[0001]

[0002] 本发明属于蚊媒病防治技术领域，具体涉及一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用。

[0003]

[0004] 蚊子作为一种害虫，具有吸血习性，吸血时蚊子可将疟原虫、丝状蚴、乙脑病毒等涎液注入人体内，使人感染发病。因此，蚊子不但叮人吸血影响睡眠，还会传播乙型脑炎、疟疾、登革热、血丝虫病等。目前，控制蚊媒仍是蚊媒病防制的主要手段，主要的防蚊手段分如下几种：1、环境治理，目的是清除蚊虫孳生场所。治理方法可以分为a.环境改造：为了防止、清除和减少蚊虫孳生和栖息而对土地、水体或植被进行的改造。包括排除积水、填地堵洞、铲除杂草等措施。b.环境处理：有计划地改变水生环境，使之不利于蚊虫孳生。疏通沟渠，变静水为流水等。c.减少人蚊接触：通过改善人们居住条件和习惯，减少人类和蚊虫的接触。房屋安装纱门、纱窗，使用蚊帐，用药物处理蚊帐。野外执勤作业，可戴防蚊帽或驱虫网。2、化学防治，具有见效快、使用方便，适合大规模应用等优点，是目前蚊虫防治重要的手段之一，主要分为a．幼虫防治：可在水体中加入有机磷杀虫剂及其缓释剂，常用的有双硫磷、倍硫磷。b．成蚊防治：（1）空间喷洒：使用杀虫剂气溶胶杀灭飞行和栖息的昆虫。如使用气雾罐、超低容量喷雾、热烟雾剂等。（2）滞留喷洒：使用具有一定持效作用的杀虫剂，喷洒在室内蚊虫栖息的表面，使用的杀虫剂有高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯等。3、生物防治：成本高，较难大规模实施。由于化学杀虫剂的长期大量使用，导致蚊杀虫剂抗性的发生和发展，因此，基于直接抑制雌蚊繁殖势能的新型蚊种群抑制方法，对于控制蚊种群数量具有更重要的实际应用价值。

[0005] MG132 (Proteasome抑制剂)是一种有效的，可逆的，可透过细胞的蛋白酶体抑制剂（Ki=4 nM）。N‑苄氧基羰基‑L‑亮氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑亮氨酸MG132属于合成肽醛类抑制剂。它通过26S复合物降低哺乳动物细胞和酵母可渗透菌株中泛素‑共轭蛋白的降解，而不影响其ATP酶或肽酶活性。MG132激活c‑Jun N‑末端激酶（JNK1），其启动细胞凋亡。

[0006] MG132还以3μM的IC 50抑制NF‑κB活化，并阻断β‑分泌酶活性。在具有约50μMMG132的IC 50的HeLa细胞中观察到剂量依赖性的细胞生长抑制24小时。MG132通过诱导细胞周期停滞以及引发细胞凋亡来抑制HeLa细胞的生长。MG132以时间和剂量依赖性方式抑制C6神经胶质瘤细胞增殖（24小时时IC 50值为18.5μM）。MG132（18.5μM）在3小时时抑制蛋白酶体活性约70％。

[0007] MG132通过下调抗细胞凋亡蛋白Bcl‑2和XIAP，促凋亡蛋白Bax和半胱天冬酶‑3的上调以及切割的C端85kDa PARP的产生来诱导细胞凋亡。MG132还会使活性氧增加5倍以上。IC 50MG132对孵育48小时后对HeLa，CaSki和C33A宫颈癌细胞存活率的影响分别为2.1,3.2和5.2μM。使用sc异种移植模型检查MG132对宫颈癌的体内抗肿瘤活性。

[0008] 使用以下方案以1mg/kg注射MG132：对于携带HeLa肿瘤的小鼠，第1,4,8,12,15,18,23和26天。与对照相比，MG132的生长抑制率为49％。MG132（ip，0.1 mg/kg/day）通过调节ERK1/2和JNK1信号通路，减轻压力超负荷引起的心脏肥大，改善腹主动脉条带（AAB）大鼠的心脏功能。

[0009]

[0010] 解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用。

[0011] 技术方案：MG132在制备抑制蚊子生殖试剂中的应用。

[0012] 优选的，上述MG132的工作浓度为4 μM。

[0013] 一种抑制蚊子生殖试剂，有效成分含有MG132。

[0014] 有益效果：本发明利用MG132能够显著抑制蚊的生殖力，且这种抑制作用能够持续到子二代。

[0015]附图说明

[0016] 图1：MG132对亲代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对亲代雌蚊产卵量的影响；B：MG132对亲代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<
0.0001）。

[0017] 图2：MG132对子一代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对子一代雌蚊产卵量的影响；B：MG132对子一代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.0001）。

