具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法 |
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| 申请号 | CN202311342002.4 | 申请日 | 2023-10-17 | 公开(公告)号 | CN117886960A | 公开(公告)日 | 2024-04-16 |
| 申请人 | 沈阳化工大学; | 发明人 | 刘学贵; 高品一; 李丹琦; 刘长风; 许佳宁; | ||||
| 摘要 | 具有抗 氧 化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法，涉及一种 生物 多糖制备方法，首先采用热 水 浸提法从干燥的北柴胡茎叶粉末中得到水提浸膏，去蛋白，脱色后，利用DEAE 纤维 素柱层析分离，用去离子水和0.1 M的NaCl溶液洗脱，并用凝胶柱层析法进一步纯化，最终收集得到1个北柴胡茎叶新多糖BCPS‑1。BCPS‑1的分子量为21.80 KDa，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、 葡萄糖 醛 酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成。该多糖具有抗氧化活性且可以通过提高损伤细胞中的T‑AOC、SOD、GSH‑Px活 力 ，降低MDA含量，激活Nrf2/HO‑1 信号 通路恢复其抗氧化系统，从而缓解氧化应激，对神经细胞氧化损伤起到保护作用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法，其特征在于，所述方法包括以下制备过程： |
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| 说明书全文 | 具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法技术领域[0001] 本发明涉及一种北柴胡茎叶多糖制备方法，特别是涉及具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法。 背景技术[0002] 北柴胡（Bupleurum chinense DC）是伞形科（Umbelliferae）、柴胡属（Bupleurum L.）的多年生草本植物，主要分布于辽宁、河北、山西等地。北柴胡具有多种活性成分，如三萜皂苷类、黄酮类、多糖类、挥发油类、木脂素类、脂肪酸和固醇类等，因此具备抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、解热、抗菌、保肝等功效。而北柴胡多糖因具有的较好的活性而备受关注，Zhao 等人从北柴胡根中分离得到水溶性多糖 WBCP，其可通过增强抗氧化防御能力从而对 GalN 诱导的肝损伤发挥肝保护作用。蒋一帆等通过巨噬细胞探讨了北柴胡多糖的免疫调节活性，实验结果表明北柴胡多糖对 MPMs 和 RAW264.7 细胞均具有免疫调节活性，且对 MPMs具有双重调节的作用。但是目前对北柴胡茎叶多糖的研究较少，为了扩大资源利用度，将北柴胡茎叶多糖的药理作用发挥到最大化，全面开发利用北柴胡茎叶资源的药用价值是十分必要的。 发明内容[0003] 本发明的目的在于提供具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法，该方法采用热水浸提法从干燥的北柴胡茎叶粉末中得到水提浸膏，去蛋白，脱色后，利用DEAE纤维素柱层析分离，用去离子水和0.1 M的NaCl溶液洗脱，并用凝胶柱层析法进一步纯化，最终收集得到1个北柴胡茎叶新多糖BCPS‑1。该多糖具有抗氧化活性且可以有效的改善H2O2诱导的 SH‑SY5Y模型中细胞损伤。 [0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法，该方法将干燥的北 柴胡茎叶切碎成粉末，过40目筛，用石油醚（1:10, w/v）对其进行回流脱脂（2h/次，3 次），继续用70%乙醇溶液（1:10, w/v）回流去除小分子化合物（2h/次，3 次），并进行过滤和干燥。