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一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法及在化妆品中的应用
申请号	CN202410083191.6	申请日	2024-01-19	公开(公告)号	CN117886963A	公开(公告)日	2024-04-16
申请人	华中农业大学;			发明人	黄琪琳; 蔡吴丹;
摘要	本发明公开了一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法及在化妆品中的应用，包括步骤：S1、提取虎乳灵芝多糖；S2、配制虎乳灵芝多糖水溶液，向虎乳灵芝多糖水溶液中添加H2O2和VC溶液，得到混合溶液；S3、采用超声辅助H2O2/Vc体系对虎乳灵芝多糖超声降解处理，得到虎乳灵芝多糖降解产物。本发明通过超声辅助H2O2/Vc体系对虎乳灵芝多糖降解，有效降低了虎乳灵芝多糖的分子量、提高了其水溶性。体外试验表明，虎乳灵芝多糖和其降解产物具有良好的吸湿保湿性、抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性、抗紫外能力以及抗炎活性，为开发具有多重护肤功效的化妆品提供了科学依据，本发明制备方法操作简单，绿色环保，省时高效。
权利要求	1.一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、从虎乳灵芝中提取虎乳灵芝多糖； S2、配制虎乳灵芝多糖水溶液，向虎乳灵芝多糖水溶液中依次添加H2O2和VC溶液，混匀，得到混合溶液； S3、采用超声辅助H2O2/Vc体系对混合溶液中的虎乳灵芝多糖进行超声降解处理，处理结束后经离心、醇沉、透析、冷冻干燥，得到虎乳灵芝多糖降解产物。 2.根据权利要求1所述的虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，采用碱溶液提取法提取虎乳灵芝多糖，具体采用0.1‑1.0mol/L的NaOH从虎乳灵芝粉末中提取虎乳灵芝多糖。 3.根据权利要求1所述的虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述虎乳灵芝多糖水溶液的浓度为1‑5mg/mL；所述添加H2O2和VC溶液的体积比为1：1‑2：1，使得所得混合溶液中H2O2和VC溶液的终浓度为10‑50mmol/L。 4.根据权利要求1所述的虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述超声降解条件：温度为4‑25℃，超声功率为100‑600W，超声降解时间为10‑60min。 5.根据权利要求1所述的虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述离心条件为：4℃，6000‑10000r/min,15‑20min；所述醇沉时采用95％的乙醇，添加量为离心后所得上清液体积的3‑4倍，在4℃下醇沉8‑12h；所述透析所用透析袋的截流分子量为 6‑8kDa。 6.如权利要求1‑5所述制备方法制得的虎乳灵芝多糖降解产物。 7.一种化妆品，其特征在于：所述化妆品包含虎乳灵芝多糖或者权利要求6所述的虎乳灵芝多糖降解产物，其具有保湿、抗氧化、美白、抗紫外线、抗炎多重功效。 8.根据权利要求7所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品是溶剂分散或者悬浮的方式，或是乳化颗粒的形式，亦或是聚合物包裹的形式。 9.根据权利要求7所述的化妆品，其特征在于，所述护肤霜、护肤乳液、护肤凝胶、护肤精华、护肤水。 10.根据权利要求7所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品为面膜、眼霜、身体乳或防晒乳。
