一种可注射水凝胶/纳米凝胶载药缓释体系及其制备方法和用途 |
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| 申请号 | CN202211392431.8 | 申请日 | 2022-11-08 | 公开(公告)号 | CN115990134B | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 四川大学华西医院; | 发明人 | 王玉; 王云兵; 孔清泉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种可注射 水 凝胶/纳米凝胶载药缓释体系及其制备方法和用途，属于 生物 医药领域。本发明提供了一种可注射、可自增强、具有 炎症 响应特性以及抗炎抗 氧 化作用的水凝胶，以及一种具有MMP‑2响应性能miRNA载体，然后将可注射水凝胶与miRNA载体相结合，最终构建一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化 给药 的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎抗氧化和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的 风 险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种纳米凝胶，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成： |
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| 说明书全文 | 一种可注射水凝胶/纳米凝胶载药缓释体系及其制备方法和用途 技术领域背景技术[0002] 随着社会老龄化的不断加重，脊柱退变性疾病(如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症等)发病率不断增高，腰腿痛已成为发病率最高的疼痛性疾病之一。据报道，全球腰腿痛患病率高达12％；一项WHO调查显示，37％的青少年每月会至少出现一次腰痛。脊柱的退变是源于椎间盘的退变(变性、失水)，椎间盘由内部的髓核和周围包围的纤维环组成。随着脊柱退变性疾病的不断进展，常规保守治疗仅能部分缓解临床症状，大部分患者不得不最终接受手术治疗。虽然目前针对脊柱退变性疾病的手术方式众多，并且不断趋近微创化，但无论何种手术方式都无法克服如手术损伤、术后复发、邻近节段退变加速、远期疗效不确切等问题，这无疑给个人和社会带来沉重的经济、社会负担。针对椎间盘退变初期的患者，尤其是仅表现为盘源性腰痛的患者，如果能通过某种方式延缓甚至逆转椎间盘退变进程，将从源头上减少脊柱退变性疾病的发生。随着生物工程技术的发展，通过髓核组织工程技术，实现椎间盘髓核再生、修复已成为可能。 [0003] 通过构建可以作为细胞和生物大分子(药物、细胞因子、miRNA等)转运载体的髓核替代生物诱导支架材料，结合再生医学为代表的生物医学工程技术，使退变髓核组织再生成为可能。髓核生物医学工程策略的目标是抑制内部炎症反应、促进髓核细胞再生、恢复ECM合成/分解代谢平衡，最终真正恢复椎间盘的生理功能并满足生物力学需求。在这个过程中，髓核替代支架材料的选择处于核心地位。理想的髓核替代支架材料除了具有常规生物材料必须的性能外(如良好的生物安全性和可降解性、与天然髓核相似的生物力学特性、可注射性)，还应能够适应髓核内部微环境变化并智能调控其生物学活性。但是大量研究结果显示，由于椎间盘内组织结构复杂、血供极差、力学环境复杂，现有材料如天然材料：脱细胞基质、藻酸盐、多肽水凝胶，以及人工合成材料：透明质酸、PLGA等，都不能很好地满足体外功能化髓核的构建要求。在国际上，已有大量科学家通过一些包括纤维蛋白凝胶(GelfoamTM)，透明质酸海绵( HYAFF)以及多肽水凝胶 等在内的可以搭载细胞生长的髓核替代支架材料产品进行临床前期研究，但是仍然没有一款成熟的功能化髓核内药物递送产品应用于临床。 [0004] 近年来，人们不断的尝试利用微球、纳米胶束、外泌体、脱细胞基质等递药体系作为髓核替代支架材料，但由于缺乏力学属性、制备工艺复杂、原材料昂贵等局限，始终无法满足上述全部需求。水凝胶材料近年来持续受到关注，并广泛应用于各种组织修复领域。可注射水凝胶固有的渗透性、吸水性、可降解性、良好的生物相容性，以及巨大的载药控释能力和力学支撑潜力，在髓核替代支架材料的选择中具有巨大的应用潜力。然而，可注射水凝胶作为药物递送载体应用于椎间盘再生存在注射后水凝胶材料外渗的潜在风险。