一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺 |
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| 申请号 | CN202410151486.2 | 申请日 | 2024-02-02 | 公开(公告)号 | CN117946254A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 湖南伍星生物科技有限公司; | 发明人 | 邹高远; 谭岸; 谭子金; 朱小丰; 谭金茂; 李爱斌; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 硫酸 软骨素钠、弹性蛋白肽和 胶原蛋白 肽的提取工艺，涉及致密结缔组织的加工技术领域，其包括以下步骤：对 牛 筋进行前处理、 脱脂 、分离、酶解、提纯、浓缩、干燥等步骤。该工艺针对牛筋具有韧性和难以加工的特点，增加了前处理步骤，用低成本的方式改善了提取工艺。本发明同时提取硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽，产品收率高(硫酸软骨素钠1.1％～1.3％、弹性蛋白肽5.3％～16.5％、胶原蛋白肽8.1％～15.6％)、 质量 高、纯度高；其中，弹性蛋白肽中的 锁 链素和异锁链素含量为0.32％～1.13％，5000Da以下肽含量达90％以上，提高了牛筋的综合利用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺，其特征在于，其包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺技术领域[0001] 本发明属于致密结缔组织的加工技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺。 背景技术[0002] 牛筋包括牛蹄筋、牛板筋、牛韧带等，是致密结缔组织，主要由水、胶原纤维、弹性纤维、成纤维细胞、基质构成，新鲜牛筋含水量70％以上，不同部位的牛筋弹性纤维含量差别较大，按干基占比算，牛板筋约20％～30％，牛蹄筋只有1％～3％，含硫酸软骨素的蛋白多糖占比只有1％～5％，铜、锰、钙等离子约占0.2％，胶原纤维约70％～90％，主要是Ⅰ型胶原蛋白。来源硫酸软骨素钠生产一般选择软骨素含量较高的肋软骨、鼻骨软骨、肩胛软骨、气管软骨等。 [0003] 硫酸软骨素(简称CS)是一种酸性黏多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、鲨鱼骨、鱿鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子，在组织中多为由多糖链与蛋白质组成蛋白聚糖，结合方式为通过一个糖链与核心蛋白共价结合。硫酸软骨素钠由50～70个双糖单元组成，其双糖单元是由葡糖醛酸和N‑乙酰半乳糖胺通过β(1‑3)糖苷键形成，双糖再以β(1‑4)糖苷键连接聚合成大分子，部分N‑乙酰半乳糖胺的C‑6或C‑4位硫酸化，通过硫酸基或羟酸基与钠离子结合。硫酸软骨素钠具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理功能。临床上主要作为骨关节炎、高血脂、心绞痛、动脉粥样硬化等疾病的治疗，其滴眼液具有治疗角膜损伤、角膜溃疡或角膜炎；在食品上硫酸软骨素钠被美国FDA归类为膳食补充剂，澳大利亚将其作为改善或预防关节病的营养保健品。目前，硫酸软骨素钠工业生产均采用酶解法从动物软骨中提取，主要包括去杂、清洗、煮料、酶解、脱蛋白、过滤、离心、离子交换、超滤、醇沉、干燥等步骤。 [0004] 胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多动物蛋白，主要存在于骨、腱、韧带、皮肤等组织中，是结缔组织中一种重要的结构蛋白。胶原蛋白由三条肽链组成，三条肽链以特有方式构成复合螺旋，变性后才能被蛋白酶水解。胶原蛋白肽是牛骨的水解产物，富含羟脯氨酸，由2个以上氨基酸构成，可用于食品、保健食品、化妆品、生物材料、微生物培养基、高端饲料等多个领域。分子量较少的易吸收，胶原蛋白肽国家食品标准要求相对分子质量10000以下的大于90％。 [0005] 弹性蛋白是弹性纤维的主要成分。弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁，在肌腱和皮肤中也有少量存在。弹性纤维与胶原纤维共同存在，赋予组织以弹性和抗张能力。提取的弹性蛋白肽中锁链素和异锁链素作为特征成分。特别强调的是，小分子的弹性蛋白肽更容易吸收，行业要求相对分子质量5000以下的大于80％。 [0006] 现有技术中，牛筋的提取工艺中面临牛筋干燥后复水性差、时间长、易酸败、效率低等问题，牛筋直接提取弹性蛋白肽牛脂去除不够影响气味，产品中其他异味物质的去除不足也影响气味，生色物质糖、血色素、脂肪酸的去除不足会影响颜色。现有企业备案标准弹性蛋白肽和胶原蛋白肽检测指标相似，难以评价品种的纯度，有研究表明锁链素和异锁链素是弹性蛋白肽的特征成分，以此作为弹性蛋白肽的纯度标准，使用牛筋等含有胶原蛋白又含弹性蛋白的致密结缔组织提取出高纯度弹性蛋白肽的工艺有待研究。 发明内容[0007] 本发明克服现有技术中无法同时在牛筋中提取硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的技术问题，而且解决现有技术中对牛筋中弹性蛋白肽提取纯度较低、综合效益低、污染较大的问题，促进产业绿色节能稳步发展和规模持续扩大。本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺，该工艺改造成本低，原料利用率高，综合效益好，绿色环保；产品质量达到国标，超过行标，如弹性蛋白肽中的锁链素含量高，肽的分子量较低。 [0008] 本发明提供一种硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺，其包括以下步骤： [0009] S1.对牛筋进行前处理； [0010] S2.将牛筋进行亚临界萃取脱脂； [0011] S3.碱水浸取，固液分离，得到滤渣和碱水提取液； [0012] S3.1.收集步骤S3的滤渣，将滤渣蒸煮、复合蛋白酶酶解、调节pH、静置、过滤，得到滤液； [0013] S3.2.将滤液分别经过强酸型阳离子交换树脂、强碱型阴离子交换树脂、弱碱型大孔树脂，收集流出液； [0014] S3.3.流出液再经精密过滤、纳滤、双效浓缩、灭菌、喷雾干燥即可得到弹性蛋白肽； [0015] S4.收集S3中固液分离后的碱水提取液； [0016] S4.1.碱水提取液经复合蛋白酶酶解、压滤、过阳离子交换树脂、过阴离子交换树脂、弱碱型大孔树脂后收集流出液； [0017] S4.2.流出液再经精密过滤、纳滤、双效浓缩、灭菌、喷雾干燥后得到胶原蛋白肽； [0018] S5.将步骤S4.1中阴离子交换树脂上的吸附物洗脱出来得到洗脱液； [0019] S5.1.将洗脱液经精密过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥得到硫酸软骨素钠。 [0020] 本发明中，所述牛筋的种类包括牛蹄筋、牛板筋、牛韧带。 [0021] S1中，所述前处理的操作为将新鲜牛筋去杂、水洗、泡酸水、冷冻切片、清洗、滤干、酒精脱水、真空干燥；其中，针对牛筋韧性大且湿滑不易加工的特性，特增加前处理的步骤；冻溶法可以通过控制冷冻速率来影响动物组织中冰晶的大小，从而刺破组织细胞；冷冻切片，切横薄片，特别适用于肌肉、筋、韧带等新鲜动物组织的机械切片；这两种方法可以提高去除血红素、核酸、糖、乳酸等杂质的效率。 [0023] 进一步S1中，所述酸水的添加量为牛筋1～2倍质量。 [0024] 进一步S1中，所述泡酸水的时间为20～30h。 [0025] 进一步S1中，所述泡酸水后还需使用反渗透水浸洗2～3次，再用0.5倍牛筋质量的水顺筋纤维方向冷冻固定；所述反渗透水的添加量为牛筋2～3倍质量。 [0026] 进一步S1中，所述切片为将牛筋切成0.5～1.0mm厚的薄片。 [0027] 进一步S1中，所述清洗为在10℃以下使用反渗透水洗，洗三次。 [0028] 进一步S1中，所述酒精为浓度为95％的酒精。 [0029] 进一步S1中，所述酒精脱水的次数为2～4次，较佳地为3次；其中，酒精可使动物组织蛋白变性和脱水，有效避免了干燥过程中切片粘连成块降低干燥效率及影响后期的破碎，还可以去除部分亲水性稍低的异味成分。 [0030] 进一步S1中，所述真空干燥的温度为40～60℃，较佳的为50～60℃。 [0031] 进一步S1中，所述真空干燥采用乙醇回收设备。 [0032] 进一步S1中，所述粉碎的操作为粉碎至颗粒状或纤维状。 [0034] S2中，亚临界萃取采用的温度为本领域常规温度；其中亚临界萃取是常用的高效油脂提取工艺，牛筋异味去除效果好，可提取如牛脂的脂溶性成分外，还可去除部分半亲水成分。 [0035] S2中，所述亚临界萃取的工作压力为0.3～0.6MPa，亚临界萃取的温度为35～50℃。 [0037] S3中，所述碱水的添加量为8～10倍牛筋质量。 [0038] S3中，所述碱水浸取的温度为在95～100℃；其中，用碱水提取胶原蛋白和蛋白多糖后，即可得到弹性蛋白，水解分离纯化干燥可得弹性蛋白肽，提取液水解分离纯化干燥提取硫酸软骨素钠和胶原蛋白肽，所得弹性蛋白肽纯度高，特征成分锁链素(异锁链素)含量高于鲣鱼弹性蛋白肽，硫酸软骨素钠和胶原蛋白肽均达到或超过国家标准。 [0039] S3中，所述碱水浸取的时间为2～3h。 [0040] S3中，所述碱水浸取的次数为2～4次，较佳的为3次。 [0041] S3.1中，所述蒸煮的加热温度为120℃。 [0042] S3.1中，所述蒸煮的时间为3～5h，较佳地为4h。 [0043] S3.1和S4.1中，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，较佳的为25wt％碱性蛋白酶和75wt％中性蛋白酶。 [0044] S3.1和S4.1中，所述复合蛋白酶的质量为滤渣质量的0.5％；其中，蛋白质酶水解是一种专一性较强的水解方法，通过酶的组合可获得分子量较集中的肽。 [0045] S3.1和S4.1中，所述酶解后还包括在75～80℃下将酶灭活0.5～1h的操作。 [0046] S3.1中，所述酶解的操作为加滤渣质量4～6倍的反渗透水，再加入复合蛋白酶进行酶解。 [0047] S3.1中，所述酶解在pH为7～8、温度为40～45℃的条件下酶解8～10h。 [0048] S3.1中，所述调节pH的值为4.0～5.0。 [0050] S3.1中所述过滤使用的助滤剂的使用量为0.5％～1％牛筋重量。 [0051] S3.3、S4.2和S5.1中，所述精密过滤的孔径为5μm。 [0052] S3.3和、S4.2和S5.中，所述纳滤使用的纳滤膜的孔径为150Da。 [0053] S3.3和S4.2中，所述纳滤后的流出液的含固量20％～25％、电导率≤5mS/cm。 [0054] S3.3和S4.2中，所述双效浓缩是在50～60℃下浓缩至比重1.15～1.25。 [0055] S3.3和S4.2中，所述灭菌为本领域常规操作。 [0057] S4.1中，所述酶解在pH为7～9、温度为50～60℃条件下酶解5～8h。 [0058] S5中，所述洗脱使用的洗脱液为10％氯化钠水溶液。 [0059] S5.1中，所述超滤使用的超滤膜孔径为5000Da。 [0060] S5.1中，所述醇沉度数60％～65％。 [0061] S5.1中，所述脱水度数为92％以上。 [0062] S5.1中，所述干燥温度60～80℃。 [0063] 本发明中，所述纳滤、超滤均保留截留液，将截留液进行下一步操作；所述精密过滤、过滤均保留滤液。 [0064] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0065] 1.针对牛筋具有韧性和难以加工的特点，本发明增加了预处理步骤。首先，从便于干燥脱脂去除牛脂味角度、增加浸出率角度以及综合利用牛筋、提高利用率的角度进行创新，引入了生理组织切片酸泡固化技术、冷冻切薄片并刺破组织细胞释放内部杂质、酒精脱水防黏结便于干燥、真空干燥实现低温膨化、非极性溶剂提油脂。这些改进措施提高了亚临界萃取脂溶性成分的效率，同时有效去除了牛筋中的水溶性和脂溶性杂质，提高了产品的提取效率和产品质量。此外，本发明还使用了专用的阴离子交换吸附树脂来富集硫酸软骨素钠，实现了有效的提取效果。值得一提的是，本发明的方法可与现有的酶法提取牛软骨硫酸软骨素钠和胶原蛋白肽的大部分生产设备相兼容，且改造成本较低。 [0066] 2.本发明利用牛筋提取硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽，产品提取产率高(硫酸软骨素钠1.1％～1.3％、弹性蛋白肽5.3％～16.5％、胶原蛋白肽8.1％～15.6％、牛脂1％～1.5％)、质量好、纯度高，无异味。