[0001] 本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束、制备方法及应用。

[0002] 乳腺癌(BC)预后性差、复发率高，研究表明，肿瘤细胞嵌入复杂的肿瘤微环境(TME)中，其中激活的成纤维细胞(aCAF)可促进肿瘤细胞的耐药和转移。因此，抑制成纤维细胞(CAF)的激活并对其进行杀伤来重塑TME，进而阻断BC和aCAF之间的cross‑talk将是治疗乳腺癌的有效方式。

[0003] 阿霉素(DOX)作为一种传统化疗药物，因其可以抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成而具有良好的抗肿瘤作用。然而，游离药物由于在体内存在清除率快、靶向性差、毒副作用强的特性，而在临床上应用受限。最近的研究显示，基于多糖的纳米颗粒具有良好的生物相容性、无毒性、无免疫原性和易于合成等优点，已被广泛用于抗肿瘤药物的递送。

[0004] 发明目的：本申请提供了一种pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束、制备方法及应用。

[0005] 技术方案：本申请实施例公开了一种pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束，所述纳米胶束包括聚合物硫酸软骨素‑阿霉素，其结构式如下所示：

[0006]

[0007] 其中，n为15～40；

[0008] 所述聚合物硫酸软骨素‑阿霉素中阿霉素的接枝率为10％～15％。

[0009] 在一些实施例中，所述纳米胶束负载有小檗碱，所述小檗碱的载药量为10％～15％。

[0010] 在一些实施例中，％所述纳米胶束的平均粒径为150nm～160nm，所述纳米胶束的电位为‑25mV～‑35mV。

[0011] 在一些实施例中，所述聚合物硫酸软骨素‑阿霉素通过以下方法制备：

[0012] 在含有硫酸软骨素的水溶液中，加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1‑羟基苯并三唑对硫酸软骨素的羧基活化，然后，将己二酸二酰肼加入到硫酸软骨素溶液中，室温条件下反应，得到硫酸软骨素‑己二酸二酰肼；

[0013] 在含有硫酸软骨素‑己二酸二酰肼的有机溶液中，加入盐酸阿霉素和三乙胺，室温下避光反应得到聚合物硫酸软骨素‑阿霉素。

[0014] 本申请实施例进一步提供了一种pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束的制备方法，[0015] 提供具有聚合物硫酸软骨素‑阿霉素的水溶液，加入小檗碱，通过探头超声法制备负载有小檗碱的纳米胶束；

[0016] 所述聚合物硫酸软骨素‑阿霉素的结构式如下：

[0017]

[0018] 其中，n为15～40；

[0019] 所述聚合物硫酸软骨素‑阿霉素中阿霉素的接枝率为10～15％。

[0020] 在一些实施例中，所述聚合物硫酸软骨素‑阿霉素通过以下方法制备：

[0021] 在含有硫酸软骨素的水溶液中，加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1‑羟基苯并三唑对硫酸软骨素的羧基活化，然后，将己二酸二酰肼加入到硫酸软骨素溶液中，室温条件下反应，得到硫酸软骨素‑己二酸二酰肼；

[0022] 在含有硫酸软骨素‑己二酸二酰肼的有机溶液中，加入盐酸阿霉素和三乙胺，室温下避光反应得到聚合物硫酸软骨素‑阿霉素。

[0023] 在一些实施例中，所述硫酸软骨素和己二酸二酰肼的质量比为1：(10～15)。

[0024] 在一些实施例中，所述硫酸软骨素‑己二酸二酰肼与所述盐酸阿霉素的质量比为1：(0.2～0.5)。

[0025] 本申请实施例进一步提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含有上述的pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束。

[0026] 本申请实施例进一步提供了上述的pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束，或上述的制备方法所制备的pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束，或上述的药物制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

[0027] 有益效果：本申请制备的pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束可靶向乳腺癌细胞(BC)以及乳腺癌微环境中激活的成纤维细胞(aCAFs)，并通过诱导BC和CAFs的凋亡以及抑制TGF‑β诱导的成纤维细胞的激活来阻断BC和CAFs之间的cross‑talk，进而起到重塑乳腺癌微环境并杀伤乳腺癌细胞的作用。附图说明

[0028] 图1为本申请的传送载体的制备方法和治疗机理图；

[0029] 图2为本申请中CS‑DOX聚合物的合成步骤；

[0030] 图3为本申请实施例中在D2O中，CS，ADH，CS‑ADH聚合物，DOX，CS‑DOX聚合物的1HNMR谱图；

[0031] 图4为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX形态学和体外稳定性分析，其中，A图为BBR/CS‑DOX纳米粒的粒径分布图，B图为电镜下的形态分布(pH＝7.4)，C图为电位分布图，D图为BBR/CS‑DOX纳米粒分别在PBS(pH＝7.4)和DMEM培养基中的粒径变化图，比例尺：200nm；

[0032] 图5为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX纳米粒的pH响应性检测结果，其中，A图为不同pH值下BBR/CS‑DOX的电镜变化图，B图为粒径变化图，C图为BBR/CS‑DOX、BBR、DOX体外药物释放，比例尺：200nm；

[0033] 图6为本申请制备的CS‑ADH分别在0.2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和Triton‑X‑100中的溶血率测试结果；

[0034] 图7为本申请中α‑SMA细胞免疫荧光染色结果，其中，A图为NIH3T3细胞的α‑SMA免疫荧光染色结果，B图为α‑SMA蛋白的荧光定量分析结果；

[0035] 图8为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX的体外细胞毒性实验测试结果，其中，A图为MCF‑7细胞与不同药物制剂孵育48h的细胞毒性测试结果，B图为MCF‑7+NIH3T3共培养细胞与不同药物制剂孵育48h的细胞毒性测试结果，C图为BBR和DOX的不同联用比例下的细胞存活率，D图为BBR和DOX的不同联用比例下的协同指数CI测试结果，*P<0.05，**P<0.01；

[0036] 图9为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX的体外细胞摄入与药物滞留实验测试结果，其中，A图为MCF‑7+NIH3T3共培养细胞摄取的激光共聚焦图像(红色：DOX，蓝色：DAPI)，B图为共培养细胞摄取的流式定量测试结果，C图为体外细胞摄入定量分析结果，D图为共培养细胞药物滞留的共聚焦图像，E图为共培养细胞药物滞留流式实验结果，F图为共培养细胞药物滞留定量测试结果；

[0037] 图10为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX的体外抗细胞迁移实验结果，其中，A图和B图分别为不同药物制剂处理的MCF‑7细胞划痕实验及其定量测试结果，C图和D图分别为MCF‑7+NIH3T3共培养细胞划痕实验及其定量测试结果(绿色荧光：NIH3T3细胞)，E图为F图为不同制剂处理的MCF‑7+NIH3T3共培养细胞Transwell实验(E)及其定量测试结果；

