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一种纳米膳食纤维及其制备、纳米膳食纤维载药系统及其制备与应用

申请号 CN202311046187.4 申请日 2023-08-18 公开(公告)号 CN117820507A 公开(公告)日 2024-04-05
申请人 苏州市立医院; 发明人 余强; 邱磊; 马荣林; 张幸;
摘要 本 发明 涉及一种纳米膳食 纤维 及其制备、纳米膳食纤维载药系统及其制备与应用。本发明利用纳米膳食纤维作为靶向载体,纳米膳食纤维本身也可在人体内发挥多种生理功能。肠道 微 生物 菌群可以利用膳食纤维进行微生物 发酵 ,产生短链 脂肪酸 ,短链脂肪酸有利于减少 炎症 和 肿瘤 的发生。
权利要求

1.一种纳米膳食纤维的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)、将燕麦粉浸泡在有机溶剂中,进行脱脂处理,过滤干燥,得到脱脂样品,与混合,水浴加热,得到混合液
(2)、将步骤(1)所得混合液的pH调节至5.0‑6.0,并加入耐热淀粉酶,95℃水浴加热震荡1‑2h;随后又在50℃水浴中震荡,继续调节混合液的pH值至4.0‑4.5,并加入糖化酶,60℃水浴中孵育1‑2h;之后将pH调节至7.0,加入中性蛋白酶,55℃水浴酶解2‑3h;
(3)、将步骤(3)中水浴孵育过后的混合液置于95‑100℃水浴中15‑30min,使酶失活,冷却;随后加入乙醇,4℃条件下膳食纤维发生沉淀,干燥,研磨成粉,过筛得到膳食纤维;
(4)、将步骤(3)中膳食纤维溶解于浓度为64%的浓硫酸中进行恒温50℃摇床反应,在低温条件下抑制水解反应,离心得到微米级膳食纤维;
(5)、将步骤(4)中微米级膳食纤维混合于超纯水中,得到悬浮液,将悬浮液进行透析至中性,之后对透析过后的悬浮液进行不同时间段的超声处理,得到纳米级膳食纤维。
2.根据权利要求1中所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,满足以下条件中至少一条:
所述脱脂样品与水的质量体积比为1:20‑1:5mg/mL;
所述水浴加热的过程:先95‑100℃水浴15‑30min,随后50‑60℃水浴30‑60min。
3.根据权利要求1中所述的制备方法,其特征在于,所述脱脂样品、耐热淀粉酶、糖化酶和中性蛋白酶的质量比为10:(0.5‑1):(0.03‑0.5):(0.3‑0.5)。
4.据权利要求1中所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述透析的透析袋的分子量8000Da‑14000Da。
5.一种如权利要求1‑4中任一项所述的制备方法所得纳米膳食纤维。
6.一种纳米膳食纤维载药系统,其特征在于,所述纳米膳食纤维载药系统通过以下方法制备得到:
S1、将EDC、NHS与权利要求5中所述纳米级膳食纤维搅拌得到混合液,加入IL‑1beta抗体溶液,搅拌混合反应,再加入药物溶液,得到NDF‑药物;
S2、将海藻酸钠、Bac和NDF‑药物混合,利用静电液滴发生器,在CaCl2溶液中形成NDF‑Ms凝胶微球,得到所述的纳米膳食纤维载药系统。
7.根据权利要求6所述的纳米膳食纤维载药系统,其特征在于,S1中,所述IL‑1beta抗体溶液的浓度为10μg/mL。
8.根据权利要求6所述的纳米膳食纤维载药系统,其特征在于,S1中,所述药物溶液中的药物选自BSA/5‑ASA。
9.根据权利要求8所述的纳米膳食纤维载药系统,其特征在于,所述BSA/5‑ASA通过以下方法制备得到:
步骤A、将BSA溶液与5‑ASA溶液混合,得到混合液;