说明书全文	一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法及在化妆品中的应用技术领域 [0001] 本发明属于食用菌多糖深加工技术领域，特别涉及一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法及在化妆品中的应用。背景技术 [0002] 虎乳灵芝Lignosus rhinoceros(Cooke)Ryvarden，隶属真菌门Eumycota,担子菌亚门Basidiomycotin，层菌纲Hymenomycetes，非褶菌目Aphyllophorales，多孔菌科Polyporaceae，虎乳灵芝属Lignosus，也称虎奶，菌核是其药用部位，有止咳定喘、健脾化湿的功效，民间常用于治疗哮喘及咳喘，疗效极佳。多糖是虎乳灵芝的主要生物活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、促进肠黏膜伤口愈合等活性。 [0003] 现有碱溶液提取法得到的虎乳灵芝多糖具有较高的纯度和得率。然而，虎乳灵芝多糖较大的分子量和较低的水溶性在一定程度上影响了其生物学活性及应用。为了得到具有理想生物活性的低分子量虎乳灵芝多糖，需对其进行适当降解。 [0004] 超声波被认为是天然多糖降解最有效的“绿色”方法之一，其降解机制主要是通过超声波的空化作用和水或氧分子产生的活性自由基。然而已有研究表明超声波对虎乳灵芝多糖的降解不够理想，其只能够使得虎乳灵芝多糖聚集体发生部分解聚。 [0005] H2O2/Vc体系作为一种非金属类芬顿化学反应体系，对多糖的降解效率与金属催化芬顿体系相当，因其低成本、短时环保而得到广泛应用。然而尚未见将其应用于虎乳灵芝多糖的降解中。 [0006] 近年来，天然提取物因其绿色环保，安全性高，可生物降解等特点成为当前化妆品研究的热点。多糖来源广泛，作为一种具有天然活性的大分子物质是化妆品中潜在的活性成分。与合成类化妆品相比，多糖类化妆品具有更好的应用前景。目前，透明质酸、壳聚糖、动植物多糖、真菌多糖等已广泛应用于化妆品领域。而关于虎乳灵芝多糖及其降解产物的护肤功效以及在化妆品领域的应用尚未见报道。发明内容 [0007] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法及在化妆品中的应用。本发明通过超声辅助H2O2/Vc体系对碱提虎乳灵芝多糖进行降解，不仅降低了虎乳灵芝多糖的分子量、提高虎乳灵芝多糖的水溶性，同时还提高了虎乳灵芝多糖的护肤功效。 [0008] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案： [0009] 本发明的第一方面提供了一种虎乳灵芝多糖降解产物的制备方法，包括以下步骤： [0010] S1、从虎乳灵芝中提取虎乳灵芝多糖； [0011] S2、配制虎乳灵芝多糖水溶液，向虎乳灵芝多糖水溶液中依次添加H2O2和VC溶液，混匀，得到混合溶液； [0012] S3、采用超声辅助H2O2/Vc体系对混合溶液中的虎乳灵芝多糖进行超声降解处理，处理结束后经离心、醇沉、透析、冷冻干燥，得到虎乳灵芝多糖降解产物。 [0013] 优选地，步骤S1中，采用碱溶液提取法提取虎乳灵芝多糖，具体采用0.1‑1.0mol/L的NaOH从虎乳灵芝粉末中提取虎乳灵芝多糖。 [0014] 优选地，步骤S2中，所述虎乳灵芝多糖水溶液的浓度为1‑5mg/mL。 [0015] 优选地，所述添加H2O2和VC溶液的体积比为1：1‑2：1，使得所得混合溶液中H2O2和VC溶液的终浓度为10‑50mmol/L。 [0016] 优选地，步骤S3中，所述超声降解条件：温度为4‑25℃，超声功率为100‑600W，超声降解时间为10‑60min。 [0017] 优选地，步骤S3中，所述离心条件为：4℃，6000‑10000r/min,15‑20min。 [0018] 优选地，步骤S3中，所述醇沉时采用95％的乙醇，添加量为离心后所得上清液体积的3‑4倍，在4℃下醇沉8‑12h。 [0019] 优选地，步骤S3中，所述透析所用透析袋的截流分子量为6‑8kDa。 [0020] 本发明的第二方面提供了上述制备方法制得的虎乳灵芝多糖降解产物。 [0021] 本发明的第三方面提供了一种化妆品，该化妆品包含虎乳灵芝多糖或者虎乳灵芝多糖降解产物，其具有保湿、抗氧化、美白、抗紫外线、抗炎多重功效。 [0022] 优选地，所述化妆品是溶剂分散或者悬浮的方式，或是乳化颗粒的形式，亦或是聚合物包裹的形式。 [0023] 优选地，所述化妆品为护肤霜、护肤乳液、护肤凝胶、护肤精华、护肤水。 [0024] 优选地，所述化妆品为面膜、眼霜、身体乳或防晒乳。 [0025] 本发明具备如下有益效果： [0026] (1)本发明采用超声辅助H2O2/Vc体系实现了对碱提虎乳灵芝多糖的有效降解，操作简单，绿色环保，省时高效。此方法制得的虎乳灵芝多糖降解产物，相较于虎乳灵芝多糖，其重均分子量和特性粘度显著降低，水溶性和生物活性明显提升。 [0027] (2)体外试验表明，虎乳灵芝多糖和虎乳灵芝多糖降解产物均具有良好的吸湿保湿性、抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性、抗紫外能力以及抗炎活性，为开发具有多重护肤功效的虎乳灵芝多糖基化妆品提供了科学依据。 [0028] (3)本发明得到的虎乳灵芝多糖和虎乳灵芝多糖降解产物安全无毒、功效显著，具有广阔的应用开发前景。附图说明 [0029] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0030] 图1为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的红外光谱图； [0031] 图2为刚果红‑实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物络合物的最大吸收波长随NaOH浓度的变化结果图； [0032] 图3为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的吸湿性和保湿性分析结果图； [0033] 图4为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的抗氧化活性结果：(A)DPPH自由基；(B)ABTS自由的清除能力； [0034] 图5为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的抑制酪氨酸酶活性结果图； [0035] 图6为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的抗紫外能力结果图； [0036] 图7为实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的抗炎活性结果：(A)细胞活力结果图；(B)吞噬能力结果图；(C)NO释放量结果图。具体实施方式 [0037] 以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本发明的描述。 [0038] 实施例1 [0039] 采用0.5mol/L的NaOH溶液从经过脱脂处理的虎乳灵芝粉末中提取得到虎乳灵芝多糖。 [0040] 实施例2 [0041] (1)采用0.5mol/L的NaOH溶液从经过脱脂处理的虎乳灵芝粉末中提取得到虎乳灵芝多糖； [0042] (2)称取虎乳灵芝多糖溶于去离子水中，配制浓度为2mg/mL的虎乳灵芝多糖水溶液； [0043] (3)按1:1(v/v)的比例将H2O2和VC溶液依次添加到虎乳灵芝多糖水溶液中，使得H2O2和VC溶液的终浓度均为20mmol/L，充分混匀2min，得到混合溶液； [0044] (4)将混合溶液于4℃，超声功率为130W条件下，利用超声辅助H2O2/Vc体系对混合溶液中的虎乳灵芝多糖进行超声降解处理30min，然后于4℃，10000r/min条件下离心20min，得到上清液； [0045] (5)向上清液中加入4倍上清液体积的乙醇(95％)，4℃下静置12h，然后再于4℃，10000r/min条件下离心20min后，沉淀复溶，透析(6‑8kDa)48h，冷冻干燥，得到虎乳灵芝多糖降解产物。 [0046] 实施例3 [0047] 步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，超声功率为325W，最终制得虎乳灵芝多糖降解产物。 [0048] 实施例4 [0049] 步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，超声功率为520W，最终制得虎乳灵芝多糖降解产物。 [0050] 对比例1 [0051] (1)采用0.5mol/L的NaOH溶液从经过脱脂处理的虎乳灵芝粉末中提取得到虎乳灵芝多糖； [0052] (2)称取虎乳灵芝多糖溶于去离子水中，配制浓度为2mg/mL的虎乳灵芝多糖水溶液； [0053] (3)将虎乳灵芝多糖水溶液于4℃，超声功率为130W条件下进行超声降解处理，然后于4℃，10000r/min条件下离心20min，得到上清液； [0054] (4)向上清液中加入4倍上清液体积的乙醇(95％)，4℃下静置12h，然后于4℃，10000r/min条件下离心20min后，沉淀复溶，透析(6‑8kDa)48h，冷冻干燥，得到虎乳灵芝多糖降解产物。 [0055] 对比例2 [0056] (1)采用0.5mol/L的NaOH溶液从经过脱脂处理的虎乳灵芝粉末中提取得到虎乳灵芝多糖； [0057] (2)称取虎乳灵芝多糖溶于去离子水中，配制浓度为2mg/mL的虎乳灵芝多糖水溶液； [0058] (3)按1:1(v/v)的比例将H2O2和VC溶液依次添加到虎乳灵芝多糖水溶液中，使得H2O2和VC溶液的终浓度为20mmol/L，充分混匀2min，利用H2O2/Vc体系对虎乳灵芝多糖进行降解处理30min，然后于4℃，10000r/min条件下离心20min，得到上清液； [0059] (4)向上清液中加入4倍上清液体积的乙醇(95％)，4℃下静置12h，然后于4℃，10000r/min条件下离心20min后，沉淀复溶，透析(6‑8kDa)48h，冷冻干燥，得到虎乳灵芝多糖降解产物。 [0060] 试验检测 [0061] 1、虎乳灵芝多糖及其降解产物的分子量、水溶性和特性粘度测 [0062] 定 [0063] (重均)分子量的测定：采用尺寸排除色谱‑多角度激光散射‑示差检测器联用装置测定实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的(重均)分子量。流动相为0.1mol/L的NaCl,其中含有0.02％的Na3N。色谱柱为Shodex‑OHpak SB‑806和SB‑805。采用流动相分别配制浓度为1mg/mL的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，进样前过0.45μm的水相膜，设置进样量和流速分别为200μL和0.5mL/min。采用Astra 软件(Version 6.1.2.84)采集数据并分析。 [0064] 水溶性的测定：分别称取50mg实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖和虎乳灵芝多糖降解产物溶于5mL去离子水中，室温搅拌24h，离心(10000r/min,20min)去除不溶性固体，上清液于105℃下烘干至恒重。水溶性＝(上清液中虎乳灵芝多糖或者虎乳灵芝多糖降解产物的质量/初始虎乳灵芝多糖或者虎乳灵芝多糖降解产物的质量)×100％。 [0065] 特性粘度的测定：采用乌氏粘度计(内径0.5‑0.6mm)于25℃下，测定实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的特性粘度。 [0066] 测定实施例1‑4和对比例1‑2制备的虎乳灵芝多糖降解产物、虎乳灵芝多糖的(重均)分子量、降解率、水溶性和特性粘度，测试结果见下表1。 [0067] 表1 [0068] 样品重均分子量(Da) 降解率(％) 水溶性(％) 特性粘度(mL/g)5 实施例1 7.838×10 ‑ 18.41±0.54 181.78 5 实施例2 5.197×10 33.69 28.33±0.21 112.98 5 实施例3 4.84×10 38.25 33.53±0.43 90.47 5 实施例4 4.326×10 44.81 38.44±0.28 56.48 5 对比例1 7.298×10 6.89 22.98±0.26 169.82 5 对比例2 6.86×10 12.48 25.34±0.32 148.15 [0069] 由上述表1结果可知，相较于实施例1和对比例1‑2，实施例4中制得的虎乳灵芝多糖降解产物的重均分子量最小，降解率最高，水溶性最好。这表明采用超声辅助H2O2/Vc体系可显著降低虎乳灵芝多糖的分子量，提高虎乳灵芝多糖的降解率和水溶性。相较于实施例1，对比例1和对比例2制得的虎乳灵芝多糖的重均分子量均有小幅度降低。超声是通过空化效应和生成的自由基对多糖进行降解；而H2O2和Vc能够发生氧化还原反应生成羟基自由基并与多糖上的氢原子发生反应，从而能够降解多糖。当采用本发明超声辅助H2O2/Vc体系对虎乳灵芝多糖进行降解时，超声可在短时间内使虎乳灵芝多糖聚集体解聚，使多糖链更容易受到自由基攻击，两者协同作用从而达到了显著提高虎乳灵芝多糖的降解率的目的，进而得到重均分子量更小的虎乳灵芝多糖降解产物。 [0070] 实施例2‑4结果表明，经超声辅助H2O2/Vc体系处理制得的虎乳灵芝多糖降解产物，随着超声功率的增加其重均分子量和特性粘度显著降低，水溶性显著增加，这表明超声辅助H2O2/Vc体系可对虎乳灵芝多糖进行有效降解。由于多糖的生物活性与它们的水溶性、化学结构、分子量等有关，分子量较小、粘度较低的多糖更有利于发挥其生物活性，因此推测降解处理能够增强虎乳灵芝多糖的生物活性。 [0071] 2、红外光谱分析 [0072] 将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物分别与KBr按照质量比1:100混‑1 ‑1合，使用Nicolet 670FT‑IR光谱仪记录400cm ～4000cm 的光谱图，结果见图1。 [0073] 由图1结果可知，采用超声辅助H2O2/Vc体系处理虎乳灵芝多糖并未改变虎乳灵芝‑1多糖的基本化学结构。