一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法 |
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| 申请号 | CN202310559097.9 | 申请日 | 2023-05-17 | 公开(公告)号 | CN116462780B | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 深圳杉海创新技术有限公司; | 发明人 | 喻文; 张嘉恒; 胡毛乾; 吴称玉; 吴金金; 陈兵洋; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，包括步骤：对制粒得到的灵芝孢子颗粒进行超临界二 氧 化 碳 萃取处理和分离处理，得到灵芝孢子油和脱油灵芝孢子颗粒；向脱油灵芝孢子颗粒中加入DES 水 溶液，经提取处理，得到提取液；向提取液中加入 乙醇 ，经过滤、干燥，得到灵芝多糖。本发明先采用超临界二氧化碳萃取灵芝孢子颗粒中的灵芝孢子油，此时灵芝孢子颗粒结构发生改变，使得颗粒表面产生大量细小孔道，从而增加DES与灵芝孢子颗粒的 接触 面积，可以提高DES萃取灵芝多糖的效率，并且用DES萃取脱油后的灵芝孢子颗粒，可以得到高收率、高纯度的灵芝孢子多糖。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其特征在于，包括步骤： |
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| 说明书全文 | 一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法技术领域[0001] 本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法。 背景技术[0002] 灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属，是赤芝和紫芝的总称，灵芝孢子是灵芝的生殖细胞，近年来因其具有比灵芝更强的药理活性而成为国内外学者研究和开发的热点。灵芝孢子的主要有效成分为多糖类和三萜类化合物。现代临床医学证明灵芝孢子粉中的多糖类化合物和三萜类化合物具有抗肿瘤、抗癌、免疫调节及降血糖等功效。2018年，灵芝被定为食药同源类物质，灵芝中的多糖含量是衡量灵芝质量的重要标准。 [0003] 目前，对灵芝多糖的提取工艺主要以水为溶剂，具体提取方法有酶化法、微波法、超声法、高压提取法、回流提取法和蒸汽爆破法等，此外还有快速溶剂提取法。但是上述方法对于灵芝孢子的提取多为高温环境下提取，这种情况不仅消耗能量高，还容易使得大量天然活性物质失活。 [0004] 对于灵芝三萜类化合物传统的提取溶剂多为醇类，提取方法有加热回流法、超声辅助法、微波辅助法、酶辅助提取法等，此外含有超临界二氧化碳萃取法、亚临界水提取法。但是基于上述方法，利用醇类作为提取溶剂提取灵芝三萜类化合物的提取率较低。 [0005] 因此，现有技术还有待于改进和发展。 发明内容[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，旨在解决现有对灵芝孢子粉有效成分的提取方法耗能大、提取率低等问题。 [0007] 本发明的技术方案如下： [0008] 一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，包括步骤： [0009] 对灵芝孢子粉进行制粒，得到灵芝孢子颗粒； [0010] 对所述灵芝孢子颗粒进行超临界二氧化碳萃取处理，经分离处理后得到灵芝孢子油和脱油灵芝孢子颗粒； [0011] 将氢键供体和氢键受体在预定温度下进行混合后加入水，得到DES水溶液； [0012] 向所述脱油灵芝孢子颗粒中加入所述DES水溶液，经提取处理，得到提取液； [0013] 向所述提取液中加入乙醇，经过滤、干燥，得到灵芝多糖。 [0014] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述灵芝孢子颗粒的尺寸为30目～60目。 [0015] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述超临界二氧化碳萃取处理的萃取温度为35℃～55℃，萃取压力为10MPa～30MPa，萃取时间为2h～5h，超临界二氧化碳的流量为20L/h～40L/h；所述分离处理的温度为30℃～45℃。 [0016] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述氢键供体选自丙三醇、1,3‑丁二醇、1,3‑丙二醇、甘油中的一种或多种；和/或，所述氢键受体选自氯化胆碱、甜菜碱、苦参碱中的一种或多种。 [0017] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:(1～4)。 [0018] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述预定温度为65℃～80℃。 [0019] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述DES水溶液的含水量小于等于60％。 [0020] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述提取处理的时间为1h～4h，所述提取处理的转速为100rpm～800rpm。 [0021] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述脱油灵芝孢子颗粒的质量与所述DES水溶液的体积的比为1g:(10～60)ml。 [0022] 所述的灵芝孢子粉有效成分的提取方法，其中，所述乙醇与所述提取液的体积比为(4～10):1。 [0023] 有益效果：本发明提供一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，包括步骤：对灵芝孢子粉进行制粒，得到灵芝孢子颗粒；对所述灵芝孢子颗粒进行超临界二氧化碳萃取处理，经分离处理后得到灵芝孢子油和脱油灵芝孢子颗粒；将氢键供体和氢键受体在预定温度下进行混合后加入水，得到DES水溶液；向所述脱油灵芝孢子颗粒中加入所述DES水溶液，经提取处理，得到提取液；向所述提取液中加入乙醇，经过滤、干燥，得到灵芝多糖。本发明先采用超临界二氧化碳萃取灵芝孢子颗粒中的灵芝孢子油，此时灵芝孢子颗粒结构发生改变，使得颗粒表面产生大量细小孔道，从而增加DES与灵芝孢子颗粒的接触面积，可以提高DES萃取灵芝多糖的效率，并且用DES萃取脱油后的灵芝孢子颗粒，可以得到高收率、高纯度的灵芝孢子多糖，采用该提取方法得到的两类产物均具有较高的经济价值和药用价值，达到了充分利用灵芝孢子粉有效充分的目的；同时，为天然植物中有效成分的分离与纯化提供了一种绿色高效、操作简单、适用于商业化应用的有效方法。附图说明 [0024] 图1为本发明一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法的工艺流程图； [0025] 图2为超临界萃取中压力对灵芝孢子油提取率的影响数据图； [0026] 图3为SCFE‑DES联用萃取中温度对灵芝多糖提取率的影响数据图； [0027] 图4为不同工艺提取灵芝孢子颗粒中灵芝多糖的结果数据图； [0028] 图5为灵芝孢子颗粒萃取前后扫描电镜图； [0029] 图6为DPPH自由基清除实验结果数据图。 具体实施方式[0030] 本发明提供一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0031] 本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。 [0032] 目前，对灵芝多糖的提取工艺主要以水为溶剂；例如：胡瑞财(中国食用菌，2021，40(7)：47‑51)等以林下栽培的灵芝子实体为试验材料，探究热水浸提法提取灵芝子实体多糖的最佳工艺条件，结果表明灵芝子实体中多糖的最佳提取时间为68.3min，最佳提取温度为84.6℃，料液比为1:34.5，在此条件下，多糖提取率可达1.88％。