步骤B、将步骤A中所述混合液通过8000分子质量的透析袋过滤,去除游离的5‑ASA,得到所述BSA/5‑ASA。
10.权利要求6‑9中任一项所述的纳米膳食纤维载药系统在结直肠疾病治疗药物中的应用。

说明书全文

一种纳米膳食纤维及其制备、纳米膳食纤维载药系统及其制

备与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域,尤其是指一种纳米膳食纤维及其制备、纳米膳食纤维载药系统及其制备与应用。

背景技术

[0002] 慢性溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病(IBD)的两种主要形式之一,最严重的后果之一是发展成为结直肠癌(CRC)。据Rogler,G研究发现,高达30%的UC患者在后期会演变为CRC。尽管诱导UC的具体病因目前为止还未有统一的认知,但UC患者临床表现为反复发作的腹泻、黏液血便以及腹痛等症状,内镜下可见病变从直肠开始,逆行向近端结肠扩展,呈弥漫性改变,黏膜呈细颗粒状,脓性分泌物附着,可伴糜烂或浅溃疡。目前,临床UC的治疗主要以杨酸类、糖皮质激素类、免疫抑制剂类药物为主。其中,除5‑氨基水杨酸为pH依赖性缓释剂可口服进入结直肠外,其他药物分子如布地奈德和氢化考的松主要用于灌肠给药,而免疫抑制剂(沙利度胺、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤等)主要为静脉注射给药。不论哪种给药方式,给药的唯一标准是能够将药物靶向至发病部位,促使药物最大化吸收,从而降低其副作用
[0003] 为了克服靶向递送药物至结直肠的技术困难,近年来纳米载体显示出巨大的优势。如研究人员发现将药物制备成纳米颗粒即可提高药物在胃肠道酸性到中性环境中的长期稳定性(pH依赖性途径和时间依赖性),为靶向至结直肠的特定位点提供机会,又可增加药物的溶解度生物利用度,保持药物在特定位点的持续释放。
[0004] 尽管目前涌现出大量靶向结直肠的纳米载体研究,且证实具有比口服给药更好的治疗效果。但进一步总结发现现有结直肠靶向纳米载体仍具有三方面不足:1)靶向药物在胃酸中难以保持稳定;2)靶向药物递送时间不可控;3)靶向药物突破空间障碍到达指定位点并释放药物是个难题。但是现有技术中大部分靶向载体仅满足前两个条件,在克服第三个困难时往往采用被动靶向,即通过克服pH变化或者药物过早释放的障碍将药物靶向至结直肠所处的环境,而并不能靶向结直肠特定位点的特定目标。尽管也有一些科研工作者逐渐开发了配体修饰的主动靶向纳米载体,但靶向载体本身并没有特殊的优势。且有些靶向载体本身在完成靶向任务后,需及时的被清除或者降解,且对结直肠本身的生长环境和机体的免疫响应没有任何改善。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题,本发明提供了一种纳米膳食纤维及其制备、纳米膳食纤维载药系统及其制备与应用。本发明利用主动靶向,在纳米膳食纤维中接上了IL‑1beta抗体,能主动靶向至结直肠的炎症部位。利用纳米膳食纤维作为靶向载体,纳米膳食纤维本身也可在人体内发挥多种生理功能,如在肠道内维持水分、增加肠道蠕动和微生物发酵等。肠道微生物菌群可以利用膳食纤维进行微生物发酵,产生短链脂肪酸,短链脂肪酸有利于减少炎症和肿瘤的发生。
[0006] 本发明中靶向载体药物中还添加了双歧杆菌,溃疡性结直肠炎患者肠道内肠道菌群稳态失调,而双歧杆菌的添加有利于肠道菌群的恢复。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种纳米膳食纤维的制备方法,包括以下步骤:
[0008] (1)、将燕麦粉浸泡在有机溶剂中,进行脱脂处理,过滤干燥,得到脱脂样品,与水混合,水浴加热,得到混合液
