一种含有贝莱斯芽胞杆菌的菌肥及其应用 |
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| 申请号 | CN202311460569.1 | 申请日 | 2023-11-03 | 公开(公告)号 | CN117682897A | 公开(公告)日 | 2024-03-12 |
| 申请人 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所; 海南省食品检验检测中心(海南省实验动物中心); | 发明人 | 张妙宜; 潘永波; 王尉; 谢江辉; 赵炎坤; 李凯; 周登博; 起登凤; 魏永赞; 陈宇丰; 冯筠庭; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种含有贝莱斯芽胞杆菌的菌肥，所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。本发明的贝莱斯芽胞杆菌具有广谱抑菌活性，对番茄枯萎病菌等具有良好的拮抗作用，该菌株具有高效固氮和产IAA能 力 ，促进 植物 的生长，还具有产解 纤维 素酶、几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶等活性。本发明将所述贝莱斯芽胞杆菌制成菌肥，可以充分发挥贝莱斯芽胞杆菌的抑菌、固氮能力和其他 生物 学特性，可以减少对 农药 、化肥的依赖，提高 农作物 的产量和品质，同时降低对环境的负面影响，在农业和环境领域中具有广泛的应用潜力。 | ||||||
| 权利要求 | 1.贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在促进植物生长中的应用；所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。 |
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| 说明书全文 | 一种含有贝莱斯芽胞杆菌的菌肥及其应用技术领域背景技术[0002] NPK肥料中的氮素(N)是农业生产中至关重要的养分之一，它是植物和动物生命活动所必需的基本化学元素。但农田土壤普遍存在着氮素缺乏的问题。增加有机肥料和化学肥料中的氮素含量来提高生态系统的生产力是实现增产效益有效途径。然而，过量的氮素施用会导致环境污染，不仅会降低氮素的利用效率，还会对水体和大气环境质量造成负面影响，对动植物生态系统平衡和人体健康构成威胁。中国是全球化肥氮消费量最大的国家之一，大量的氮肥使用虽然促进了我国农业的发展，但也引发了水体富营养化等问题。随着人口的增长和农产品需求的增加，化肥氮的消耗量还将继续增加。因此，提高氮素的利用效率，避免过度使用化肥氮，防止对环境质量的不利影响(如土壤板结等)，并兼顾经济效益和环境效益，已成为农业氮素管理的基本原则和重要任务。我们需要在保证农作物产量的同时，应积极探索培育土壤氮素肥力的方法，以实现农业的可持续发展。 [0003] 微生物是地球上最古老的生物，至少有41亿年的历史，以不同的形态、生理特征和代谢能力存在于土壤、水体、空气、动植物体内等环境中，细菌、真菌、病毒等地球微生物的多样性丰富了微生物资源库，为农业、医药、环境等领域的科学研究和应用提供了宝贵的资源。固氮细菌作为特殊的一类细菌，在地球微生物中具有重要地位，它作能够将大气中的氮‑气(N2)转化为植物可利用的氮化合物，如氨(NH3)和硝酸盐(NO3)，对地球生态系统的氮循环至关重要。氮是生物体合成蛋白质和核酸等生命必需物质的重要元素，但大部分生物无法直接利用大气中的氮气。固氮细菌通过固氮作用将氮气转化为可供其他生物利用的形式，进而促进了生物多样性和生态系统的健康发展。固氮细菌广泛存在于土壤、水体和植物根际等环境中，与植物之间形成了共生关系，例如豆科植物根瘤菌与豆类植物的根系结合，共同促进氮的固定和植物生长。此外，固氮细菌还可以与其他微生物共同生活，形成复杂的微生物群落，参与土壤有机质分解和营养循环等关键生态过程。对固氮细菌开展分类、生理特性、固氮机制以及与植物和其他微生物的相互作用等方面的研究有助于揭示地球生态系统的氮循环机制，提高农业生产效率，促进可持续发展。然而，固氮细菌的研究还面临一些挑战，如挖掘和合理利用固氮菌资源、固氮菌的开发利用、固氮效率的提高以及环境因素对固氮作用的影响。因此，进一步的研究仍然需要不断努力，以充分发挥固氮细菌在地球微生物中的重要作用。 [0004] 植物内生菌被认为至少是生活于健康植物某一阶段乃至整个生命周期体内不使植株出现明显病害的微生物，自1992年K1eopper等人首次提及后引起人们关注，其种类多样性决定了在其在生物控制领域、医药、林业等广泛应用，在农业可持续发展观念的强化和化学防治难以奏效的双重冲击下，微生物因来源广、数量大，成本较低等优点，得到了越来越广的研发空间，包括提高土壤肥力、修复土壤、提高作物产量和品质、提高作物抗逆性等。