[0038] 图11为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX的体外3D肿瘤球渗透实验，通过激光共聚焦显微镜分别拍摄DOX、CS‑DOX、BBR/CS‑DOX处理的MCF‑7肿瘤球在不同层面的渗透情况，(绿色荧光：DOX)；

[0039] 图12为本申请实施例中制备的BBR/CS‑DOX在“NIH3T3+4T1”皮下荷瘤小鼠模型中的体内抑瘤实验。(A)“NIH3T3+4T1”荷瘤小鼠治疗方案示意图。经过不同药物处理7次后，刨离不同治疗组的皮下瘤的瘤照(B)和肿瘤生长抑制率(D)。皮下荷瘤小鼠经尾静脉给药期间，小鼠体重变化曲线(C)和肿瘤体积变化曲线(E)；

[0040] 图13为本申请不同药物制剂处理的不同脏器(瘤、心、肝、脾、肺、肾)H&E染色分析；

[0041] 图14为本申请中“NIH3T3+4T1”皮下荷瘤小鼠模型中，不同制剂处理的皮下肿瘤组织切片染色结果，其中，A图为不同制剂组的皮下瘤H&E染色结果，B图为Masson三色染色结果，C图为α‑SMA免疫荧光染(绿色荧光：α‑SMA)，D图和E图分别为CD31免疫组化染色以及Tunel染色结果；

[0042] 图15为本申请DiR/CS‑DOX在乳腺癌晚期荷瘤小鼠模型中的体内生物分布结果，其中，A图为晚期乳腺癌模型的建立及活体成像示意图，B图为在不同时间点，DiR和DiR/CS‑DOX在荷瘤小鼠体内的生物分布情况，C图为DiR和DiR/CS‑DOX处理荷瘤小鼠48h后，主要脏器的离体荧光成像，D图和E图分别为DiR和DiR/CS‑DOX组的肺组织照片及其肺组织H&E染色；

[0043] 图16为本申请实施例制备的BBR/CS‑DOX的体内肿瘤渗透性和血小板靶向性分析结果，其中，A图为BBR/CS‑DOX在晚期乳腺癌荷瘤小鼠的肺组织分布及血小板靶向性考察结果，B图为BBR/CS‑DOX在晚期乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤组织中渗透的共聚焦显微镜图像(绿色：P‑选择素、红色：DOX)；

[0044] 图17为本申请实施例制备的BBR/CS‑DOX的体内抗乳腺癌肺转移结果，其中，A图为4T1乳腺癌肺转移模型建立示意图，B图为肺转移小鼠经过各药物制剂处理期间体重变化曲线，C图、D图和E图分别为经过不同药物处理的小鼠肺组织照片、肺结节定量以及肺组织H&E染色图像。

[0045] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0046] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0047] 硫酸软骨素(CS)是一种天然多糖，由于其具有多个官能团，其结构式如下所示：

[0048]

[0049] 其中，n表示硫酸软骨素的聚合度，n的取值与硫酸软骨素的分子量有关。在一些实施例中，本申请采用的硫酸软骨素的平均分子量(MW)为10～20kDa。如在一些具体实施例中，硫酸软骨素的平均分子量(MW)为10kDa、15kDa、20kDa中的任意值或者任意两值组成的范围。

[0050] 硫酸软骨素可以被进一步修饰以形成两亲性聚合物纳米胶束，并可对化疗药物进行包载。研究表明，CS具有与CD44受体特异性结合的特性，并且乳腺癌细胞和成纤维细胞表面均高表达CD44受体。因此，基于CS的纳米递药系统可主动靶向BC和CAFs并提高化疗药物的生物利用度、降低毒副作用。

[0051] 在一些实施例中，本申请通过己二酸二酰肼(ADH)与CS形成CS‑ADH，其结构式如下：

[0052]

[0053] 在一些实施例中，CS‑ADH通过以下方法制备：在含有硫酸软骨素(CS)的水溶液中，加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和1‑羟基苯并三唑(HOBt)对CS的羧基活化，然后，将ADH加入到CS溶液中，室温条件下反应，得到CS‑ADH。

[0054] 在一些实施例中，硫酸软骨素、EDC和HOBt的质量比为：1：(1.5～2)：(1～1.5)，如在一些具体实施例中，硫酸软骨素、EDC和HOBt的质量比为：1：(1.9～2)：(1.3～1.4)。

[0055] 在一些实施例中，硫酸软骨素和己二酸二酰肼的质量比为1：(10～15)，如在一些具体实施例中，硫酸软骨素和己二酸二酰肼的质量比为1：(13～15)。

[0056] 在一些实施例中，CS‑ADH通过以下方法制备：称取200mg CS溶解于40mL蒸馏水，随后将0.384g EDC和0.27g HOBt加入该体系中，对CS的羧基活化1h。然后，将2.613g ADH加入到CS溶液，室温条件下匀速搅拌24h，纯水透析72h，冻干36h，得到CS‑ADH。

[0057] 为了解决游离阿霉素的问题，在一些实施例中，本申请通过将阿霉素(DOX)通过腙键与硫酸软骨素(CS)结合形成pH敏感性纳米胶束(CS‑DOX)。在一些实施例中，本申请通过以下方式实现阿霉素与硫酸软骨素的连接：在含有CS‑ADH的有机溶液中，加入盐酸阿霉素(DOX·HCl)和三乙胺(TEA)，室温下避光反应得到CS‑DOX聚合物，其结构式如下所示：

[0058]

[0059] 在一些实施例中，CS‑ADH溶解于甲酰胺，形成含有CS‑ADH的有机溶液。

[0060] 在一些实施例中，CS‑ADH与盐酸阿霉素的质量比为1：(0.2～0.5)，如CS‑ADH与盐酸阿霉素的质量比为1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5中的任意值或者任意两值组成的范围。

[0061] 在一些实施例中，三乙胺加入量与反应体系的体积比为(0.0005～0.001)：1。

[0062] 在一些实施例中，CS‑DOX聚合物通过以下方法制备：将40mg CS‑ADH溶于8mL甲酰胺中，加入16mg DOX·HCl和6μL TEA，室温下避光搅拌56h，纯水透析72h，冻干得到CS‑DOX聚合物纳米胶束。

