发明所述仙草干粉的含水量优选小于10％，更优选为9.75％。本发明优选将仙草干粉与碳酸氢钠溶液混合后进行静置提取，得到静提液。本发明所述碳酸氢钠溶液的摩尔浓度优选为0.14mol/L，选择此摩尔浓度的碳酸氢钠溶液是为了仙草胶更好的溶解，因为仙草胶属于酸性多糖，易溶于碱性溶液，此摩尔浓度的碳酸氢钠溶液碱性温和，降低蛋白及糖苷类杂质在碳酸氢钠溶液中的溶出率。本发明所述仙草干粉与碳酸氢钠溶液的料液比优选为1g:18mL～1g:22mL，更优选为1g:20mL。选择此料液比是为了提高仙草胶的出胶率。本发明所述静置提取的温度优选为室温25～35℃；本发明所述静置提取的时间优选为25～35min，更优选为30min。静置提取的作用为了促进仙草胶溶出。 [0059] 得到静提液，本发明优选将所述静提液进行加热提取后过滤，得到滤液。本发明所述加热提取的温度优选为88～92℃，更优选为90℃；所述加热提取的时间优选为55～65min，更优选为60min。加热提取的作用为使得仙草胶更快地溶于溶剂中。加热提取结束后，待所得提取液的温度降至65～70℃，本发明优选将所得提取液进行过滤，得到滤液；本发明所述过滤优选利用200目纱网完成。 [0060] 得到滤液后，本发明优选将所述滤液与无水乙醇混合，得到沉淀后的仙草胶溶液。本发明所述滤液与无水乙醇的体积比优选为1：(2～3)，更优选为1:2.5；本发明所述无水乙醇的作用为沉淀仙草胶。得到沉淀后的仙草胶溶液，本发明优选将所述沉淀后的仙草胶溶液离心，得到仙草胶沉淀；本发明对所述离心的参数没有特殊限定，采用常规的方法即可。 本发明所述离心的转速优选为10000r/min；离心的时间优选为10min。离心后，得到仙草胶沉淀，本发明优选将所述仙草胶沉淀烘干后与碳酸氢钠溶液混合，得到仙草胶溶液。本发明所述烘干的作用为去除无水乙醇；烘干后，本发明优选在所得仙草胶沉淀中添加碳酸氢钠溶液混合加热后得到仙草胶溶液。本发明所述加热的温度优选为80℃；本发明所述加热的作用为促进仙草胶溶解；本发明优选先添加部分碳酸氢钠溶液搅拌至仙草胶沉淀溶解后再添加剩余的碳酸氢钠溶液；本发明所述仙草胶溶液的可溶性固形物浓度优选为4％± 0.2％。本发明所述仙草胶溶液优选于115℃湿热灭菌20min后应用。 [0061] 在本发明中，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为4％～6％，更优选为5％。本发明所述海藻酸钠溶液的制备方法优选包括：称取一定量的海藻酸钠粉末，加入去离子水溶解后定容至100mL，得到海藻酸钠溶液；本发明所述海藻酸钠溶液优选在105℃湿热灭菌15min后应用。 [0062] 在本发明中，所述金属离子无机盐溶液的质量浓度为2％～6％，进一步优选为2.5％～5％，更优选为3％。所述金属离子无机盐溶液优选包括氯化钙溶液；本发明所述氯化钙溶液的制备方法优选包括：称取一定量的氯化钙粉末，加入去离子水溶解后定容至 100mL，得到氯化钙溶液；本发明所述氯化钙溶液优选于121℃湿热灭菌15min后应用。 [0063] 得到少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液后，本发明优选将所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液按照体积比1:(1～3):(2～4)【即1:(1～3):(2～4)】进行混合，得到凝胶溶液，优选为1:(1～2):(2～3)，更优选为1:1:2。该1:(1～3):(2～4)范围的体积比可以使得凝胶溶液中仙草胶溶液的可溶性固形物浓度在1％～1.5％之间，海藻酸钠溶液浓度则维持为未混合前原溶液浓度的一半，易形成复合物胶球。本发明将少根根霉‑淀粉培养液与仙草胶和海藻酸钠制成凝胶溶液混合体系，进行包埋，完成第2阶段的固定化。 [0064] 本发明提供了上述技术方案所述的复合物胶球的制备方法，包括以下步骤： [0065] 将少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液混合，得到凝胶溶液； [0066] 将所述凝胶溶液滴加到金属离子无机盐溶液中，得到复合物胶球。本发明对所述混合的参数没有特殊限定，采用常规的方法保证混合均匀即可。 [0067] 少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液的制备方法在上文已经论述，在此不再赘述。所述凝胶溶液的制备在上文已经论述，在此不再赘述。 [0068] 本发明将所述凝胶溶液滴加到金属离子无机盐溶液中，得到复合物胶球。所述金属离子无机盐溶液的体积为少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液总体积的2.5倍以上，更优选为少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液总体积的2.5倍～ 5倍。