具有拮抗功能的微生物通过进入土壤后，建立与植物病原菌的竞争机制，抢占生态位点，进行营养物质和氧等的争夺，或者通过寄生、溶解的方式抑制病原菌，诱导作物自身产生抗性，降低发病率。前人报道拮抗菌株在代谢过程中产生的代谢产物可提高植物的抗病能力，或通过破坏病原菌细胞结构，使菌丝发生裂变扭曲，失去侵染能力。曾益波通过对光合细菌PSB06的促生抗病功能展开研究，发现菌株代谢产生胞外蛋白可有效抑制稻瘟病，Anming等人在金钗石斛茎中分离出一株抗拟盘多毛孢属的生物防治菌株Y‑1，并通过蛋白质组学研究确定其多肽类代谢产物抑制病原菌呼吸链中的能量产生和氨基酸生物合成的作用机制。 贝莱斯芽胞杆菌作为生物农药在控制农作物物病害具有一定的优势，其可产生一系列抗菌物质，如抗生素、酶和抗菌肽等，对多种植物病原菌具有抑制作用。挖掘和开发贝莱斯芽胞杆菌生物农药产品可有效降低化学农药使用量，降低对环境的污染和对人体健康的危害，同时提高作物产量和品质。然而，对于具体的应用情况，还需要根据不同的作物和病害选择合适的贝莱斯芽胞杆菌菌株和应用方式。 发明内容[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种含有贝莱斯芽胞杆菌的菌肥及其应用。 [0006] 本发明的第一个方面是提供贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在促进植物生长中的应用；所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。 [0007] 优选地，所述贝莱斯芽胞杆菌通过固氮和/或分泌IAA来促进植物生长。 [0008] 本发明的第二个方面是提供贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在促进种子萌芽、和/或促进种子提前进入露白期、和/或促进胚芽生长、和/或促进胚根生长、和/或增加植物地上部分鲜重、和/或增加植物地下部分鲜重、和/或促进植物根冠生长、和/或促进植物根系生长、和/或增加植物侧根数量中的应用；所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。 [0009] 本发明的第三个方面是提供贝莱斯芽胞杆菌或其发酵液在提高植物抗旱性中的应用；所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。 [0010] 本发明的第四个方面是提供一种含有贝莱斯芽胞杆菌的菌肥，所述贝莱斯芽胞杆菌命名为Bacillus velezensis QN3NO‑3(下文也称贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3)，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021304。 [0012] 优选地，所述菌肥还包括其他肥料营养元素。 [0013] 本发明的菌肥也可以根据实际使用需要添加肥料上可接受的辅料，比如制成固体肥料可添加载体基质(稻壳炭等)等，制成液体肥料可添加溶剂等。 [0014] 优选地，所述还包括肥料上可接受的辅料。 [0015] 本发明的贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3具有固氮作用，而且还可以分泌IAA，可以通过固氮和/或分泌IAA来促进植物生长，因此，本发明含有所述贝莱斯芽胞杆菌的菌肥也能促进植物生长。因此，本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的菌肥在促进植物生长中的应用。 [0016] 本发明的贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3能够促进种子萌芽，促进种子提前进入露白期、促进胚芽和胚根生长、增加植物地上和地下部分鲜重，促进植物根冠根系生长，增加植物侧根数量，因此，本发明含有所述贝莱斯芽胞杆菌的菌肥也能促进种子萌芽，促进种子提前进入露白期、促进胚芽和胚根生长、增加植物地上和地下部分鲜重，促进植物根冠根系生长，增加植物侧根数量。因此，本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的菌肥在促进种子萌芽、和/或促进种子提前进入露白期、和/或促进胚芽生长、和/或促进胚根生长、和/或增加植物地上部分鲜重、和/或增加植物地下部分鲜重、和/或促进植物根冠生长、和/或促进植物根系生长、和/或增加植物侧根数量中的应用。 [0017] 侧根在植物耐旱性中起重要作用，本发明的贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3能够增加植物侧根数量中，可以提高植物的抗旱性，因此，本发明含有所述贝莱斯芽胞杆菌的菌肥也能提高植物的抗旱性。因此，本发明的第七个方面是提供本发明第四个方面所述的菌肥在提高植物抗旱性中的应用。 [0018] 本发明的贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3具有广谱抗菌性，对番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、菜心炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、玉米弯孢菌叶斑病菌、玉米链格孢叶枯病菌、小麦赤霉病菌、小麦赤霉病菌、杧果拟盘多毛孢叶枯病菌、水稻稻瘟病菌、芒果炭疽病菌等具有良好的抑制作用，因此，本发明含有所述贝莱斯芽胞杆菌的菌肥也对上述致病菌具有抑制作用。 [0019] 因此，本发明的第八个方面是提供本发明第四个方面所述的菌肥在拮抗番茄枯萎病菌、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或玉米弯孢菌叶斑病菌、和/或玉米链格孢叶枯病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或杧果拟盘多毛孢叶枯病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。 [0020] 本发明的第九个方面是提供本发明第四个方面所述的菌肥在防治番茄枯萎病菌、和/或香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或香蕉炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或玉米弯孢菌叶斑病菌、和/或玉米链格孢叶枯病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或杧果拟盘多毛孢叶枯病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或芒果炭疽病菌所致病害中的应用。 [0021] 本发明的第十一个方面是提供一种促进植物生长的方法，对植物施用如本发明第五个方面所述的菌肥。 [0022] 本发明的贝莱斯芽胞杆菌具有广谱抑菌活性，对番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、菜心炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、玉米弯孢菌叶斑病菌、玉米链格孢叶枯病菌、小麦赤霉病菌、小麦赤霉病菌、杧果拟盘多毛孢叶枯病菌、水稻稻瘟病菌、芒果炭疽病菌等具有良好的抑制作用，而且该菌株具有高效固氮和产IAA能力，能促进植物的生长，比如能够有效促进种子萌芽、促进种子提前进入露白期、促进胚芽胚根生长、增加植物鲜重、促进植物根冠和根系生长、植物侧根数量，还能提高植物的抗旱性。该菌株还具有产解纤维素酶(切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β‑葡萄糖苷酶、滤纸纤维素酶等)、几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶等活性，能高效降解纤维素，破坏真菌细胞壁。 [0023] 本发明将所述贝莱斯芽胞杆菌制成菌肥，可以充分发挥贝莱斯芽胞杆菌的抑菌、固氮能力和其他生物学特性，可以减少对农药、化肥的依赖，提高农作物的产量和品质，同时降低对环境的负面影响，在农业和环境领域中具有广泛的应用潜力。附图说明 [0024] 图1为QN3NO‑3菌体扫描电镜结果和革兰氏染色结果。 [0025] 图2为菌株QN3NO‑3部分生理生化实验。 [0026] 图3为菌株QN3NO‑3产IAA能力测定结果。 [0027] 图4为IAA含量标准曲线。 [0028] 图5为菌株QN3NO‑3解纤维素能力测定(Image J截图)结果。 [0029] 图6为菌株QN3NO‑3发酵液中的纤维素酶活力测定。 [0030] 图7为菌株QN3NO‑3处理后玉米种子萌芽情况。左图：1‑3d萌芽情况；右图：第三天萌芽情况。 [0031] 图8为双皿对扣法测定菌株挥发物的抑菌活性。 [0033] 图10为菌株QN3NO‑3发酵液上清液对几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶活性测定。 [0034] 图11为菌株QN3NO‑3广谱抑菌活性研究结果。 具体实施方式[0035] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0036] 1材料 [0037] 1.1样品来源及处理 [0038] 对海南省澄迈县桥头镇诺尼种植园(N 19°58′9″，E 109°55′19″)诺尼活株果实进行多点采样，装袋编号，4℃保存。 [0039] 1.2培养基 [0042] 纤维素刚果红培养基：微晶纤维素1.88g，刚果红1g，明胶2.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.0。 [0043] 1.3主要试剂： [0044] DNS试剂：称量3,5‑二硝基水杨酸10g溶于500ml蒸馏水中，加入20g氢氧化钠、200g酒石酸钾钠，将溶液加热溶解后加入2g苯酚和0.5g无水亚硫酸钠，待溶质溶解后冷却至室温，定容至1000ml。试剂保存于棕色容量瓶中，放置一周后过滤使用； [0046] 微晶纤维素底物溶液：称取0.5g微晶纤维素溶于100ml醋酸钠缓冲溶液中； [0047] 滤纸底物溶液：称取0.5g的滤纸浸于100ml的醋酸钠缓冲溶液中； [0048] 标准葡萄糖溶液：将27.0g葡萄糖溶于25ml蒸馏水中，配置6mol/L的葡萄糖溶液。根据表1配置葡萄糖溶液标准曲线； [0049] 1.10mol/L氢氧化钠：称取400g分析纯级别氢氧化钠溶于500ml蒸馏水中，然后定容到1L； [0051] 高效凯氏定氮催化剂片。 [0052] 1.4供试作物： [0053] 供试材料为玉米，品种为美玉16号，由海南绿川种苗有限公司提供的加甜糯品种。 [0055] 采用Image J(Version 1.38)软件测算灰度面积，采用Microsoft Excel 2007软件和单因素方差分析实验数据，运用邓肯氏新复极差检验法(DMRT法)进行差异显著性分析。 [0056] 2实验方法与结果 [0057] 2.1内生细菌分离、筛选 [0059] 样品印迹实验：采用组织印迹法将样品贴放于LB培养基中5min，28℃培养3d作为无菌检查。 [0061] 分离筛选：用无菌水进行梯度稀释(10‑1、10‑2、10‑3)制成悬浮液，充分振荡后取200μL稀释液用平板涂布法在阿须贝氏培养基上均匀接种，重复3次，28℃下倒置暗箱培养5d，选择形态及长势较好、生长速度较快的不同菌落，用接种环平板划线法多次纯化于新的固体阿须贝氏培养基上至纯培养。 [0062] 本研究对诺尼果实样品进行消毒制成悬浮液，通过稀释平板法初步分离纯化到71株内生细菌，选取5株优势菌进行固氮及促生功能复筛(固氮功能复筛参照“2.2固氮能力鉴定及活性测定”，促生功能复筛参照“2.6菌株对玉米生长的生物活性影响”)，挑取其中效果最佳的1株作为研究对象，命名QN3NO‑3。该菌落在LB培养基上呈不规则圆形，黄灰色，不透明，表面光滑有褶皱，边缘波动曲线状，中央隆起，菌体椭圆或短杆状，革兰氏染色紫红色属阳性菌(图1)。培养时间延长菌落趋向干燥扁平、边缘褶皱不规则。 [0063] 2.2菌株的生理生化鉴定 [0064] 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出来的拮抗菌株进行生理生化鉴定。 [0065] (1)单一碳源利用实验：在细菌的生理生化鉴定中，菌株对碳源的利用情况是一项重要的指标。不同的细菌对碳源的利用情况不同。单一碳源利用实验就是将单一的碳源按照1％的浓度加入普戈二氏的基础培养基中，然后接入待鉴定的菌株，在28℃下培养一到两周，另外将菌株接入不加任何碳源的基础培养基上作为空白对照，观察菌株在各个培养基上的生长情况。若能生长，则为阳性，表明该菌株具有利用该碳源的能力，若不能生长，则为阴性，表明没有利用该碳源的能力。碳源包括：α‑乳糖、D‑果糖、D‑半乳糖、D‑甘露醇、葡萄糖、甘露醇、无水乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、山梨醇、肌醇、松三糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、蜜二糖等。 [0066] (2)单一氮源利用实验：跟碳源利用情况不同一样，不同细菌对氮源的利用情况也不同。将单一氮源按照0.5％的浓度加入氮源基础培养基中，制成平板，然后接入菌株，另外将菌株接入不加任何氮源的基础培养基上作为空白对照，在28℃下培养一到两周，观察菌株的生长情况。若能生长，则为阳性，表明该菌株具有利用该氮源的能；若不能生长，则为阴性，表明不具有利用该氮源的能力。加入的氮源包括：胰蛋白胨、天门冬酰胺、缬氨酸、组氨酸、草氨酸、硫酸铵、乙酸铵、氯化铵、四水合钼酸铵、硝铵酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、安氨酸、精氨酸、丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。 [0067] (3)淀粉水解实验：将营养琼脂培养基作为基本培养基，在此基础上加入1％可溶性淀粉。