[0009] (2)、将步骤(1)所得混合液的pH调节至5.0‑6.0,并加入耐热淀粉酶,95℃水浴加热震荡1‑2h;随后又在50℃水浴中震荡1h,继续调节混合液的pH值至4.0‑4.5,并加入糖化酶,60℃水浴中孵育1‑2h;之后将pH调节至7.0,加入中性蛋白酶,55℃水浴酶解2‑3h;
[0010] (3)、将步骤(3)中水浴孵育过后的混合液置于95‑100℃水浴中15‑30min,使酶失活,冷却;随后加入乙醇,4℃条件下过夜,膳食纤维发生沉淀,干燥,研磨成粉,过筛得到膳食纤维;
[0011] (4)、将步骤(3)中膳食纤维溶解于浓度为64%的浓硫酸中进行恒温50℃摇床反应,在低温条件下抑制水解反应,离心得到微米级膳食纤维;
[0012] (5)、将步骤(4)中微米级膳食纤维混合于超纯水中,得到悬浮液,将悬浮液进行透析至中性,之后对透析过后的悬浮液进行不同时间段的超声处理,得到纳米级膳食纤维。
[0013] 在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,满足以下条件中至少一条:
[0014] 所述有机溶剂选自乙酸乙酯;
[0015] 所述燕麦粉与有机溶剂的质量比为1:4;
[0016] 所述浸泡温度为室温、时间为3‑5h;
[0017] 所述脱脂样品与水的质量体积比为1:20‑1:5mg/mL;
[0018] 所述水浴加热的过程:先95‑100℃水浴15‑30min,随后50‑60℃水浴30‑60min。
[0019] 在本发明的一个实施例中,所述脱脂样品、耐热淀粉酶、糖化酶和中性淀蛋白酶的质量比为10:(0.5‑1):(0.03‑0.5):(0.3‑0.5)。其中,糖化酶和中性蛋白酶购于Solarbio,耐热淀粉酶购于阿拉丁试剂
[0020] 在本发明的一个实施例中,步骤(3)中,所述过夜是指大于8h以上。
[0021] 在本发明的一个实施例中,步骤(4)中,所述恒温摇床条件:温度为40‑60℃,时间为2‑8小时。
[0022] 在本发明的一个实施例中,步骤(4)中,水解后的样品离心条件:15000rpm,8℃下离心15min,反复离心至少5次。
[0023] 进一步的,步骤(4)中,在低温条件下抑制水解反应中的低温是在上(0℃)抑制反应。
[0024] 在本发明的一个实施例中,步骤(5)中,所述透析的透析袋的分子量8000Da‑14000Da。
[0025] 进一步的,步骤(5)中,还包括对纳米膳食纤维进行冷冻干燥,得到纳米膳食纤维粉末。
[0026] 本发明的第二个目的在于提供所述的制备方法所得纳米膳食纤维。
[0027] 本发明的第三个目的在于提供一种纳米膳食纤维载药系统,所述纳米膳食纤维载药系统通过以下方法制备得到:
[0028] S1、将EDC、NHS与所述纳米级膳食纤维搅拌得到混合液,加入IL‑1beta抗体溶液,搅拌混合反应,再加入药物溶液,得到NDF‑药物;
[0029] S2、将海藻酸钠、Bac和NDF‑药物混合,利用静电液滴发生器,在CaCl2溶液中形成NDF‑Ms凝胶微球;得到所述的纳米膳食纤维载药系统,(其中,Bac是指双歧杆菌三联活菌胶囊,培菲康)。
[0030] 在本发明的一个实施例中,S1中,所述IL‑1beta抗体溶液的浓度为10μg/mL。
[0031] 在本发明的一个实施例中,S1中,所述药物溶液中的药物选自BSA/5‑ASA。
[0032] 在本发明的一个实施例中,S2中,所述BSA/5‑ASA通过以下方法制备得到:
[0033] 步骤A、将BSA溶液与5‑ASA溶液混合,得到混合液;
[0034] 步骤B、将步骤A中所述混合液通过8000分子质量的透析袋过滤,去除游离的5‑ASA,得到所述BSA/5‑ASA。