因此，需要研究一种可注射性好，并且注射后可以自增强的水凝胶。同时，该水凝胶最好能够具有pH和ROS双响应的炎症响应特性，可以迅速对炎症微环境的变化和刺激进行感知和响应，精准可控的将药物释放于疾病部位。 [0005] 此外，MicroRNA(miRNA)是一类由18‑24个核苷酸序列组成的小型非编码RNA，广泛存在于真核生物中，并参与基因调节。成熟的miRNA在细胞质中引导RISC复合体(miRISC)靶向3’‑UTR区域中带有部分互补序列的mRNA，导致转录沉默或mRNA降解，进而调控细胞的多种生理活动。miRNA调节失衡在椎间盘退变的发生过程中扮演着重要角色。大量的研究表明，多种miRNAs表达异常将导致髓核内部细胞炎症、ECM降解、髓核细胞凋亡等，并通过不同作用机制加速椎间盘髓核退变。因此，寻找并探索miRNAs作用靶点和规律，并通过miRNAs基因治疗的方法调节髓核细胞功能，在退变椎间盘髓核修复中具有巨大的应用前景。 [0006] miRNAs基因治疗可根据miRNAs自身表达情况分为miRNAs缺乏时的miRNA替代疗法以及过表达时的miRNA抑制疗法。然而，无论哪种方法，如何将外源miRNA或miRNA抑制剂精准、稳定的转运到靶区域是miRNA基因治疗退变髓核成败的关键。基于椎间盘内无血管的特殊结构特点，以及miRNAs全身递送的诸多局限(如靶器官外异常聚集、靶器官局部低生物活性及多次用药等)，miRNAs全身递送的方法并不适用于髓核的miRNAs基因治疗。然而，由于椎间盘髓核特殊的封闭结构，单纯局部注射miRNAs又会导致局部浓度过高、转染效率不足、清除率过快等一系列问题。目前miRNA载体又存在装载效率不足、不稳定、制备复杂、生物免疫原性和无法实现智能长效缓释等不足。因此，寻找一种适合椎间盘盘内局部递送miRNAs的转运载体，并结合炎症响应型水凝胶共同构建智能miRNAs递药系统，在退变髓核miRNAs基因治疗中具有重大的科学意义。 发明内容[0007] 本发明的目的是提供一种可注射水凝胶/纳米凝胶载药缓释体系及其制备方法和用途。 [0008] 本发明提供了一种纳米凝胶，它是由如下重量配比的原料制备而成： [0010] 进一步地，前述的纳米凝胶是由如下重量配比的原料制备而成： [0011] 单(6‑氨基‑6‑去氧)β环糊精4份、MMP‑2响应型多肽10份、氧化葡聚糖10份。 [0012] 进一步地，所述MMP‑2响应型多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0013] 本发明还提供了前述的纳米凝胶的制备方法，它包括如下步骤： [0014] 将单(6‑氨基‑6‑去氧)β环糊精和MMP‑2响应型多肽溶于溶剂中，加入氧化葡聚糖，搅拌后而得； [0015] 优选地，将单(6‑氨基‑6‑去氧)β环糊精和MMP‑2响应型多肽溶于溶剂中，滴加氧化葡聚糖，剧烈搅拌后将溶液再加入溶剂中，继续搅拌，透析，过滤，离心、冻干后得到纳米凝胶； [0016] 更优选地，所述溶剂为PBS。 [0017] 本发明还提供了前述的纳米凝胶作为mRNA载体中的用途。 [0018] 本发明还提供了一种载microRNA的纳米凝胶，它是由如下重量配比的原料制备而成： [0019] 前述的纳米凝胶1～20份、microRNA 1份； [0020] 优选地， [0021] 前述的纳米凝胶5～20份、microRNA 1份； [0022] 更优选地，所述microRNA为antagomir‑21。 [0023] 本发明还提供了一种载microRNA的纳米凝胶的制备方法，它包括如下步骤：将纳米凝胶和microRNA在溶剂中混合搅拌后而得。 [0024] 本发明还提供了一种水凝胶前驱体，它含有如下重量分数的组分： [0026] 优选地，它含有如下重量分数的组分： [0027] 接枝苯硼酸的羧甲基壳聚糖6份、接枝3,4,5羟基苯甲醛的明胶10份、丙炔酸改性的聚乙二醇分子8份、水880份。 [0028] 进一步地，所述接枝苯硼酸的羧甲基壳聚糖是按照如下方法制备而成： [0029] 在羧甲基壳聚糖和3‑醛基苯硼酸中加入还原剂后在溶剂中反应得到羧甲基壳聚糖接枝的苯硼酸； [0030] 和/或，所述接枝3,4,5羟基苯甲醛的明胶是按照如下方法制备而成： [0031] 在明胶和3,4,5‑羟基苯甲醛中加入还原剂后在溶剂中反应得到接枝3,4,5羟基苯甲醛； [0032] 和/或，所述丙炔酸改性的聚乙二醇分子是按照如下方法制备而成： [0033] 将聚乙二醇、丙炔酸和催化剂溶于有机溶剂中，反应得到丙炔酸改性的聚乙二醇分子； [0034] 优选地， [0035] 所述接枝苯硼酸的羧甲基壳聚糖是按照如下方法制备而成： [0036] 在羧甲基壳聚糖水溶液中加入3‑醛基苯硼酸DMSO溶液，然后加入还原剂反应得到羧甲基壳聚糖接枝的苯硼酸； [0037] 和/或，所述接枝3,4,5羟基苯甲醛的明胶是按照如下方法制备而成： [0038] 在明胶水溶液中加入3,4,5‑羟基苯甲醛DMSO溶液，然后加入还原剂反应得到接枝3,4,5羟基苯甲醛。 [0039] 进一步地， [0040] 所述羧甲基壳聚糖、3‑醛基苯硼酸和还原剂的质量比为1：(0.1～1)：(0.1～1)； [0041] 和/或，所述明胶、3,4,5‑羟基苯甲醛和还原剂的质量比为1：(0.1～1)：(0.1～1)； [0042] 和/或，所述聚乙二醇、丙炔酸和催化剂的质量比为1：(0.1～1)：(0.01～0.1)； [0044] 进一步地，前述的水凝胶前驱体还含有如下重量份数的组分： [0045] 前述的载microRNA的纳米凝胶0.001～0.005份； [0046] 优选地，它还含有如下重量份数的组分： [0047] 前述的载microRNA的纳米凝胶0.001～0.002份。 [0048] 本发明还提供了一种水凝胶，它是前述的水凝胶前驱体固化反应而成。 [0049] 进一步地，所述固化反应的条件是在20～30℃静置。 [0050] 本发明还提供了前述的水凝胶在制备退变髓核修复材料中的用途。 [0051] 进一步地，所述退变髓核修复材料是髓核替代材料和/或促髓核再生材料。 [0052] 本发明中，MMP‑2响应型多肽是指对MMP‑2(基质金属蛋白酶‑2)的刺激做出相应响应的多肽，其序列为GCRDVPMS‑MRGGDRCG(SEQ IDNO.1)。 [0053] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： [0054] (1)为了解决髓核替代支架材料的问题，本发明设计了一种自增强的水凝胶体系，即“以弱机械强度”的水凝胶状态注射到椎间盘内部后，自我增强其机械强度，最终达到一种“较强机械强度”的水凝胶状态。这种成胶时间和机械强度可调的水凝胶构建模式，将很好的用于椎间盘再生中，具有防止渗漏及增强脊柱稳定性的作用。该水凝胶还具有pH和ROS双响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物，实现智能给药。同时，本发明水凝胶还具有良好的抗氧化性能和抗炎性能，有利于抑制退变髓核进程，促进退变髓核修复。 [0055] (2)为了解miRNA转运载体的问题，本发明设计了一种能够对MMP‑2响应的纳米凝胶载药颗粒。同时，该纳米凝胶装载胆固醇修饰的miRNA药物时，是miRNA药物中的胆固醇分子与环糊精分子(CD)主客体自组装而形成的，这种自组装作用是物理的相互作用形式，是较弱的作用力，也是可逆的。本发明miRNA转运载体有利于miRNA药物智能缓释给药，促进ECM再生。 [0056] (3)本发明将纳米凝胶载药颗粒装载在自增强的水凝胶体系中，最终构建出一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的椎间盘内miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎抗氧化和促进ECM再生的效果，具有优异的促进退变髓核再生、修复的功效。 [0057] (4)本发明水凝胶递送体系缓释miRNA药物(如miRNA‑21抑制剂antagomir‑21)的机制为：①水凝胶对椎间盘内的炎性环境(低pH和高ROS)响应，智能裂解释放出纳米凝胶载药颗粒；②纳米凝胶载药颗粒在MMP‑2存在下智能裂解；③miRNA药物自发缓慢的从Ox‑Dex‑CD中释放出来。 [0058] 综上，本发明首先提供了一种可注射水凝胶，该可注射水凝胶植入退变髓核内部后可以自发的增强自身模量，起到充分填充和避免渗漏的作用，同时该水凝胶具有很强的抗炎抗氧化作用，可促进退变髓核的修复。此外，本发明可注射水凝胶具有pH和ROS双响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物。其次，本发明提供了一种可以载miRNA的纳米凝胶载药颗粒，该纳米凝胶可在MMP‑2存在下智能裂解，释放可以促ECM再生的药物，促进退变髓核修复。本发明将可注射水凝胶与载miRNA的纳米凝胶相结合，最终构建一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎抗氧化和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的风险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。 [0060] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明 [0061] 图1为NG@antagomir‑21的理化特性结果；其中，A为NG@antagomir‑21合成流程示1 意图；B为NG及CD‑NH2的H NMR谱；C为PBS中纳米凝胶直径随时间变化图；D为PBS中加入MMP‑ 2前后的纳米凝胶的粒度分布；E为纳米凝胶的大小和zeta电位值；F为纳米凝胶的SEM扫描结果(比例尺，100nm)；G为纳米凝胶的TEM扫描结果(比例尺，100nm)；H为封装在NG中的Cy3‑antagomir‑21引起了Cy3荧光的猝灭；I为电泳迁移率偏移分析研究NG与antagomir‑21之间的相互作用结果；J为电泳迁移验证NG对antagomir‑21的保护作用结果；K为antagomir‑21在不同条件下从纳米凝胶中释放曲线图；图中，*P<0.05,**P<0.01,n＝3。 [0062] 图2为水凝胶的理化特性结果：其中，A为水凝胶合成过程和自增强机制的示意图；1 B为CMC和CMC‑BA、Gel及Gel‑TB的 H NMR谱；C为CMC和CMC‑BA、Gel及Gel‑TB的FTIR光谱；D为水凝胶合成及自增强过程的照片；E为不同状态(statusI和II)SEM扫描结果图；F为StatusI时水凝胶的可注射性及自愈性示意图；G为statusII时水凝胶炎症响应及组织粘附能力示意图。 [0063] 图3为水凝胶的流变性能及基因缓释效果检测结果；其中，A为不同状态下(statusI和II)水凝胶的频率扫描结果；B为不同状态下(statusI和II)水凝胶振幅扫描结果；C为不同状态下(statusI和II)水凝胶剪切变稀及自愈结果；D为通过共聚焦显微镜观察水凝胶中cy3‑antagomir‑21荧光分布结果；E为水凝胶在不同条件下自我降解速率；F为在各种条件下从水凝胶中释放antagomir‑21的结果；G为注射入椎间盘后cy3‑antagomir‑21水凝胶的实时荧光成像和Living Image计算的半定量分析结果。 [0064] 图4为髓核细胞转染及水凝胶生物相容性检测结果；其中，A为通过Cy3免疫荧光(标尺，20μm)观察不同条件下培养髓核细胞(NPC)的Cy3‑antagomir‑21转染，(+)代表加入MMP‑2；B为不同组NPC细胞内cy3荧光强度定量分析结果；C为不同浓度NG@antagomir‑21与L929细胞共培养时，细胞活性比较；D为通过RT‑PCR检测不同干预后NPCmiRNA‑21表达情况；E为用水凝胶处理24和48小时后L929细胞的存活率及F为活死染色结果；G为水凝胶清除DPPH的百分比。 [0065] 图5为水凝胶促进ECM再生及抗炎效果体外鉴定结果；其中，A为水凝胶及antagomir‑21通过不同机制发挥抗炎及ECM再生作用示意图；B为RT‑PCR检测NPC转染antagomir‑21后不同组ColII、Aggrecan、MMP‑13及ADAMTs‑4的基因表达结果；C为ColII及MMP‑13免疫荧光染色结果及D为Westernblot结果；E为DFCH‑DA染色观察不同组NPC细胞内ROS清除结果；F为不同组TNF‑α免疫荧光染色结果。 [0066] 图6为水凝胶体内修复退变髓核的结果；其中，A为通过建立大鼠椎间盘退变模型，并植入不同水凝胶，4、8周观察退变髓核修复效果示意图；B为术后4、8周X光扫描结果；C为术后4、8周MRI扫描结果；D为椎间盘高度指数(DHI)在不同组不同时间点的变化趋势；E为不同治疗组不同时间的MRI分级结果；F和H为HE染色、番红O‑固绿染色及ColII、MMP‑13、TNF‑α免疫荧光染色结果；G定量观察组织学分级；图中，*P<0.05，**P<0.01，ns无显著性差异。 具体实施方式[0067] 本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。 [0068] antagomir‑21是一种人工合成的miRNA序列，是一种胆固醇修饰的miRNA抑制剂，作为miRNA‑21抑制剂，可通过购买市售产品获得，本具体实施方式中使用的antagomir‑21是从吉玛基因公司购买的。 [0069] 本发明中，如果没有特殊说明，所述的溶液均为水溶液。 [0070] 实施例1、包含载药纳米凝胶的可注射水凝胶的制备 [0071] 1、载antagomir‑21的纳米凝胶(NG@antagomir‑21)的合成 [0072] 称取单(6‑氨基‑6‑去氧)β环糊精(CD‑NH2)4mg及MMP‑2响应型多肽10mg溶解于5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，持续搅拌并缓慢逐滴加入氧化葡聚糖(Ox‑Dex)溶液0.5ml(20mg/ml)。