在本发明实施例中，所述少根根霉‑淀粉培养液、仙草胶溶液、海藻酸钠溶液和金属离子无机盐溶液的体积比为1:1:2:10～20。本发明所述滴加时优选利用自制的4.00±0.20mm口径的注射器完成。本发明对所述滴加的速度优选为0.1～0.125mL/s。在本发明实施例中，利用1mL注射器，吸取1mL的凝胶溶液，通过注射器沿金属离子无机盐溶液的液面垂直方向将凝胶溶液匀速滴入金属离子无机盐溶液中，耗时8～10s可把混合液滴完。本发明的技术方案也可以利用其他口径的注射器，同样能够形成菌胶球。本发明自制注射器的方法优选为：取1mL的正常移液枪头，平切掉枪头尖部，使得剩余枪头的切口截面直径为4.00± 0.20mm，之后将枪头套入1mL注射器前段即可。本发明得到的复合物胶球为圆球形胶球。本发明所述金属离子无机盐溶液的作用为提高复合物菌球凝胶强度。本发明所述复合物胶球的球径为3.75～3.82mm，胶球凝胶强度优选为1.940N～1.948N。本发明将凝胶溶液混合体系加入金属离子无机盐溶液中进行交联，进一步提高了胶球的凝胶强度。 [0069] 本发明通过筛选适合少根根霉糖化及产孢的淀粉溶液培养体系获得量化的菌体，然后经过搅碎培养液，使得培养液中的淀粉底物充分吸附菌体，完成第1阶段的固定化；之后将少根根霉‑淀粉培养液与仙草胶和海藻酸钠制成混合体系，进行包埋，完成第2阶段的固定化，将第2阶段的固定化所得混合体系加入金属离子无机盐溶液中进行交联，进一步提高了胶球的凝胶强度。 [0070] 本发明提供了上述技术方案所述的复合物胶球或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合物胶球在少根根霉菌种保藏和/或糖化淀粉中的应用。本发明所制备得到的胶球内根霉菌活化能力强，具备较强保藏活性，球内菌体经长时间冷藏，仍保持较高菌种活化能力，本发明制备得到的胶球可再生利用能力强，复用糖化4次的胶球，干燥脱水后，仍具备较好的菌种活化能力及复水性。本发明所制备得到的胶球具备较好复用糖化淀粉溶液能力和较强胶体强度，重复利用胶球糖化淀粉溶液4次，第4次糖化的还原糖含量降至第1次糖化量的49.11％，但胶球仍是具备糖化淀粉能力，且胶球整体保持完整，说明胶球的复用性好。 [0071] 本发明的少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球(以下简称胶球)制备方法操作方便，且具备良好的重复性。本发明通过获得少根根霉‑淀粉、仙草胶溶液和海藻酸钠溶液，再将三种溶液按1:(1～3):(2～4)的体积比混合均匀制成凝胶液，凝胶液经过金属离子无机盐溶液交联即可制得胶球，获得的胶球使得少根根霉得以量化且可控制。以20mL淀粉溶液为例，30％的接种量通过公式C＝V菌/(V菌+V淀粉)×100％计算得到，需要添加约8.6mL菌孢液，培养后就可获得28.6mL少根根霉‑淀粉培养液，按体积比1:1:2换算可得到114.4mL凝胶液，1mL凝胶液可制得胶球6～8颗，114.4mL凝胶液可得胶球大约686～915颗，即8.6mL菌孢液经本发明方法制胶球即可获得686～915颗，量化效率较高，制备得到的胶球数量多。 [0072] 本发明的木薯少根根霉‑淀粉‑仙草胶复合物胶球制备方法试验内容，主要是针对于试验前期所分离得到木薯少根根霉菌株(少根根霉的保藏编号为CGMCC NO.19912，参见中国专利CN202211509250.9一种少根根霉菌粉的制备方法及应用)所设计及实施，但其它可糖化淀粉的少根根霉复合物胶球也有可能适用本方法。 [0073] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0074] 实施例1少根根霉与淀粉复合物培养液的制备 [0075] 1、少根根霉孢液的制备 [0076] (1)将木薯少根根霉接种在装有20mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的50mL刻度试管斜面，30℃暗培养4d～7d，使之产孢。 [0077] (2)在上述长菌试管斜面中加入20～25mL无菌生理盐水，用无菌玻璃棒轻轻搅拌液体1～2min，使得斜面表面的新鲜根霉菌菌丝与孢子分散于生理盐水中，之后将试管中的悬浊液移入150mL锥形瓶(内含6mm的玻璃珠25～30粒)。再将锥形瓶置于气浴摇床中，摇床温度30～35℃，转速160～190r/min，摇晃振荡1～1.5h，使得一些孢囊中的孢子得以释放及成团的孢子散开，得到孢子杂液。之后用2张无菌擦镜纸抽滤孢子杂液以除去菌丝及培养基杂质，让孢子通过留在滤液中，所得到的滤液即为实验所需的少跟根霉菌孢子液，简称菌孢液。 [0078] (3)吸取20μL菌孢液于血球计数板中计数，25×16规格的血球板计数公式如下：每4 毫升液体孢子数(CFU/mL)＝N×25×10×稀释倍数CFU/mL，其中N表示左上、左下、中间、右上、右下五个中方格的平均孢子数。菌孢液中的孢子形态基本为球形或近球形，孢子平均大小为7.8μm，具体见图1。制备的菌孢液当天使用，或者尽量于3～7℃冰箱保存4d内使用。 [0079] 2、少根根霉培养淀粉种类的筛选 [0080] (1)制备葡萄糖标准曲线 [0081] 葡萄糖标准曲线的制定参照表1进行，制备的葡萄糖标准曲线(即还原糖标准曲2 线)为y＝0.5506x‑0.0441(R＝0.9999)，y为吸光值，x为葡萄糖量。 [0082] (2)淀粉种类筛选 [0083] 以马铃薯淀粉、木薯淀粉、旱藕淀粉三种淀粉作为碳源，以水作为溶剂，配制质量浓度为4％的淀粉溶液20mL，配制方式：先分别将淀粉和溶剂于121℃湿热灭菌15min，之后两者于超净工作台冷却至室温，将两者混合搅拌即为所需的淀粉溶液，后续操作淀粉溶液均按此方式配制，分别配制得到马铃薯淀粉溶液、木薯淀粉溶液和旱藕淀粉溶液。 [0084] 马铃薯淀粉溶液分为糖化组1和CK组1，其中糖化组1具体处理为：将步骤1的(2)制备的菌孢液按马铃薯淀粉溶液和菌孢液总体积10％的接种量接入溶液中作为糖化组，混合均匀后，置于30℃的培养箱静置暗培养96h。设置三个平行实验。 [0085] CK组1：将生理盐水按马铃薯淀粉溶液和生理盐水总体积的10％接种量接入溶液中作为CK组，混合均匀后，置于30℃的培养箱静置暗培养96h。设置三个平行实验[0086] 木薯淀粉溶液分为糖化组2和CK组2，具体处理同马铃薯淀粉溶液，唯一的区别在于将马铃薯淀粉溶液替换成木薯淀粉溶液 [0087] 旱藕淀粉溶液分为糖化组3和CK组3，具体处理同马铃薯淀粉溶液，唯一的区别在于将马铃薯淀粉溶液替换成旱藕淀粉溶液。 [0088] 具体接种量公式为：C＝V菌/(V菌+V淀粉)×100％(式中：C表示接种量；V菌表示菌液的体积，单位mL；V淀粉表示淀粉溶液的体积，单位mL)。 [0089] 采用DNS法测量暗培养后所得淀粉溶液中的还原糖含量，测定的具体步骤参照葡萄糖标准曲线的制备步骤进行，每个糖化组设置三个平行实验，还原糖含量取重复试验平均值，选择糖化效果较好的淀粉作为碳源，并用于后续实验的开展。具体实验操作及结果见表1和表2。根据表2的数据可知，在接菌量和培养条件相同的情况下，同一底物碳源浓度，少根根霉对旱藕淀粉的利用更好，在旱藕淀粉溶液中的菌丝生长量和淀粉糖化程度明显优于其余两种淀粉，因此选择旱藕淀粉作为后续实验的碳源。 [0090] 表1葡萄糖标准曲线制备 [0091] [0092] 表2各个淀粉的少根根霉培养及糖化效果 [0093] [0094] 3、旱藕淀粉浓度的筛选 [0095] 处理1：以旱藕淀粉作为碳源，水为溶剂，配制质量浓度4％的旱藕淀粉溶液20mL，将步骤1的(2)制备的菌孢液按旱藕淀粉溶液和菌孢液总体积10％的接种量(即约2.2mL)接入旱藕淀粉溶液中作为糖化处理组，同体积的2.2mL生理盐水接入旱藕淀粉溶液作为对照组(CK)；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0096] 处理2：同处理组1，唯一的区别在于配制质量浓度6％的旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0097] 处理3：同处理组1，唯一的区别在于配制质量浓度8％的旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0098] 处理4：同处理组1，唯一的区别在于配制质量浓度10％的旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0099] 处理5：同处理组1，唯一的区别在于配制质量浓度12％的旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0100] 处理6：同处理组1，唯一的区别在于配制质量浓度14％的旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0101] 处理1～处理6的糖化处理组和对照组均置于30℃的培养箱静置暗培养96h，培养完成后测量处理1～处理6的糖化处理组和对照组所得旱藕淀粉溶液中的还原糖含量，平均值见表3。根据表3可知，从菌丝生长量来看，在接菌量和培养条件相同的情况下，质量浓度12％的旱藕淀粉溶液和质量浓度14％的旱藕淀粉溶液中根霉菌长势较为一致，同时优于其他处理组；从淀粉糖化效果来看，在接菌量和培养条件相同的情况下，随着淀粉碳源浓度的增加，旱藕淀粉溶液中的还原糖随之增加，其中旱藕淀粉质量浓度从4％～12％这一区间范围内，所设置各个浓度间还原糖含量均呈显著差异，而旱藕淀粉质量浓度12％和旱藕淀粉质量浓度14％这两个浓度的还原糖含量无显著差异，糖化效果处于同一水平。