[0035] 本发明的第四个目的在于提供所述的纳米膳食纤维载药系统在结直肠疾病治疗药物中的应用。
[0036] 本发明通过实验发现,正常小鼠结肠和溃疡性结直肠炎小鼠IL‑1β免疫组化,提示IL‑1β聚集在溃疡性结直肠炎小鼠的结肠,因此选择IL‑β与纳米膳食纤维进行结合(见图7),期望能实现靶向至结直肠炎症部位,最终实现靶向治疗。
[0037] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点:
[0038] 本发明在药物治疗的基础上,通过将纳米膳食纤维设计为抗体类配体介导的靶向载体,不仅可以将药物靶向至肠道病变部位处发挥治疗效果,中和炎症部位的炎症因子,并促使药物均匀分布,通过IL‑1beta抗体类配体中和炎症因子及纳米膳食纤维改善肠道微生物和肠道免疫的微环境,从而增强炎症反应的免疫抵抗,避免反复发作。
[0039] 本发明中纳米膳食纤维本身也可在人体内发挥多种生理功能,如在肠道内维持水分、增加肠道蠕动和微生物发酵等。附图说明
[0040] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中,
[0041] 图1是本发明原子显微镜(AFM)对纳米膳食纤维NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3的大小和形态表征结果图。
[0042] 图2是本发明所得材料NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3的傅里叶变换红外(FT‑IR)光谱图。
[0043] 图3是野生型小鼠和结肠炎小鼠结肠IL‑1β免疫染图。
[0044] 图4是本发明BCA检测试剂盒检测NDF中IL‑1β抗体含量结果图。
[0045] 图5是本发明NDF‑1‑Pro/5‑ASA、NDF‑2‑Pro/5‑ASA、NDF‑3‑Pro/5‑ASA中各含量的结果图。
[0046] 图6是本发明NDF表面结合上的BSA图。
[0047] 图7是本发明BSA和5‑ASA的混合物中利用荧光检测方法测定5‑ASA的负载能力结果图。BSA的浓度为1.0mg/ml,5‑ASA呈现不同浓度,300‑600荧光强度下检测5‑ASA的荧光强度。
[0048] 图8是本发明NDF‑1‑Pro/5‑ASA、NDF‑2‑Pro/5‑ASA、NDF‑3‑Pro/5‑ASA的长度变化情况图。
[0049] 图9是本发明NDF‑M1、NDF‑M2、NDF‑M3的共聚焦显微镜图。
[0050] 图10是本发明NDF‑M1、NDF‑M2、NDF‑M3的冻干再水化的共聚焦显微镜图。通过共聚焦显微镜获得NDF‑M图像,以显示凝胶微球的形态和BSA/5‑ASA分布,所有数据均以mean±SD(n=3)表示。
[0051] 图11是本发明NDF‑M1、NDF‑M2、NDF‑M3的体外释放情况图。
[0052] 图12是本发明NDF‑M1小鼠实验的中采用荧光定量法检测结肠内容物中5‑ASA的含量的结果图。
[0053] 图13是本发明NDF‑M1小鼠实验的中5‑ASA、蛋白质和GLCUA含量结果图。其中,图13A为比较对给5‑ASA和给NDF‑M1/H的对照组和给与5‑ASA和NDF‑1/H急性结直肠炎小鼠血清中的5‑ASA含量。图13B,比较对给5‑ASA和给NDF‑M1/H的对照组和给与5‑ASA和NDF‑1/H急性结直肠炎小鼠结肠炎症部位,给与5‑AS和NDF‑1/H急性结直肠炎小鼠结肠非炎症部位肠道内容物中的5‑ASA含量。图13C,NDF‑M1/H和正常对照组与NDF‑M1/H和给水的急性结直肠炎小鼠结肠内容物中GLCUA含量。
[0054] 图14是本发明慢性结肠炎小鼠流程图.