[0063] 小檗碱(BBR)是一种从黄连等小檗属植物中提取的异喹啉类生物碱，具有抗炎、抗癌等多种药理作用。此外，BBR可以通过激活AMPK信号通路，抑制TGF‑β诱导的成纤维细胞的激活。因此，DOX和BBR的联合可通过促肿瘤细胞凋亡和重塑TME来实现协同抗乳腺癌效果。

[0064] 在一些实施例中，本申请进一步通过CS‑DOX聚合物纳米胶束包埋BBR，得到pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束BBR/CS‑DOX，实验结果表明，BBR/CS‑DOX可靶向乳腺癌细胞和成纤维细胞并有效阻断乳腺癌细胞和成纤维细胞之间的cross‑talk，从而抑制乳腺癌的耐药和转移。BBR/CS‑DOX形态上近似球形，并具有窄的粒径分布，负Zeta电位和pH响应性的药物释放。BBR/CS‑DOX对人乳腺癌细胞(MCF‑7)以及人乳腺癌细胞和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)共培养细胞模型(MCF‑7/NIH3T3)表现出较高的细胞毒性作用以及有效抑制细胞迁移的作用。BBR/CS‑DOX明显增加MCF‑7/NIH3T3共培养细胞模型对药物的摄取和滞留。BBR/CS‑DOX在MCF‑7/NIH3T3共培养细胞的3D肿瘤模型中具有较强的渗透能力。体内抗肿瘤研究表明，与其他药物制剂组相比，BBR/CS‑DOX具有更好的抗肿瘤作用。苏木素‑伊红染色、免疫组化以及免疫荧光等组织学分析实验进一步表明BBR/CS‑DOX具有抗乳腺癌效果。

[0065] 在一些实施例中，BBR/CS‑DOX通过以下方法制备：在CS‑DOX水溶液中，加入BBR，室温条件下搅拌，得到聚合物溶液，将聚合物溶液在冰浴中超声，得到pH敏感性硫酸软骨素纳米胶束BBR/CS‑DOX。

[0066] 在一些实施例中，BBR在CS‑DOX纳米胶束中的载药量为10％～15％，如BBR在纳米胶束中的载药量为10％、11％、12％、13％、14％、15％中的任意值或者任意两值组成的范围。

[0067] 在一些实施例中，BBR/CS‑DOX纳米胶束的平均粒径为150nm～160nm，如BBR/CS‑DOX纳米胶束的平均粒径为150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm中的任意值或者任意两值组成的范围。

[0068] 在一些实施例中，BBR/CS‑DOX纳米胶束的Zeta电位为‑25mV～‑35mV，如BBR/CS‑DOX纳米胶束的Zeta电位为‑25mV、‑26mV、‑27mV、‑28mV、‑29mV、‑30mV、‑31mV、‑32mV、‑33mV、‑34mV、‑35mV中的任意值或者任意两值组成的范围。

[0069] 在一些实施例中，BBR/CS‑DOX纳米胶束的多分散指数(PDI)为0.14～0.2。

[0070] 本申请将DOX通过酰胺反应并生成具有酸敏感性的腙键连接到CS，形成pH响应性的CS‑DOX纳米胶束，并通过超声透析法将BBR包载在CS‑DOX中形成BBR/CS‑DOX。BBR/CS‑DOX可同时靶向BC和CAFs并在酸性肿瘤微环境响应性释放药物，进而重塑乳腺癌微环境、抑制BC的增殖和转移。

[0071] 本申请实施例中采用的材料如下所示：

[0072] CS(MW：10kDa)购自康平生物科技(中国山东)。己二酸二酰肼(ADH)和1‑羟基苯并三唑(HOBt)购自源叶生物(中国上海)。1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)购自Medpep试剂公司(中国上海)。三乙胺(TEA)购自Macklin生物科技(中国上海)。盐酸阿霉素(DOX·HCl)购自Meilunbio生物(中国大连)。小檗碱购自伊诺凯生物科技(中国北京)。ExCell胎牛血清购自依科赛生物科技(中国苏州)。α‑SMA抗体购自Proteintech抗体公司(中国武汉)。

[0073] 人乳腺癌细胞(MCF‑7)，小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)购自武汉大学细胞保藏中心。6周龄的BALB/c小鼠(雌性)从济南朋悦实验动物有限公司购买，实验过程中的动物实验符合潍坊医学院动物伦理标准。

[0074] 本申请中，通过以下方法测试BBR/CS‑DOX理化性能和生物活性。

[0075] (1)BBR/CS‑DOX的载药量、包封率以及接枝率的测定方法：通过紫外分光光度计检测BBR/CS‑DOX纳米胶束中DOX的接枝率。将6mg CS‑DOX溶于1mol/L HCl溶液中，避光条件下磁力搅拌24h，设置紫外分光光度计波长为480nm，检测DOX的接枝率。称取2mg BBR/CS‑DOX溶于10mL甲醇，在转速为20000r/min条件下离心20min，之后取上清液，设置紫外分光光度计的波长为357nm，测定上清液中BBR的含量，计算BBR的载药量和包封率。

[0076] (2)BBR/CS‑DOX粒径和zeta电位的测试方法：称取4mg BBR/CS‑DOX并溶于4mL PBS缓冲液(pH＝7.4)，冰浴条件下探头超声5min，之后过220nm的滤膜，通过马尔文粒度仪检测BBR/CS‑DOX的粒径和zeta电位。

[0077] (3)BBR/CS‑DOX纳米胶束的pH响应性检测方法：粒径变化测试方法：将BBR/CS‑DOX溶于不同pH(PBS，pH＝7.4、6.8、5.5)中，通过马尔文粒度仪测定BBR/CS‑DOX纳米胶束在不同pH下的粒径变化。形态变化测试方法：使用不同pH(pH＝7.4、6.8、5.5)的PBS溶液，分别配置成1mg/mL的BBR/CS‑DOX溶液，室温下孵育4h，经磷钨酸染色后，通过透射电子显微镜观察不同pH下纳米胶束形态变化

[0078] (4)BBR/CS‑DOX纳米胶束的稳定性测试方法：分别使用PBS和RPMI 1640培养基配置1mg/mL的BBR/CS‑DOX，并将配置好的BBR/CS‑DOX分装相同的7份存放在4℃冰箱，通过马尔文粒度仪连续7天测量BBR/CS‑DOX在PBS和RPMI 1640培养基中的粒径变化。

[0079] (5)BBR/CS‑DOX体外药物释放分析：通过透析法对BBR/CS‑DOX纳米胶束的体外药物释放行为进行检测，分别取1mL BBR/CS‑DOX溶液(pH＝7.4、6.8、5.5)加入透析袋中，将透析袋放入装有50mL释放介质(含0.5％Tween 80的PBS缓冲液)的锥形瓶中，将整个释放体系置于37℃、转速为100rpm的气浴恒温震荡培养箱中，在指定的时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h)取3mL的释放介质并加入相同体积的新介质。最后计算不同pH下BBR和DOX的累积药物释放量。