滤渣在 100 ℃下用去离子水（1:40, w/v）回流提取（2h/次，3 次），得到粗多糖提取液。 采用酶+Sevage法去蛋白，首先吸取 1 mL 粗多糖提取液，将其吹干称重，并将粗多糖提取液配制成 80 mg/mL 的溶液。向粗多糖提取液中加入 2.5%体积的中性蛋白酶，将其在 50 ℃水浴中恒温反应 1 h，将温度升高至 90 ℃，使其继续反应 10 min，并于 3000 rpm 条件下离心 15 min，收集上清液；按照体积比 4：1 向收集的上清液中加入 Sevage 试剂（二氯甲烷：正丁醇=4：1），搅拌 30 min，并在 3000 rpm 条件下离心 15 min，收集上清液。重复此操作，直至多糖的蛋白含量不变，得到去蛋白的粗多糖提取液，减压浓缩、干燥。AB‑8树脂柱脱色，称取去蛋白后的粗多糖样品 10 g，溶于适量的去离子水中，将大孔树脂层析柱的液面放至与大孔树脂水平，将溶解好的多糖样品均匀平铺在大孔树脂表面，挂样 6 h；挂样结束后缓慢加入去离子水，静置 10 min。打开柱出口阀，以 2 s/滴的流速进行洗脱，直至洗脱液无明显颜色。收集洗脱液，减压浓缩后进行透析（3500 Da）、干燥得到粗多糖。用DEAE‑52纤维素柱对粗多糖进行分离，称取 500 mg 脱色素的粗多糖样品，用适量的去离子水溶解。将 DEAE 层析柱液面放至与 DEAE 纤维素平齐，将溶解好的多糖样品均匀平铺于 DEAE 纤维素表面，挂样 6h，依次缓慢加入去离子水和0.1 mol/L NaCl 对多糖样品进行洗脱；用自动接样器在试管中收集洗脱下来的样品，流速为 1.0 mL/min，直至无明显颜色；用苯酚硫酸法对收集的样品进行多糖含量的监测，绘制洗脱曲线，并根据洗脱曲线收集对称峰，合并滤液进行减压浓缩、透析（3500 Da）、干燥。采用Sephadex G‑200柱对所得的馏分进行纯化，称取 100 mg 过完 DEAE 的粗多糖样品，用适量的去离子水使其溶解；将 Sephadex G‑200层析柱液面放至与 Sephadex G‑200 平齐，将溶解好的多糖样品均匀平铺在 SephadexG‑200 表面，挂样 6 h；向挂样结束的层析柱中缓慢加入去离子水，静置 10 min，打开柱下方阀门，用自动接样器以 0.7 mL/min 的速度收集洗脱下来的样品，直至洗脱液无明显颜色；用苯酚硫酸法对试管中收集的样品进行多糖含量的监测，并绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线收集对称峰，合并滤液后减压浓缩、透析（3500 Da）、干燥，得到1个北柴胡茎叶新多糖（BCPS‑1）。 [0005] 上述得到的北柴胡茎叶新多糖，其分子量为21.80 KDa，且BCPS‑1 主要由 鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其质量百分比为 21.90 %、12.93 %、2.06 %、9.94 %、4.00 %、13.48 %、35.69。 [0007] 所述的具有抗氧化及神经细胞保护活性的北柴胡茎叶多糖制备方法，所述制备的北柴胡茎叶新多糖，通过DPPH和ABTS自由基的清除作用评价其抗氧化活性；通过测定细胞内 T‑AOC、SOD、GSH‑Px 和 MDA 的水平，说明 BCPS‑1由抗氧化途径发挥对氧化应激损伤细胞的神经细胞保护活性；通过研究 Nrf2/HO‑1 信号通路表达，揭示BCPS‑1通过介导 Nrf2/HO‑1 信号通路发挥对 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞氧化损伤的保护作用。 [0008] 本发明的优点与效果是：1.抗氧化活性结果表明北柴胡茎叶多糖具有较好的抗氧化活性。当样品浓度达到 5 mg/mL时， BCPS‑1对DPPH自由基的清除效果为57.56 %；在该加药浓度下， BCPS‑1对ABTS自由基的清除效果为79.87 %。 [0009] 2.神经细胞保护活性实验表明，SH‑SY5Y 细胞经 H2O2损伤后，细胞的存活率达到 61.08%，而经不同浓度的 BCPS‑1对其进行干预后，细胞的存活率可呈剂量依赖性的显著升高。