[0018] 图3：MG132对子二代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对子二代雌蚊产卵量的影响。B：MG132对子二代雌蚊幼虫数的影响。C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.0001）。

[0019] 图4：MG132对子三代雌蚊生殖作用的影响。 A：MG132对子三代雌蚊产卵量的影响。B：MG132对子三代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<
0.01，***P<0.0001）。

[0020] 图5：亲代MG132处理组吸血未产卵雌蚊卵巢解剖图。A：正常雌蚊72 h PBM卵巢解剖图；B‑G：亲代MG132处理组吸血5 d未产卵雌蚊卵巢解剖图（放大倍数3.2x10）。

[0021] 图6：MG132处理组亲代及子代雌蚊卵巢形态比例。

[0022]

[0023] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0024] 实施例1材料与方法
MG132对蚊生殖力的影响
1.MG132母液配制
称取 47.5 mg MG132 (Synonyms: Z‑Leu‑Leu‑Leu‑al; MG132) 粉末（MCE，HY‑
13259），溶于 1 mL DMSO（MCE，HY‑129770）中，使其充分混匀，配制成100 mM MG132母液。

[0025] 2.测定MG132对蚊生殖力的影响取6 μL上述MG132母液，加入 150 mL ddH2O，配制成4 μM工作液。用该工作液处理
3龄末~4龄初幼虫，直至羽化3天，以等浓度的 DMSO和 ddH2O 处理作为对照。每组处理 500只幼虫，并设立3个生物学重复。

[0026] 羽化3天，雌雄蚊充分交配后，给予血食，吸血后72 h（72 h PBM）观察各组雌蚊产卵量。在OLMPUS相差倒置显微镜下计数每个卵筏中的卵个数（N=20），将卵筏放回实验室正常饲养，待幼虫孵化，计数1龄幼虫，并计算孵化率（N=20）。

[0027] 此外，解剖雌蚊 72 h PBM 雌蚊卵巢，在OLMPUS相差倒置显微镜下观察各组卵巢形态的改变。

[0028] 结果MG132对蚊生殖力的影响
1.MG132处理后雌蚊产卵量、 幼虫数及孵化率的变化
在亲代中，DMSO对照组蚊产卵量为140.1± 9.42，幼虫数为119± 11.64，孵化率为84.91%± 4.85%，而MG132处理组蚊产卵量仅为81.25± 46.28，幼虫数为65.29± 
38.27，孵化率为63.48%± 34.85%， MG132处理组产卵量，幼虫数和孵化率明显低于对照组（图1，P<0.0001、 P<0.0001、 P=0.0016）。为了研究这种抑制作用的持续性，我们随后连续观察处理蚊至子三代，发现DMSO对照组子代产卵量、幼虫数和孵化率与对照组亲代无明显差异，而MG132处理后的子一代产卵量、幼虫数、孵化率分别为104.48± 42.58、87.52± 
27.62、73.06%± 27.62%；MG132处理后的子二代产卵量、幼虫数、孵化率分别为107.72± 
33.49、97.32± 32.07、86.31%± 17.95%；MG132处理后的子三代产卵量、幼虫数、孵化率分别为166.95± 20.95、146.75± 21.41、87.66%± 4.00%。 提示MG132处理后的子一代产卵量、幼虫数、孵化率显著下降（图1， P<0.0001， P<0.0001， P=0.0048）。

[0029] MG132处理后的子二代产卵量、幼虫数明显降低，而孵化率无差异（图3，P<0.0001， P<0.0001，P=0.2267）。

[0030] MG132处理后的子三代产卵量、幼虫数、孵化率指标均无明显差异（图4，P<0.0001，P<0.0001，P=0.0048）。提示MG132抑制蛋白酶体活性后，能够显著抑制蚊的生殖力，且这种抑制作用能够持续到子二代。在亲代MG132处理组和子一代中，分别观察到6只和3只吸血5天的雌蚊仍未产卵。解剖亲代雌蚊卵巢，发现有1只卵巢体积明显减小，5只卵巢发育延迟，卵泡未发育（图5）。提示MG132处理后对蚊生殖力的影响可能是通过影响卵巢发育实现的。

[0031] 我们进一步观察MG132处理后卵巢形态的变化，亲代、子一代、子二代和子三代MG132处理组和对照组，各组随机收集20只 72 h PBM的雌蚊卵巢进行解剖。根据卵巢不同形态，将卵巢分为四组：形态正常组、形态稀疏组、体积变小组和发育延迟组。结果显示，亲代、子一代、子二代卵巢形态正常比例分别为10%、15.8%、50%，随着MG132作用的减弱，MG132处理组雌蚊卵巢形态正常比例逐渐增加。处理后子三代卵巢形态已恢复正常（图6）。