[0080] (6)空白纳米粒CS‑ADH的溶血实验：首先制得2％小鼠红细胞悬液，之后用2％小鼠红细胞悬液配置成不同浓度的CS‑ADH溶液(0.2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL)，并设置阳性对照组为Triton‑X‑100，阴性对照组为生理盐水组。将上述待测样品置于温度为37℃、转速为100rpm的气浴式恒温震荡箱中，孵育2h。之后对所有样品进行拍照后，将其置于3500r/min转速下离心10min，取每个样品中的上清液加入96孔板，设置酶标仪的波长为
545nm，测量吸光度值(OD)，计算溶血率

[0081] (7)BBR/CS‑DOX纳米粒的体外细胞学检测：α‑SMA细胞免疫荧光染色方法：α‑SMA(α‑平滑肌肌动蛋白)是激活的癌相关成纤维细胞表面高表达的标志性蛋白。通过使用MCF‑7细胞上清液(MCF‑7CM)对NIH3T3细胞预处理，使其成为激活态，之后进行药物干扰，观察激活后的NIH3T3细胞中α‑SMA蛋白表达情况。首先将NIH3T3细胞接种于激光共聚焦皿，培养过夜后，将含有10％血清的MCF‑7细胞上清液预处理NIH3T3细胞24h，之后向预处理的NIH3T3细胞中分别加入DOX，DOX+BBR，孵育细胞24h，之后对NIH3T3细胞进行α‑SMA细胞免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜拍照。BBR/CS‑DOX的体外细胞毒性检测方法：本申请建立由MCF‑7和/NIH3T3组成的共培养细胞模型(MCF‑7/NIH3T3)模拟乳腺癌微环境，采用MTT法检测DOX，BBR，DOX+BBR，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX对MCF‑7和MCF‑7/NIH3T3的细胞毒性。将MCF‑7细胞和MCF‑7/NIH3T3共培养细胞(MCF‑7与NIH3T3数量比为5:1)分别接种于96孔板(5×103个细胞/孔)，细胞培养箱中培养过夜后，分别用DOX，BBR，DOX+BBR，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX处理细胞48h。之后，每孔加入10μLMTT溶液，继续孵育细胞4h，每孔加入150μL二甲基亚砜溶液。用酶标仪(波长为490nm)测定每个孔的吸光度，分别计算MCF‑7细胞和MCF‑7/NIH3T3共培养细胞的细胞存活率。此外，为了验证BBR与DOX的药物协同效应，检测两药在不同药物浓度比值下(DOX:CAP＝3:1，1.5:1，1:1，1:1.5，1:3)对MCF‑7/NIH3T3共培养细胞的细胞毒性(DOX浓度：0.1‑25μg/mL)。BBR/CS‑DOX的体外细胞摄入与药物滞留分析方法：本申请进行MCF‑7/NIH3T3共培养细胞细胞摄入以及竞争性抑制实验，验证MCF‑7/NIH3T3共培养细胞的靶向
5
性。将MCF‑7/NIH3T3共培养细胞以1.5×10 个/皿接种于激光共聚焦培养皿并培养过夜，将CS(10mg/mL)预孵育细胞4h，之后将DOX、BBR/CS‑DOX分别加入未预孵育的细胞，BBR/CS‑DOX加入到CS预处理的细胞(DOX：10μg/mL)，分别孵育共培养细胞3h后，弃掉培养液，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定10min，DAPI染色8min，用激光共聚焦显微镜观察。之后通过流式细胞
5
术对该实验进行定量分析。药物滞留实验方法：首先将MCF‑7/NIH3T3共培养细胞以2×10个/皿接种于激光共聚焦皿，将DOX，DOX+BBR，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX分别处理细胞4h、12h、
24h，经过4％多聚甲醛固定后，DAPI染色，最后通过共聚焦显微镜拍照观察。此外，通过流式细胞术对共培养细胞的药物滞留情况进行定量分析，考察药物在共培养细胞内的分布情况。BBR/CS‑DOX的体外抗细胞迁移分析方法：通过伤口愈合试验评估BBR/CS‑DOX的体外抗肿瘤细胞迁移作用。首先将MCF‑7细胞和MCF‑7/NIH3T3共培养细胞(CFSE染液对NIH3T3进行
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荧光标记)以2×10个/孔分别接种于6孔板，培养24h，然后用200μL移液枪头尖端对6孔板内的细胞进行垂直划线，在每个孔中形成三条接近等宽的伤口状线，PBS清洗2次，分别用DOX，BBR，DOX+BBR，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX处理不同孔内的细胞，在0h和24h这两个时间点通过倒置荧光显微镜拍摄每个孔中细胞的伤口宽度，最后使用Image J软件计算MCF‑7细胞和MCF‑7/NIH3T3共培养细胞的细胞迁移率。Transwell实验方法：对MCF‑7/NIH3T3共培养细胞进行Transwell实验，具体为使用不含血清的培养基配置不同的药物制剂，将不同的药物制剂(DOX，BBR，DOX+BBR，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX)与MCF‑7/NIH3T3共培养细胞接种于Transwell上室，将含有10％Excell血清的培养液加入下室，培养箱中培养24h，PBS清洗小室2～3次，使用细棉签头擦除上室未迁移的共培养细胞，PBS清洗2～3次，4％多聚甲醛对迁移到下室的共培养细胞进行固定，PBS清洗2～3次，使用结晶紫对迁移的共培养细胞在室温下染色
8min，最后通过倒置荧光显微镜对迁移到下室的共培养细胞进行拍照观察，考察BBR/CS‑DOX的体外抗肿瘤细胞迁移作用。3D肿瘤球渗透实验方法：将低熔点琼脂糖添加到96孔板
3
中，置于超净工作台中经紫外线照射灭菌后。将180μLMCF‑7/NIH3T3共培养细胞(1.5×10个/孔)接种到96孔板中，培养箱中培养7天后，对共培养细胞进行每隔一天半量换液法换液，待细胞球长到适宜大小，弃掉孔内培养液，分别将DOX，CS‑DOX，BBR/CS‑DOX加入孔中，孵育6h后，通过CLSM观察不同制剂组在共培养细胞3D肿瘤球中的渗透情况。