采用点接法(即接种直径＜0.5cm)将拮抗菌株接到配制的平板上，28℃培养一周后，将碘液滴加在菌落周围。如果在菌落周围存在透明圈，则该结果为阳性，菌株能够产生淀粉酶，而透明圈的直径则表示产生的淀粉酶的活性大小；如果不产生淀粉酶，则整个平板都会显示蓝色。 [0068] (4)明胶液化实验：将待鉴定菌株接种于装有明胶培养基的试管中，然后在28℃下培养，在第5、10、20、30d观察明胶的液化情况。如果有液化现象，则为阳性，表明该菌株具有液化明胶的能力，反之，则为阴性。 [0069] (5)纤维素分解实验：按照配方，配制纤维素分解培养基，然后将滤纸条的一段浸入液体培养基中，将培养基进行灭菌，将菌株接种在培养基中，静置培养，一个月后观察滤纸条是否分解，若分解，则阳性，说明产生了纤维素分解酶，反之，则阴性。 [0070] (6)硝酸盐还原：按配方配制硝酸盐还原培养基，将菌株接入培养基中，28℃下静置培养7d和14d，以不接菌株的培养基作为空白对照。取空白试管，将少许的7d和14d培养液分别加入不同试管中，同时分别滴加之前配制的A液和B液。若溶液呈现粉红、玫瑰红、棕色或者橙色，则硝酸盐还原为阳性；若无上述颜色出现，再滴加1或2滴二苯胺试剂，溶液呈蓝色，则依然是阴性，反之，则按阳性对待。 [0071] (7)脲酶实验：按配方配制脲酶培养基，将待测菌株接种到脲酶培养基上，28℃下倒置培养4d后，观察培养基的颜色变化。如果待测菌株具有产生尿素酶的能力，则培养基会变成桃红色，为阳性，不变色，则为阴性。 [0072] (8)脂酶(吐温20、40、80)实验：配制好脂酶培养基后，将单独封装的吐温20、40、80一起进行灭菌，将吐温与培养基混合制板。将菌株接种于平板上，培养一到两周，观察平板，若在菌落周围有模糊的晕圈产生，则为阳性，反之，则为阴性。 [0073] (9)盐耐受性实验：配制具有不同NaCl浓度(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)的培养基，培养基的其他成分均相同，将待鉴定菌株接种于这些培养基上，在28℃下培养下，每周观察一次，培养四周，最终记录菌株是否在培养基上生长，以确定待鉴定菌株对NaCl的耐受能力的上限与下限浓度。 [0074] (10)pH耐受实验：将液体培养基的pH值分别调整到4、5、6、7、8、9、10，将待测菌株分别接入不同pH值的培养基中，保证其他的培养条件一致，28℃下振荡培养，每周观察一次，培养四周，最后确定菌株在各个培养基上的生长情况。确定菌株能够生长的pH值的上限与下限及最适pH值。 [0075] 实验测定结果显示，QN3NO‑3在淀粉水解、明胶液化、脲酶试验、酶促试验中呈阳性反应；在酶脂实验中只对吐温40敏感；在甲基红、丙二酸、磷酸盐还原、硫化氢试验中无反应，呈阴性。在pH4‑10中均可生长，最适生长环境为pH9；耐盐实验中NaCl浓度1％‑9％中可生长，11％‑15％无生长。 [0076] 根据碳氮源利用实验结果，QN3NO‑3可利用α‑乳糖、D‑果糖、D‑半乳糖、D‑甘露醇、葡萄糖、甘露醇、无水乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、山梨醇、肌醇、松三糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、蜜二糖等碳源；可利用氮源较少，如胰蛋白胨、天门冬酰胺、缬氨酸、组氨酸和草氨酸等，不可利用硫酸铵、乙酸铵、氯化铵、四水合钼酸铵、硝铵酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、安氨酸、精氨酸、丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。 [0077] 根据合形态、培养及生理生化特征，初步鉴定该菌为Bacillus velezensis QN3NO‑3(中国典型培养物保藏中心.武汉，CCTCC NO：M 2021304，2021年3月30日)。 [0078] 表1 QN3NO‑3菌株生理生化特征分析 [0079] [0080] [0081] 2.3固氮能力鉴定及活性测定 [0082] 将菌株用灭菌牙签将待测菌株挑入Ashby无氮固体培养基，传代6代，能良好生长说明有固氮能力，无法长出说明不具固氮能力。 [0083] 利用凯氏定氮法测定菌株固氮活性，用接种环挑取优势固氮菌于LB培养液中发酵培养2天，发酵液在4℃下以10000rmp离心10min去上清，将菌体置于研钵中用液氮快速研磨，称取1g于干燥的消煮管底部，加入少量水润湿，加入5mL浓硫酸和2片高效凯氏定氮催化剂片。将消煮管进行消煮，等到消煮管中的溶液变为灰白捎带绿色后，再继续消煮一段时间即可。将消煮管取下。利用全自动凯氏定氮仪测量各个经过消煮的培养液中的氮含量。 [0084] 利用Kjeltec 8200凯氏定氮仪测定菌悬液中含氮量，在催化剂条件作用下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，计算出样品中的氮量为152.75mg/L，蛋白质含量为954.69mg(蛋白质含量＝含氮量/16％)，说明该菌株具高效固氮能力。 [0085] 2.4产IAA能力鉴定及活性测定 [0086] 制备含100mg/Lα‑氨基吲哚基丙酸的液态LB，接入待测菌株，设3个重复，室温下180r/min培养2d，吸取培养后的菌悬液50μL于白色点滴板上，对照设置2组：50μL未接菌LB为阴性对照，50μL浓度为50μg/mL的IAA液为阳性对照，三者同时加入50μL Salkowski比色液，常温下避光静置15min，颜色不变色为阴性，不产IAA；变粉红则为产IAA菌，可进行IAA含量测定。 [0087] 配制IAA母液(100μg/mL)，分别在25mL的定容瓶中定容浓度为0、10、20、30、40、50、60μg/mL的IAA溶液，用紫外分光光度计测定OD530nm，绘制IAA标准曲线。吸取菌悬液于离心管内放置入初始转速为12000r/min的离心机内10min，离心弃沉淀，吸取4mL上清液混合等体积的Salkowski比色液，以不加上清液为空白对照，判定方法同上，根据IAA标准曲线计算菌株IAA产量。 [0088] 根据Salkowski比色法鉴定结果(图3)，菌株QN3NO‑3混合液与IAA阳性对照组呈粉红色，而未接菌阴性对照组无颜色变化，说明菌株QN3NO‑3可分泌IAA。利用紫外分光光度计测定结果绘制IAA(图4)，计算QN3NO‑3在含L‑色氨酸LB培养基下分泌IAA量为40.61±0.43μg/mL。 [0089] 2.5解纤维素能力鉴定及纤维素酶活性测定 [0090] 用接种环将细菌样品在纤维素刚果红培养基上划线，28℃恒温培养2‑3d后，待菌落生长后观察培养基的菌落周围是否产生透明圈，设置三个重复。产生透明圈说明该菌种可产解纤维素酶，根据透明圈大小初步判断纤维素酶活性。拍照采集后运用Image J软件测算平板上不规则透明圈灰度面积(pix)和菌落面积(ar)，求两者的比值，并且计算AR/ar比值，比值的大小可以初步反映菌株产生纤r维素酶的活力大小。运用Excel 2007和方差分析软件进行实验数据换算及分析。 [0091] 计算“比值”公式： [0092] 比值(AR/ar)＝菌落面积(pix)/透明圈面积(pix)。 [0093] 根据平板划线观察结果(图5)，纤维素刚果红培养基上产生大面积透明圈，说明QN3NO‑3可产解纤维素酶。利用Image J(Version 1.38)软件测定平板上不规则透明圈面积(AR)平均值为12690.33pix、菌落面积(ar)平均值为823.33pix，两者比值AR/ar为15.41。可见该菌株产生纤维素酶活力较强，可进行鉴定及后续实验。 [0094] 将培养2d的菌悬浮液(108CFU/mL)取2mL接种到含有100mL CMC液体培养基的250mL烧瓶中，在28℃下振荡150r/min培养2天。发酵液在4℃下以10000rmp离心5分钟，上清液用作酶提取液。通过测定微晶纤维素(MCC)、羧甲基纤维素(CMC)和水杨酸(SAL)的还原糖释放量，测定外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶的活性。总纤维素酶活性用滤纸纤维素酶活性(FPA)表示，用Ghose(1987)所述的滤纸分析法测定，以Whatman 1号滤纸为底物。根据540nm处的二硝基水杨酸(DNS)方法测定纤维素酶活性，并进行单糖分析。用不同浓度的D‑葡萄糖溶液作校正曲线。所有样品在540nm处用紫外可见分光光度计测量。酶活性的单位(U)定义为每毫升发酵上清液每分钟释放1μmol(β‑葡萄糖苷酶为2μmol)还原糖(以葡萄糖计)的酶量。 [0095] 纤维素酶活性测定结果如图6所示，培养2d后，外切葡聚糖酶活力为61.81IU/mL，内切葡聚糖酶活力为47.11IU/mL，β‑葡萄糖苷酶活力为53.31IU/mL，滤纸纤维素酶活力为29.47IU/mL，表明QN3NO‑3株具有良好的产内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β‑葡萄糖苷酶等酶活性，说明该菌株能高效降解纤维素能力。 [0096] 2.6菌株对玉米生长的生物活性影响 [0097] 将玉米种子置于冰箱4℃春化3天，取出置于10％(v/v)次氯酸钠内进行表面消毒‑115min，用无菌水反复清洗5次。将消毒好的玉米种子在菌悬浮液(×10 )中浸泡60min后排列放置在带灭菌滤纸的培养皿内28℃黑暗培养3天，静待发芽，统计萌芽率。后转至透明培养箱内至7天，收集整株幼苗，并在清水中缓慢洗涤滤纸附着物，记录根和地上部分的长度和鲜重，计算幼苗生长指标(地上鲜重g、地下鲜重g、胚芽长cm、胚根长cm、侧根数量pcs，根冠比)。