一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202210889846.X | 申请日 | 2022-07-27 |
| 公开(公告)号 | CN116426521A | 公开(公告)日 | 2023-07-14 |
| 申请人 | 海南大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 周世豪; 连宇阳; 王阿强; 彭四华; | 第一发明人 | 周世豪 |
| 权利人 | 海南大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 海南大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：海南省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：海南省海口市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：海南省海口市人民大道58号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：570208 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/113 | 所有IPC国际分类 | C12N15/113 ; C12N15/89 ; A01N57/16 ; A01P23/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 6 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京中安信知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 赵黎虹; |
| 摘要 | 本 发明 涉及的一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNA方法，包括设计和制备siRNA(干扰载体)，siRNA是根据瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的保守cDNA序列进行设计，包含的干扰 片段 ，干扰片段为：其正义链为5’CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT3’，反义链为5’UAACACAUCCUCGACAUCGTT3’。本发明的有益效果是：通过使用RNAi技术，以卵黄原蛋白受体基因为靶标基因，使用气压显微注射仪对短时高温处理过的瓜实蝇注射卵黄原蛋白受体基因的siRNA，再结合qRT‑PCR技术和解剖卵巢，评价RNA干扰的沉默效率，研究高温背景下瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的功能，进而实现对瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的沉默和抑制，从而有效的降低瓜实蝇的繁殖能 力 。 | ||
| 权利要求 | 1.一种RNA干扰载体，用于抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达，其特征在于，包括干扰片段，所述干扰片段的正义链为5’CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT3’，反义链为5’UAACACAUCCUCGACAUCGTT 3’。 |
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| 说明书全文 | 一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法技术领域[0001] 本涉及RNA干扰防治害虫领域，具体的是一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法。 背景技术[0002] 瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae(Coquillett)属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)，是热带亚热带区域果蔬类作物的重要害虫。雌性瓜实蝇将产卵器刺入瓜果产卵，卵孵化成幼虫后在瓜果内取食，导致瓜果腐烂，对经济造成了巨大损失。瓜实蝇成虫不取食瓜果和叶片，喷施药剂的防治方法并不理想，繁殖速度快，产卵量大，分布范围广等特性使瓜实蝇的危害极其严重。 [0003] 卵黄原蛋白受体是卵黄原蛋白(Vitellogenin，Vg)摄取进入发育的卵母细胞所必需的蛋白。卵黄原蛋白受体是具有介导内吞作用的受体，通常具有卵巢特异性，是卵黄原蛋白的专一性胞吞作用受体，卵黄原蛋白受体介导卵黄原蛋白进入昆虫卵母细胞后沉淀积累形成昆虫生殖必须的卵黄蛋白。卵黄原蛋白受体介导的胞吞作用是一个动态循环过程，它是卵黄发生的基础，对昆虫卵母细胞发育起着至关重要的作用。 [0004] RNA干扰是由和靶标基因序列同源的双链RNA介导的特异性基因表达沉默抑制现象，是生物的一种古老并且在进化上保持高度保守的调节基因表达机制。双链RNA(dsRNA)会被细胞内的核酸内切酶Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)，siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与一些酶(Argonaute)结合成沉默复合物(RISC)，RISC与靶mRNA结合，切割mRNA，导致特定基因沉默。本提出一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法，可有效抑制瓜实蝇的繁殖。 [0005] 内容 [0007] 本发明涉及一种RNA干扰载体，包括干扰片段，所述干扰片段的 [0008] 正义链为5’CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT 3’， [0009] 反义链为5’UAACACAUCCUCGACAUCGTT 3’。 [0010] 本发明还涉及RNA干扰载体在制备抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的药物中的应用。 [0011] 本发明还涉及一种RNA干扰载体的制备方法，包括将包含siRNA干粉的离心管在3000‑4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时干粉散失，然后将2.5nmol的siRNA干粉溶解在125μL Tris‑EDTA溶液中，配制成20μM的siRNA溶液。 [0012] 本发明还涉及一种RNA干扰载体的在抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的应用，包括以下步骤：取初羽化的瓜实蝇成虫在25℃和45℃的人工气候箱中分别处理1h，处理完成后继续在25±1℃条件下饲养，待饲养至5日龄，对存活雌成虫进行乙醚迷晕，将其放入容器中，使用微量上样针取4.5μL(1.25μg)的siRNA溶液注入注射针中，然后将注射针安装到气压注射仪上并加以固定，选取雌成虫腹部背板第2至第3腹节的连接处为注射点，使用气压显微注射仪以1.25μg或4.5μL的注射量为每头瓜实蝇成虫注射siRNA。 [0013] 进一步地，还包括：待瓜实蝇成虫注射siRNA注射完成并饲养一定时间后，使用RNAprep FastPure动物组织/细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA，在琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液)和吸光度检测后，使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix逆转录试剂盒合成提取的总RNA，合成cDNA，逆转录得到的cDNA产物3倍稀释后作为qPCR模板，通过琼脂糖凝胶电泳得到条带，并对条带大小和qRT‑PCR的溶解曲线进行分析，判断siRNA的特异性，在实际实施过程中，通过琼脂糖凝胶电泳得到条带大小与预期的大小一致，没有杂带出现。qRT‑PCR的溶解曲线只有一个信号峰，说明引物的特异性较高，结果可靠。 [0014] 进一步的，qRT‑PCR反应体系包含1μL cDNA模板，10μL 2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)、1μL上游引物、1μL下游引物和7μLddH2O，反应程序为：在95℃下预变性2min，在95℃下变性15s，在60℃下退火15s，在72℃下延伸20，共进行41个循环。 [0015] 本发明的有益之处在于：通过使用RNAi技术，以卵黄原蛋白受体基因为靶标基因，使用气压显微注射仪对短时高温处理过的瓜实蝇注射卵黄原蛋白受体基因的siRNA，再结合qRT‑PCR技术和解剖卵巢，评价RNA干扰的沉默效率，研究高温背景下瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的功能，进而实现对瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的沉默和抑制，从而有效的降低瓜实蝇的繁殖能力。 附图说明[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0018] 图1是干扰靶基因后对瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达量的影响。 [0019] 图2是25℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响。 [0020] 图3是45℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响。 [0021] 图4是干扰靶基因对瓜实蝇产卵的影响。 [0022] 图5是抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法的流程示意图。 具体实施方式[0023] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0024] 参照图5，在本发明一较佳实施例中的一种抑制瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因表达的RNAi方法，包括设计和制备siRNA(干扰载体)，siRNA是根据瓜实蝇卵黄原蛋白受体基因的保守cDNA序列进行设计，包含的干扰片段，干扰片段为： [0025] 其正义链为5’CGAUGUCGAGGAUGUGUUATT 3’， [0026] 反义链为5’UAACACAUCCUCGACAUCGTT 3’； [0027] 阴性对照为一种商业化的siRNA，与靶细胞无同源性，它在任何处理中均无RNAi效应，商业化的siRNA包括： [0028] 其正义链为5’GGUUCUCCGAACGUGUCACGU 3’， [0029] 反义链为5’ACGUGACACGUUCGGAGAACC 3’。 [0030] 上述两种siRNA均由擎科生物科技有限公司(中国北京)合成。然后准备注射针，使用PC‑100垂直型微电极拉针仪的“一部法”，设置参数为60.0，将GD‑1玻璃毛细管加热拉成至针头细小的注射针，使针头轻轻触碰盖玻片以锻针，再使用EG‑401磨针仪将针尖开口处磨至30度，拉针仪，玻璃毛细管和磨针仪均购自NARISHIGE(Japan)公司。之后配制溶液，将装有siRNA干粉的离心管在3000‑4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时干粉散失。将2.5nmol的siRNA干粉溶解在125μL Tris‑EDTA溶液中，配制成20μM的siRNA溶液，取初羽化的瓜实蝇成虫在25℃和45℃的人工气候箱中分别处理1h，处理完成后继续在室温(25±1℃)条件下饲养，待饲养至5日龄，对存活雌成虫进行乙醚迷晕，将其放入自制的固定容器中。使用Microloader微量上样针(购自Eppendorf公司(Germany))取4.5μL(1.25μg)的siRNA溶液注入注射针中，然后将注射针安装到气压注射仪上并加以固定，选取雌成虫腹部背板第2至第3腹节的连接处为注射点，使用IM‑11‑2气压显微注射仪以1.25μg或4.5μL每头的量注射siRNA和阴性对照，并设置创伤(使用未上样的注射针刺入相同的位置)和空白对照。 [0031] 靶基因表达水平的qRT‑PCR分析，注射完成后，将siRNA，阴性对照，创伤和空白对照的雌虫分别放入小笼子内，取相同数量的雄虫与雌虫配对，放入饲料、水和用于产卵的南瓜薄片，在室温(25±1℃)条件下饲养。待注射24、48、72小时后，分别从siRNA、阴性对照、创伤和空白对照取15头雌虫，5头为一重复，各设置3个重复，液氮速冻后，放入超低温冰箱。使用RNAprep FastPure动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(双柱型)提取总RNA，在琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液)和吸光度检测后，使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix逆转录试剂盒合成提取的总RNA，按照说明书合成cDNA，逆转录得到的cDNA产物3倍稀释后作为qPCR模板，总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购自擎科生物科技有限公司(中国北京)。通过琼脂糖凝胶电泳得到条带大小与预期的大小一致，没有杂带出现。qRT‑PCR的溶解曲线只有一个信号峰，说明引物的特异性较高，结果可靠。根据之前的筛选，Succinate dehydrogenaseflavoprotein基因被选为内参基因，使用的引物如表1。 [0032] [0033] 表1靶标基因和内参基因的引物序列 [0034] qRT‑PCR反应体系包含1μL cDNA模板，10μL 2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)、1μL上游引物、1μL下游引物和7μL ddH2O，反应程序为：在95℃下预变性2min，在95℃下变性15s，在60℃下退火15s，在72℃下延伸20s。共进行41个循环，每个样品三个循环，反应完成后选择相对定量分析模式，并导出原始数据。内参基因和待检测基因的CT值通过2‑ΔΔCT方法，获得样品差异表达模式的多重关系。 [0035] 干扰靶基因对卵黄原蛋白受体基因表达的影响 [0036] 结果见图1(A为25℃处理1h后干扰靶基因对卵黄原蛋白受体基因表达的影响，B为45℃处理1h后干扰靶基因对卵黄原蛋白受体基因表达的影响)。 [0037] 在25℃时，空白对照、阴性对照和创伤的相对表达量均在72h达到峰值，siRNA组在3个时间段始终保持低水平的表达，在24h时，阴性对照和创伤的相对表达量均显著高于siRNA组，48h各处理组无显著差异，72h时空白对照、阴性对照和创伤的相对表达量显著的高于siRNA组，表明卵黄原蛋白受体基因的表达被有效干扰。 [0038] 在45℃时，各处理组的相对表达量呈上升的趋势，均在72h达到峰值，siRNA组的相对表达量在3个时间段呈较低水平的表达，空白对照、阴性对照和创伤在3个时间段内的相对表达量均显著高于siRNA组。在45℃处理1h后，创伤、空白对照和阴性对照组的最大相对表达量均高于25℃。 [0039] 干扰靶基因对瓜实蝇卵巢的影响 [0040] 待注射完成后，将siRNA组，阴性对照组，创伤组和空白对照组的雌虫分别放入小笼子内，取相同数量的雄虫与雌虫配对，放入饲料、水和用于产卵的南瓜薄片，在室温(25±1℃)条件下饲养。待注射完5天后，分别解剖11日龄、12日龄、13日龄雌成虫，分三天解剖，每天每个处理解剖5头，对其卵巢拍照记录。 [0041] 结果见图2(25℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响(A)卵巢的发育速度，(B)卵巢的直径)和图3(45℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇卵巢发育的影响(A)卵巢的发育速度(B)卵巢的直径)。 [0042] 在25℃和45℃，siRNA的卵巢直径在第11、12、13日龄均显著小于空白对照、阴性对照和创伤的卵巢直径，siRNA的卵巢发育速度明显慢于空白对照、阴性对照和创伤。综上，沉默卵黄原蛋白受体基因减缓了瓜实蝇卵巢的发育，45℃时，siRNA的卵巢直径在3个时间段均均小于25℃，表明极端高温45℃处理1h抑制了瓜实蝇卵巢的发育。 [0043] 干扰靶基因对瓜实蝇产卵的影响 [0044] 待注射完成后，从siRNA，阴性对照，创伤和空白对照组分别取5头雌虫放入小笼子，取5头雄虫配对作为一个循环，共设置6个重复，笼内放置有水、成虫人工饲料和用于产卵的南瓜薄片，在室温(25±1℃)条件下饲养和观察，并记录总产卵量(粒)、产卵天数(d)和卵孵化率(％)。 [0045] 结果见图4(A为25℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇产卵的影响，B为45℃处理1h后干扰靶基因对瓜实蝇产卵的影响)，在25℃时，siRNA的总产卵量、产卵天数和孵化率均最低，分别为204粒，67.3d和69.7％，显著低于其余处理组，比空白对照(分别为1754粒，123.8d和90.0％)分别降低了约88.4％，45.6％和22.6％。 [0046] 在45℃时，siRNA的总产卵量、产卵天数和孵化率均最低，分别为97粒，47.0d和29.4％，显著低于空白对照(分别为2027粒，86.8d和51.6％)，且比空白对照降低了约 95.2％，45.9％和43.0％。45℃处理1h后，空白对照、阴性对照和创伤的总产卵量均高于25处理1h，siRNA与之相反，在45℃的总产卵量低于25℃。综上，沉默卵黄原蛋白受体基因有效的抑制了瓜实蝇的繁殖。 [0047] 综上所述，通过制备siRNA(干扰载体)，能够对卵黄原蛋白受体基因进行干扰，使得卵黄原蛋白受体基因沉默，通过沉默卵黄原蛋白受体基因有效的抑制了瓜实蝇的繁殖，进而实现对瓜实蝇的科学有效的治理，降低瓜实蝇对农作物的危害。 [0048] 另外通过显微注射的方式，将siRNA(干扰载体)直接注射到瓜实蝇的体内，能够快速作用于瓜实蝇的卵黄原蛋白受体基因，并能作用于虫卵，能够实现对瓜实蝇的繁殖的长效抑制，进而实现对瓜实蝇的防治。 [0049] 本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。 |
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