持续剧烈搅拌8h，后将上述溶液逐滴加入15ml PBS中，继续搅拌4h。反应溶液透析48h后0.45μm滤头过滤，离心冻干收集纳米凝胶(NG)。 [0073] 分别吸取100μl NG溶液(1mg/ml)及150μl antagomir‑21溶液(20μM)，此时NG和antagomir‑21的质量比为5：1w/w，加入750μl HEPES缓冲液中，充分搅拌12h，并透析收集，制成NG@antagomir‑21(NG@ant)。 [0074] MMP‑2响应型多肽：[NH2‑GCRDVPMS‑MRGGDRCG‑NH2]。 [0075] 2、CMC‑BA的合成 [0076] 称取3g羧甲基壳聚糖(CMC)溶解于300ml去离子水中，加入3‑醛基苯硼酸(BA，1.6g溶解于30ml DMSO中)，并持续搅拌常温下反应12h，随后将1.45g NaBH3CN缓慢加入溶液中继续搅拌8h，透析72h后冻干。 [0077] 3、Gel‑BA的合成 [0078] 称取5g明胶(Gel)溶解于500ml去离子水中，加热溶解。加入3,4,5‑羟基苯甲醛(TB，3g溶解于10ml DMSO中)，并持续搅拌常温下反应12h，随后将3g NaBH3CN缓慢加入溶液中继续搅拌8h，透析72h后冻干。 [0079] 4、DA‑PEG的合成 [0080] 将PEG(10.0g，5mmol，分子量为2000)、丙炔酸(3.5g，50mmol)和对甲苯磺酸一水合物(p‑TSA)(0.57g，3mmol)溶解于干甲苯(150mL)中。充分搅拌并回流48小时去除多余水分，充分冻干后溶解于水中，使用乙醚沉淀，并用异丙醇重结晶，DA‑PEG干燥保存使用。 [0081] 5、制备装载NG@antagomir‑21的可注射水凝胶体系 [0082] 80μl DA‑PEG溶液(10％w/v)逐滴加入400μl Gel‑TB溶液中(2.5％w/v)并持续搅拌，后制备400μl CMC‑BA溶液(1.5％w/v)并加入NG@antagomir‑211.76mg，将上述两种溶液混合后轻微搅拌，水凝胶瞬间形成(statusI)。将上述水凝胶静置12h，得到水凝胶(statusII)。 [0083] statusI为硼酸酯键成胶后得到的水凝胶；statusII为通过氨炔点击化学自增强成为较强水凝胶。 [0084] 以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。 [0085] 试验例1、NG@antagomir‑21的理化特性 [0086] 1、实验方法 [0087] 对实施例1的原料CD‑NH2和制备的NG(未载antagomir‑21)进行核磁共振1H NMR谱检测； [0088] 将实施例1制备的纳米凝胶放入PBS中，放置不同时间后用DLS检测纳米凝胶的粒径； [0089] 将实施例1制备的纳米凝胶放入PBS中或加入MMP‑2(MMP‑2加入的最终浓度为1μg/ml)后的PBS中，放置2h后，使用DLS检测纳米凝胶的粒径和放入PBS中的Zeta电位； [0090] 采用SEM观察实施例1制备的纳米凝胶的形貌； [0091] 将实施例1制备的纳米凝胶放入PBS中或加入MMP‑2(MMP‑2加入的浓度为1μg/ml)后的PBS中，放置2h后，采用TEM观察纳米凝胶的形貌； [0092] 将Cy3连接的antagomir‑21按照实施例1所述方法包裹在NG内，采用酶标仪检测antagomir‑21溶液中Cy3荧光强度，NG加入量依次为0、0.5、0.75、1、1.5、2mg/ml，观察随NG加入量增多，antagomir‑21溶液中Cy3的荧光强度，荧光强度逐渐降低，说明Cy3‑antagomir‑21被包裹入NG中。 [0093] 采用实施例1所述方法，将NG和antagomir‑21按照不同质量比(5:1/10:1/20:1和40:1)制备NG@antagomir‑21，采用电泳迁移率偏移分析研究NG@antagomir‑21中NG与antagomir‑21之间的相互作用，并采用电泳迁移验证NG对antagomir‑21的保护作用，具体方法如下： [0095] (2)胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子，将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液加入5μlEB(或者其他核酸染料)溶液，混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止； [0096] (3)加样：在点样板上不同比例TANPs@ant样品和上样缓冲液2.5μl的1x loading buffer，样本上样7.5μl，混匀后，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面，注意加样前要先记下加样的顺序； [0097] (4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压190V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳； [0098] (5)观察照相：电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。 [0099] 采用荧光强度检测方法研究实施例1制备的NG@antagomir‑21中antagomir‑21在不同条件下从纳米凝胶中的释放情况，具体方法如下： [0100] 将NG@cy3‑antagomir‑21置于透析袋中(MWCO＝3500DA)，并将透析袋置于去PBS(加或不加MMP‑2，1μg/ml)中不断搅拌，不同时间点吸取上清液200μL，进行荧光强度检测，根据浓度标曲检测cy3‑antagomir‑21释放量。 [0101] 上述各组的纳米凝胶是指NG@antagomor‑21。 [0102] 2、实验结果 [0103] NG@antagomir‑21的理化特性结果如图1所示： [0104] 图1A为NG@antagomir‑21合成流程示意图，说明antagomir‑21可以装载于Ox‑Dex、MMP‑2响应型多肽和CD‑NH2自组装形成的纳米凝胶中。 [0105] 图1B为NG及CD‑NH2的1H NMR谱，该结果说明CD‑NH2成功接枝于NG内。 [0106] 图1C为PBS中纳米凝胶直径随时间变化图，说明本发明纳米凝胶稳定性好。 [0107] 图1D为PBS中加入MMP‑2前后的纳米凝胶的粒度分布，该结果说明在MMP‑2的作用下，纳米凝胶被裂解为大小不同的碎片。 [0108] 图1E为纳米凝胶的大小和zeta电位值，装载antagomir‑21对纳米凝胶的粒径没有改变，而zeta电位由正电位变为负电位，进一步说明装载antagomir‑21成功。 [0109] 图1F和1G为纳米凝胶的SEM和TEM图片，该结果说明纳米凝胶为大小均一的球型结构，同时，该结果还说明本发明制备的纳米凝胶具有MMP‑2响应性，在MMP‑2存在的情况下会智能裂解，利于antagomir‑21的释放。 [0110] 图1H显示封装在NG中的Cy3‑antagomir‑21引起了Cy3荧光的猝灭，该结果说明Cy3‑antagomir‑21会被NG装载，并且表现为浓度依赖性。 [0111] 图1I和1J说明当NG/antagomir‑21的质量比达到20：1时，NG装载效率达到饱和，同时NG具有良好的antagomir‑21保护效果。 [0112] 图1K说明NG@antagomir‑21具有敏感的MMP‑2响应释放特点，CD‑NH2的加入，进一步实现其缓释效果。 [0113] 试验例2、水凝胶的理化特性 [0114] 1、实验方法 [0115] 对原料CMC、Gel以及实施例1制备的CMC‑BA和Gel‑TB进行核磁共振、FTIR检测； [0116] 观察实施例1水凝胶合成及自增强过程中状态变化； [0117] 观察实施例1制备的statusI和statusII两种状态水凝胶的SEM扫描图像； [0118] 观察statusI状态水凝胶的的可注射性和自愈性，以及statusII状态水凝胶的炎症响应及组织粘附能力，炎症响应检测方法为模拟体外炎性环境(pH 5的HCl溶液和/或H2O2 1mM溶液)，观察水凝胶在不同溶液覆盖下的降解情况，组织粘附能力检测方法为观察不同组织与水凝胶粘附状态并通过万能拉力机检测抗拉指数。 [0119] 2、实验结果 [0120] 水凝胶的理化特性结果如图2所示： [0121] 图2B为CMC和CMC‑BA、Gel及Gel‑TB的1H NMR谱，图2B中a、b、c分别对应图2A中对应的氢元素特征峰，该结果说明已成功制备CMC‑BA及Gel‑TB。 [0122] 图2C为CMC和CMC‑BA、Gel及Gel‑TB的FTIR光谱，该结果说明已成功制备CMC‑BA及Gel‑TB。 [0123] 图2D为水凝胶合成及自增强过程的照片，水凝胶刚交联时，是通过硼酸酯键成胶，强度较弱，水凝胶仍然可以呈流动状；交联一段时间后水凝胶通过氨炔点击化学自增强成为高强度水凝胶，此时水凝胶强度大，作为髓核修复材料可以满足椎间盘的机械强度。 [0124] 图2E为statusI和statusII两种状态水凝胶的SEM扫描图片，该结果说明status II表现出更加致密的微观结构。 [0125] 图2F为StatusI时水凝胶的可注射性及自愈性示意图，图2G为statusII时水凝胶炎症响应及组织粘附能力示意图，该结果说明本发明刚制备的水凝胶(StatusI)可注射性能好，并且自愈性好；待水凝胶交联一段时间后(StatusII)强度增强，并且该水凝胶在低pH高ROS环境下会溶解，具有炎症响应能力，并且该水凝胶组织粘附能力好，黏附能力好就可以使得水凝胶注射入椎间盘内部后可以和椎间盘组织充分粘附，不会渗漏。 [0126] 试验例3、水凝胶的流变性能及基因缓释效果检测 [0127] 1、实验方法 [0128] 对实施例1制备的statusI和statusII两种状态水凝胶进行流变学测试； [0129] 将Cy3连接的antagomir‑21按照实施例1所述方法制备水凝胶，通过共聚焦显微镜观察水凝胶中cy3‑antagomir‑21荧光分布结果； [0130] 将实施例1制备的装载了NG@antagomir‑21水凝胶放在不同溶液中(PBS溶液，pH5的HCl溶液，pH5的HCl溶液加上1mM的H2O2)，观察不同时间后水凝胶的降解速度； [0131] 将实施例1制备的水凝胶放在不同溶液中(PBS溶液，pH5.5的HCl溶液，pH5.5的HCl溶液加上1mM的H2O2，pH5.5的HCl溶液加上1mM的H2O2和1μg/ml MMP‑2)，观察不同时间后水凝胶中释放antagomir‑21的结果； [0132] 水凝胶动物体内实时成像观察：将不同形式的Cy3‑antagomir‑21分别注入大鼠不同节段椎间盘内部(Co 2/3,4/5,6/7)，分别于不同时间点通过小动物实时荧光仪IVIS Spectrum system(PerkinElmer,USA)观察荧光强度。 [0133] 2、实验结果 [0134] 水凝胶的流变性能及基因缓释效果检测结果如图3所示： [0135] 图3A为不同状态下(statusI和II)水凝胶的频率扫描结果，图3B为不同状态下(statusI和II)水凝胶振幅扫描结果，图3C为不同状态下(statusI和II)水凝胶剪切变稀及自愈结果，这些结果说明随着水凝胶由status I变为II，水凝胶的弹性模量逐渐增强。 [0136] 图3D为通过共聚焦显微镜观察水凝胶中cy3‑antagomir‑21荧光分布结果，该结果说明antagomir‑21在水凝胶中均匀分布。 [0137] 图3E为水凝胶在不同条件下自我降解速率，图3F为不同条件下水凝胶中释放antagomir‑21的结果，结果说明水凝胶在低pH和高ROS环境下快速降解，antagomir‑21迅速释放，说明本发明水凝胶具有pH和ROS双响应的炎症响应特性。 [0138] 图3G为注射入椎间盘后cy3‑antagomir‑21水凝胶的实时荧光成像和Living Image计算的半定量分析结果，这些结果说明得益于水凝胶的包裹和NG对antagomir‑21的装载，antagomir‑21可以在体内存留10d之久，从而真正实现长效缓释。 [0139] 试验例4、NG@antagomir‑21促进antagomir‑21被髓核细胞转染及水凝胶生物相容性检测 [0140] 1、实验方法 [0141] 培养原代髓核细胞(NPC)后，分别设置不同组(对照组control，单纯antagomir‑21转染，NG@antagomir‑21转染组(无MMP‑13)及NG@antagomir转染组(有MMP‑2))，转染24h后通过免疫荧光染色、miRNA‑21基因表达观察antagomir‑21转染效果。通过L929细胞活性及活死染色，鉴定水凝胶生物相容性，通过DPPH清除实验，检测水凝胶抗氧化性能。 [0142] 2、实验结果 [0143] 图4为髓核细胞转染及水凝胶生物相容性检测结果： [0144] 图4A为通过Cy3免疫荧光(标尺，20μm)观察不同条件下培养髓核细胞(NPC)的Cy3‑antagomir‑21转染结果，(+)代表加入MMP‑2，该结果说明在NG@antagomir‑21相对于单纯antagomir‑21，具有更高的转染效率，尤其是加入MMP‑2诱导NG@antagomir‑21裂解后，转染效率最高。图4B为不同组NPC细胞内cy3荧光强度定量分析结果，该结果与前述一致。 [0145] 图4C为不同浓度NG@antagomir‑21与L929细胞共培养时，细胞活性比较，说明本发明制备的载antagomir‑21纳米凝胶具有良好的细胞相容性。 [0146] 图4D为通过RT‑PCR检测不同干预后NPC miRNA‑21表达情况，该结果说明在NG@antagomir‑21相对于单纯antagomir‑21，具有更高的转染效率，尤其是加入MMP‑2诱导NG@antagomir‑21裂解后，转染效率最高。