[0082] (6)BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗肿瘤分析，BBR/CS‑DOX在4T1/NIH3T3皮下荷瘤小鼠模型中的体内抗肿瘤效应的实验方法：构建4T1/NIH3T3共植入皮下荷瘤小鼠模型模拟肿6
瘤微环境，将4T1细胞和NIH3T3细胞以数量比为5:1进行混合，取0.1mL的混合细胞(2×10
3
个/只)并皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后背，当肿瘤体积长到大约110mm时，将荷瘤小鼠随机分组(每组5只)：①生理盐水组(Saline)、②游离BBR组、③游离DOX组、④DOX+BBR组、⑤CS‑DOX组、⑥BBR/CS‑DOX组，对小鼠进行每隔一天尾静脉给药(给药剂量DOX：3mg/kg，BBR：3mg/kg)，并记录各组小鼠体重和皮下瘤体积，14天后，使所有小鼠安乐死，剖离小鼠的脾、肾、心、肺、肝和肿瘤，称取肿瘤的重量(计算抑瘤率)并对不同组别的肿瘤进行拍照，将剖离的主要器官和肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中，以进行后期的病理切片分析。BBR/CS‑DOX纳米粒的体内生物分布评价方法：采用小动物活体成像系统考察BBR/CS‑DOX在小鼠体内的生物分布情况。首先建立乳腺癌晚期荷瘤小鼠模型，将4T1细胞和NIH3T3细胞以数量比
6
为5:1进行混合后，将0.1mL的混合细胞(2×10 个/只)皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后背，7天后，再次将0.1mL的4T1细胞尾静脉注射到已皮下荷瘤小鼠体内，6天后，分别将DiR和包载DiR的纳米粒(DiR/CS‑DOX)尾静脉注射到晚期乳腺癌荷瘤小鼠体内，并在不同时间点(2h、6h、12h、24h、48h)，通过小动物活体成像系统监测游离DiR和DiR/CS‑DOX在小鼠体内的生物分布情况。48h后，使小鼠安乐死并剖离小鼠的脾、肝、心、肾、肺以及肿瘤组织，通过小动物活体成像系统对这些器官进行离体荧光成像分析。BBR/CS‑DOX纳米粒的肿瘤组织渗透性与肺组织分布性考察方法：建立晚期乳腺癌荷瘤小鼠模型，当BALB/c小鼠皮下瘤体积约
3
为120mm时，随机挑选小鼠并分为3组，向3组小鼠的尾静脉分别注射0.2mL游离DOX、0.2mL CS‑DOX和0.2mL BBR/CS‑DOX，12h后使小鼠安乐死，剖离小鼠皮下瘤和肺组织，并通过冷冻切片机对肺组织和不同深度的肿瘤组织进行切片，之后对这些切片进行CD62P(标记P选择素的蛋白)免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜拍照。BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗乳腺癌肺转移评估方法：为了研究BBR/CS‑DOX的体内抗乳腺癌肺转移作用，建立了4T1肺转移
6
模型。将0.1mL4T1细胞(2×10个/只)尾静脉注射到BALB/c小鼠体内，次日随机挑选荷瘤小鼠并分为7组(每组3只)：①健康组(Health)、②生理盐水组(Saline)、③游离BBR组、④游离DOX组、⑤BBR+DOX组、⑥CS‑DOX组、⑦BBR/CS‑DOX组，对小鼠进行每隔一天的尾静脉给药(给药剂量DOX：3mg/kg，BBR：3mg/kg)，给药7次后，使小鼠安乐死，取出小鼠肺组织并进行拍照，计算肺组织转移性肺结节的数量后，将肺组织固定在4％多聚甲醛中以进行组织切片染色。

[0083] (7)组织学染色分析：对4T1/NIH3T3共植入皮下荷瘤小鼠进行组织学染色分析，首先对不同处理组的皮下瘤小鼠肿瘤组织和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行常规脱水包埋。之后对不同药物处理组的乳腺癌皮下荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾、瘤进行H&E染色分析。此外，对不同制剂组处理的乳腺癌皮下荷瘤小鼠进行Masson三色染色、α‑平滑肌肌动蛋白(α‑SMA)免疫荧光染色、CD31(血管标记蛋白)免疫组化染色以及TUNEL染色，考察BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗肿瘤机制。

[0084] 实施例1：BBR/CS‑DOX纳米胶束的制备

[0085] CS‑ADH的合成：己二酸二酰肼(ADH)通过酰胺反应与CS形成CS‑ADH：称取200mg CS溶解于40mL蒸馏水，随后将0.384g EDC和0.27g HOBt加入该体系中，对CS的羧基活化1h。然后，将2.613g ADH加入到CS溶液，室温条件下匀速搅拌24h，纯水透析72h，冻干36h，得到CS‑ADH。

[0086] CS‑DOX聚合物的合成：DOX与CS‑ADH通过腙键连接：将40mg CS‑ADH溶于8mL甲酰胺中，加入16mg DOX·HCl和6μL TEA，室温下避光搅拌56h，纯水透析72h，冻干得到CS‑DOX聚1
合物纳米胶束。HNMR检测CS‑DOX化学结构，结果如图3所示。图3为在D2O中CS，ADH，CS‑ADH聚
1
合物，DOX，CS‑DOX聚合物的 HNMR谱，从图3可以看出，CS与ADH经过酰胺反应得到CS‑ADH，
1 1
DOX通过腙键与CS‑ADH结合形成CS‑DOX聚合物。HNMR验证CS‑DOX聚合物的结构，CS的HNMR
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中，CS结构中的乙酰甲基氢质子化学位移为2.01ppm；在ADH的HNMR中，ADH中亚甲基中氢的
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化学位移为1.65‑1.82ppm和2.20‑2.45ppm；CS‑ADH的 HNMR中，在2.01ppm处和1.65‑
1
1.82ppm和2.20‑2.45ppm处出现明显的化学位移，表明ADH成功连接到CS上。DOX的HNMR中，
1
DOX中芳香苯环的化学位移为7.2‑7.8ppm；CS‑DOX的HNMR中，在7.2‑7.8ppm处出现明显的化学位移，表明DOX成功连接到CS上。本申请制备的CS‑DOX，其制备工艺简易，无需进行硫酸化过程。

[0087] BBR/CS‑DOX的制备：采用超声透析法将BBR包载在CS‑DOX，具体为：称取5mg CS‑DOX，充分溶解于2mL纯水中，低速磁力搅拌15min使聚合物溶解溶胀充分。取150μL BBR(10mg/mL)缓慢滴入强烈磁力搅拌下的CS‑DOX聚合物水溶液中，室温条件下强烈搅拌4h后，将聚合物溶液在冰浴中经探头超声2min/次，超声3次(功率120W)。之后，将聚合物溶液装入透析袋(MW：3500)中，纯水透析24h，将透析后的溶液置于4000rpm的离心机中离心20min，以除去未包载的BBR。取上清液，过800nm的滤膜，得到BBR/CS‑DOX。此外对药物与聚合物质量比进行筛选，分别检测BBR与CS‑DOX不同质量比(1：10、2：10、3：10)条件下BBR的载药量与包封率。