[0055] 图15是本发明结肠内容物中短链脂肪酸含量。
[0056] 图16是本发明小鼠体重变化图,每隔3天,对小鼠称重。
[0057] 图17是本发明小鼠结肠变化图。
[0058] 图18是本发明小鼠结肠组织匀浆中炎症因子的含量。

具体实施方式

[0059] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0060] 实施例
[0061] 本实施例提供了一种纳米膳食纤维靶向载药系统的制备方法,具体如下:
[0062] 一、制备纳米膳食纤维,步骤如下:
[0063] (1)、常温25℃下将20克燕麦粉浸泡在乙酸乙酯(燕麦粉:乙酸乙酯1:4,w/w)中3小时,随后用蒸馏水冲洗残余的有机溶剂。过滤样品,将样品在60℃下干燥获得脱脂样品。将10mg脱脂样品按照质量体积比为10mg:100mL的比例与水混合,置于95℃水浴下15分钟,随后又在50℃水浴中震荡30分钟。
[0064] (2)、将步骤(1)所得样品的pH调节至5.5,再添加0.5g耐热淀粉酶,然后在95℃下水浴震荡1小时。为了进一步水解样品,将pH调节至4.2,添加0.03克糖化酶,然后在60℃水浴孵育1小时。将pH调节至7.0,添加0.36克中性蛋白酶,并在55℃水浴下孵育2小时。将样品置于95℃水浴中15分钟,然后冷却至室温。加入4倍体积的95%乙醇,在4℃下静置过夜,膳食纤维发生沉淀,将沉淀的膳食纤维进行干燥,获得干燥的膳食纤维。
[0065] (3)、将步骤(2)干燥的膳食纤维研磨成粉末状,70um过滤筛过滤,得到微米级别的膳食纤维。分别称量3份200mg微米级别的膳食纤维,将样品分别溶解至1mL64%的浓硫酸的棕色瓶中,以转速为150rpm/min,温度为50℃进行恒温摇床2小时、4小时、8小时,得到三种不同尺寸的微米级膳食纤维NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3。
[0066] (4)、将酸解后的膳食纤维NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3的棕色瓶放在冰上30分钟,抑制浓硫酸的水解反应。将浓硫酸水解后的样品在15000rpm,8℃下离心15分钟,反复离心5次,用超纯水洗,最后再用超纯水溶解沉淀得到悬浮液。悬浮液在超纯水透析至中性,透析袋的分子量8000Da‑14000Da。将3份透析至中性的悬浮液水浴超声120分钟,得到三种不同尺寸的纳米级别的膳食纤维NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3。材料表征:(1)、利用原子力显微镜(AFM)观察其形貌:滴入NDF溶液(50μg/mL)于母板上,室温干燥,进行AFM观察,结果见图1。(2)、采用动态光散射法测量了NDF在水中的Zeta电位和粒子长度,结果见表1;三种不同尺寸的纳米级别的膳食纤维的长度分别为:NDF‑1为100nm‑500nm,NDF‑2为500‑1000nm,NDF‑3为1000‑2000nm。
[0067] 表1
[0068] NPs Size(nm) Zeta potential(mV)NDF‑1 214±40 ‑43.3±1.8
NDF‑2 692±203 ‑38.0±8.7
NDF‑3 1081±65 ‑32.4±4.4
NDF‑1‑Pro/5‑ASA 488±118 ‑0.40±0.2
NDF‑2‑Pro/5‑ASA 1881±590 ‑1.30±0.1
NDF‑3‑Pro/5‑ASA 2690±508 ‑9.40±1.1
[0069] 二、纳米膳食纤维接上BSA/5‑ASA(5‑氨基水杨酸),再接上双歧杆菌,具体操作如下:
[0070] (一)、IL‑1β修饰NDF表面