因此，为了减少碳源的用量，综合考虑选择旱藕淀粉质量浓度12％作为后续实验的碳源浓度值。 [0102] 表3各个浓度旱藕淀粉溶液的少根根霉培养及糖化效果 [0103] [0104] 4、水溶液与培养液溶液的筛选 [0105] 采用两种溶剂来配制淀粉溶液，一种为水；另一种为MS无机盐培养液，MS无机盐培养液只含有常规植物组培MS培养基大量元素和微量元素，配制方法见表4。 [0106] 处理1：以旱藕淀粉作为碳源，以水为溶剂，配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL，将步骤1的(2)制备的菌孢液按旱藕淀粉溶液和菌孢液总体积10％的接种量接入旱藕淀粉溶液中作为糖化处理组，同体积的生理盐水接入旱藕淀粉溶液作为对照组(CK)，糖化处理组和CK各设置三个平行实验； [0107] 处理2：同处理1，唯一的区别在于以0.25MS培养液作为溶剂配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL；0.25MS表示同样体积培养液中大量元素和微量元素添加量降为原MS培养液的0.25倍，0.5MS、0.75MS、1.25MS同理；糖化处理组和CK各设置三个平行实验； [0108] 处理3：同处理1，唯一的区别在于以0.5MS培养液作为溶剂配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和CK各设置三个平行实验； [0109] 处理4：同处理1，唯一的区别在于以0.75MS培养液作为溶剂配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和CK各设置三个平行实验； [0110] 处理5：同处理1，唯一的区别在于以MS培养液作为溶剂配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和CK各设置三个平行实验； [0111] 处理6：同处理1，唯一的区别在于以1.25MS培养液作为溶剂配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液20mL；糖化处理组和CK各设置三个平行实验。 [0112] 处理1～处理6的糖化处理组和对照组均置于30℃的培养箱静置暗培养96h，测量暗培养后所得淀粉溶液中的还原糖含量，测定结果的平均值见表5。根据表5可知，从菌培养效果来看，以培养液为溶剂的旱藕淀粉溶液根霉菌整体长势较好，均有菌丝和孢子囊生成，且在0.25MS至MS这一浓度范围内，随着无机盐元素添加量增加，产孢量逐步增加，MS培养液作为溶剂时产孢最多，当元素添加量增加至1.25MS时，呈现抑制作用，产孢量减少，而水溶液培养的菌体只有菌丝生成；从淀粉糖化效果来看，水溶液作为溶剂的还原糖含量高于培养液，这是由于培养液中无机盐提供了根霉菌产孢所需的金属离子和氮元素，而产孢需要消耗溶液中还原糖，故而造成溶液中还原糖含量的减少，且在设置的无机盐元素添加量范围内，还原糖含量呈现先降后升再降的变化趋势，MS培养液的还原糖含量相对其它培养液的要高。因此，综合培养效果和糖化效果考虑，选择MS无机盐培养液作为淀粉溶液的溶剂。 [0113] 表4为1L的MS无机盐培养液中大量元素和微量元素的添加量 [0114] [0115] 表5不同溶剂淀粉溶液的少根根霉培养及糖化效果 [0116] [0117] [0118] 5、培养温度与培养时间的筛选 [0119] 处理组1：以旱藕淀粉作为碳源，以MS无机盐培养液为溶剂，配制成12％(g/mL)淀粉溶液20mL，将步骤1的(2)制备的菌孢液按旱藕淀粉溶液和菌孢液总体积10％的接种量接入旱藕淀粉溶液中作为糖化处理组，与菌孢液同体积的生理盐水接入旱藕淀粉溶液作为对照组(CK)；糖化处理组和对照组置于25℃的培养箱静置暗培养144h，每隔24h测量淀粉溶液中的还原糖含量和观察菌体长势；糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0120] 处理组2：同处理组1，唯一的区别在于：糖化处理组和对照组置于30℃的培养箱静置暗培养144h，糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0121] 处理组3：同处理组1，唯一的区别在于：糖化处理组和对照组置于35℃的培养箱静置暗培养144h，糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0122] 处理组4：同处理组1，唯一的区别在于：糖化处理组和对照组置于40℃的培养箱静置暗培养144h，糖化处理组和对照组各设置3个平行实验； [0123] 处理组1～处理组4的还原糖含量取重复试验平均值，结果见表6和图2。