[0088] BBR与载体CS‑DOX在不同质量比例下制备的BBR/CS‑DOX(表1)结果显示，随着BBR与CS‑DOX质量比增加，BBR的载药量增加，而BBR与CS‑DOX质量比从10:1到10:3时，BBR的包封率从35.47％增加到58.47％，质量比为10:5时，BBR的包封率降低到49.92％，这可能是因为CS‑DOX聚合物对BBR的包载能力有限，当BBR的药物量增加到一定程度时，BBR在CS‑DOX聚合物中的含量达到饱和，导致BBR包封率的下降。因此，选择BBR包封率最高(58.47％)时，即BBR与CS‑DOX质量比为10:3时，BBR的载药量为13.42％用于后期实验的研究。此外DOX在CS‑DOX中的接枝率为13.03％。

[0089] 通过上述方法将硫酸软骨素替换为透明质酸，合成sHA‑DOX，与CS‑DOX进行比较，结果如表1和表2所示，sHA‑DOX载体聚合物与CAP在质量比为5:1时，CAP具有最高的载药量(12.02％)，BBR的最佳载药量为13.42％，BBR载药量高于CAP载药量，说明CS‑DOX作为聚合物载体比sHA‑DOX具有较高的包载药物的能力。

[0090] 表1BBR与CS‑DOX不同配比下的BBR/CS‑DOX理化性质分析

[0091]

[0092] 注：DL：载药量；DE：包封率；DLS：平均粒径；PDI：多分散系数；ζ‑potential：Zeta电位。

[0093] 表2不同比例加药量的CAP/sHA‑DOX纳米粒理化性质表征

[0094]

[0095] 注：DL：载药量；DE：包封率；DLS：平均粒径；PDI：多分散系数；ζ‑potential：Zeta电位。

[0096] 本申请进一步分析BBR/CS‑DOX的形态学及体外稳定性，通过酰胺反应以及探头超声法制备了BBR/CS‑DOX纳米粒。由表2和图4中A图和图4中C图所示，BBR/CS‑DOX的平均粒径为157.63±0.83nm，Zeta电位为‑29.00±1.57mV，多分散指数(PDI)为0.17±0.03，这些特性有利于延长纳米粒在血液中的循环时间，并通过被动靶向方式促进药物在肿瘤区域的积聚。BBR/CS‑DOX纳米粒的透射电镜图如图4中B图所示，BBR/CS‑DOX在pH＝7.4的条件下形态呈现均匀的球形。体外稳定性检测实验表明，在PBS(pH 7.4)和DMEM培养基中，BBR/CS‑DOX纳米粒的平均粒径在7天内没有显著变化(图4中D图所示)，表明BBR/CS‑DOX是一种稳定的纳米制剂。

[0097] 表3和表4研究结果显示，所制备的CS‑DOX粒径为158.33±0.93nm与sHA‑DOX粒径230.83±3.40nm相比，平均粒径更小，更易通过EPR效应到达肿瘤部位。

[0098] 表3不同纳米胶束的粒径、PDI、Zeta电位

[0099]

[0100] 注：DLS：平均粒径；PDI：多分散系数；ζ‑potential：Zeta电位。

[0101] 表4不同纳米胶束理化性质表征

[0102]

[0103] 注：DLS：平均粒径；PDI：多分散系数；ζ‑potential：Zeta电位

[0104] 本申请进一步研究了BBR/CS‑DOX的pH响应性，结果如图5所示，如图5中A图所示，BBR/CS‑DOX纳米粒在pH＝7.4时，呈现均匀的球形，在pH＝6.8时，部分纳米粒出现破裂导致形状不完整，pH＝5.5时，所有纳米粒破裂。此外，如图5中B图所示，通过马尔文粒度仪测得BBR/CS‑DOX随着pH降低，粒径逐渐增大，pH为5.5时粒径最大。这些结果是由于BBR/CS‑DOX纳米粒中存在的腙键对酸敏感，其可在酸性条件下断裂，从而导致纳米粒破裂、粒径变大。如图5中C图所示，游离药BBR和DOX的体外药物释放在8h前存在突释现象，BBR/CS‑DOX在不同pH下的药物释放显示。在pH＝5.5时，BBR和DOX从BBR/CS‑DOX中的累积药物释放量明显高于在pH＝6.8和pH＝7.4时的累计药物释放量，可能的原因是BBR/CS‑DOX中在强酸性条件下完全断裂，导致BBR和DOX的累积药物释放量增加。

[0105] 为了考察BBR/CS‑DOX纳米粒的生物相容性，对其空白载体CS‑ADH进行溶血实验。如图6所示，CS‑ADH在阳性对照组Triton‑X‑100中的溶血率为100％，而CS‑ADH在2％红细胞悬液配置的不同浓度(0.2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL)中溶血率均低于5％，表明CS‑ADH对红细胞无明显的干扰作用，其具有良好的生物相容性。

[0106] 实施例2：BBR/CS‑DOX纳米粒的体外细胞学检测

[0107] (1)α‑SMA细胞免疫荧光染色

[0108] 由于激活的NIH3T3细胞会高表达α‑SMA蛋白，因此，为了考察BBR是否能够有效抑制NIH3T3的激活，使用MCF‑7细胞上清液对NIH3T3细胞进行预处理，之后细胞经过药物处理后，进行α‑SMA细胞免疫荧光染色。由图7中A图和图7中B图所示，与单独的NIH3T3细胞相比，经过MCF‑7CM处理的NIH3T3细胞绿色荧光更强，表明NIH3T3细胞经过MCF‑7细胞上清液处理后被激活为激活状态，进而高表达α‑SMA蛋白。此外，经过MCF‑7CM预处理的NIH3T3细胞经过药物处理后，绿色荧光变弱，尤其是DOX+BBR组，可能的原因是BBR可能通过激活AMPK信号通路，抑制TGF‑β诱导的NIH3T3的激活。