[0071] 1、通过酰胺化反应将IL1‑Beta抗体与NDF结合;
[0072] 2、将100mg EDC和200mg NHS分别加入1.0mL NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3(1.0mg/mL DI H2O)中,在25℃下搅拌2h;
[0073] 3、将步骤(1)中所得含NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3混合液与10μg/mL的IL‑1β抗体溶液1.2mL进行混合并磁搅拌反应,反应6h后,再加入1mL BSA/5‑ASA溶液(BSA 37.4mg/mL,ASA 
60.9mg/mL),反应24h,合成得到NDF‑1‑Pro/5‑ASA、NDF‑2‑Pro/5‑ASA、NDF‑3‑Pro/5‑ASA。
[0074] 4、用DI H2O洗涤NDF‑Pro/5‑ASA三次,去除游离IL‑1β和BSA/5‑ASA,并悬浮于1.0mL DI H2O中。用默克BCA试剂盒检测悬浮液中IL‑1β和BSA含量,用荧光光谱法检测5‑ASA的含量,结果见图4,由图4可知,发现10μg的IL‑1β抗体与1.0mgNDF结合。利用傅里叶变‑1
换红外(FT‑IR)光谱进行结构表征,结果见图2和表1,由图2可知,红外光谱图像在1597cm出现了C=O的特征峰,提示NDF的羧基化修饰成功。C=O特征峰能通过酰胺键将IL‑1β抗体和BSA/ASA结合在NDF表面,证实了NDF表面存在大量羧基。将所得NDF‑1‑Pro/5‑ASA、NDF‑2‑Pro/5‑ASA、NDF‑3‑Pro/5‑ASA材料进行表征,结果见图8和表1,由表1发现NDF‑pro/5‑ASA的长度和zeta电位增加,这表明NDF‑pro/5‑ASA合成成功。得到了三种不同的NDFs‑Pro/5‑ASA,分别为NDF1‑Pro/5‑ASA(1.0mg/0.37mg/0.62mg)、NDF2‑Pro/5‑ASA(1.0mg/0.23mg/
0.36mg)和NDF3‑Pro/5‑ASA(1.0mg/0.17mg/0.30mg)。
[0075] 其中,BSA/5‑ASA混合溶液的制备方法为:
[0076] 步骤A、将0.25mg4.0mg/mL的BSA与不同浓度梯度(0.25mL,0‑9.6mg/mL)的5‑ASA混合48小时,BSA通过静电作用结合5‑ASA;
[0077] 步骤B、混合液通过8000分子质量的透析袋过滤,去除游离的5‑ASA,最终得到BSA/5‑ASA混合溶液;
[0078] 步骤C、BCA法测定BSA/5‑ASA中的BSA含量,荧光光谱检测BSA/5‑ASA中的5‑ASA含量。BSA通过静电作用结合5‑ASA,BSA/5‑ASA偶联数据显示,每1mLDIH2O中有37.4mgBSA和60.9mg5‑ASA。
[0079] (二)、海藻酸钠对NDF‑Pro/5‑ASA的包裹
[0080] 1、将含有10mg海藻酸钠、10mgBac1mL和NDF‑pro/5‑ASA(5‑ASA浓度分别为1、2、5、10、20mg/mL)混合后,通过0.5mm针和静电液滴发生器(Bio‑leaderinc,China)将其挤出到CaCl2溶液(0.1M)中,形成1mL NDF‑Ms凝胶微球,可视化NDF‑Pro/5‑ASA共聚焦显微镜下的分布,结果见图9,结果见图9,图中荧光显微镜和光镜显示,所有凝胶微球的尺寸都在300μm左右,药物BSA/5‑ASA均匀地分散在凝胶微球内。
[0081] 2、10min后,采用自然沉降法收集NDF‑Ms,在10mL0.05%(w/v)聚赖氨酸溶液(PLL)中以50rpm的转速在摇床中浸泡10min,在NDF‑Ms表面形成PLL涂层壳。