根据表6可知，在所设置的培养温度范围内，同一培养时间，当温度从25℃升至35℃时，随着温度的升高，根霉菌的生长越好，35℃条件下的根霉菌产孢能力最强，培养72h已有较多孢子产生，培养96h产孢已达到较强数值水平，而25℃和30℃培养72h仍以菌丝生长为主，当培养温度升至40℃时，少根根霉因不耐高温受到抑制，菌生长最弱，且只有少量菌丝生长无产孢；由图2可知，25℃、30℃、35℃这三个培养温度，还原糖含量均是随着培养时间延长呈现先增加后降低的变化趋势，且温度越高，还原糖含量达到峰值的时间就越短，35℃还原糖含量在48h就达到最高，25和30℃相对较晚，72h才达到峰值，40℃则是还原糖含量随着培养时间延长呈现逐步增加，但糖含量均处于所有温度的最低水平，不同温度的糖量变化与根霉菌生长变化相呼应，25和30℃在72h内以菌丝生长为主，35℃则48h内就完成菌丝生长，这一阶段主要是是糖化淀粉过程，还原糖消耗少，后期因产孢消耗还原糖才导致下降，40℃所有时段均为菌丝生长，故而还原糖处于增加。35℃在96h还原糖下降开始减缓，往后延长，还原糖虽有降低但无显著差异，表明产孢已达到饱和状态。因此，综合上述结果分析，选择35℃培养96h作为后续实验的培养条件。 [0124] 表6糖化组中不同培养温度和培养时间根霉菌培养效果 [0125] [0126] 6、菌液接种量的筛选 [0127] 以旱藕淀粉作为碳源，以MS无机盐培养液为溶剂，配制成质量浓度12％旱藕淀粉溶液10mL于50mL刻度离心管中，将步骤1的(2)制备的菌孢液分别按旱藕淀粉和菌孢液总溶液体积的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％的接种量接入溶液中作为糖化处理组，生理盐水按照旱藕淀粉和生理盐水总溶液体积的45％的接种量接入旱藕淀粉溶液作为对照组(CK)，不同接种量的糖化组各设置三个平行实验，糖化处理组和对照组均置于35℃培养箱静置暗培养96h，测量淀粉溶液中的还原糖含量和观察菌体长势，平行试验平均值见表7。选择糖化效果及培养效果较好的菌液接种量用于后续实验。根据表7可知，在接种量10％～25％范围内，菌体生长均处于同一水平，而还原糖则表现为先降后升，这是由于接种量增加，导致糖化溶液体积变相增大，从而导致还原糖浓度下降，当接种量不断增加，开始缓慢减弱因体积增大导致糖浓度减小这一作用；在接种量30％～40％范围内，菌体生长均处于同一水平且优于其它接种量，此时增加的菌体量完全抵消了因体积增大导致糖浓度减小这一作用，还原糖含量也处于一个中度水平；接种量增至45％，此时糖化溶液体积增大太过明显，导致发酵淀粉浓度和无机盐浓度显著下降，影响菌体产孢，菌体量增加也无法抵消，因而菌体长势最差，以菌丝生长为主，产孢少。因此，综合上述分析，30％～40％的接种量可以获得较好培养效果和糖化效果，为了减少菌体使用量，选择30％接种量用于后续试验。 [0128] 表7糖化组中不同菌孢液接种量对少根根霉培养效果及糖化效果的影响[0129] [0130] 实施例2少根根霉‑淀粉‑仙草胶复合物胶球的制备 [0131] 1、仙草胶提取液的制备 [0132] (1)取全株仙草的地上部分用水冲洗一次，沥干水分后，将茎部或带叶片的分枝用剪刀剪成4～8cm的小段，之后将小段放置于托盘中在50℃的鼓风干燥箱干燥，直至茎部变脆且可轻易折断停止干燥，将干燥好的仙草小段置于中药粉碎机中高速旋转剪切粉碎35s，粉碎好的材料过20目筛网，取过筛的仙草干粉粉末用于仙草胶提取，水分测定粉末含水量为9.75％。 [0133] (2)称取仙草干粉于玻璃瓶中，按料液比为1g:20mL的比例添加提取剂，提取剂为0.14mol/L的碳酸氢钠溶液；加入提取剂后先室温静置提取30min，之后将静提液置于温度为90℃的灭菌锅中进一步加热提取1h，提取完毕后待提取液温度降至70℃，将所得提取液趁热经200目纱网挤压过滤，吸取一定体积的滤液，加入2.5倍滤液体积的无水乙醇，得到混合溶液；混合溶液中的乙醇浓度约为71％；加入无水乙醇沉淀仙草胶，得到仙草胶溶液，沉淀结果见图4。 [0134] (3)将仙草胶溶液置于离心机10000r/min常温离心10min，倾去上清液，离心管中沉淀置于50℃烘箱中挥去残余乙醇，往管中加入少量0.14mol/L的碳酸氢钠溶液，并于微波反应仪中加热至80℃，之后用玻璃棒搅拌至沉淀完全溶解，继续添加碳酸氢钠溶液，摇匀将仙草胶溶液的可溶性固形物浓度调到4％±0.2％(此时溶液温度控制在25～30℃)，所制得的溶液即为仙草胶提取液。 [0135] 2、海藻酸钠溶液的制备 [0136] 称取一定量的海藻酸钠粉末于试管中并用热水溶解，以配制质量浓度2％的海藻酸钠溶液100mL为例，具体配制方法为：称取2.0g的海藻酸钠粉末于100mL玻璃烧杯中，取一定体积的去离子水于微波反应仪中加热至50℃，之后往试管中分次加入加热好的去离子水，每加入20mL体积水一次，就搅拌一次，直至粉末完全溶于水中，无结块或结团状，继续加水至100mL刻度并搅拌均匀。最后放入微波反应仪中进一步加热溶解，待溶液表面起泡沸腾即可停止加热，该溶液即为所需浓度海藻酸钠溶液。其它浓度配制类似。 [0137] 3、少根根霉‑淀粉培养液的制备 [0138] 以旱藕淀粉作为碳源，以MS无机盐培养液为溶剂，配制成质量浓度为12％淀粉溶6 6 液20mL，将孢子浓度为0.50×10～0.85×10 CFU/mL范围的菌孢液按淀粉溶液和菌孢液总体积的30％接种量接入溶液中，置于35℃的培养箱中静置暗培养96h。 [0139] 将长好的菌体连同淀粉溶液一起倒入匀浆机(S1‑M81型九阳家用磨粉机)粉碎30s，后将粉碎搅拌均匀的溶液倒入无菌玻璃瓶中备用，该溶液即为含菌淀粉液，整个粉碎操作在洁净工作台中完成。含菌淀粉液中根霉菌孢子、菌丝和淀粉粒分布见图5与图6。由图 5可见，含菌淀粉液中的少根根霉孢子较多，且分散也较为均匀，而淀粉颗粒有些完整，有些则因糖化而破裂，此外由图6也可以看出淀粉液里面也分布有大量菌丝。 [0140] 4、凝胶金属离子的筛选 [0141] 溶液1：利用步骤3的方法制备少根根霉‑淀粉培养液(所用菌孢液孢子浓度0.75×6 10CFU/mL)； [0142] 溶液2：利用步骤1的方法制备仙草胶提取液(可溶性固形物4％)； [0143] 溶液3：利用步骤2的方法制备质量浓度为4％的海藻酸钠溶液； [0144] 溶液4：氯化钙用水配制成质量浓度为2％溶液； [0145] 溶液5：硫酸锌用水配制成质量浓度为2％溶液； [0146] 溶液6：硫酸镁用水配制成质量浓度为2％溶液； [0148] 将上述各种液体进行灭菌处理，4％海藻酸钠溶液于105℃湿热灭菌15min，仙草胶提取液于115℃湿热灭菌20min，金属离子溶液于121℃湿热灭菌15min。 [0149] 各种液体灭菌完成后降至室温，凝胶溶液制备具体如下： [0150] 先将溶液1、溶液2、溶液3按照体积比1:1:2混合均匀，得到凝胶溶液；溶液1、溶液2、溶液3和金属离子无机盐溶液的体积比为1:1:2:(10～20)。 [0151] 在超净工作台中，拟制备球径为4.00mm左右的含菌胶球，用特制注射器吸取凝胶溶液，并分别垂直滴入溶液4～溶液7的金属离子溶液中，凝胶溶液滴加的速度为0.1～0.125mL/s(下同)，于4～8℃冰箱中静置过夜，取出观察凝胶情况，结果见表8。特制注射器制备：先取1mL的正常移液枪头，平切掉枪头尖部，使得剩余枪头的切口截面直径为4.00± 0.20mm，之后将枪头套入1mL注射器前段即可，见图7。根据表8可知，四种金属离子无机盐中，氯化钙和硫酸锌可以达到成圆球形的要求，且氯化钙成球效率高，形成的球径(3.84mm)也与试验设定的4.00mm球径误差小，保水能力较强，因此选择氯化钙作为凝胶金属离子无机盐。 [0152] 表8四种金属离子无机盐的凝胶情况 [0153] [0154] 5、海藻酸钠溶液浓度的筛选 [0155] 溶液1：利用步骤3的方法制备少根根霉‑淀粉培养液，所用菌孢液孢子浓度0.66×6 10CFU/mL； [0156] 溶液2：利用步骤1的方法制备仙草胶提取液(可溶性固形物4％)； [0157] 溶液3：氯化钙用水配制成2％(即0.02g/mL)溶液；体积为10～20mL； [0158] 溶液4：利用步骤2的方法制备质量浓度为2％(即0.02g/mL)的海藻酸钠溶液； [0159] 溶液5：利用步骤2的方法制备质量浓度为3％(即0.03g/mL)的海藻酸钠溶液； [0160] 溶液6：利用步骤2的方法制备质量浓度为4％(即0.04g/mL)的海藻酸钠溶液； [0161] 溶液7：利用步骤2的方法制备质量浓度为5％(即0.05g/mL)的海藻酸钠溶液； [0162] 溶液8：利用步骤2的方法制备质量浓度为6％(即0.06g/mL)的海藻酸钠溶液； [0163] 各个溶液的灭菌处理同步骤4。 [0164] 将溶液1、溶液2、溶液4按照体积比1:1:2(即1mL、1mL和2mL)混合均匀，得到凝胶溶液1； [0165] 将溶液1、溶液2、溶液5按照体积比1:1:2(即1mL、1mL和2mL)混合均匀，得到凝胶溶液2； [0166] 将溶液1、溶液2、溶液6按照体积比1:1:2(即1mL、1mL和2mL)混合均匀，得到凝胶溶液3； [0167] 将溶液1、溶液2、溶液7按照体积比1:1:2(即1mL、1mL和2mL)混合均匀，得到凝胶溶液4； [0168] 将溶液1、溶液2、溶液8按照体积比1:1:2(即1mL、1mL和2mL)混合均匀，得到凝胶溶液5； [0169] 凝胶溶液1～5分别用特制的注射器吸取，并垂直滴入氯化钙溶液中，于4～8℃冰箱中静置过夜，取出观察凝胶情况，每个海藻酸钠溶液质量浓度试验各选取15～20个胶球测量球径，球径取平均值，具体实验操作及结果见表9和图8。