[0109] (2)BBR/CS‑DOX的体外细胞毒性检测

[0110] 为了考察BBR/CS‑DOX纳米粒的体外抗肿瘤增殖作用，对BBR/CS‑DOX进行体外细胞毒性实验。如图8中A图所示，各药物制剂对MCF‑7细胞的毒性作用具有浓度依赖性。此外，与游离药组(BBR、DOX、BBR+DOX)相比，CS‑DOX组对MCF‑7的细胞毒性更强，可能是由于CS可以与MCF‑7细胞表面的CD44受体结合，增加细胞对药物的摄取，促进细胞凋亡。除此之外，与CS‑DOX组相比，BBR/CS‑DOX对细胞的毒性作用更强，说明DOX和BBR两种药物联用能起到协同抗MCF‑7细胞增殖的作用。为了进一步模拟肿瘤微环境，建立MCF‑7+NIH3T3共培养细胞模型。如图8中B图所示，各药物制剂组对共培养细胞也具有浓度依赖性的毒性作用，并且，与其他制剂组相比，BBR/CS‑DOX对共培养细胞具有最强的细胞毒性作用。

[0111] 此外，为了验证DOX与BBR是否具有药物协同效应，对其进行不同联用比例下的药物协同实验。如图8中C图和图8中D图所示，BBR与DOX在不同联用比例下对共培养细胞均展现出浓度依赖性的细胞毒性。并且，在不同联用比例下，两药的协同指数CI值均小于1，表明DOX与BBR之间具有良好的药物协同性。

[0112] (3)BBR/CS‑DOX的体外细胞摄入与药物滞留分析

[0113] 为了考察MCF‑7+NIH3T3共培养细胞对BBR/CS‑DOX的摄取情况，对共培养细胞进行细胞摄入实验。如图9中A图和图9中C图所示，与游离药物DOX组相比，BBR/CS‑DOX组的细胞内红色荧光强度更强，可能的原因是CS对共培养细胞表面的CD44受体具有较强的亲和性，进而增加了共培养细胞对药物的摄取。此外，与BBR/CS‑DOX组相比，加入CS预先孵育细胞后，共培养细胞内的红色荧光更弱，可能是由于加入的CS与共培养细胞表面的CD44受体结合，导致细胞对药物的摄入量减少。流式细胞术实验进一步验证上述实验(如图9中B图)。

[0114] 此外，为了进一步考察药物在共培养细胞内的分布情况，进行药物滞留实验。如图9中D图所示，在不同时间点，与其他药物处理组相比，BBR/CS‑DOX组的红色荧光强度更强，表明BBR/CS‑DOX可以增加药物在共培养细胞内的滞留，具有一定的减少药物外排的作用。
药物滞留的流式细胞术实验(图9中E图)及其定量(图9中F图)进一步验证了这一结果。

[0115] (4)BBR/CS‑DOX的体外抗细胞迁移分析

[0116] 为了分析BBR/CS‑DOX的体外抗细胞迁移作用，进行细胞划痕实验和Transwell实验。如图10中A图所示，与其他制剂组相比，在24h时，BBR/CS‑DOX处理的MCF‑7细胞的伤口宽度更大。如图10中B图所示，与其他药物处理组相比，BBR/CS‑DOX处理的MCF‑7细胞的细胞迁移率最低，表明BBR/CS‑DOX纳米粒可以有效抑制MCF‑7细胞的迁移。为了模拟真实的肿瘤微环境，建立MCF‑7+NIH3T3共培养细胞的细胞迁移模型。如图10中C图和图10中D图所示，共培养细胞经不同药物处理24h后，与其他给药组相比，BBR/CS‑DOX处理组的共培养细胞伤口宽度最宽以及细胞迁移率最低，说明BBR/CS‑DOX纳米粒也可有效抑制MCF‑7+NIH3T3共培养细胞的细胞迁移。

[0117] 此外，为了进一步考察BBR/CS‑DOX纳米粒的体外抗细胞迁移作用，对MCF‑7+NIH3T3共培养细胞进行Transwell实验。如图10中E图和图10中F图所示，与其他药物制剂组相比，BBR/CS‑DOX组的共培养细胞迁移数量最少，进一步说明BBR/CS‑DOX纳米粒具备良好的体外抗细胞迁移作用。

[0118] (5)BBR/CS‑DOX的体外3D肿瘤球渗透实验

[0119] 为了分析BBR/CS‑DOX在体外的细胞渗透情况，进行MCF‑7细胞的体外3D肿瘤球渗透实验。如图11所示，游离药DOX处理的MCF‑7肿瘤球，在20μm处中心以及边缘具有较强的绿色荧光，而随着扫描深度的增加，绿色荧光主要分布在边缘且逐渐变弱；而与游离DOX组相比，纳米制剂组CS‑DOX和BBR/CS‑DOX在起初的20μm深度，绿色荧光较弱，之后随着扫描深度增加，中心及边缘处的绿色荧光强度都是先增强后减弱，并且在最大深度120μm处荧光强度高于DOX组。以上结果表明基于CS的纳米制剂可能由于具有较小的粒径而具有较好的体外肿瘤细胞球渗透性。

[0120] 实施例3：BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗肿瘤分析

[0121] 本申请通过建立“NIH3T3+4T1”皮下荷瘤小鼠模型，考察BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗肿瘤作用(图12中A图所示)。如图12中B图所示，经过14天尾静脉给药处理，BBR/CS‑DOX纳米粒组与其他药物制剂组相比较，刨离的皮下瘤大小最小。此外，对不同治疗组的荷瘤小鼠药物处理期间，与其他药物分组相比，BBR/CS‑DOX纳米粒组的肿瘤体积生长最缓慢，且肿瘤体积最小(图12中E图所示)。如图12中D图所示，经过不同药物处理后，与其它组别相比，BBR/CS‑DOX组的肿瘤生长抑制率最高(93.78％)。以上结果表明，BBR/CS‑DOX纳米粒具有良好的体内抗乳腺癌增殖的作用。如图12中C图所示，皮下荷瘤小鼠在给药期间，游离药物组DOX和DOX+BBR的小鼠体重稍有下降，而BBR/CS‑DOX纳米粒的小鼠体重无明显下降，表明游离药(DOX、DOX+BBR)对荷瘤小鼠具有一定的毒性作用，BBR/CS‑DOX纳米粒具有一定的生物安全性。

[0122] 此外，对不同药物处理组的荷瘤小鼠的不同脏器(皮下瘤、心、肝、脾、肺、肾)进行苏木素&伊红(H&E)染色。如图13所示，与其他药物处理组相比，BBR/CS‑DOX处理的荷瘤小鼠的脏器无明显病理性损伤，表明BBR/CS‑DOX可能是一种安全有效的药物递送系统。

