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柚子皮乳膏及其应用
申请号	CN202310377338.8	申请日	2023-04-11	公开(公告)号	CN117815165A	公开(公告)日	2024-04-05
申请人	漳州柚皮王生物技术有限公司;			发明人	吴锦辉;
摘要	本申请提供了一种含酶改性柚子皮多糖的乳膏及其在治疗银屑病等皮肤病中的应用。本申请使用食用酶木聚糖酶改性柚子皮多糖以及柚苷和柚皮素等成分，提供了良好的抗氧化性、治疗活性以及乳化稳定性；相比激素类药物更为安全可靠，可供日常长期使用。
权利要求	1.一种柚子皮乳膏，其特征在于，所述乳膏包含柚子皮多糖。 2.柚子皮多糖在制备治疗银屑病的乳膏剂型药物中的应用。 3.根据权利要求1或2所述的乳膏或者应用，其中所述乳膏还包含柚苷和柚皮素成分。 4.根据权利要求1或2所述的乳膏或者应用，其中所述柚子皮多糖按照以下方法制备：将柚子皮干燥、粉碎、过100目筛；按照1:30质量/体积的料液比加入去离子水，调节pH至 5.0；100摄氏度下，提取时间2小时；冷却后抽滤；加入3倍体积乙醇沉淀；离心取沉淀，浓缩并冷冻干燥。 5.根据权利要求4所述的乳膏或者应用，其中所述柚子皮多糖为经过聚半乳糖醛酸酶或者木聚糖酶改性的柚子皮多糖。 6.根据权利要求5所述的乳膏或者应用，其中所述酶改性的柚子皮多糖按照以下方法制备： (1)配制柚子皮多糖浓度为1‑10mg/mL； (2)加入木聚糖酶至100‑300U/mL，pH 56.0‑8.0，40‑60摄氏度下处理1‑4小时；或者加入多聚半乳糖醛酸酶至50‑100U/mL，pH 5.0‑7.0，40‑60摄氏度下处理1‑4小时； (3)灭酶；冷却后浓缩并冷冻干燥。 7.根据权利要求6所述的乳膏或者应用，其中步骤(1)中配制柚子皮多糖浓度为5mg/mL。 8.根据权利要求7所述的乳膏或者应用，其中步骤(2)中加入木聚糖酶至200U/mL，pH 7.0，40摄氏度下处理3小时。 9.根据权利要求1‑8任一项所述的乳膏或者应用，其中所述乳膏使用以下原料制备：去离子水50份、三乙醇胺0.2份、硬脂酸8份、硬脂酸甘油酯5份、凡士林5份、甘油15份、液体石蜡15份、香精0.2份、柚子皮多糖8份。 10.根据权利要求9所述的乳膏或者应用，其中所述乳膏按照以下方法制备：将硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡加热至70摄氏度混合作为油相；将甘油、三乙醇胺加入 35份去离子水中加热至70摄氏度作为水相；将油相随搅拌缓慢加入水相中乳化；降温至40摄氏度已经事先溶于加入15份去离子水中的柚子皮多糖和香精；继续搅拌至室温下形成乳膏。
说明书全文	柚子皮乳膏及其应用技术领域 [0001] 申请属于化妆品领域和糖工程技术领域，具体地，本申请提供了一种含柚子皮多糖的乳膏露及其在治疗银屑病等皮肤病中的应用。背景技术 [0002] 以银屑病为代表的多种难治愈皮肤病发明机理复杂(与感染和自身免疫等多种因素相关)，中西医均无特效治疗方法。使用具有抗氧化、抗菌、免疫调节功能的植物多糖、多酚或肽类产品(如柚苷和柚皮素等)进行长期调理是一种治疗、控制病情的良好选择；通过化学、物理或者生物手段改性多糖，是进一步提高多糖效果，乃至赋予多糖新功能的有效途径；其中酶改性是多糖分子结构和性能改进的常用方法，使用某些水解酶处理不仅能起到降低分子量的效果，而且会改变多糖分子的空间结构，如三螺旋结构，进而影响多糖的生理活性。 [0003] 柚子是一种被广泛食用和加工的水果，但柚子皮含大量纤维且苦涩，没有食用价值，目前仅可用于加工香精、柚子茶等少数产品。柚子皮中含有的多糖等成分有明显的抗氧化、抗菌、免疫调节乃至抗肿瘤功能，是一种有待开发的植物多糖资源。发明内容 [0004] 针对上述情况，申请人尝试使用酶改性的柚子皮多糖制备含较高浓度有效成分的乳膏剂，用于治疗银屑病等皮肤疾病。 [0005] 一方面，本申请提供了一种柚子皮乳膏，其包含柚子皮多糖。 [0006] 另一方面，本申请提供了柚子皮多糖在制备治疗银屑病的乳膏剂型药物中的应用。 [0007] 进一步地，所述乳膏还包含柚苷和柚皮素成分。 [0008] 进一步地，所述柚子皮多糖按照以下方法制备：将柚子皮干燥、粉碎、过100目筛；按照1:30质量/体积的料液比加入去离子水，调节pH至5.0；100摄氏度下，提取时间2小时；冷却后抽滤；加入3倍体积乙醇沉淀；离心取沉淀，浓缩并冷冻干燥。 [0009] 进一步地，所述柚子皮多糖经过聚半乳糖醛酸酶或者木聚糖酶改性。 [0010] 进一步地，所述酶改性的柚子皮多糖按照以下方法制备： [0011] (1)配制柚子皮多糖浓度为1‑10mg/mL； [0012] (2)加入木聚糖酶至100‑300U/mL，pH 56.0‑8.0，40‑60摄氏度下处理1‑4小时；或者加入多聚半乳糖醛酸酶至50‑100U/mL，pH 5.0‑7.0，40‑60摄氏度下处理1‑4小时； [0013] (3)灭酶；冷却后浓缩并冷冻干燥。 [0014] 进一步地，步骤(1)中配制柚子皮多糖浓度为5mg/mL； [0015] 进一步地，步骤(2)中加入木聚糖酶至200U/mL，pH 7.0，40摄氏度下处理3小时。 [0016] 进一步地，所述乳膏使用以下原料制备：去离子水50份、三乙醇胺0.2份、硬脂酸8份、硬脂酸甘油酯5份、凡士林5份、甘油15份、液体石蜡15份、香精0.2份、柚子皮多糖8份。 [0017] 进一步地，所述乳膏按照以下方法制备：将硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡加热至70摄氏度混合作为油相；将甘油、三乙醇胺加入35份去离子水中加热至70摄氏度作为水相；将油相随搅拌缓慢加入水相中乳化；降温至40摄氏度已经事先溶于加入15份去离子水中的柚子皮多糖和香精；继续搅拌至室温下形成乳膏。 [0018] 此外，本申请还提供了上述柚子皮多糖的制备方法。 [0019] 本申请中的柚子皮多糖制备原料不局限于实施例中使用的沙田柚，其他柚子品种，如文旦柚、泰国柚等也可以使用。柚子皮多糖可以根据已知的方法自行制备或者售卖市售的成品。本领域技术人员可以根据不同柚子皮多糖的情况适当的调整提取和酶改性的方法。 [0020] 本申请中还可以包含柚子皮中的其他成分，例如柚苷和柚皮素成分，其可以与柚子皮多糖在同一过程中提取制备，也可以单独提取或市售购买；其功能如抗炎、免疫调节、抗氧化等功能本领域技术人员公知。 [0021] 本申请中的酶不具备具体厂家或者含量。常见含量范围内，本领域技术人员可以进行计算并相应调整用量。 [0022] 除银屑病外，本申请的乳膏可用于多种皮肤疾病的治疗或日常调理，包括但不限于银屑病、皮炎、痤疮、玫瑰糠疹、荨麻疹、癣等。附图说明 [0023] 图1为果胶酶(A)、α 淀粉酶(B)、β淀粉酶(C)、多聚半乳糖醛酸酶(D)、果胶酯酶(E)、果胶裂解酶(F)、阿拉伯呋喃糖苷酶(G)、木聚糖酶(H)以及未处理的柚子皮多糖(I)对银屑病细胞模型HaCat细胞存活的影响(J为仅加入培养基的不加入多糖的对照，n＝5)。 [0024] 图2为果胶酶(A)、α淀粉酶(B)、β淀粉酶(C)、多聚半乳糖醛酸酶(D)、果胶酯酶(E)、果胶裂解酶(F)、阿拉伯呋喃糖苷酶(G)、木聚糖酶(H)以及未处理的柚子皮多糖(I)的DPPH和超氧阴离子自由基清除率效果(三次平均值)。 [0025] 图3为果胶酶(A)、多聚半乳糖醛酸酶(D)、果胶酯酶(E)、木聚糖酶(H)改性的柚子皮多糖以及未处理的柚子皮多糖(I)的乳化稳定性(三次平均值)。具体实施方式 [0026] 以下实施例的目的仅在于展示本发明，而不是对本申请的保护范围做任何限定，本申请的保护范围仅由权利要求限定。本申请仅展示了部分代表性实验数据，对于部分数据，特别是前期的浓度、用量、pH、温度等参数摸索过程，由于篇幅原因未能完全展示。 [0027] 实施例1材料和基本实验方法 [0028] 柚子皮多糖的提取方法 [0029] 实施例中展示的实验用柚子皮多糖为自制，原料使用品牌/经销商同批次市售的沙田柚剥皮制备。 [0030] 按照前期摸索，制备方法为：将柚子皮干燥、粉碎、过100目筛；按照1:30的料液比(质量/体积)加入去离子水，调节pH至5.0；100摄氏度下，提取时间2小时；冷却后抽滤；加入3倍体积乙醇沉淀；离心取沉淀，浓缩并冷冻干燥。按照质量计算，柚子皮多糖得率约12％。 [0031] 后续申请人购买了市售的两种柚子皮多糖(陕西哈拿生物、兰州沃特莱斯生物)，采用实施例中优选的方法进行处理，也实现了类似的效果。 [0032] 银屑病细胞模型的制备和使用 [0033] 方法改进自“热活血解毒复方(QHJD)对TNF‑α诱导的HaCat细胞增殖和凋亡的影响”。中国实验方剂学杂志，2016年，第22卷，第4期；以TNF‑α诱导的，类似银屑病的表皮细胞快速增殖效果为基础： [0034] 使用永生化的人表皮细胞HaCat细胞来制备银屑病细胞模型(HaCat细胞以及专用培养基购自武汉尚恩生物，细胞的培养和传代方法参照其公司提供的操作说明进行)。 [0035] 取对数生长期的HaCat细胞，以PBS冲洗后使用0.25％的胰蛋白酶消化5分钟；加入培养基终止消化并吹吸成细胞悬液；离心清洗，并以培养基重悬；将重悬的细胞接种至96孔板的孔中，每孔200微升，约5000个细胞。 [0036] 将孔分为空白组、对照组和待测药物组；在96孔板上培养24小时后，为对照组和待测药物组HaCat细胞更换含有TNF‑α(40ng/mL)的培养基，空白组使用无TNF‑α的培养基，培养24小时；为浓度待测药物更换含有待测药物的培养基，为空白组和对照组更换无TNF‑α和待测药物的培养基；培养24小时后进行CCK‑8实验检测细胞活性/存活率(CLPBIO公司CCK‑8 试剂盒，按照试剂盒提供的操作说明进行)，以空白组的细胞存活率为100％计算，计算对照组和待测药物组的相对存活率。 [0037] 银屑病小鼠模型的制备和使用 [0038] 方法改进自“Hesperidin inhibits keratinocyte proliferation and imiquimod‑induced psoriasis‑like dermatitis via the IRS‑1/ERK1/2pathway,Life Science，2019年，第219卷”；以咪喹莫特/IMQ诱导的，类似银屑病的皮肤问题为基础： [0039] 将健康，特别是经过检查无明显皮肤问题的BALB/C小鼠背部备皮2cm×2cm,将备皮后的小鼠分为空白组、模型组，分别每日一次涂抹给予凡士林乳膏和5％的IMO乳膏，持续1周后观察皮肤状态，相比空白小鼠出现皱褶、角质化、红肿、白色鳞屑即为造模成功。 [0040] 分组时参考以下标准，保证每组初始评分基本一致；给药连续进行7日，每日一次使用乳膏剂涂抹备皮部位(轻揉1分钟)，1小时候使用纯净水彻底洗去乳膏剂(为避免可能的刺激和过敏反应)；给药前(计为第0日)末次给药后24小时(计为第7日)进行评分。评分参考银屑病的PASI标准，由于模型面积已经确定，因此仅评价皮损、鳞屑、斑块肥厚和红斑四项标准： [0041] 表1小鼠银屑病模型评分标准(参考PASI) [0042] [0043] DPPH清除率测定和超氧阴离子自由基清除率测定 [0044] 使用市售的DPPH清除率测定试剂盒(上海研启生物)和超氧阴离子自由基清除率测定试剂盒(海赛培森生物)测定0.5mg/mL柚子皮多糖溶液的DPPH清除率和超氧阴离子自由基清除率。 [0045] 乳化稳定性检测 [0046] 配置1％的柚子皮多糖PBS缓冲液(pH 7.0,0.02M)溶液；将10mL上述溶液与2mL 植物油(市售调和油)匀质搅拌3分钟形成乳化液；从容器下半部分取0.1mL分散于10mL 0.1％ SDS溶液中，以分光光度计测定500nm光吸收(A1)；将乳化液静置15分钟后从容器下半部分取0.1mL分散于10mL 0.1％ SDS溶液中以分光光度计测定500nm光吸收(A2)；乳化稳定性表示为A2/A1×100％。 [0047] 乳膏的配方和制备方法 [0048] 乳膏配方(重量计)：去离子水50份、三乙醇胺0.2份、硬脂酸8份、硬脂酸甘油酯5份、凡士林5份、甘油15份、液体石蜡15份、香精0.2份、柚子皮多糖8份。 [0049] 制备方法：将硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡加热至70摄氏度混合作为油相；将甘油、三乙醇胺加入35份去离子水中加热至70摄氏度作为水相；将油相随搅拌缓慢加入水相中乳化；降温至40摄氏度已经事先溶于加入15份去离子水中的柚子皮多糖和香精；继续搅拌至室温下形成乳膏。 [0050] 实施例2对柚子皮多糖的酶改性实验 [0051] 使用如实施例1中所述的方法制备的同批次柚子皮多糖进行以下酶改性实验(条件摸索实验未展示)：实施例2中使用的酶均为食品级 [0052] 配置多糖浓度为5mg/mL；根据前期实验，加入果胶酶、α淀粉酶、β淀粉酶至100U/mL，pH 6.0，40摄氏度下处理2小时，或者多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶裂解酶至80U/mL，pH 6.0，40摄氏度下处理2小时，或者阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酶至200U/mL，pH 7.0，40摄氏度下处理3小时；处理后80摄氏度灭酶3分钟；冷却后重新浓缩并冷冻干燥。 [0053] 实施例3酶改性对柚子皮多糖的抗氧化效果和治疗银屑病细胞模型的效果的影响[0054] 使用如实施例1所述的方法测定柚子皮多糖对银屑病细胞模型的效果，结合前期实验中对培养基粘度的观察，选择培养基中多糖浓度为20mg/mL，结果如图1所示：柚子皮多糖可以有效抑制HaCat细胞生长，酶改性的多糖中除了阿拉伯呋喃糖苷酶基本无效之外，相比未改性多糖，其他几种酶的改性均可以提高抑制效果，特别是果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶的效果尤其突出。 [0055] 使用如实施例1所述的方法测定柚子皮多糖以及酶改性柚子皮多糖的抗氧化效果，结果如图2所示：相比未改性多糖，其他几种酶的改性均可以提高多糖的抗氧化效果。 [0056] 相比洗发水、沐浴露、洗手液等液态日用品，有效物质浓度更高且可以长时间存留与皮肤之上的乳膏剂是发挥柚子皮多糖治疗效果更好的选择，申请人随后使用实施例1中的方法，使用果胶酶酶改性的柚子皮多糖、聚半乳糖醛酸酶酶改性的柚子皮多糖制备了乳膏剂，但在药剂制备中申请人发现，这两种多糖制备的乳膏剂稳定性较差，特别是用量在5％以上时，在实验室中冷藏存放一周左右即容易出现目视可见的液体析出、不均匀等问题。这种情况严重影响了柚子皮多糖的应用范围。 [0057] 实施例4酶改性柚子皮多糖的乳化稳定性考察 [0058] 经过查阅文献，柚子皮多糖在酸性条件下稳定性较好，但在治疗银屑病的乳膏适用的中性或碱性条件下乳化稳定性不佳。因此，申请人扩大的酶法改性多糖的选择范围以寻求乳化稳定性更好的酶改性方法，结果如图3所示，与前面的摸索结果相同，果胶酶酶改性的柚子皮多糖、聚半乳糖醛酸酶酶改性的柚子皮多糖乳化稳定性较差(低于未改性的情况)，而木聚糖酶改性的柚子皮多糖在这方面有着非常好的表现。故将其用于制备乳膏剂。 [0059] 乳膏制备后，正常实验室常温或冷藏存放中基本没有发现目视可见的不稳定现象(标准的药剂学稳定性实验尚未完成)，表明这种多糖具备制备乳膏剂的条件。 [0060] 实施例5柚子皮多糖对银屑病小鼠模型的治疗效果 [0061] 按照实施例1中的记载制备不含柚子皮多糖、含有木聚糖酶改性的柚子皮多糖、含有未改性的柚子皮多糖的乳膏产品；进而按照实施例1中记载的方案进行银屑病小鼠动物模型实验。结果如表2所示： [0062] 表2治疗7日后鼠银屑病模型评分(每组n＝10，均存活) [0063] 第0日平均得分第7日平均得分空白 12.5 9.7 木聚糖酶改性的柚子皮多糖 13.1 3.2 未改性的柚子皮多糖 12.7 6.4 [0064] 结果表明：虽然在抗氧化性上以及细胞模型中效果不及果胶酶等酶改性的多糖，但木聚糖酶改性的，乳化稳定的多糖可以用于制备浓度较高的乳膏剂，在小鼠模型实验中也取得了优于未改性多糖的效果。与同日提交的沐浴露主题申请中的评分结果横向对比，效果也更佳(如果后续证明无明显刺激性，按照实际使用情况，使用后不对乳膏清洗，效果有望进一步增强)。此外，乳膏剂还有体积重量小、便于携带、使用方便的有点[0065] 随后的实际银屑病人试用也显示了该乳膏剂的良好效果，每天使用的病人在一个月内缓解率达到了80％以上。

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