盐地碱蓬多糖及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410394268.1 | 申请日 | 2024-04-02 | 公开(公告)号 | CN117964790A | 公开(公告)日 | 2024-05-03 |
| 申请人 | 青岛农业大学; 山东中医药大学; | 发明人 | 刘聪敏; 齐小雨; 绪扩; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于海洋 生物 医药技术领域，涉及对海洋潮间带 植物 盐地 碱 蓬中多糖的提取和纯化，具体涉及一种盐地碱蓬多糖及其制备方法和应用，该多糖的单糖组成包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、 葡萄糖 、木糖、甘露糖、核糖、古罗糖 醛 酸、葡萄糖醛酸，其摩尔百分比分别为：0.25%、2.25%、30.70%、50.80%、1.06%、6.43%、3.78%、0.28%、2.42%、2.04%。本发明从海洋潮间植物盐地碱蓬提取物中分离纯化得到一个新的多 糖化 合物，并基于斑 马 鱼高血脂模型对该多糖在降血脂方面的作用功效进行研究，发现该多糖具有降血脂的活性，可用于防治高血脂等 疾病 ，为盐地碱蓬在降血脂方面的应用提供了科学依据。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种盐地碱蓬多糖，其特征在于，所述盐地碱蓬多糖的单糖组成包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、古罗糖醛酸、葡萄糖醛酸，其摩尔百分比分别为：0.25%、2.25%、30.70%、50.80%、1.06%、6.43%、3.78%、0.28%、2.42%、2.04%。 |
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| 说明书全文 | 盐地碱蓬多糖及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 盐地碱蓬(Suaeda salsa)为藜科碱蓬属一年生草本植物，丛生于含盐量高达0.3%的海滩潮间带，是海滩潮间带的先锋植物，广泛分布于黄河三角洲等区域。盐地碱蓬株型美观，具有“翡翠珊瑚”的雅称，其嫩茎叶口感好，具有特别的海鲜味，沿海居民常将盐地碱蓬作为野菜食用，俗称为“海英菜”、“碱蒿”等。盐地碱蓬的茎叶还可作为原料提取叶绿素，用于食品添加剂和日用化工产品。盐地碱蓬化学成分高值化利用对促进海洋潮间带植物的综合利用具有重要意义，多糖类作为盐地碱蓬的主要化学成分之一，引起广泛的关注。 [0003] 天津科技大学刘素华在其硕士毕业论文（盐地碱蓬中植物盐的提取及其多糖功能性的研究，2018年）中采用单因素试验和正交试验对碱蓬多糖提取方法进行优化，当料液比为1：15 g/mL、时间120 min、温度90℃、提取次数为3次时，碱蓬多糖的提取得率为14.38%。采用葡聚糖凝胶分离纯化多糖，得到多糖含量为48.46%的碱蓬多糖。对于碱蓬多糖的生物活性方面，研究了该碱蓬多糖的体外抗氧化活性，并分析了碱蓬多糖对肿瘤细胞的抑制作用，当多糖浓度为12.8 mg/mL时，对HepG2细胞具有较好的抑制作用。该论文提取得到含量为48.46%的粗多糖，并对其体外抗氧化活性和抗肿瘤活性进行研究。 [0004] 翟豫州等人[正交实验法优化盐地碱蓬中多糖的超声提取工艺，广东化工. 2021, 48(15), 29‑31]根据单因素试验和正交实验法优化盐地碱蓬中多糖的提取工艺，得到最理想的盐地碱蓬多糖的超声提取工艺是料液比1∶40，超声提取的次数3次，超声提取的时间30 min，超声提取的温度40℃。该文章未给出盐地碱蓬多糖的单糖组成、糖苷键连接方式等化学结构信息，且未涉及到盐地碱蓬多糖在防治心力衰竭等心脏疾病方面的活性及应用。 [0005] 中国专利CN110734502A公开了一种盐地碱蓬多糖的提取方法，选用纤维素酶、木质素酶、果胶酶和β‑葡萄糖聚酶作为降解酶，并且控制其比例，水解盐地碱蓬细胞壁中的纤维素或木质素，从而破坏细胞壁，使得盐地碱蓬细胞内的多糖快速释放出；同时通过乙醇、丙醇和丁醇作为醇沉试剂，减少盐地碱蓬多糖的沉淀时间，提高其得率。该专利是通过酶解法进行提取，同时配合醇沉试剂，以减少提取时间，提高得率。 [0006] 中国专利CN107997110A公开了一种盐地碱蓬生物盐制备方法，通过将盐地碱蓬汁液经过蛋白酶处理、再去除重金属离子、最后浓缩结晶制得盐地碱蓬生物盐。经过分析，本发明的生物盐中主要成分为无机盐，次要部分为天然有机物：维生素、氨基酸和多糖。由此可知，该专利方法是用于提取盐地碱蓬中的生物盐，具体提取其中的无机盐成分。 [0007] 中国专利CN112961257A公开了一种盐地碱蓬水溶性膳食纤维提取工艺和其单糖组成及比例，优化提取工艺条件为：料液比1：15，pH=10，提取温度61℃，提取时间75 min，获得盐地碱蓬水溶性膳食纤维提取率为16.50%；其单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖以及岩藻糖，其物质量的比为1.00：9.96：3.08：2.03：1.45：26.32：4.90：10.75。该方法以盐地碱蓬为原料，通过碱提醇沉法提取水溶性膳食纤维，并给出其单糖组成，但是没有实验证明其具有降糖或降脂活性。 发明内容[0009] 为了解决上述现有技术中提取纯化得到盐地碱蓬多糖的纯度不高以及缺乏对纯多糖的结构测定和活性开发的问题，本发明提出了一种盐地碱蓬多糖及其制备方法和应用，从海洋潮间带植物盐地碱蓬提取物中分离纯化得到一个新的多糖化合物，进一步研究发现该多糖具有降血脂的功效活性，可用于防治高血脂等疾病方面的应用。 [0010] 本发明通过水提醇沉法提取粗多糖，再联合应用木瓜蛋白酶解、大孔树脂吸附和透析等操作去除蛋白杂质，最后运用阴离子交换柱和凝胶色谱柱进行富集，得到了纯度为98.3%的盐地碱蓬多糖，远超过现有技术中提到的最高53.51%的纯度；并且，本发明通过系统测试单糖组成、甲基化、核磁，给出了多糖的结构信息，确认了该多糖的化学结构。 [0011] 本发明的技术方案是：本发明提供了一种盐地碱蓬多糖，所述盐地碱蓬多糖的单糖组成包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、古罗糖醛酸、葡萄糖醛酸，其摩尔百分比分别为：0.25%、2.25%、30.70%、50.80%、1.06%、6.43%、3.78%、0.28%、2.42%、2.04%。 [0012] 进一步的，所述盐地碱蓬多糖的重均分子量为45.496 kDa，多分散指数为1.33。 [0013] 进一步的，所述盐地碱蓬多糖具有如下结构单元：。 [0014] 进一步的，所述盐地碱蓬多糖的制备方法包括以下步骤：（1）取烘干后的盐地碱蓬粉碎、过筛，加入无水乙醇常温超声提取，合并提取液，离心收集沉淀；向沉淀中加入1倍纯水，水浴提取，合并提取液，离心，收集上清提取液；减压浓缩、过夜醇沉，离心后得到多糖粗提物； 向多糖粗提物中加入纯水和木瓜蛋白酶，过夜酶解，然后，再加入三氯甲烷和正丁醇混合溶液充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入石油醚充分搅拌混匀，收集下层水相；最后向水相中加入适量AB‑8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜；收集滤液，透析、冷冻干燥，得到盐地碱蓬粗多糖； （2）取盐地碱蓬粗多糖配成浓度10 mg/mL的多糖母液，离心取上清液，在离子交换柱上进行洗脱；合并洗脱液，减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到纯化后粗多糖； （3）取纯化后粗多糖配成浓度15 mg/mL的多糖母液，离心取上清液，在凝胶柱层析柱上进行洗脱；合并洗脱液，减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到盐地碱蓬多糖SS3‑N1。 [0015] 进一步的，所述步骤（2）中采用DEAE seplife FF型阴离子交换柱进行洗脱，其规格为26 mm×400 mm；洗脱时，依次采用纯水、0.1 mol/L、0.2 mol/L和0.3 mol/L氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4 mL/min。 [0016] 进一步的，所述步骤（3）中采用Sephacryl S‑400HR型凝胶柱层析柱进行洗脱，规格为26 mm×1000 mm；采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1 mL/min。 [0017] 本发明还提供了所述盐地碱蓬多糖在制备降血脂的药物中的应用。 [0018] 本发明还提供了所述盐地碱蓬多糖在制备降血脂的食品或保健品中的应用。 [0019] 本发明又提供了一种降血脂的药物，以所述的盐地碱蓬多糖为有效成分。 [0020] 本发明采用卵黄诱导的斑马鱼高血脂模型，评价该盐地碱蓬多糖在降血脂方面的作用功效，为其未来的应用提供科学依据。现有文献表明，斑马鱼模型在筛选心脏保护活性成分方面具有独特优势，斑马鱼肝脏在结构、功能、信号通路和离子通道方面与人类心脏高度相似；血脂组成、代谢与人类的基本一致；且胚胎及其幼体近乎透明，血管可视，可活体观察心跳、血管形成和血管病变等。 [0021] 本发明的有益效果：本发明以盐地碱蓬为原料，通过水提醇沉法确定了一种提取步骤简单、提取效率高的制备方法；并通过纯度及分子量测定、单糖组成测试确定了盐地碱蓬多糖SS3‑N1的单糖组成和摩尔百分比，通过单糖甲基化测试、多糖核磁检测得到盐地碱蓬多糖SS3‑N1的糖苷键的类型和连接顺序，以及主链与支链的连接位点等关键结构信息，进而得到多糖的结构单元；本发明基于斑马鱼高血脂模型，对该盐地碱蓬多糖在降血脂方面的作用功效进行研究，发现该多糖具有降血脂的活性，为其进一步降脂、防治高血脂等机理的探究提供了确切物质基础，为盐地碱蓬在降血脂方面的应用提供了科学依据。 附图说明 [0022] 图1为盐地碱蓬多糖的离子柱洗脱曲线；图2为盐地碱蓬多糖的凝胶柱洗脱曲线； 图3为盐地碱蓬多糖的绝对分子量分析图； 图4为盐地碱蓬多糖的分子构型分析图； 图5为供试单糖标准品离子色谱图； 图6为盐地碱蓬单糖片段的离子色谱图； 图7为盐地碱蓬多糖的核磁共振氢谱图； 图8为盐地碱蓬多糖的核磁共振碳谱图； 图9为盐地碱蓬多糖的氢‑氢化学位移相关谱（COSY）图； 图10为盐地碱蓬多糖的异核单量子相关谱（HSQC）图； 图11为盐地碱蓬多糖的降血脂活性结果；其中，（A）为斑马鱼尾部脂质染色强度IOD（积分光密度值），（B）为降脂率统计图； 图12为降血脂相关基因表达检测分析结果。 具体实施方式[0023] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0024] 为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。 [0025] 实施例1 多糖的提取与纯化1、多糖的提取 取500 g烘干后的盐地碱蓬粉碎、过60目筛后，加入2倍无水乙醇常温超声提取3次；合并提取液后，8000×g转速离心5 min，收集沉淀。再取上述沉淀加入1倍纯水，60℃水浴提取2次，每次80 min，合并提取液后，8000×g转速离心5 min，收集上清提取液。40℃减压浓缩提取液至原体积的1/5，加入2倍体积无水乙醇4℃环境下过夜醇沉，然后，10000×g转速离心5 min，收集固体沉淀，即得到多糖粗提物。 [0026] 向多糖粗提物中加入2倍纯水和0.5 g木瓜蛋白酶，过夜酶解，然后，再加入2倍三氯甲烷和正丁醇混合溶液（v/v=1:1），充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入2倍石油醚，充分搅拌混匀，收集下层水相；最后，向水相中加入适量AB‑8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜。收集滤液，最后用3000Da透析袋透析48 h后，将留下的液体进行冷冻干燥，得到盐地碱蓬粗多糖2.39 g，用硫酸苯酚法测得多糖含量为47.8%，备用。 [0027] 2、多糖的离子柱纯化取适量盐地碱蓬粗多糖溶解于纯水中，配成浓度10 mg/mL的多糖母液，10000×g转速离心5 min，取上清液在DEAE seplife FF型阴离子交换柱（26 mm×400 mm）上进行洗脱。依次采用纯水、0.1 mol/L、0.2 mol/L和0.3 mol/L氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4 mL/min，每15 mL收集1管，并依次编号。 [0028] 采用硫酸‑苯酚法测定各管洗脱液的多糖含量，并绘制如图1所示的离子纯化洗脱曲线。根据多糖含量测定结果，合并同一个洗脱峰对应的各收集管洗脱液，45℃减压浓缩至原体积的1/5，再用3000Da的透析袋透析48 h，将留下的液体进行冷冻干燥，得到4个粗多糖组分，即图1中标号1、2、3、4的四个多糖峰。 [0029] 3、多糖的凝胶柱纯化取离子柱纯化后的3号峰的粗多糖组分（纯度为92.5%），加纯水，配成浓度15 mg/mL的多糖母液，10000×g转速离心5 min，取上清液在Sephacryl S‑400HR型凝胶柱层析柱（26 mm×1000 mm）上进行洗脱，采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1 mL/min，每12mL收集1管，并依次编号。采用硫酸‑苯酚法测定各管洗脱液的多糖含量，并绘制如图2所示的凝胶纯化洗脱曲线。根据多糖含量测定结果，合并主峰对应的各收集管洗脱液，即图2中的第39‑45号管，40℃减压浓缩至原体积的1/5，再用3000Da的透析袋透析48 h，将余留液体冷冻干燥，得到盐地碱蓬多糖SS3‑N1，重179.2 mg。 [0030] 实施例2 多糖的纯度及分子量测定采用凝胶色谱‑示差‑多角度激光光散射系统测定多糖的纯度及分子量，液相系统为U3000（美国赛默飞世尔科技公司），配备Optilab T‑rEX示差检测器（美国怀雅特技术公司）和DAWN HELEOS Ⅱ激光光散射检测器（美国怀雅特技术公司），凝胶排阻色谱柱包括Ohpak SB‑805 HQ (300×8 mm)、Ohpak SB‑804 HQ (300×8 mm)、Ohpak SB‑803 HQ (300×8 mm)串联。 [0031] 将盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品溶解在0.1 mol/L NaNO3水溶液 (含0.02% NaN3，w/w)中，终浓度为1 mg/mL，经0.45 μm滤膜过滤后上机检测。 [0032] 进样量100 μL，柱温45℃，流动相A为0.1 mol/L NaNO3水溶液 (含0.02% NaN3，w/w)，流速0.4 mL/min，洗脱梯度：等度100 min。 [0033] 以检测的保留时间为横坐标，以摩尔质量为纵坐标绘制绝对分子量分析图，得到如图3所示的盐地碱蓬多糖SS3‑N1的绝对分子量分析图；以摩尔质量为横坐标，以均方根半径为纵坐标绘制分子构型图，得到如图4所示的盐地碱蓬多糖SS3‑N1的分子构型分析图。盐地碱蓬多糖SS3‑N1的数均分子量(Mn)为：34.206 kDa；峰值分子量(Mp)为：69.306 kDa；重均分子量(Mw)为：45.496 kDa；z均分子量(Mz)为：56.645 kDa；多分散指数(Mw/Mn)为1.33。 [0034] 实施例3 单糖组成测试色谱系统采用的是Thermo ICS5000离子色谱系统，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。采用Dionex™ CarboPac™ PA20 (150*3.0 mm，10 μm)液相色谱柱；进样量为5 μL。流动相A为H2O，流动相B为0.1 mol/L NaOH，流动相C为0.1 mol/L NaOH (含0.2 mol NaAc)，流速0.5 mL/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0 min，A相/B相/C相 (95：5：0，V/V/V)，26 min，A相/B相/C相(85：5：10，V/V/V)，42 min，A相/B相/C相(85：5：10，V/V/V)，42.1 min，A相/B相/C相(60：0：40，V/V/V)，52 min，A相/B相/C相(60：40：0，V/V/V)，52.1 min，A相/B相/C相(95：5：0，V/V/V)，60 min，A相/B相/C相(95：5：0，V/V/V)。 [0035] 称取5 mg盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品，加入1 mL 2 mol/L TFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干；加入99.99%甲醇清洗，再吹干；重复甲醇清洗2 3次。加入无菌水溶解，~转入色谱瓶中待测。 [0036] 再分别准确称取所需的表1中各单糖标准品后，加入水配成10 mg/mL标准溶液母液单标，然后取1 2 mg标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为50 μg/mL的标准品混~标，然后分别稀释至25 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL和0.5 μg/mL系列浓度。采用外标法定量，通过配制不同浓度标样来制定标准曲线。以横坐标为保留时间，纵坐标为响应值，得到如图5所示的标准品离子色谱图和如图6所示的盐地碱蓬多糖离子色谱图。 [0037] 检测得到该盐地碱蓬多糖SS3‑N1含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、古罗糖醛酸、葡萄糖醛酸，其摩尔百分比分别为：0.25%、2.25%、30.70%、50.80%、1.06%、6.43%、3.78%、0.28%、2.42%、2.04%。 [0038] 单糖标准曲线的测量值如表1所示：表1 单糖标准曲线的测量值 [0039] 注：标准品主要来自sigma公司实施例4 单糖甲基化测试 本实施例所用分析仪器为安捷伦的7890A‑5977B气质联用仪，自动进样器型号为G4567A；色谱系统采用的是Agilent气相色谱系统Agilent 7890A，色谱柱：BPX70 (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，SGE)，进样量为1 μL，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃保持2.0 min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3 min。质谱系统采用的是美国Aiglent公司的四极杆质谱检测系统Agilent 5977B，配有电子轰击离子源（EI）和MassHunter工作站。采用电子轰击离子源（EI），分析物在全扫描（SCAN）模式下进行检测，质量扫描范围(m/z): 50 350。 ~ [0040] 取2 3 mg的盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品，加入500 μL DMSO溶解，加入1 mg NaOH，孵~育30 min；加入50 μL碘甲烷溶液反应1 h，加入1 mL水和2 mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相；重复水洗3次。吸取下层二氯甲烷相并用氮气吹干，加入100 μL 2 mol/L TFA，121℃反应90 min。30℃蒸干，加入50 μL 2 mol/L 氨水，50 μL 1 mol/L NaBD4，混匀，室温下反应2.5 h。加入20 μL乙酸终止反应，氮气吹干，250 μL甲醇洗两次，氮气吹干。加入乙酸酐 250 μL，涡旋混匀，100℃反应2.5 h。加入1 mL水静置10 min，加入500 μL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相，重复水洗3次。取下层二氯甲烷相，GC‑MS上机检测。 [0041] 如表2所示，盐地碱蓬多糖SS3‑N1中主要含有以下连接方式：表2盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品键合结构分析结果 [0042] 实施例5 多糖的核磁测试采用布鲁克600 MHz核磁共振波谱仪对盐地碱蓬多糖SS3‑N1进行定量分析，扫描温度为25℃。液体探头QXI 1H/31P/13C/15N 5 mm四共振反向检测探头（Z‑gradient，ATM Acc），技术参数：信噪比(1H)：888；分辨率(Hz)：0.32 (rotating) BBFO 1H‑19F，31P‑15N， 1H decoupling/observe多核正向检测探头（Z‑gradient，ATM）。技术参数：信噪比(1H)： 798；分辨率(Hz)：0.26 (rotating)；信噪比(13C): 328;分辨率(Hz): 0.1。 [0043] 取20 mg盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品充分溶解至D2O中，配制成浓度40 mg/mL多糖溶液，将溶解后溶液转移至核磁管中，加入量0.5 mL。