由表9和图8可知，2％海藻酸钠凝胶效果最差，3％浓度球径与设定的4.00mm值相差过大，凝胶强度也不高，成形也不稳定，而4％、5％和6％三个浓度球径和强度相差不大，但5％的球径处于中等位置，混合也较为容易，因此选择5％作为试验的海藻酸钠浓度。 [0170] 表9不同浓度海藻酸钠对胶球凝胶的影响 [0171] [0172] 6、氯化钙溶液浓度的筛选 [0173] 溶液1：利用步骤3的方法制备少根根霉‑淀粉培养液，所用菌孢液孢子浓度0.50×6 10CFU/mL； [0174] 溶液2：利用步骤1的方法制备仙草胶提取液(可溶性固形物4％)； [0175] 溶液3：利用步骤2的方法制备质量浓度为5％(即0.05g/mL)的海藻酸钠溶液； [0176] 溶液4：氯化钙用水分别配制成2％(即0.02g/mL)溶液； [0177] 溶液5：氯化钙用水分别配制成3％(即0.03g/mL)溶液； [0178] 溶液6：氯化钙用水分别配制成4％(即0.04g/mL)溶液； [0179] 溶液7：氯化钙用水分别配制成5％(即0.05g/mL)溶液； [0180] 溶液8：氯化钙用水分别配制成6％(即0.06g/mL)溶液； [0181] 各个溶液的灭菌处理同步骤4。 [0182] 先将溶液1、溶液2、溶液3按照体积比1:1:2混合均匀，得到凝胶溶液； [0183] 凝胶溶液用特制的注射器吸取，分别垂直滴入溶液4～溶液8中，不同浓度的氯化钙溶液中，1mL凝胶溶液可形成6～8颗胶球，于4～8℃冰箱中静置过夜，取出观察凝胶情况，每个氯化钙浓度试验各选取15～20个胶球测量球径，同时利用质构仪测量胶球强度，两个数值指标取其平均值，选择凝胶效果较好的氯化钙浓度用于后续实验开展。具体实验结果见表10。质构仪测凝胶强度具体操作：将完整胶球置于仪器载物台中部，采用12mm的圆柱形塑料探头，选取力量感应元为25N，设置探头起始力为0.0375N，探头实验速度为30mm/min(即0.5mm/s)，实验穿刺深度2mm，探头回程速度60mm/min(即1.0mm/s)，探头回程高度设置为5mm。由表10数据可以看出，3％的氯化钙形成复合物菌球凝胶强度最高，虽然球径值最小，但与其它浓度形成球径相差不是很大，接近原设定4.0mm球径，因此选用3％氯化钙作为后面凝胶试验的浓度值。 [0184] 表10不同浓度氯化钙对凝胶胶球的影响 [0185] [0186] 7、胶球凝胶验证试验 [0187] 溶液1：利用步骤3的方法制备少根根霉‑淀粉培养液，所用菌孢液孢子浓度0.72×6 10CFU/mL； [0188] 溶液2：利用步骤1的方法制备仙草胶提取液(可溶性固形物含量为4％)； [0189] 溶液3：利用步骤2的方法制备质量浓度为5％(即0.05g/mL)的海藻酸钠溶液； [0190] 溶液4：氯化钙用水配制成质量浓度为3％(即0.03g/mL)溶液； [0191] 各个溶液的灭菌处理同步骤4。 [0192] 先将溶液1、溶液2、溶液3按照体积比1:1:2混合均匀，得到凝胶溶液； [0193] 凝胶溶液用特制的注射器吸取，垂直滴入溶液4中，1mL凝胶溶液可形成6～8颗胶球，于4～8℃冰箱中静置过夜，随机选取23个胶球测量球径及凝胶强度，求取平均值，验证凝胶试验效果。具体结果见图9与图10。根据图9和图10可知，本发明制备所得的复合物菌球形状、球径(3.82mm)和凝胶强度(1.948N)，与上述第6部分“氯化钙溶液浓度的筛选”中同样条件下制成的菌球数、形状及菌球参数(球径3.75mm和强度1.940N)无显著差异，上述试验结果说明本发明所得到的胶球制备方法具备良好的重复性。 [0194] 实施例3少根根霉‑旱藕淀粉‑仙草胶的复合物胶球(简称少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球)的应用 [0195] 1、菌球复用糖化淀粉溶液 [0196] 以旱藕淀粉为碳源，MS无机盐培养液为溶剂，配制成质量浓度为12％淀粉溶液10mL放置于50mL刻度离心管中。 [0197] 在超净工作台中，随机选取实施例2“胶球凝胶验证试验”部分制备的少根根霉‑旱藕淀粉‑仙草胶的复合物胶球(以下简称菌胶球)10颗，将10颗菌胶球放入旱藕淀粉溶液中糖化旱藕淀粉，稍微摇晃混匀后，置于35℃培养箱静置暗培养糖化48h，将菌胶球放入无菌水洗去表面附着的淀粉，共洗涤3次，同时测定淀粉溶液中的还原糖含量(记为第一次糖化)；之后再将洗好的菌胶球再次放入新鲜的旱藕淀粉溶液中糖化淀粉48h，将菌胶球放入无菌水洗去表面附着的淀粉，共洗涤3次，测定淀粉溶液中的还原糖含量(记为第二次糖化)；重复糖化这一操作4次。