因此，miRNA‑21抑制作用最明显。 [0147] 图4E为各样品处理24和48小时后L929细胞的存活率，图4F为活死染色结果，该结果进一步说明制备的载体以及水凝胶均有良好的细胞相容性。 [0148] 图4G为载纳米凝胶、未载纳米凝胶的水凝胶和载纳米凝胶的水凝胶的清除DPPH的百分比，该结果说明，未载纳米凝胶的水凝胶本身就具有良好的抗氧化活性。 [0149] 试验例5、水凝胶促进ECM再生及抗炎效果体外鉴定 [0150] 1、实验方法 [0151] 培养原代髓核细胞(NPC)后，TBHP刺激细胞诱导体外髓核细胞退变模型，分别设置不同组(正常组control，TBHP组(未干预)，单纯antagomir‑21转染，NG@antagomir‑21转染组)，通过PCR、免疫荧光染色及Western‑blot检测ECM合成指标Col II及分解指标MMP‑23基因及蛋白表达情况。 [0152] 另分别设置不同组(正常组control，TBHP组(未干预)，Hydrogel单纯水凝胶治疗组，Hydrogel/NG@antagomir‑21即包含NG@antagomir‑21的水凝胶治疗组)，通过DFCH‑DA染色观察细胞内ROS清除效果及炎症因子TNF‑α表达差异。 [0153] 2、实验结果 [0154] 图5为水凝胶促进ECM再生及抗炎效果体外鉴定结果： [0155] 图5B、5C和5D说明了本发明装载了NG@antagomir‑21的水凝胶治疗髓核细胞后，ECM再生基因高表达，并充分抑制ECM分解基因的表达。说明本发明水凝胶体系可显著促进髓核细胞ECM再生，帮助髓核修复。 [0156] 图5E为DFCH‑DA染色观察不同组NPC细胞内ROS清除结果结果，该结果说明本发明载纳米凝胶和未载纳米凝胶的水凝胶均具有优异的抗氧化作用。 [0157] 图5F为不同组TNF‑α免疫荧光染色结果该结果说明本发明载纳米凝胶和未载纳米凝胶的水凝胶均具有优异的抗炎作用。 [0158] 试验例6、水凝胶体内修复退变髓核研究 [0159] 1、实验方法 [0160] 本部分通过对大鼠椎间盘穿刺，建立动物椎间盘退变模型，同时，给予退变椎间盘内进行不同治疗(control正常椎间盘，NC注入PBS治疗，antagomir‑21即只注入antagomir‑21溶液，NG@ant即注入NG@ant溶液，及包含NG@ant的水凝胶治疗)，分别于4周及8周后通过X线、MRI扫描以及组织学评估(HE染色，番红O‑固绿染色，及免疫组化染色)。 [0161] 2、实验结果 [0162] 图6为水凝胶体内修复退变髓核结果： [0163] 图6B为术后4、8周X光扫描结果，说明Hydrogel/NG@antagomir‑21组可以有效恢复椎间隙高度，效果优于使用单纯的antagomir‑21溶液以及NG@antagomir‑21。 [0165] 图6D为椎间盘高度指数(DHI)在不同组不同时间点的变化趋势，该结果说明Hydrogel/NG@antagomir‑21组可以有效恢复椎间隙高度，效果优于使用单纯的antagomir‑21溶液以及NG@antagomir‑21。 [0166] 图6E为不同治疗组不同时间的MRI分级结果，该结果说明Hydrogel/NG@antagomir‑21组可以有效恢复椎间盘内部含水量，降低MRI分级，椎间盘修复效果最佳。 [0167] 图6F和6H为HE染色，番红O‑固绿染色及ColII、MMP‑13、TNF‑α免疫荧光染色，说明Hydrogel/NG@antagomir‑21组退变髓核修复效果最佳。 [0168] 图6G为定量观察组织学分级，该结果也同样说明Hydrogel/NG@antagomir‑21组退变髓核修复效果最佳。 [0169] 本发明首先提供了一种可注射水凝胶，该可注射水凝胶植入退变髓核内部后可以自发的增强自身模量，起到充分填充和避免渗漏的作用，同时该水凝胶具有很强的抗炎抗氧化作用，可促进退变髓核的修复。此外，本发明可注射水凝胶具有pH和ROS双响应的炎症响应特性，载药后可根据髓核内部的不同炎症程度释放内部的药物。其次，本发明提供了一种可以载miRNA的纳米凝胶载药颗粒，该纳米凝胶可在MMP‑2存在下智能裂解，释放可以促ECM再生的药物，促进退变髓核修复。本发明将可注射水凝胶与载miRNA的纳米凝胶相结合，最终构建一种可注射、自增强、具有炎症响应特性、可智能化给药的miRNA水凝胶递送体系，该水凝胶递送体系同时具有抗炎抗氧化和促进ECM再生的效果，可有效促进退变髓核再生、修复。本发明为退变髓核修复提供新思路，最终避免手术带来的风险和巨大的经济花费，具有良好的应用前景。 |
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