[0082] 3、将包被的微胶囊悬浮在5mL1%CaCl2溶液中,在显微镜下计数(约300微球/mL)。
[0083] 三、包被的微胶囊NDF‑Ms微球的表征以及性能测试
[0084] (一)、A:以50μL10MNa2CO3溶解步骤(三)中所得1mLNDF‑Ms微球,用BCA试剂盒测定微球中蛋白浓度,并将蛋白浓度稀释至1.0mg/mL。然后,通过检测260nm激发波长和500nm发射波长的荧光强度,测定1.0mg/mL蛋白存在下5‑ASA的浓度。计算NDF‑Pro/5‑ASA的包封率(%)与BCA的浓度有关(当蛋白浓度已知,各溶液取100uL测荧光,能测出5‑ASA的浓度)。结果见表2。
[0085] 表2
[0086]
[0087] 表2数据可知,所有5‑ASA的封装效率都保持在80%左右。根据临床试验与小鼠实验的给药浓度转换,选择0.5:1(5‑ASA:海藻酸盐)的比例进行后续的实验研究。
[0088] B:将所得NDF‑Ms微球的组分进行测定,结果见图5和图6,由图5可知,NDF‑1中5‑ASA的浓度为0.62±0.12μg/mg,显著高于其他两种NDF‑2(0.36±0.10)和NDF‑3(0.30±0.15μg/mg)。由图6可知,NDF‑1、NDF‑2、NDF‑3与BSA/5‑ASA的结合呈浓度依赖性。结果显示NDF‑1与BSA的结合浓度为0.37±0.02mg/mg,高于其他两种NDF‑2、NDF‑3(0.23±0.02和
0.17±0.04mg/mg)。
[0089] C:使用荧光测定的方法测试NDF‑Ms微球中NDF对于5‑ASA药物的负载能力,结果见图7。由图7可知,在不同浓度的5‑ASA下,荧光强度发生了明显的位移。随着5‑ASA浓度的增加,5‑ASA的负荷逐渐增加,并达到一个平台。
[0090] (二)、冻干再水化,具体操作步骤:将1mLNDF‑Ms微球,置于冻干机里冻干,得到冻干之后的NDF‑Ms微球;之后将冻干过后的NDF‑Ms微球,加1ml水进行溶解,观察NDF‑Ms微球的变化,结果见图10从图10中可知,通过共聚焦显微镜获得NDF‑M图像,显示凝胶微球的形态和BSA/5‑ASA分布,因此发现NDF‑Ms可以冻干再水化。因此,说明本发明成功构建了Bac和NDF‑pro/5‑ASA的给药微球封装。
[0091] (三)、NDF‑Ms凝胶微球体外释放情况
[0092] 测试NDF‑Pro/5‑ASA在胃模拟液和肠模拟液(SGIF)中的释放效率,用于模拟人体内pH环境下凝胶微球的缓释情况,具体操作为:
[0093] (1)、将5.0mLNDF‑Ms与12mLSGIF共孵育,接种于24孔板(650μL/孔,约55微球/孔),共18个时间点,共24h。
[0094] (2)、当不同孔达到指定孵育时间点时,每孔加入50μL10MNa2CO3溶解NDF‑Ms,离心(3000rpm,5min)除去上清。
[0095] (3)、值得注意的是,在2小时内用10MNa2CO3将pH从1.5调整到5.0,采用本领域常规的不同方法检测NDF‑Ms中蛋白质BSA、5‑ASA、NDF和Bac的含量。实验结果见图11。(蛋白测定方法为本领域常规的方法,BSA用BCA蛋白测定法,5‑ASA用荧光测定,BAC间接通过BAC分解膳食纤维产生的葡萄酸,葡萄糖醛酸用紫外分光光度计在530nm测定)
[0096] (4)、将pH调整到7.0,每孔加入1mLMRS培养基,培养6小时,采用本领域常规的不同方法检测NDF‑Ms中蛋白质BSA、5‑ASA、NDF和Bac的含量。实验结果见图11。
[0097] 图11‑A中未与NDF结合的5‑ASA微球迅速释放,NDF‑Ms在胃肠模拟液中的释放曲线显示药物在PH为7.0,6‑16小时后释放量增加,提示NDF‑Ms运输至结肠后大量释放5‑ASA。图11‑B和图11‑C同时显示蛋白质和葡萄糖醛酸含量降低,蛋白质和葡萄糖醛酸的减少有可能是因为双歧杆菌的发酵。