当BCPS‑1在最大浓度 250μg/mL 时，细胞存活率分别可达 98.91 %，表明该多糖具有较好的神经细胞保护活性；另外，细胞经 H2O2 诱导后，其 T‑AOC、SOD、GSH‑Px 的活力显著下降，且MDA 的含量明显升高，表明 H2O2成功诱导细胞发生氧化损伤。经 BCPS‑1 处理后，细胞内的 T‑AOC、SOD 和 GSH‑Px 的活力均得到明显的提升，且 MDA 的含量显著下降，表明 BCPS‑1 具有较好的抗氧化活性，是通过抗氧化途径发挥神经细胞保护活性；并且损伤细胞中的 HO‑1 和 Nrf2 蛋白的表达显著下降，而经 BCPS‑1 处理后，HO‑1 和 Nrf2 的表达显著升高，可见，BCPS‑1 可能通过激活 Nrf2/HO‑1 信号通路有效改善 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞的氧化应激损伤。以上结果揭示北柴胡茎叶多糖可作为一种天然抗氧化剂，为其开发和应用奠定了基础。 附图说明 [0010] 图1是 BCPS‑1的红外光谱；1 13 图2是 BCPS‑1的H和 C NMR图谱； 图3是 BCPS‑1的HSQC和HMBC NMR图谱； 图4是 BCPS‑1的单糖组成测试图； 图5是 BCPS‑1清除DPPH自由基的测试图； 图6是 BCPS‑1清除ABTS自由基的测试图； 图7是 BCPS‑1作用于对 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞保护活性的结果图； 图8是 BCPS‑1作用于对 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞氧化试剂盒测试结果图； 图9是 BCPS‑1 对 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞中 Nrf2/HO‑1 信号通路图。 实施方式 [0012] 实施例如下：1）北柴胡茎叶多糖的提取、分离和纯化 北柴胡茎叶干燥、粉碎，过40目筛，依次用10倍体积石油醚和乙醇在回流下脱脂和 去除黄酮、皂苷等小分子（3次，每次2 h）。滤渣按照料液比1：40（g/mL）用蒸馏水回流提取2 h，重复3次，得到的热水提取物。采用酶+Sevage法去蛋白。首先，在烧杯中将粗多糖提取液配成80 mg/mL的溶液，加入2.5 %的中性蛋白酶，均匀搅拌后，50 ℃恒温搅拌加热1 h。再在 90 ℃水浴加热10 min灭活，离心，收集上清液。加入上清液溶液1/4体积的Sevage试剂（二氯甲烷溶液：正丁醇溶液= 4：1），搅拌30 min，离心，收集上清液，减压浓缩、干燥。AB‑8树脂柱脱色，用去离子洗脱，减压浓缩、透析、干燥得到粗多糖。用DEAE‑52纤维素柱对粗多糖进行分离，用去离子水和0.1 M的NaCl溶液进行洗脱。苯酚‑硫酸法测定其糖含量。采用Sephadex G‑200柱对所得的馏分进行纯化，减压浓缩、透析、干燥最终得到1个新多糖（ BCPS‑1）。 [0013] 2）北柴胡茎叶多糖的谱图分析1 核磁谱图如图2、3所示，在 BCPS‑1 多糖的 H NMR 中，δ 4.40，4.55，4.58，4.98， 5.03，5.14，5.21 ppm分别是木糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖醛酸，阿拉伯糖，鼠李糖 13 的端基氢信号。结合 C NMR 发现在δ 90‑110 ppm 范围内有糖残基的特征端基碳信号。结 1 1 合 H‑H COSY、HSQC NMR 谱图和 Smith 降解结果，推断出δ 4.40/102.6ppm (H1/C1)，δ 3.25/73.0 ppm (H2/C2)，δ 3.42/75.7 ppm (H3/C3)，δ 3.62/81.0 ppm(H4/C4)，δ 3.71/ 62.6 ppm (H5/C5)为→3,4)‑β‑D‑Xylp‑(1→残基信号。而δ 5.03/99.0 ppm (H1/C1)，δ 3.68/71.7 ppm (H2/C2)，δ 3.80/73.1 ppm (H3/C3)，δ 4.00/75.6 ppm(H4/C4)，δ 4.21/ 70.5 ppm (H5/C5)归属于α‑D‑GlcpA‑(1→残基信号。