[0123] 为了进一步研究BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗乳腺癌作用，对不同药物制剂组的皮下瘤进行组织切片染色处理。如图14中A图所示，与其药物处理组相比，BBR/CS‑DOX纳米粒组的皮下瘤组织切片出现更多的细胞核溶解和细胞质空泡化，表明BBR/CS‑DOX具有较强促进肿瘤细胞坏死的作用。此外，有研究表明胶原纤维是细胞外基质的重要组成成分，胶原纤维高表达会导致细胞外基质沉积，进而诱导肿瘤细胞耐药。如图14中B图所示，与其他药物制剂组相比，BBR/CS‑DOX组的胶原纤维表达量最低，说明BBR/CS‑DOX具有一定抑制ECM沉积的作用。众所周知，激活的CAFs会高表达α‑SMA，激活的CAFs与肿瘤细胞可进行cross‑talk，进而肿瘤细胞增殖和转移。不同药物组的肿瘤组织切片的α‑SMA免疫荧光染色结果显示(图14中C图所示)，与对照组相比(Saline)，BBR组的绿色荧光强度明显变弱，可能是由于BBR通过激活AMPK信号通路，抑制TGF‑β诱导的成纤维细胞的激活，导致α‑SMA蛋白表达量降低。此外，与其他药物制剂组相比，BBR/CS‑DOX组的绿色荧光强度最弱，表明BBR/CS‑DOX纳米粒可有效抑制CAFs激活，进而重塑乳腺癌微环境。恶性肿瘤细胞快速增殖过程中，需要更多的营养物质，因而会有大量新生血管增生，CD31是标记肿瘤血管的标志性蛋白。不同药物处理的肿瘤组织切片CD31免疫组化结果显示(图14中D图所示),与对照组(Saline)相比，经过药物处理的肿瘤组织新生血管数量明显减少，尤其是BBR/CS‑DOX组的肿瘤组织新生血管数量最少，说明BBR/CS‑DOX纳米粒可有效抑制乳腺癌新生血管增生。此外，肿瘤组织切片的Tunel染色结果显示(图14中E图所示)，与其他药物制剂组相比，BBR/CS‑DOX组的绿色荧光强度更强，表明BBR/CS‑DOX可有效促进乳腺癌细胞的凋亡。

[0124] 实施例4：BBR/CS‑DOX纳米粒的体内生物分布

[0125] 为了考察BBR/CS‑DOX的体内生物分布情况，建立4T1乳腺癌晚期模型(图15中A图)。如图15中B图所示，游离DiR尾静脉注射到荷瘤小鼠体内后，主要集中在肝脏部位，并随着时间的增加在肝脏部位的荧光强度逐渐变弱，而DiR/CS‑DOX通过尾静脉注射到小鼠体内后，主要分布在瘤子部位，并且在12h时，瘤子上的荧光强度最强，之后随着时间的延长，瘤子部位的荧光强度稍有减弱，但还是高于DiR组的瘤子部位的荧光强度。此外，DiR和DiR/CS‑DOX组的组织离体荧光成像结果显示(图15中C图所示)，与DiR组相比，DiR/CS‑DOX组的瘤组织荧光强度更强。以上结果表明，DiR/CS‑DOX可延长药物在体内的循环时间，并具有乳腺癌肿瘤靶向性。如图15中D图所示，剖取的DiR和DiR/CS‑DOX组的荷瘤小鼠肺组织具有明显的肺结节，此外，DiR和DiR/CS‑DOX组的荷瘤小鼠肺组织H&E染色显示，其肺部切片均具有明显的肿瘤灶(图15中E图)，这表明4T1乳腺癌晚期模型的成功建立。

[0126] 实施例5：BBR/CS‑DOX纳米粒的体内肿瘤渗透和血小板靶向性考察

[0127] 研究表明，肿瘤组织中激活的血小板有利肿瘤的转移并且激活的血小板会高表达P‑选择素，而P选择素与CS具有亲和性，因此抑制血小板激活将有利于抑制肿瘤的远端转移。如图16中A图所示，与游离药物DOX相比，BBR/CS‑DOX在乳腺癌晚期荷瘤小鼠的肺部位肿瘤组织荧光红色荧光强度更强，并可与肺组织中的P‑选择素有效结合，表明BBR/CS‑DOX具有靶向转移到肺部的乳腺癌和靶向激活的血小板的作用，出现该结果的原因可能是由于CS与乳腺癌表面的CD44受体有效结合并且CS与激活的血小板表面的P‑选择素受体具有较强的亲和力。传统化疗药物通常由于在肿瘤组织的深层部位渗透性差，导致抗肿瘤效果不佳。BBR/CS‑DOX的肿瘤渗透实验结果显示(图16中B图)，与游离药物组DOX相比，BBR/CS‑DOX在
500‑2500μm深度处红色荧光均较强，并且在1500μm深度处红色荧光强度最强，可能是由于BBR/CS‑DOX纳米粒具有乳腺癌靶向性可到达肿瘤部位，并且由于其具有纳米尺寸的粒径有利于在肿瘤中的深渗透。

[0128] 实施例6：BBR/CS‑DOX纳米粒的体内抗乳腺癌肺转移分析

[0129] 为了进一步分析BBR/CS‑DOX纳米粒抗乳腺癌远端肺转移的作用，建立4T1乳腺癌肺转移模型(图17中A图)。如图17中B图所示，对肺转移小鼠尾静脉给药期间，混合游离药物组(BBR+DOX)与其他药物组相比，小鼠体重稍有下降，而BBR/CS‑DOX组的小鼠体重无明显下降的趋势，表明BBR/CS‑DOX纳米粒是一种较为安全的纳米制剂。各药物制剂对荷瘤小鼠尾静脉给药结束后，剖离各制剂组的小鼠肺组织并对其拍照。如图17中C图和图17中D图所示，与其他药物处理组相比，BBR/CS‑DOX组的小鼠肺组织结节数量最少，表明BBR/CS‑DOX纳米粒具有良好的抗乳腺癌肺转移的作用。此外，对不同治疗组小鼠的肺组织切片H&E染色结果显示(图17中E图)，BBR/CS‑DOX组的肺组织切片无明显肿瘤转移灶，进一步表明BBR/CS‑DOX纳米粒具有抗乳腺癌肺转移的作用。

[0130] 从以上结果可以看出，本申请成功制备了具备酸敏感性释放的装载有DOX和BBR的硫酸软骨素纳米粒(BBR/CS‑DOX)，其可靶向乳腺癌细胞(BC)以及乳腺癌微环境中激活的成纤维细胞(aCAFs)，并通过诱导BC和CAFs的凋亡以及抑制TGF‑β诱导的成纤维细胞的激活来阻断BC和CAFs之间的cross‑talk，进而起到重塑乳腺癌微环境并杀伤乳腺癌细胞的作用。