[0098] (四)、慢性结肠炎小鼠实验
[0099] 设置6组小鼠,每组6只,诱导慢性结肠炎,饮用水中加1.5%DSS(w/v),连续5天,第1‑5天,第11‑15天,第21‑25天,如图14所示。慢性结肠炎小鼠每天灌胃给药,分别给与生理盐水,5‑ASA(2.0mg/20g),Bac(10mg/20g),NDF‑M1/L(NDF‑M1凝胶微球),NDF‑M2/M(NDF‑M1凝胶微球)和NDF‑M1/H(NDF‑M1凝胶微球)。NDF‑M1/L含有1.0mgNDF,0.61mg蛋白,1.0mg5‑ASA和4.0mgBac.NDF‑M1/M和NDF‑M1/H分别增加了2和4倍。健康小鼠作为对照鼠,允许喝水。
第31天,异氟醚麻醉杀死小鼠。检测小鼠体重变化、小鼠结肠变化、小鼠结肠组织匀浆中炎症因子的含量以及结肠内容物中短链脂肪酸含量(通过LC‑MS/MS测定短链脂肪酸的浓度),实验结果见图15‑18,由图15‑18可知,小鼠体重和结肠图显示NDF‑M1处理显著改善了体重减轻小鼠和DAI与模型组比较。此外,结直肠长度在NDF‑M1给药组明显长于模型组。NDF‑M1/M和NDF‑M1/H的疗效优于NDF‑M1/L。通过检查结肠组织中的炎性细胞因子(IL‑1β)和炎症相关的分子介质(MDA、H2O2和MPO)。显示NDF‑M1治疗组结肠组织损伤明显减少,因此NDF‑M1/H体现了较好的效果,因此选择NDF‑M1/H做相关研究。(其中,该实验过程中使用的膳食纤维都是指NDF‑1)。
[0100] (五)、NDF‑Ms小鼠实验‑靶向作用
[0101] 急性结肠炎的诱导及NDF‑M1/H的药代动力学分析,具体如下:
[0102] 1、将18只小鼠分为6组,每组3只,其中对照组(野生型)9只,急性结肠炎小鼠9只(3%DSS诱导7d)。分别用生理盐水、4.0mg5‑ASA或NDF‑M1/H(NDF‑M1/H凝胶微球)灌胃处理12小时。
[0103] 2、随后,在异氟醚麻醉下处死小鼠,收集血清、结肠内容物和结肠组织。
[0104] 3、为了观察NDF‑M1/H的药代动力学,首先将上述小鼠的结肠进行分离,分离得到的结肠组织包括炎症性肠区(IBS)和非炎症性肠区(non‑IBS),并用ELISA试剂盒检测这两个部分中IL‑1β的表达情况。
[0105] 4、然后用生理盐水(1:10)稀释组织匀浆和结肠内容物,按蛋白测试方法测定匀浆组织中5‑ASA、蛋白质和GLCUA。实验结果见图12‑13,由图12可知,结直肠炎症肠区部位比正常结直肠部位(非炎症性肠区)的IL‑1β高3倍。图12‑B显示,采用荧光定量法检测结肠内容物中5‑ASA的含量,5‑ASA在急性结肠炎小鼠的IBS部位显著积累,说明NDF‑M1/H对炎症部位具有靶向作用,结肠组织IL1‑beta多意味着炎症重。
[0106] 由图13可知,图13‑A中发现无论是对照组(野生型)还是急性结肠炎小鼠,NDF‑M1/H处理后血清中5‑ASA的含量都比单纯处理5‑ASA的小鼠降低了2倍,说明给与NDF‑M1/H结肠炎小鼠血浆比给与5‑ASA对照小鼠血浆中5‑ASA少,意味NDF‑M1/H中的5‑ASA都集中到结肠部位,发挥疗效。图13‑B显示,与非IBS部位相比,NDF‑M1/H治疗的急性结肠炎小鼠IBS部位的5‑ASA水平更高。同时,发现口服NDF‑M1/H后急性结肠炎小鼠IBS部位的GLCUA明显高于其他部位(图13‑C)。因此,NDF‑M1能够在IBS位点输送5‑ASA。
[0107] 显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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