胡灵(浙江工业大学学报，2011，39(2)：140‑145.)等利用微波法，采取四因素三水平响应面的分析方法，结果表明利用微波法提取灵芝多糖的最佳提取时间为20min，最佳提取功率为400W，提取温度为90℃，料液比为20:1(mL/g)，此时灵芝多糖的提取率为1.15％。翟旭峰等(现代食品科技， 2012，28(12)：1704‑1708，1773.)利用响应面分析的方法采用超声波提取灵芝多糖，试验表明优化后的工艺为超声功率320W，提取的时间为34min，提取温度为70℃，灵芝多糖的提取率为2.78％。但是，上述文献中对于灵芝孢子的提取多为高温环境下提取，这种情况消耗能量高，还容易使得大量天然活性物质失活，且提取率较低。 [0033] 对于灵芝三萜类化合物传统的提取溶剂多为醇类；例如：王石磊等(山东化工，2018，47(24)：13‑15)选取云南文山产的竹灵芝作为研究对象，考察乙醇浓度、温度、料液比、提取时间等不同提取条件对灵芝中三萜类成分提取得率的影响，再利用正交试验法优化提取条件，最终确定最佳提取条件为：乙醇浓度100％，料液比1:20，浸提温度40℃，提取时间20min，提取得率达1.8％。丁霄霄等(食品工业，2018，39(8)：40‑44)以灵芝子实体为原料，在酶解时间、酶解温度和酶解pH单因素试验的基础上，利用响应面法优化复合酶酶(纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶)提取灵芝总三萜的工艺条件。提取得率为1.29％± 0.04％。梁磊等(菌物学报,2017,36(4):512‑521)探索了微波超声协同提取灵芝三萜的提取工艺及提取产物的抗氧化活性。在单因素实验的基础上，通过响应面优化试验后得到最优提取率为13.18mg/g，灵芝酸A含量为2.5mg/g。但是以多醇为提取溶剂对灵芝孢子粉中的灵芝三萜类化合物进行提取，不但提取率低，而且工艺较为复杂。 [0034] 近年来研究主要集中在灵芝子实体、菌丝体及其孢子活性成分定性定量、药理活性等方面。目前还没有针对灵芝孢子油和和多糖化合物这两种极性差异较大的有效成分的萃取的报道，因此，有必要开发一种绿色环保、简单高效的萃取方法。 [0035] 基于此，如图1所示，本发明提供一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，包括步骤： [0036] 步骤S10：对灵芝孢子粉进行制粒，得到灵芝孢子颗粒； [0037] 步骤S20：对所述灵芝孢子颗粒进行超临界二氧化碳萃取处理，经分离处理后得到灵芝孢子油和脱油灵芝孢子颗粒； [0038] 步骤S30：将氢键供体和氢键受体在预定温度下进行混合后加入水，得到DES水溶液； [0039] 步骤S40：向所述脱油灵芝孢子颗粒中加入所述DES水溶液，经提取处理，得到提取液； [0040] 步骤S50：向所述提取液中加入乙醇，经过滤、干燥，得到灵芝多糖。 [0041] 本实施方式中，利用超临界二氧化碳萃取(SCFE)与低共熔溶剂(DES)联用的方式提取灵芝孢子粉中的有效成分，不但绿色环保、操作简单、提取率高且纯度高，还可以充分利用灵芝孢子粉中的孢子油和灵芝多糖；进一步地，超临界二氧化碳萃取技术萃取灵芝孢子颗粒，得到灵芝孢子油，不但提取率高，并且具有较高的经济价值和药用价值，达到了充分利用灵芝孢子粉有效成分的目的；同时，所述灵芝孢子颗粒经过超临界二氧化碳萃取后，得到的脱油灵芝孢子颗粒的结构发生改变，颗粒表面产生大量的细小孔道，从而在利用DES水溶液对所述脱油灵芝孢子颗粒进行提取时，增加了DES与颗粒的接触面积，从而提高DES萃取灵芝多糖的效率。进一步地，低共熔溶剂(Deep eutectic solvent，DES)作为绿色溶剂在天然产物提取方面具有巨大的应用潜力，其具有低毒、环保、可回收、结构和性能可调节等特点；因此，本实施例利用超临界萃取与低共熔溶剂联用的方式提取灵芝孢子粉中的有效成分，不但具有绿色环保高效的优势，且提取的多糖具有较强的抗氧化活性，对多糖的提取和应用具有重要意义。 [0042] 具体地，本发明提高灵芝多糖提取率的原理包括：一方面，利用超临界CO2破坏灵芝孢子的结构，促进溶剂与孢子细胞壁中的有效成分接触；另一方面，利用超临界CO2萃取技术提取灵芝孢子油(脱油处理)，减少灵芝孢子颗粒中的油脂类化合物(约占20‑30％)，有利于溶剂对多糖化合物的提取，从而提升多糖提取效率。进一步地，采用超临界CO2萃取，不仅进行了脱油，而且破坏了结构，两者共同促使多糖提取效率提高，提取率增加了2‑3倍。同时，不同于水溶剂提取，在以低共熔溶剂提取时，灵芝多糖的主要成分含有大量羟基和羧基，能够与低共熔溶剂分子间形成氢键作用，从而提高萃取性能，并增强选择性。通过工艺优化，不仅提升了灵芝孢子油的提取率，而且得到高收率、高纯度的灵芝多糖类化合物，实现充分利用灵芝孢子粉有效成分和绿色环保生产的目的。 [0043] 在一些实施方式中，所述灵芝孢子颗粒的尺寸为30目～60目；将所述灵芝孢子颗粒的尺寸控制在30目～60目，可以提高从灵芝孢子颗粒中提取灵芝孢子油的提取率，且有利于颗粒结构发生改变，为后续利用低共熔溶剂提取脱油灵芝孢子颗粒中的灵芝多糖起到促进作用。 [0044] 在一些实施方式中，所述步骤S10中，对灵芝孢子粉进行制粒具体包括步骤：将灵芝孢子粉与水进行混合搅拌后，进行真空干燥制粒、过筛，得到所述灵芝孢子颗粒。先对灵芝孢子粉进行制粒得到灵芝孢子颗粒后，再进行超临界二氧化碳萃取处理，可以更有利于灵芝孢子油的提取，并且形成表面多孔结构的脱油灵芝孢子颗粒。 [0045] 在一些实施方式中，所述超临界二氧化碳萃取处理的萃取温度为35℃～55℃，萃取压力为10MPa～30MPa，萃取时间为2h～5h，超临界二氧化碳的流量为20L/h～40L/h；所述分离处理的温度为30℃～45℃；在该萃取参数范围和分离温度下，可以使得灵芝孢子油高效地从灵芝孢子颗粒中萃取出来，从而实现灵芝孢子油的提取，并且得到表面具有细小孔道的脱油灵芝孢子颗粒。 [0046] 在一些优选地实施方式中，所述超临界二氧化碳萃取处理的萃取温度为45℃，萃取压力为25MPa，萃取时间为2.5h，超临界二氧化碳的流量为30L/h；所述分离处理的温度为35℃；在该条件下，灵芝孢子油的提取率达到最高，高达34.22％。 [0047] 在一些实施方式中，所述氢键供体选自但不限于丙三醇、1,3‑丁二醇、1,3‑丙二醇、甘油等多元醇中的一种或多种；和/或，所述氢键受体选自但不限于氯化胆碱、甜菜碱、苦参碱中的一种或多种；采用上述类型的氢键供体和氢键受体在预定温度下混合可以得到低共熔溶剂，其具有绿色环保高效的优势，且提取的多糖具有较强的抗氧化活性。 [0048] 在一些实施方式中，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:(1～4)；按该摩尔比将所述氢键受体与所述氢键供体在预定温度下进行混合后，可以使得所述氢键受体与所述氢键供体相互结合，得到具有绿色环保高效的DES，提高萃取脱油灵芝孢子颗粒中灵芝多糖的提取率。 [0049] 在一些实施方式中，所述预定温度为65℃～80℃；在65℃～80℃下将所述氢键受体与所述氢键供体进行混合，可以使得所述氢键受体与所述氢键供体较好的结合，得到DES。 [0050] 在一些优选地实施方式中，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:1，所述预定温度为75℃；按摩尔比为1:1将所述氢键受体与所述氢键体在75℃下进行充分混合搅拌，可以生成透明均一的低共熔溶剂(DES)。 [0051] 在一些实施方式中，所述DES水溶液的含水量小于等于60％，控制所述DES水溶液的含水量小于等于60％，可以使得所述DES水溶液从所述脱油灵芝孢子颗粒中提取出较多的多糖类化合物，即提高灵芝多糖的提取率；并且，提取得到的灵芝多糖纯度较高。 [0052] 在一些实施方式中，所述提取处理的时间为1h～4h，所述提取处理的转速为100rpm～800rpm；向所述脱油灵芝孢子颗粒中加入所述DES水溶液，然后在转速为100rpm～ 800rpm下处理1h～4h进行充分搅拌，可以使得所述DES水溶液充分地与所述脱油灵芝孢子颗粒进行接触，并且使得所述DES水溶液渗入到所述脱油灵芝孢子颗粒表面的细小孔道内，提高所述DES水溶液对所述脱油灵芝孢子颗粒的多糖类化合物的提取率。 [0053] 在一种优选地实施方式中，所述提取处理的时间为2h，所述提取处理的转速为700rpm。 [0054] 在一些实施方式中，所述脱油灵芝孢子颗粒的质量与所述DES水溶液的体积的比为1g:(10～60)ml；按该料液比将所述脱油灵芝孢子颗粒与所述DES水溶液进行混合后，经提取处理，可以使得所述DES水溶液萃取出较多的多糖类化合物。 [0055] 在一些实施方式中，所述步骤S40中，所述提取处理在65‑80℃下进行，在此温度区间内能够缩短灵芝多糖提取时间，提高灵芝多糖的提取效率；经所述提取处理后，还包括离心过滤处理，得到单一的提取液。 [0056] 在一些实施方式中，所述乙醇与所述提取液的体积比为(4～10):1；利用醇沉法，通过向所述提取液中加入乙醇，可以使得提取液中的多糖类化合物沉淀下来，然后经过过滤和干燥即可得到灵芝多糖，采用该方法得到的灵芝多糖纯度较高，含量大于85％，具有很强的抗氧化活性。 [0058] 本实施方式中，采用超临界萃取联用DES萃取的灵芝多糖提取率是采用有机溶剂(乙酸乙酯、正己烷等用于提取油脂化合物的弱极性溶剂)与DES联用萃取的灵芝多糖提取率的2‑3倍，最高提取率可达27.57％；进一步地，利用超临界二氧化碳萃取技术萃取灵芝孢子粉中的灵芝孢子油，再用DES萃取脱油后的灵芝孢子颗粒，可以得到高收率、高纯度的灵芝孢子多糖，所得到两类产物均具有较高的经济价值和药用价值，达到了充分利用灵芝孢子粉有效充分的目的，为天然植物中有效成分的分离与纯化提供了一种绿色高效、操作简单、适用于商业化应用的有效方法。 [0059] 下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。 [0060] 实施例1 [0061] 称取灵芝孢子颗粒637.23g加入超临界萃取釜中，设置萃取温度45℃，萃取压力30MPa，分离温度35℃，萃取时间3h，SC‑CO2流量为25L/h，得到灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒，灵芝孢子油提取率为31.52％；精准称取氯化胆碱13.962g，丙三醇18.418g，将其加入烧杯中70℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入16.19g水得到均匀DES水溶液； 取90mL DES水溶液，加入3g脱油后的灵芝孢子颗粒，在65℃、500rpm下萃取3h，得到提取液 85mL；向提取液中加入200mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，经过滤、干燥得到灵芝多糖，多糖提取率为27.57％。 [0062] 实施例2 [0063] 称取灵芝孢子颗粒503.17g加入超临界萃取釜中，设置萃取温度45℃，萃取压力25MPa，分离温度35℃，萃取时间2.5h，SC‑CO2流量为30L/h，得到灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒，灵芝孢子油提取率为34.22％；精准称取氯化胆碱13.962g，丙三醇18.418g，将其加入烧杯中75℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入16.19g水得到均匀DES水溶液；取40mL DES水溶液，加入1g脱油后的灵芝孢子颗粒，在60℃、700rpm下萃取2h，得到提取液35mL；向提取液中加入175mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，经过滤、干燥得到灵芝多糖，多糖提取率为21.85％。 [0064] 实施例3 [0065] 称取灵芝孢子颗粒847.46g加入超临界萃取釜中，设置萃取温度40℃，萃取压力20MPa，分离温度35℃，萃取时间3h，SC‑CO2流量为35L/h，得到灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒，灵芝孢子油提取率为32.61％；精准称取氯化胆碱13.962g，丙三醇18.418g，将其加入烧杯中75℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入32.38g水得到均匀DES水溶液； 取40mL DES水溶液，加入1g脱油后的灵芝孢子颗粒，在55℃、500rpm下萃取3h，得到提取液 35mL；向提取液中加入175mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，经过滤、干燥得到灵芝多糖，多糖提取率为17.50％。 [0066] 实施例4 [0067] 称取灵芝孢子颗粒503.17g加入超临界萃取釜中，设置萃取温度40℃，萃取压力15MPa，分离温度35℃，萃取时间2.5h，SC‑CO2流量为25L/h，得到灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒，灵芝孢子油提取率为23.84％；精准称取氯化胆碱139.62g，丙三醇184.18g，将其加入烧杯中80℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入161.9g水得到均匀DES水溶液；取150mL DES水溶液，加入3g脱油后的灵芝孢子颗粒，在70℃、500rpm下萃取3h，得到提取液140mL；向提取液中加入560mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，经过滤、干燥得到灵芝多糖，多糖提取率为17.96％。 [0068] 实施例5 [0069] 称取灵芝孢子颗粒499.21g加入超临界萃取釜中，设置萃取温度45℃，萃取压力10MPa，分离温度35℃，萃取时间2.5h，SC‑CO2流量为40L/h，得到灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒，灵芝孢子油提取率为13.84％；精准称取氯化胆碱13.962g，丙三醇18.418g，将其加入烧杯中75℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入16.19g水得到均匀DES水溶液；取40mL DES水溶液，加入1g脱油后的灵芝孢子颗粒，在75℃、500rpm下萃取3h，得到提取液35mL；向提取液中加入175mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，经过滤、干燥得到灵芝多糖，多糖提取率为14.43％。 [0070] 实施例6 [0071] 精准称取氯化胆碱27.924g，丙三醇36.836g，将其加入烧杯中75℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂；取50mL低共熔溶剂，加入1g灵芝孢子颗粒，在75℃、500rpm下萃取3h，得到取提取液35mL；向提取液中加入175mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，多糖提取率为9.88％。 [0072] 实施例7 [0073] 称取灵芝孢子颗粒10g加入乙酸乙酯300mL，35℃、700rpm下脱油处理12h，收集灵芝孢子油和脱油后的灵芝孢子颗粒；精准称取氯化胆碱13.962g，丙三醇18.418g，将其加入烧杯中75℃，300rpm搅拌得到低共熔溶剂，在其中加入32.38g水得到均匀DES水溶液；取90mL DES水溶液，加入3g脱油后的灵芝孢子颗粒，在65℃、500rpm下萃取3h，得到取提取液 85mL；向提取液中加入175mL乙醇，充分搅拌均匀，沉积多糖化合物，多糖提取率为10.52％。 [0074] 实施例8 [0075] 以95％乙醇为基础溶液配置0.12mg/mL的DPPH溶液，以95％乙醇为空白溶液，分别以实施例2的灵芝孢子油、实施例1的SCFE‑DES提取物、实施例7的EA提取物和DES提取物为样品。