化学信号δ4.58/102.6 ppm (H1/C1)，δ 3.43/69.4 ppm (H2/C2)，δ 3.84/74.1 ppm (H3/C3)，δ 3.69/71.6 ppm (H4/C4)，δ 3.45/71.2 ppm (H5/C5)，δ 3.68/61.0 ppm (H6/C6)为→3)‑β‑D‑Manp‑(1→残基信号。δ 4.98/107.0 ppm (H1/C1)，δ 3.69/72.1 ppm (H2/C2)，δ 3.61/75.1 ppm(H3/C3)，δ 3.84/ 68.7 ppm (H4/C4)，δ 3.63/81.0 ppm (H5/C5)，δ 3.68/60.9 ppm (H6/C6)归属于β‑D‑Galp‑(1→残基信号。δ 5.14/109.5 ppm (H1/C1)，δ 4.15/81.1 ppm (H2/C2)，δ 3.85/ 75.6 ppm (H3/C3)，δ 4.05/81.2 ppm (H4/C4)，δ 3.68/68.0 ppm (H5/C5)归属于α‑L‑Araf‑(1→残基信号。δ 5.21/92.1 ppm (H1/C1)，δ 3.75/81.2 ppm (H2/C2)，δ3.68/68.0 ppm (H3/C3)，δ 3.42/71.3 ppm (H4/C4)，δ 3.80/68.7 ppm (H5/C5)，δ 1.24/16.5ppm (H6/C6) 为 →2)‑α‑L‑Rhap‑(1→ 残 基 信 号。 而 δ 4.55/96.0 ppm 归 属 于→4)‑β‑D‑Glcp‑(1→残基的 H1/C1 信号。进一步结合 HMBC NMR 谱图，可知α‑D‑GlcpA‑(1→的 H1（δ 5.03 ppm）与β‑D‑Galp‑(1→的 C5（δ 81.0 ppm）相关。β‑D‑Galp‑(1→的 H1（δ 4.98 ppm）与→3)‑β‑D‑Manp‑(1→的 C2（δ 69.4 ppm）相关。→3,4)‑β‑D‑Xylp‑(1→的 H1（δ 4.40 ppm）与α‑L‑Araf‑(1→的 C5（δ 68.0 ppm）相关。乙酰基的甲基质子信号一般出现在 1.8‑2.2 ppm 范围内，因此，δ 2.02，2.04，2.12，2.18 ppm 处的化学位移归属于乙酰基质子。 [0014] 红外谱图如图1所示，在 3423.31 cm‑1处的强吸收峰归因于 BCPS‑1 中糖类分子间和内部羟基的伸缩振动。在 2932.87 cm‑1处的吸收峰为BCPS‑1中CH3和CH2的C‑H伸缩振动，而1419.72 cm‑1处的吸收峰归因于 BCPS‑1中的 C‑H 的弯曲振动，1336.19 cm‑1(BCPS‑3)处的吸收峰同样归因于 C‑H 的变角振动。在 1748.25cm‑1处出现的特征吸收峰是由 C=O 的伸缩振动引起的，表明多糖样品中存在糖醛酸。1617.86 cm‑1处的吸收峰归因于多糖样品中的结合水。在 BCPS‑1 中 1100.33cm‑1和 1018.04 cm‑1，证明 BCPS‑1具有吡喃环，832.84 cm‑1属于α构型。而 640.08 cm‑1处的吸收峰是吡喃环骨架的对称伸缩振动信号。 [0015] 3）北柴胡茎叶多糖单糖组成的测定精密称取 BCPS‑1 10 mg，放置在具塞比色管中，加入2 mL三氟乙酸溶液（2 mol/ L），氮气封管置于110 ℃烘箱中水解6 h，水解完成后用甲醇反复多次旋蒸带走残留的三氟乙酸，氮气吹干得到水解产物。分别取各单糖标准品和水解后的多糖样品10 mg，分别放置于具塞比色管中，随后分别加入0.5 mL吡啶溶液和10 mg盐酸羟胺，封管，放置于90 ℃的水浴锅中反应1 h，期间不断振荡。反应液冷却至室温后再加入0.5 mL乙酸酐溶液，继续在90 ℃反应30 min，反应液冷却后过0.45 μm有机膜待进气相色谱分析。 [0016] 色谱条件：气质联用色谱仪（7890A/5975C）；色谱柱：Agilent HP‑5毛细管柱； 检测器：FID检测器； 载气：氦气，流速1.0 mL/min，分流比为110：1； 程序升温：起始温度160 ℃，保持2 min，以2 ℃/min的速度升至250 ℃，保持2 min； MS条件：质量扫描范围为50～350 amu，溶剂延迟2.5 min； 进样量：30～60 μL； 色谱图见图4，由图可知 BCPS‑1是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其质量百分比为 21.90 %、12.93 %、2.06 %、9.94 %、4.00 %、 13.48 %、35.69 %。 [0017] 4）北柴胡茎叶多糖分子量的测定准确称取已知分子量的标准葡聚糖T4、T10、T20、T40、T200、T500和纯化多糖 BCPS‑1并用去离子水将其分别配制成终浓度为10 mg/mL的样品溶液。配制好的进样液分别过0.22 μm的有机滤膜备用。 [0018] 色谱条件：高效凝胶渗透色谱仪（LC‑20 AR）；检测器：RID‑20A示差折光检测器； 色谱柱：A TSK gel G5000PW column (I.D. = 7.5 mm, L = 300 mm)； 流动相：KH2PO4（0.02 mol/L）； 柱温：室温； 流速：0.6 mL/min； 进样量：50 μL； 根据标准葡聚糖的分子量对数和出峰时间得出相关的线性回归方程：lgMr = ‑ 2 1.3411 X + 23.614（R =0.9861），将 BCPS‑1的出峰时间代入线性回归方程计算可得， BCPS‑1的分子量为21.80 kDa。 [0019] 5）DPPH自由基清除能力准确称取1.2 mg DPPH粉末溶于15 mL无水乙醇中，充分混匀，即得到0.2 mmol/L 的DPPH储备液，避光保存。准确称取多糖样品于EP管中，用50 %的乙醇溶液配制得到10 mg/mL的样品储备液，并将其配置成不同的样品浓度。取100 μL不同浓度的样品，再加100 μL的DPPH储备液，避光反应30 min，在517 nm下测其吸光度值。用Vc作为阳性对照。清除能力的计算公式为R % = (1‑(A1‑A2)/A0) × 100 %。A2为100 μL的样品和100 μL的无水乙醇，为样品本底组。A0为100 μL的DPPH和100 μL的50 %乙醇，为空白对照组。由图5可知，北柴胡茎叶多糖清除DPPH自由基的能力与浓度呈剂量依赖性。当样品的浓度达到5 mg/mL时， BCPS‑ 1对DPPH自由基的清除效果为57.56 % 6）ABTS自由基清除能力 将样品配置成一系列不同浓度的样品溶液，取10 μL不同浓度的样品，加入190 μL ABTS+储备液，避光反应10 min，放入酶标仪中，在734 nm波长处检测吸光度（A1）。用Vc作为阳性对照。清除能力的计算公式为R % = (1‑(A1‑A2)/A0) × 100 %。10 μL无水乙醇和190 μL ABTS，为样品本底组（A2）。空白对照（A0）为190 μL的ABTS和10 μL的50 %乙醇。由图6可知，当浓度达到5 mg/mL时， BCPS‑1对ABTS自由基的清除效果为79.87 %。 [0020] 7）北柴胡茎叶多糖对H2O2诱导的SH‑SY5Y模型中细胞损伤的保护作用（1）SH‑SY5Y 细胞的培养 ① 细胞复苏 将新配制好的细胞培养液提前放入水浴锅中预热。将细胞从‑80 ℃冰箱中取出， 快速放入 37 ℃的水浴锅中融化 1 min，摇晃，直至全部融化无冰晶。轻轻吹打解冻的细胞悬液，使其均匀，并将其转入 5 mL 的离心管中，在 25 ℃，1000 rpm 条件下离心 5 min。 将离心好的细胞混悬液中的上清液移除，并加入 2 mL 新鲜培养液，将细胞沉淀吹打均匀后，接种于细胞培养瓶中，并在 37 ℃，5 % CO2 条件的培养箱中进行培养。24 h 后观察细胞的状态，根据细胞状态进行传代或换液。 [0021] ② 细胞传代从培养箱中取出培养瓶，观察细胞的状态与密度。当细胞的密度达到 80 %及以 上，需传代处理。首先吸弃旧的培养液，加入 1 mL 的 PBS 对细胞进行清洗，而后吸弃 PBS，加入 1 mL 的胰酶消化细胞，快速放入培养箱中，并计时 1 min。取出培养瓶，轻轻拍打，在显微镜下观察到 80%细胞已完成消化后，加入 1 mL 的培养液终止消化，并吸取细胞悬液对培养瓶壁进行反复轻柔吹打，而后将细胞悬液转至 5 mL的离心管中，1000 rpm 下离心 10 min。