将核磁管放入核磁共振波谱仪中扫描，1 13 1 1 得到如图7所示的一维H谱图，如图8所示的 C谱图，如图9所示的 H‑H COSY谱图以及如图 10所示的HSQC谱图。 [0044] 结合一维NMR和二维NMR谱图，对盐地碱蓬多糖SS3‑N1样品的糖残基信号进行归属，如下表：1 13 表3 盐地碱蓬多糖SS3‑N1各糖残基H和 C的化学位移 [0045] 因此，该多糖链的结构如下：。 [0046] 试验例1 多糖改善蛋黄粉诱导的斑马鱼高血脂活性选取3天（dpf）野生型AB系健康斑马鱼，置于24孔板中，每孔10条。设置空白组和50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL三个浓度的多糖给药组（盐地碱蓬多糖SS3‑N1）。孵育24 h，拍照观察，统计各组斑马鱼畸形率和死亡率，根据安全浓度确定后续活性评价实验给药浓度。结果发现，盐地碱蓬多糖SS3‑N1在以上三个浓度下均未造成斑马鱼畸形或死亡。可选用以上三个浓度作为活性评价给药浓度。 [0047] 选用受精后5天（dpf）的野生型AB系斑马鱼，随机分为空白组（不做任何处理）、模型组（0.2%蛋黄粉给药处理）、阳性药组（0.2%蛋黄粉+0.4 μM阿托伐他汀给药处理）、和不同剂量多糖给药组（0.2%蛋黄粉+50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL盐地碱蓬多糖SS3‑N1给药处理）。喂食蛋黄粉2 d后，模型组改用养鱼水培养，不同剂量多糖给药组用药物处理。24 h后，对各组斑马鱼进行油红O染色，观察斑马鱼血管内脂质沉积情况，并拍照，利用Image‑Pro Plus软件统计斑马鱼尾部脂质染色强度。 [0048] 如图11(A)所示，与空白组相比，模型组斑马鱼尾部脂质染色强度IOD值明显增高，即斑马鱼血管内脂质沉积明显增多，说明蛋黄粉造模成功（注：##表示与空白组比较，P<0.01）；与模型组相比，经0.4 μM阿托伐他汀处理的斑马鱼的尾部脂质染色强度显著降低。 与模型组相比，经50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL浓度盐地碱蓬多糖处理的斑马鱼的尾部脂质染色强度显著降低，其中100 μg/mL浓度组的染色强度甚至优于阳性药阿托伐他汀（注：**表示与模型组比较，P<0.01）。如图11(B)所示，以染色强度改善率作为降脂率，可发现100 μg/mL浓度组的降脂率优于0.4 μM的阳性药阿托伐他汀（注：**表示与模型组比较，P<0.01）。 [0049] 试验例2 降血脂相关基因表达检测选用受精后5天（dpf）的野生型AB系斑马鱼，随机分为空白组（不做任何处理）、模型组（0.2%蛋黄粉给药处理）、阳性药组（0.2%蛋黄粉+0.4 μM阿托伐他汀给药处理）、和多糖给药组（0.2%蛋黄粉+200 μg/mL盐地碱蓬多糖SS3‑N1给药处理）。喂食蛋黄粉2 d后，模型组改用养鱼水培养，不同剂量多糖给药组用药物处理。24 h后，收集样品，提取总RNA，采用实时荧光定量PCR方法，检测Pparα、Nrf2、Ho‑1、Cyp7a1、Hmgcr、Ampk、Acaca等基因表达水平。 [0050] 如图12所示，与空白组相比，模型组斑马鱼的Pparα、Nrf2、Ho‑1、Cyp7a1基因表达量显著降低，Hmgcr、Ampk、Acaca基因表达量显著升高；而经200 μg/mL浓度多糖SS3‑N1处理后，可显著增加Pparα、Nrf2、Ho‑1、Cyp7a1基因的表达量，降低hmgcr、ampk、acaca基因的表达量（注：##表示与空白组比较，P<0.01，#表示与空白组比较，P<0.05；**表示与模型组比较，P<0.01，*表示与模型组比较，P<0.05）。以上研究结果表明，SS3‑N1能够上调Nrf2和Ho‑1基因表达水平，抑制活性氧导致的细胞毒性，能够促进Ampk、Ppara和Cyp7a1表达，从而促进胆固醇代谢，通过下调Acaca表达抑制脂肪酸合成，通过下调Hmgcr表达抑制胆固醇合成。 [0051] 综合分析上述实验数据，表明盐地碱蓬多糖SS3‑N1能够显著降低蛋黄粉诱导的斑马鱼血管内脂质的沉积，未来可用以降血脂药物功能食品或药物研发。 [0052] 上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
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