具体结果见图11～13。 [0198] 根据前面试验结果，35℃温度下培养48h的糖化效果最好，因此设置每隔48h取出菌胶球。 [0199] 根据图11可知，从培养效果来看，接入菌胶球培养24h后观察，淀粉溶液内就已经有较多的菌丝体生成了，这是由于菌丝的生成，糖化管中的溶液浑浊而不清亮，新鲜旱藕淀粉液则较为透明清亮；由图12可知，从糖化效果来看，复用次数越多，菌球糖化淀粉能力越弱，这表现为随着次数的增加，溶液中的还原糖含量显著降低，第1次糖化时，每2mL糖化液的还原糖含量为9.005mg，第4次复用糖化时，还原糖含量为4.422mg，糖化能力下降至第1次的49.11％，几乎下降一半，但此时仍是具有糖化能力的，且由图13可知，经过复用糖化4次的菌胶球仍保持完整球形形态，未有破损状况。这表明本发明制备的菌球具备较好复用糖化淀粉液能力和较强胶体强度。 [0200] 对比例1菌孢液糖化淀粉 [0201] 以旱藕淀粉作为碳源，以MS无机盐培养液为溶剂，配制成质量浓度为12％旱藕淀6 粉溶液20mL，将菌孢液(菌孢液孢子浓度0.72×10CFU/mL)按旱藕淀粉溶液和菌孢液总体积的30％接种量接入溶液中，置于35℃的培养箱中静置暗培养48h，测定溶液中的还原糖含量，设置三次重复试验，取平均值。 [0202] 实施例3和对比例1的两种类型糖化试验结果见表11。由表中数据可以看出，同样接种量和孢子浓度制备出来的菌球，在同样的糖化条件下，10颗菌球糖化能力与原菌孢液接种量效果较为接近，表现为两者糖化液中还原糖含量无显著差异，此外，从表中也可看出菌球糖化在底物分离和复用糖化方面也优于菌孢液糖化。综合上述试验结果，本发明的方法制备得到的菌球对淀粉溶液的糖化效果明显优于菌孢液糖化淀粉。 [0203] 表11菌孢液和菌球糖化淀粉的效果对比 [0204] [0205] 实施例4、菌球中的菌种保藏与活化 [0206] 先制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，并做成试管斜面和平板，在超净工作台中，随机选取实施例2的“胶球凝胶验证试验”制备得到的少根根霉‑旱藕淀粉‑仙草胶的复合物胶球(以下简称菌胶球)1颗，接种于试管斜面；将剩余菌胶球保存于装有无菌水的灭菌玻璃瓶中，水量没过胶球即可，在4～8℃冰箱放置40d后取出，随机选取1颗菌胶球接种于PDA培养基平板。 [0207] 接种好的试管斜面和PDA培养基平板均置于35℃培养箱静置暗培养72h，取出观察培养情况。具体培养结果见图14与图15。 [0208] 由图14可知，新鲜制备的菌胶球接入试管斜面，35℃暗培养72h，试管斜面长满根霉菌菌丝且有孢子囊长出，可知本发明制备的菌胶球不影响少根根霉释放和生长，具备较强的培养基活化能力。 [0209] 由图15可知，冷藏40d后的菌胶球接入PDA培养基平板，35℃暗培养72h，平板长满根霉菌菌丝且有孢子囊长出，表明了本发明制备的菌球能够很好的保持菌种活性，长时间的保存仍具备较强的活化能力，证明菌球具备较强的保藏活性。 [0210] 实施例5、复用糖化后的菌球再生利用 [0211] 先制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，并做成平板。随机选取已复用糖化4次的少根根霉‑旱藕淀粉‑仙草胶的复合物胶球(以下简称菌胶球，菌球)，经无菌水洗涤3次置于灭菌的滤纸上，将滤纸放置在培养皿中，后将培养皿半开皿盖置于4～8℃风冷冰箱中脱水干燥，干燥6d后取出，此时培养皿整体重量变化率在0.001g的水平，认定菌球干燥完成。随机选取干燥好的菌球，接种于PDA平板中，35℃培养48h，观察菌体生长情况，具体结果见图16～18。根据图16可知，干燥脱水的菌球变小且颜色变深，形成颗粒状。根据图17和图18可知，干燥脱水的菌球接种于培养基，培养48h后，菌球复水恢复至干燥前的大小和颜色，且菌球内的菌体仍保持活性，培养48h的菌丝就已经长满平板表面，同时还有少量孢子囊生成。 可见，本发明的方法制备得到的菌球经多次复用糖化后，菌球内仍存在较多根霉菌体，且菌体活力不受菌球干燥脱水的影响，说明本发明制备得到的菌球本身具备较强可再生利用能力。 [0212] 综上，本发明在包埋过程中利用仙草胶和海藻酸钠较好的凝胶性能，包埋降低少根根霉在混合体系中混合难度，同时使制备得到的胶球内根霉菌活化能力强，少根根霉‑淀粉‑仙草胶的复合物胶球具备较好复用糖化淀粉溶液能力和较强胶体强度、复水性，为后期木薯少根根霉的应用提供方向。 [0213] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。 |
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