此外，实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物在890cm 附近均有明显吸收峰，表明虎乳灵芝多糖及其降解产物中均存在β‑D‑葡聚糖。 [0074] 3、刚果红试验分析 [0075] 将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配置成浓度为2mg/mL的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，分别与91μmol/l刚果红等体积混合，然后添加不同体积的NaOH溶液(2mol/L)，得到NaOH终浓度为0mol/L、0.05mol/L、 0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L的系列刚果红‑多糖(虎乳灵芝多糖和虎乳灵芝多糖降解产物)络合物溶液。采用紫外分光光度计测定400～700nm范围内的最大吸收波长。测定结果见图2。 [0076] 由图2结果可知，与纯刚果红溶液相比，NaOH终浓度在0～0.20mol/L范围内，实施例1制得的虎乳灵芝多糖与刚果红形成的刚果红‑虎乳灵芝多糖络合物溶液的最大吸收波长(λmax)随NaOH浓度的增加先缓慢上升后急剧下降，且明显发生了红移，这表明虎乳灵芝多糖溶液中存在有序的螺旋结构，当NaOH终浓度超过0.20mol/L时，其λmax与纯刚果红溶液时的相近，表明虎乳灵芝多糖溶液中的有序结构在碱性条件下被完全破坏。此外，本发明还发现实施例2‑4采用超声辅助H2O2/Vc处理后的虎乳灵芝多糖降解产物溶液也会发生红移，且λmax的变化趋势与实施例1相似，表明超声辅助H2O2/Vc处理不会完全破坏虎乳灵芝多糖溶液中的有序结构，但是发生红移的程度有所下降。 [0077] 4、吸湿保湿性分析 [0078] (a)相对湿度(RH)为43％和81％时吸湿性的测定：精确称取实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物样品及甘油各0.1g放置于已干燥至恒重的称量瓶中，将称量瓶敞口放置于相对湿度分别为43％和81％的干燥器中，密封好干燥器并放置于20℃的恒温箱内。放置一段时间后取出称重。吸湿性＝(Mt‑M0)/M0×100％，Mt为放置一段时间后样品的质量(g)，M0为起始时样品的质量(g)。测定结果见图3(A)和(B)。 [0079] (b)相对湿度(RH)为0时保湿性的测定：首先将200g干燥后的硅胶放置于干燥器中。精确称取实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物样品及甘油各0.1g放置于已干燥至恒重的称量瓶中，分别加入5mL蒸馏水后置于干燥器中。密封后放置于20℃的恒温箱内，放置一段时间后取出称重。保湿性＝(M0‑Mt)/M0×100％，Mt为放置一段时间后样品的质量(g)，M0为起始时样品的质量(g)。测定结果见图3(C)。 [0080] 由图3(A)结果可知，在相对湿度(RH)为43％时，各样品的吸湿率在最开始的12h内增加比较快，当放置时间到达24h后，各样品的吸湿速率基本达到饱和；在放置时间为48h时，各样品的吸湿性能大小依次为：甘油＞实施例4＞实施例3＞实施例2＞实施例1。不同分子量虎乳灵芝多糖及其降解产物的吸湿率有一定的差异，降解产物的分子量越低，其吸湿性能越好，可能是由于超声辅助H2O2/Vc处理破坏了多糖的结构，使多糖长链变短，结构变得疏松，增大了接触水分子的面积，进而有利于结合大量水分子。 [0081] 由图3(B)结果可知，在相对湿度(RH)为81％时，虎乳灵芝多糖及其降解产物的吸湿率变化与相对湿度(RH)为43％时相似，但均高于相对湿度(RH)为43％时的吸水率，这可能是由于在相对湿度(RH)为81％时，空气中水分子相对较多，而导致各样品吸湿率上升速度较快。 [0082] 由图3(C)结果可知，在相对湿度RH＝0的绝对干燥条件下，各样品在放置72h内的保湿率持续下降。放置72h时的保湿率大小依次为：实施例1＞实施例2＞甘油＞实施例3＞实施例4。不同分子量虎乳灵芝多糖及其降解产物的保湿率存有一定差异，分子量越高，其保湿性能越好，这可能是由于较高分子量的虎乳灵芝多糖有利于形成大的网状结构，使得所吸收的水分子不容易被释放出来，而小分子量的降解产物，由于结构比较松散，容易失水。 [0083] 5、抗氧化活性分析 [0084] DPPH自由基清除能力的测定：分别将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列浓度(0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，取2mL系列样品溶液分别加入2mL0.1mmol/L DPPH的无水乙醇溶液后混匀，暗处反应30min，测定波长为517nm处吸光度值。以VC为阳性对照。清除率＝[1‑(A1‑A2)/A0]×100％，其中A1为样品+DPPH；A2为样品+无水乙醇；A0为水+DPPH。结果见图4(A)。 [0085] ABTS自由基清除能力的测定：将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列浓度(0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，取0.2mL系列样品溶液分别加入2mL的ABTS工作液，室温避光反应10min，然后测定波长为734nm处的吸光度值。以VC为阳性对照。清除率＝[1‑(A1‑A2)/A0]×100％，其中A1为样品+ABTS；A2为样品+水；A0为水+ABTS。结果见图4(B)。 [0086] 由图4(A)结果可知，在0.5‑2.5mg/mL范围内，实施例1‑4制得的不同分子量的虎乳灵芝多糖及其降解产物和Vc都有一定抑制DPPH自由基的能力，且清除DPPH自由基的效果随着样品浓度的不断增加而增强。在相同样品浓度下，清除DPPH自由基的能力大小依次为：Vc＞实施例4＞实施例3＞实施例2＞实施例1。 [0087] 由图4(B)结果可知，随着样品浓度的增大，其清除ABTS自由基的效果也不断增强。当浓度为2.5mg/mL时，实施例4制得的虎乳灵芝多糖降解产物溶液样品对ABTS自由基的清除能力最大(为55.4％)。 [0088] 6、抑制酪氨酸酶活性分析 [0089] 酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，是黑色素合成的关键酶，能催化酪氨酸羟基化为醌类，醌类物质再经过一系列反应转化为黑色素。如果机体内酪氨酸酶活性较高，会加快黑色素的生成和沉积，使皮肤变黑。因此，抑制酪氨酸酶活性可以达到护肤美白的效果。 [0090] 具体步骤：分别将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列浓度(1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.0mg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，取150μL系列样品溶液(以磷酸缓冲液为空白)分别与50μL2.5mmol/L多巴反应液混合，37℃下孵育5min，加入50μL酪氨酸酶(50U)，37℃下反应30min，于波长475nm处测定吸光度，计算酪氨酸酶活性抑制率，抑制率＝[1‑(C‑D)]/(A‑B)]×100％(A为未加样品而加酪氨酸酶的混合液，B为未加样品、酪氨酸酶的混合液，C为加样品、酪氨酸酶的混合液，D为加样品而未加酪氨酸酶的混合液)。结果见图5。 [0091] 由图5结果可知，虎乳灵芝多糖及其降解产物在一定范围内对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，且随着样品浓度的升高，对酶活性的抑制率也随之增强。与虎乳灵芝多糖相比，虎乳灵芝多糖降解产物的抑制率较强，这可能与其抗氧化活性的增强有关。当样品浓度为6mg/mL时，实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物的抑制率分别为17.64％、25.53％、32.12％和48.1％。 [0092] 7、抗紫外能力分析 [0093] 分别将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制浓度为5mg/mL的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，以相同质量浓度的市售JM防晒喷雾作为对照。用分光光度计测量其在吸收波长280～400nm之间的透过率。紫外吸收率＝(1‑透过率)×100％。结果见图6。 [0094] 由图6结果可知，在波长280‑400nm范围内，实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物随着波长的增大其对应的紫外吸收率均下降；其中，实施例4制得的虎乳灵芝多糖降解产物的紫外吸收率最高，说明其防晒效果最好。以上结果说明虎乳灵芝多糖及其降解产物均具有一定的抗紫外线效果，可以作为防晒成分添加到护肤品中。 [0095] 8、抗炎活性分析 [0096] (1)RAW264.7细胞活力测试： [0097] 通过MTT法测定虎乳灵芝多糖及其降解产物和脂多糖(LPS)对巨噬细胞增殖活性的影响。分别将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列不同浓度(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降5 解产物溶液作为样品溶液，备用；取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×10个/mL，按照每孔100μL加入96孔细胞培养板中，在37℃，5％CO2条件下过夜培养12h，设置空白组、LPS组和样品组，分别添加对应培养基200μL。37℃，5％CO2下培养24h后，倒掉培养基，每孔加入150μL MTT溶液，反应2h后，每孔加入200μL DMSO，使用酶标仪振荡5min，在波长 490nm处测定吸光度值。细胞活力＝处理组吸光度/对照组吸光度×100％。结果见图7(A)。 [0098] (2)RAW264.7细胞吞噬能力检测： [0099] 将对数生长期的巨噬细胞按照1×104个/孔密度接种于96孔板,按照试验分组培养24h后,然后加入不同浓度样品溶液(将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列不同浓度(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，作为样品溶液)1mL预处理2h后，再加入100μL LPS溶液(1μg/mL)处理24h。去除上清，每孔加入100μL中性红(0.1％)，孵育2h后，弃去中性红，PBS溶液洗涤细胞3次，加入200μL细胞裂解液,室温裂解30min,酶标仪振荡5min，在540nm处测定吸光度值。结果见图7(B)。 [0100] (3)RAW264.7细胞NO含量测定： [0101] NO含量的升高是RAW 264.7细胞出现炎症反应的标志之一，在24孔板中加入0.5mL 5 10×10个/mL RAW 264.7细胞，培养箱中孵育24h后去除培养基，然后加入不同浓度样品溶液(分别将实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物溶于去离子水中，配制系列不同浓度(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)的虎乳灵芝多糖溶液和虎乳灵芝多糖降解产物溶液，作为样品溶液)1mL预处理2h后，再加入100μL LPS溶液(1μg/mL)处理24h，同时设置空白组(只加培养基)和对照组(只加LPS)。培养结束后收集上清液，参照NO 试剂盒说明书推算各组细胞培养液中NO的含量。结果见图7(C)。 [0102] 由图7(A)结果可知，在实验浓度(100‑800μg/mL)范围内，实施例1‑4和LPS均不具有细胞毒性。与空白对照组相比，均可有效促进巨噬细胞的增殖。 [0103] 从图7(B)结果可知，与空白对照组相比，LPS可显著增强巨噬细胞的吞噬能力。当添加实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物后，巨噬细胞的吞噬能力呈现出不同的变化，实施例1和实施例2对LPS诱导的巨噬细胞的吞噬能力随着浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，而实施例3和实施例4对LPS诱导的巨噬细胞的吞噬能力随着浓度的增加而减少，但均高于空白对照组。 [0104] 由图7(C)结果可知，LPS诱导巨噬细胞大量分泌NO。在实验浓度(100‑800μg/mL)范围内，添加实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物均可显著抑制LPS诱导的NO产生，且对NO释放的抑制效果呈现浓度依赖性。当浓度为800μg/mL时，实施例1‑4制得的虎乳灵芝多糖及其降解产物对LPS诱导的NO释放量依次分别为8.64μmol/L、7.94μmol/L、6.31μmol/L、5.88μmol/L。相较于实施例1，实施例4对LPS诱导的NO释放量显著降低，这表明分子量的降低可有效提高虎乳灵芝多糖的抗炎活性。 [0105] 本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

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