其中，弹性蛋白肽中的锁链素和异锁链素含量为0.32％～1.13％，超过国内某企业的弹性蛋白肽的原料收购标准；5000Da以下肽含量达90％以上，硫酸软骨素钠达到药典标准，胶原蛋白肽达到食品标准，提高了牛筋的综合利用价值。 [0067] 3.与单一提取弹性蛋白肽工艺相比，本发明同时提取了弹性蛋白肽、胶原蛋白肽和硫酸软骨素钠，大幅提高了牛筋的综合利用率，显著减少了废水中有机物含量，降低了处理成本，显著提高了牛筋的综合利用价值。附图说明 [0068] 图1为硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的提取工艺流程图。 具体实施方式[0069] 为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。 [0070] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。 [0071] 硅藻土通常分为粗土、中土、细土，不同厂家对硅藻土分类略有差别，本发明实施例使用的硅藻土购于吉林远通矿业有限公司，中土型号为ZBS300#、细土型号为BS30#，本发明实施例中硅藻土为混合硅藻土，中细质量比为3/1。 [0072] 本发明中的复合萃取剂是油脂设备厂家专用萃取剂，主要成分为丁烷，有些萃取剂中会加入乙醇调整溶剂极性。 [0073] 本发明S3.2中强酸型阳离子交换树脂、强碱型阴离子交换树脂可使用罗门哈斯品牌；S4.1中阴离子交换树脂需要使用软骨素吸附专用树脂，用于富集硫酸软骨素钠，一般为罗门哈斯品牌。 [0074] 以下实施例中，硫酸软骨素钠参照药典标准检测；胶原蛋白肽参照国标GB31645检测；弹性蛋白肽的检测尚无国标，可参QBT5936‑2023‑弹性蛋白肽(公示阶段尚未批复)，其中涉及锁链素/异锁链素的含量测定方法(具体为锁链素/异锁链素是由4个赖氨酸组成的环肽，在弹性蛋白肽中通常以结合其他氨基酸的多肽形式出现。利用酸水解处理将弹性蛋白肽中锁链素/异锁链素从多肽链上释放出来，释放出来的锁链素/异锁链素经过氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换柱分离后，在135℃下与茚三酮混合反应形成蓝紫色化合物，在570nm波长下检测衍生产物，保留时间定性，外标法进行定量分析。)。 [0075] 其他物质的可参照Q/HTSW 0004S‑2021，广东省食品安全企业标准中对牛韧带弹性蛋白肽的参考标准。 [0076] 实施例1 [0077] 原料：东北新鲜牛筋 [0078] (1)取一定量经检验检疫合格的牛筋，进行初步筛选。对牛筋前处理：鲜牛筋去杂，加1倍量pH＝1的醋酸溶液(由反渗透水配制)浸泡24小时，加2倍水清洗2次，加0.5倍量牛筋质量的水冷冻成长条状，用冷冻横切片法将牛筋切成0.5～1.0mm厚的薄片，10℃以下反渗透水水洗三次，95％酒精浸泡脱水3次，在乙醇回收装置中50℃下进行真空干燥，粉碎至颗粒状。(本步骤中倍量是指牛筋重量的倍数) [0079] (2)脱脂：亚临界萃取牛脂，使用丁烷复合萃取溶剂进行萃取，萃取工作压力在0.5MPa左右，工作温度35～50℃。 [0080] (3)碱水浸取、分离：pH＝9的氢氧化钠水溶液提取胶原蛋白及蛋白多糖，滤渣含弹性蛋白；分三次浸取，三次所需氢氧化钠水溶液总量为牛筋片的质量的8～10倍，第一次浸取3h、第二次浸取2h、第三次浸取2h；提取温度为95～100℃，固液分离后，得到滤渣和碱水提取液。 [0081] (4)酶解：收集滤渣，加水蒸煮(加热温度为120℃)4小时；加滤渣4～6倍质量反渗透水、加滤渣质量0.5％的复合酶水解(复合酶中含25wt％碱性蛋白酶和75wt％中性蛋白酶)，酶解在pH为7～8、温度为40～45℃的条件下酶解8～10h；75℃下酶灭活，时间0.5小时；调节pH至4.0～5.0，过滤使用助滤剂用滤渣重0.5％～1％硅藻土。其中，使用的助滤剂添加过多会损失产量，因此添加滤渣重量0.5％～1％的硅藻土助滤 [0082] (5)提纯：过滤液依次经过强酸型阳离子交换树脂、强碱型阴离子交换树脂、弱碱型大孔树脂，收集流出经精密过滤器(孔径为5μm)、纳滤(膜孔径150Da)，浓缩脱盐处理到含固量20％～25％，电导率≤3mS/cm。 [0083] (6)浓缩：50～60℃双效真空浓缩到45％～50％。 [0084] (7)灭菌、干燥：喷雾干燥的进风160～190℃、出风80～85℃，得到弹性蛋白肽。 [0085] (8)硫酸软骨素钠的提取：将(3)的碱水提液酶解[同步骤(4)使用的酶的种类及质量，酶解在pH为7～9、温度为50～60℃条件下酶解5～8h]，再在75～80℃下酶灭活1h；压滤[助滤剂同步骤(4)中过滤，使用10％的食氯化钠水溶液水洗脱]、过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、弱碱型大孔树脂，10％氯化钠水溶液水洗脱阴离子交换树脂的截留物的硫酸软骨素钠，洗脱液压滤[助滤剂同步骤(4)中过滤]去除碎树脂等杂质，后超滤，超滤膜5000Da，处理至超滤水含氯0.5％～0.8％，含固量10％～12％，截留液加约3倍酒精沉淀，控制料液中酒精度数60％～65％，沉淀物加酒精脱水，脱水处理2次，加酒精量应保证处理到酒精度数大于92％，脱水沉淀用热风烘箱干燥，干燥温度75℃。 [0086] (9)胶原蛋白肽的提取：将(8)的阴离子交换树脂吸附硫酸软骨素后的流出液通过精密过滤、纳滤、双效浓缩、灭菌、喷雾干燥处理后得胶原蛋白肽。[本步骤中精密过滤、纳滤、双效浓缩、灭菌、喷雾干燥具体参数同步骤(5)～(7)]。 [0087] 实施例2 [0088] 原料使用东北新鲜牛板筋，其他步骤同实施例1。 [0089] 实施例3 [0090] 原料使用东北新鲜牛颈韧带，其他步骤同实施例1。 [0091] 实施例1～3获得的硫酸软骨素钠、弹性蛋白肽、胶原蛋白肽的收率如表1牛筋产品收率表。 [0092] 对比例1 [0093] 本实施例对牛筋前处理(1)中仅经水洗、干燥、粉碎；其他步骤均同实施例1。各物质收率分别为：硫酸软骨素0.1％、弹性蛋白肽14.7％、胶原蛋白肽1.8％、牛脂无；弹性蛋白肽中的锁链素和异锁链素含量为0.12％，且弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的颜色均为黄色，腥味和酸味重，为顺利滤过，硅藻土用量较实施例1增加近5倍。 [0094] 对比例2 [0095] 本实施例对牛筋前处理(1)中仅经水洗、干燥、粉碎；其他步骤均同实施例1，并增加针剂用活性炭脱色脱味处理工艺，活性炭用量为弹性蛋白肽水解液及胶原蛋白肽水解液的0.5～1wt％，硅藻土用量与对比例1差不多。 [0096] 各物质收率分别为：硫酸软骨素0.1％、弹性蛋白肽8.7％、胶原蛋白肽1.5％、牛脂无；弹性蛋白肽中的锁链素和异锁链素含量为0.18％，且弹性蛋白肽和胶原蛋白肽的颜色均为白色，无明显异味。 [0097] 表1 [0098] 项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2硫酸软骨素钠 1.3％ 1.1％ 1.2％ 0.1％ 0.1％ 弹性蛋白肽 5.3％ 9.3％ 16.5％ 14.7％ 8.7％ 胶原蛋白肽 15.6％ 13.5％ 8.1％ 1.8％ 1.5％ 牛脂 1.5％ 1.2％ 1.0％ 0％ 0％ [0099] 将实施例1～3获得的硫酸软骨素钠的各项性能进行检测，数据见表2硫酸软骨素钠检测数据汇总表。 [0100] 表2 [0101] [0102] [0103] 表3为几个企业弹性蛋白肽食品备案标准部分指标汇总表。 [0104] 表3 [0105] [0106] [0107] 将实施例1～3获得的弹性蛋白肽参照胶原蛋白肽GB31645‑2018标准方法检测，增加锁链素和异锁链素项目(参照国内某保健食品企业鲣鱼弹性肽原料检测指标应大于0.1％)，数据见表4弹性蛋白肽检测数据汇总表。 [0108] 表4 [0109] [0110] [0111] 从表1中的数据可以看出，实施例1～3中硫酸软骨素钠的收率和胶原蛋白肽的收率均较稳定，弹性蛋白肽的收率与原料相关性大；从表2～4中的数据可以看出，实施例1～3获得的硫酸软骨素钠、胶原蛋白肽的质量均达到国家标准的质量，弹性蛋白肽达到国内企业备案标准要求，其中锁链素和异锁链素含量超过国内某企业的弹性蛋白肽的原料收购标准。 [0112] 从对比例1可看出，未经处理的牛筋提取的弹性蛋白肽纯度低，色黄异味重，达不到行业要求；从对比例2可看出，对未经处理的牛筋提取的弹性蛋白肽增加脱色脱味处理可得到色味合格产品，但收率较低，且纯度仍小于实施例。从表1中可看出未经前处理的牛筋总提取率低于处理过的。 |
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