以96孔酶标板为反应容器，设定样品管(T)，样品空白(T0)，溶剂管(C)，溶剂空白管(C0)，在所有试管中加入95％乙醇100μL，T和T0管加入100μL上述四种样品，C，C0管加入100μL的95％乙醇混合均匀，在T，C管中加入DPPH乙醇溶液50μL，在T0，C0管中加入50μL95％乙醇，将填装好的酶标板放入酶标仪中，执行设定流程，震荡5min，静置15min，在517nm处利用五点法测定吸光度值，求取平均值记为该点吸光度值，利用吸光度值根据公式1计算得到样品的DPPH自由基清除率。 [0076] [0077] 公式中： [0078] T‑样品管吸光度，即样品与DPPH反应后溶液的吸光度值； [0079] T0‑样品本底吸光度值； [0080] C‑溶剂管吸光度值，未加样品时DPPH吸光度值； [0081] C0‑溶剂本底吸光度值。 [0082] 实施例1‑5的实验结果如图2、图3所示，从图2中可以发现，随着压力升高，灵芝孢子油的提取率逐步增加，在25MPa时达到最高34.22％，说明调控压力可以有效地提高灵芝孢子油的提取率。从图3中能够发现，在55℃到75℃的提取温度区间内，灵芝多糖的提取率先升高后降低，在65℃时达到峰值。 [0083] 实施例1、6、7中不同萃取工艺对灵芝多糖的提取结果如图4所示，对比低共熔溶剂提取工艺(DES)、乙酸乙酯‑低共熔溶剂联用工艺(EA‑DES)和超临界萃取低共熔溶剂联用(SCFE‑DES)工艺提取灵芝多糖的结果发现，采用SCFE‑DES工艺的多糖提取率分别是DES提取工艺的2.8倍和EA‑DES提取工艺的2.6倍，证明采用SCFE工艺进行灵芝孢子颗粒脱油处理，能够促进DES工艺高效地提取灵芝多糖，且提取结果明显优于使用EA脱油后再用DES提取多糖的结果。 [0084] 实施例1、6、7中收集的灵芝孢子颗粒的SEM图如图5所示，其中，图5中的A为灵芝孢子颗粒，B为乙酸乙酯脱油后的灵芝孢子颗粒，C为超临界萃取后的灵芝孢子颗粒，D为DES萃取后的灵芝孢子颗粒，E为乙酸乙酯‑DES萃取后的灵芝孢子颗粒，F为SCFE‑DES萃取后的灵芝孢子颗粒。 [0085] 由图5中的A和B可以发现，经过乙酸乙酯(EA)萃取后的灵芝孢子颗粒外观形貌未发生明显变化，由图5中的A和C发现，经超临界萃取后的灵芝孢子颗粒结果发生明显改变，颗粒表面产生大量细小孔道，进而增加DES与灵芝孢子颗粒的接触面积，提高DES萃取灵芝多糖的效率。因此采用SCFE‑DES联用工艺可以显著提升灵芝多糖的提取率。 [0086] 实施例8中不同萃取工艺的提取物的DPPH自由基清除率实验结果如图6所示。采用超临界萃取法提取的灵芝孢子油的DPPH自由基清除率高达93.59％，远高于EA提取的灵芝孢子油的DPPH自由基清除率(33.45％)，说明超临界萃取法对灵芝孢子油的提取效率更高，得到的灵芝孢子油更多。同时，对比SCFE‑DES工艺与EA‑DES工艺的提取物的DPPH自由基清除率发现，SCFE‑DES工艺得到的提取物的DPPH自由基清除率为98.96％，远高于使用EA‑DES工艺时的结果(63.39％)。对提取的两种活性成分的DPPH自由基清除率实验结果都证明，SCFE‑DES联用工艺具有远高于其他工艺的产物的收率以及抗氧化能力，对灵芝孢子中有效成分的利用更加充分，不仅提高其经济利用价值，而且生产工艺绿色环保。 [0087] 综上所述，本发明提供的一种灵芝孢子粉有效成分的提取方法，包括步骤：对灵芝孢子粉进行制粒，得到灵芝孢子颗粒；对所述灵芝孢子颗粒进行超临界二氧化碳萃取处理，经分离处理后得到灵芝孢子油和脱油灵芝孢子颗粒；将氢键供体和氢键受体在预定温度下进行混合后加入水，得到DES水溶液；向所述脱油灵芝孢子颗粒中加入所述DES水溶液，经提取处理，得到提取液；向所述提取液中加入乙醇，经过滤、干燥，得到灵芝多糖。本发明先采用超临界二氧化碳萃取灵芝孢子颗粒中的灵芝孢子油，此时灵芝孢子颗粒结构发生改变，使得颗粒表面产生大量细小孔道，从而增加DES与灵芝孢子颗粒的接触面积，可以提高DES萃取灵芝多糖的效率，并且用DES萃取脱油后的灵芝孢子颗粒，可以得到高收率、高纯度的灵芝孢子多糖，采用该提取方法得到的两类产物均具有较高的经济价值和药用价值，达到了充分利用灵芝孢子粉有效充分的目的；同时，为天然植物中有效成分的分离与纯化提供了一种绿色高效、操作简单、适用于商业化应用的有效方法。 |
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