将离心好的细胞悬液的上清液去除，加入 2 mL新的培养液，将细胞沉淀吹散均匀，接种于含 2 mL 新鲜培养液的培养瓶中，并放入培养箱中进行培养。 [0022] ③ 细胞计数和铺板当细胞密度达到 80 %及以上时，可进行计数铺板。按照上述传代的步骤进行操 作，吸弃离心好的细胞悬液的上清液后，加入 3 mL 新鲜的培养液，轻柔吹打，使细胞分散均匀。将计数板擦拭干净，盖上盖玻片，吸取 10 μL 混匀的细胞悬液，匀速均匀的打入计数板，并在显微镜下分别记录 4 个象限内的细胞数，根据实验的需求对其进行计算，配制好相应的细胞混悬液，进行铺板。 [0023] ④ 细胞损伤模型的建立按照上述的操作方法，对细胞密度达到 80 %及以上的细胞按照每孔 5000 个细 胞的密度接种到 96 孔板中，在培养箱中孵育 24 h。24 h 后取出 96 孔板，观察细胞状态。吸弃 96 孔板中的上清液，加入 50 μL 的培养液，于培养箱中孵育 2 h。之后分别加入不同浓度的 H2O2溶液，使孔内 H2O2的浓度分别为 700，800，900，1000，1100，1200 μmol/L，继续在培养箱中孵育 4 h。损伤结束后，采用 MTT 法对细胞的存活率进行测定。向 96 孔板中分别加入 20 μL 的 MTT 溶液（5 mg/mL），于培养箱中孵育 3.5 h，使 MTT 与活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶充分结合。吸弃上清液，每孔加入 150 μL 的 DMSO 去溶解结晶甲瓒，振荡，10 min 后使用酶标仪在 490 nm 处测定其吸光度。空白组为 100 μL 的完全培养基对细胞进行培养。此实验操作重复三次，选取细胞存活率为 60 %左右的 H2O2组浓度为后续损伤实验中所用的浓度。 [0024] 当 H2O2浓度为 1000 μmol/L 时，细胞的存活率为 62.12 %，为 SH‑SY5Y 细胞进行氧化损伤建模的合适浓度。因此，选取 1000 μmol/L 的 H2O2对细胞进行氧化损伤建模，用于后续的实验。 [0025] ⑤ 北柴胡茎叶多糖的 MTT 实验按照上述的操作方法，将细胞按照每孔 5000 个细胞的密度接种于 96 孔板中， 放入培养箱中培养 24 h 使细胞贴壁。培养后，将 96 孔板中的上清液移除，分别加入100 μL 的 31.25，62.5，125，250，500μg/mL 浓度的多糖样品，放入培养箱中孵育48 h。孵育结束后，同样采用 MTT 法对细胞的存活率进行测定。向 96 孔板中分别加入 20 μL 的 MTT 溶液（5 mg/mL），培养箱中孵育 3.5 h。而后吸弃上清液，分别加入 150 μL DMSO，振荡 10 min，使用酶标仪在 490 nm 处测定吸光度值。使用完全培养基代替多糖样品作为空白对照组。所有实验操作重复三次，选取平均值。 [0026] 当多糖样品溶液的浓度为 250 μg/mL 时，细胞的存活率大于 100 %，说明其具有促进细胞生长的作用。而样品浓度为 500 μg/mL时，细胞存活率小于 100 %。综上所述，250 μg/mL 浓度的活性优于 500 μg/mL，因此，选取 62.5，125，250μg/mL 三个浓度进行后续的实验研究（2）将细胞以每孔 5000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，于培养箱中孵育 24 h。细胞贴壁后，吸弃上清液，分别加入 50 μL 提前配制好的 62.5，125，250 μg/mL 的多糖样品溶液，于培养箱中孵育 24 h。孵育结束后，再加入 50 μL的 H2O2（1000 μmol/L）继续作用 4 h。损伤结束后，加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）作用 3.5 h。作用结束后，吸弃上清液，每孔加入 150 μL DMSO，振荡反应 10 min，使用酶标仪在 490 nm 处测定其吸光度值。 本实验中的空白组为使用 100 μL 的完全培养基对细胞进行培养，损伤组为用 50 μL 的培养液代替多糖样品溶液。每个浓度做三个复孔，并且重复三次，选取其平均值。 [0027] 由图7可知，由图中结果可知，经 H2O2处理后，细胞的存活率为 61.08%，较 Control 组相比明显下降，表明建模成功。而不同浓度的 BCPS‑1均可对氧化损伤的细胞呈剂量依赖性的发挥保护作用。BCPS‑1在最大浓度 250μg/mL 时，细胞的存活率可达到 98.91 %，表明 BCPS‑1具有显著的神经细胞保护活性。 [0028] 8）北柴胡茎叶多糖对 SH‑SY5Y 神经细胞抗氧化相关指标的影响收集充分裂解的细胞于1.5 mL EP管，以10000 r/min的转速，在4 ℃的冷冻离心 机上离心10 min。取上清液进行GSH‑Px、MDA、SOD、T‑AOC含量的测定。 [0029] 由图8可知，与对照组相比，损伤组中的细胞单独经 H2O2 处理后，其 T‑AOC 、SOD、GSH‑Px的水平显著下降，MDA含量上升。与损伤组相比（0.7 mg/mL），细胞经 62.5，125，250 μg/mL 的 BCPS‑1 干预后，其 T‑AOC、SOD、GSH‑Px的水平显著提升，MDA含量下降，说明BCPS‑1能明显提高T‑AOC、GSH‑Px和SOD的活性，且呈剂量依赖性，同时能明显降低MDA含量，从而防御细胞的氧化应激损伤，抑制细胞脂质过氧化水平。 [0030] 9）北柴胡茎叶多糖对 Nrf2/HO‑1 信号通路的影响（1）蛋白的提取及变性 按照上述的方法对蛋白进行提取，收集蛋白上清液，对其进行蛋白含量的测定，并 根据蛋白浓度进行定量，计算 Western blot 的蛋白上样量。向蛋白中加入 1/4 体积的蛋白上样缓冲液（5×），混匀，在 100 ℃水浴中煮沸 15 min 使蛋白变性。流水冷却至室温并保存于‑20 ℃，备用。 [0031] SDS‑PAGE 分离蛋白提前配制好 8 %和 10 %的 SDS‑PAGE 胶。将预处理好的蛋白（30 μg）上样到SDS‑PAGE 的孔道内，60 V 条件下电泳 40 min，加压到 120 V，继续电泳，直到 marker完全分离开。 [0032] （2）转膜准备好适当大小的 PVDF 膜（0.45 μm），浸泡在甲醇中激活 1 min。按照“三明治”结构对胶进行处理，并在 150 mA 的条件下在冰浴中电转 90 min。 [0033] （3）剪膜及封闭电转结束后，按照β‑actin，HO‑1，Nrf2 的分子量分别是 42 kDa，33 kDa 和 100 kDa，对条带进行裁剪，并使用脱脂奶粉（0.05 g/mL）使其浸泡，在摇床上室温封闭 1 h。 [0034] （4） 洗膜及孵育抗体封闭结束后，倾倒封闭液，使用 PBST 对其进行 4 次清洗（8 min/次）。用滤纸将条带残余的 PBST 吸干，转移至干燥的孵育盒内，按照β‑actin（1: 4000），HO‑1（1: 1000），Nrf2（1: 1000）的比例在条带表面滴加相应的一抗，孵育过夜。移除一抗，用 PBST 清洗 4 次（8 min/次），用滤纸吸干条带后再次转移至干燥的孵育盒中，滴加二抗（1: 5000），室温孵育 2 h。 [0035] （5）显影对完成孵育的条带用 PBST 再次进行清洗。将显影液按照 A 液：B 液=（1：1）的比例在避光的条件下配制好，并滴加在蛋白条带上，使用凝胶成像系统对其进行检测，分析显影结果。 [0036] （6）数据处理所有实验重复三次，结果用 mean ± SEM 表示，p ＜ 0.05 表明有统计学意义。 数据的统计、分析及图表的绘制均采用 Origin 9.0 和 GraphPad 8.02软件。 [0037] 如图9 所示。由图中结果可知，H2O2处理显著下调了 HO‑1 和 Nrf2 的表达，表明细胞受到氧化应激损伤，这是通过 Nrf2/HO‑1 信号通路发生的。然而，经过BCPS‑1 处理后，HO‑1 和 Nrf2 的表达显著升高，且呈剂量依赖性。与 H2O2 模型组相比，最大浓度 250 μg/mL 的 BCPS‑1 处理可分别上调细胞中 HO‑1 和 Nrf2 蛋白表达约 1.80 倍和 1.59 倍。总之，BCPS‑1 可通过激活 Nrf2/HO‑1 信号通路来有效的改善 H2O2诱导的 SH‑SY5Y 细胞的氧化应激损伤。 |
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