对照组是未接种菌株的培养液，每个处理重复3次，每次10粒玉米种子。 [0098] 萌芽率＝(发芽种子数/总种子数)×100％；根冠比＝根鲜重/地上部鲜重。 [0099] 玉米种子经过菌悬液(10‑1)处理，以培养基为对照，培养3天后，种子萌芽率分别为93.99％和77.78％，并且在培养第一天菌悬液处理组已出现93.99％的种子露白，对照组仅有66.67％；第二天QN3NO‑3菌悬液促进玉米种子胚根生长发，胚芽也得到迅速膨大，经培养基处理中80％种子露白。两组处理存在显著差异性，说明菌株可使玉米种子提前进入露白期，稳定性好，对玉米具有催芽效果(图7)。 [0100] 玉米幼苗素质的好坏在很大程度上影响后期生长和产量，健壮的幼苗生物活性一般较强。玉米种子接种贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3生长至7天后，测量玉米幼苗生物活性指标，结果表明接种QN3NO‑3的玉米幼苗与未接种的对照组相比，在胚芽、胚根的长度和鲜重上都有显著的促进作用，对侧根数量也有一定增量作用。QN3NO‑3菌株促使玉米幼苗比未接种幼苗的地上和地下鲜重分别增加了35.29％和80％，根冠比也从0.60提高至0.80，显著促进玉米幼苗地下部分根系生长，进而促进地上部分生长量。菌株处理组胚芽6.04cm比培养基处理长2.22cm；胚根平均长度为11.45cm，是培养基组的1.56倍，显著增强了根系机能活性。侧根在玉米的耐旱性中起重要作用，幼苗期培养基组为侧根数量8.07，菌株处理后为8.3。以上结果表明，QN3NO‑3能促进玉米幼苗生长发育，并对根系生长发挥重要的作用。 [0101] 2.7平板对峙培养法测定菌株广谱抑菌活性 [0102] 供试病原菌：番茄枯萎病菌F.oxysporum f.sp.lycopersic、香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)、香蕉枯萎病菌1号生理小种Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.cubense Race 1(ATCC MYA‑3244)、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum sp.Cucumebrium(ACCC 30220)、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici(ATCC 96157)、草莓炭疽菌Colletotrichumfragariae(ATCC 58718)、荔枝炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides(ATCC 58691)、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae(ATCC 96167)、菜心炭疽病菌Colletotrichum higginsianum(KACC 40807)、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(ATCC 58222)、玉米弯孢菌叶斑病菌Curvularia lunata(ATCC 60937)、玉米链格孢叶枯病菌Alternaria tenuissima(ATCC 26276)、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe(ATCC MYA‑4620)、板栗疫病菌Cryphonectraa paraitica、杧果拟盘多毛孢叶枯病菌Pestalotiopsis mangiferae(MTCC 3412)、水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea(ATCC 208987)和芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides(ATCC MYA‑4131)。 [0103] 配制PDA培养基平板，用打孔器取下培养5d、长势良好的病原菌菌饼(Φ＝5mm)，置于PDA平板中央，以平板中央为中心画“十”，在“十”字4条边上距中心2.5cm处，接种供试菌株，每皿接4处，设3个重复，以只接种病原菌作为对照，28℃倒置培养5‑7d后，计算抑菌率，抑菌率＝(对照菌落直径‑处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。结果如表2和图11所示，菌株QN3NO‑3对香蕉、番茄、芒果、橡胶、水稻等17种寄主作/植物病原菌具广谱抗性。 [0104] 表2菌株广谱抑菌活性研究结果 [0105] [0106] 2.8双皿对扣法测定菌株挥发物的抑菌活性 [0107] 测定微生物源挥发性抑菌物质抑菌活性的方法使用“双皿对扣法”。将QN3NO‑3菌株划线于LB培养基上，于28℃的培养箱中孵育2d。然后再将番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病四号生理小种菌饼(Φ＝5mm)分别接于PDA平板的中心位置，再分别与生长2天的菌株QN3NO‑3对扣，两平板用封口膜封住，与空LB培养皿对扣的平板作为对照。于28℃的培养箱中继续孵育7d。重复3次。测得QN3NO‑3菌株可释放挥发性物质抑制番茄枯萎病菌和香蕉枯萎病菌生长，利用ImageJ软件测量病原菌直径。 [0108] 抑菌率＝(对照菌落直径‑处理菌落直径)/对照菌落直径×100％ [0109] 抑菌率分别为49.22％和42.16％。 [0110] 2.9菌株发酵液上清液和粗蛋白的研究 [0111] (1)QN3NO‑3发酵液上清液和硫酸铵粗蛋白对番茄枯萎病菌拮抗测定 [0112] 将培养2d的菌悬浮液(108CFU/mL)取2mL接种到含有100mL CMC液体培养基的250mL烧瓶中，在28℃下振荡150r/min培养2天。发酵液在4℃下以10000rmp离心5分钟，上清液即为QN3NO‑3发酵液上清液，测定抑菌率。 [0113] 利用硫酸铵分级沉淀法，在离心条件为4℃、12000r/min、30min的离心机中分批次高速离心1L发酵液原液，弃沉淀后，向上清液分次缓慢放入相应量的硫酸铵至20％、30％、50％、70％、80％溶液终浓度，搅拌至清澈，得到不同饱和浓度的上清液于4℃冰箱中静置沉淀24h。用50mL的离心管分装后置于离心机中4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀沉淀。在烧杯中将以上各级沉淀加入少量10mmol/L PBS缓冲液直至溶解，置入已加入相同浓度PBS缓冲液的透析袋于4℃静置过夜，透析除盐后的溶液用过滤器除菌得到发酵液粗蛋白液，测定抑菌率。 [0114] 抑菌率测定：以无菌水为对照，采用平板打孔抑菌试验分别测定QN3NO‑3发酵液上清液和发酵液粗蛋白液的抑菌活性。在PDA平板中心距边缘25mm处用孔径7mm的打孔器进行打孔，每孔加入100μL各处理液，每个处理重复3次，平板中心位置加入病原真菌(番茄枯萎病菌)。常温下培养待对照平板长满真菌后，利用ImageJ软件测量QN3NO‑3发酵液处理液和不同浓度梯度的粗蛋白溶液的病原菌直径，抑菌率＝(对照菌落直径‑处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。 [0115] 结果如图9所示。QN3NO‑3上清液可拮抗番茄枯萎病菌，抑菌率为49.11％，不同浓度的硫酸铵粗蛋白对番茄枯萎病菌也有明显抑制效果，抑菌率达到46.39％以上。 [0116] (2)菌株发酵液上清液几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶活性测定 [0117] QN3NO‑3菌株在无菌LB液体培养基中28℃，180rpm孵育5d收集菌悬液，8000rpm离心15min。分别于每天收集上清测定几丁质酶活性和β‑1,3‑葡聚糖酶活性。 [0118] 结果如图10所示。致病真菌的细胞壁成分主要由几丁质和葡聚糖组成，实验数据表明，贝莱斯芽胞杆菌QN3NO‑3在不同培养时期可产生几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶。孵育至5d，几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶活性最高，分别为19.79±0.52U/mL和15.19±0.38U/g。结合抑菌实验，说明几丁质酶可以通过降解几丁质来削弱或破坏真菌细胞壁的结构完整性，直接抑制多种植物病原真菌的生长发育。此外，β‑1,3‑葡聚糖酶通过降解β‑1,3‑葡聚糖水解真菌细胞壁的另一个关键成分，这两种酶导致渗透失衡、细胞裂解和真菌生长抑制。几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶活性为生物防治剂的抑菌机理提供了依据，了解这些酶的存在和活性可以进一步支持植物病原体管理生物防治策略的开发和优化。 [0119] 2.10农药抗敏性实验 [0120] 通过琼脂稀释法进行QN3NO‑3菌株药敏实验：制备含各种杀菌剂的琼脂稀释平板(3个浓度，每个浓度3次重复)进行QN3NO‑3划线接种，观察菌株长势，结果如表3所示。根据结果研判，QN3NO‑3菌株在甲基硫菌灵、中生菌素、代森锰锌、多菌灵、敌克松、甲霜灵、恶霉灵7种备选广谱杀菌剂中均可生长，在代森锰锌浓度过高时抑制生长、长势不佳，在多菌灵浓度达500％时任长势极佳。说明QN3NO‑3菌株作为微生物源肥在现今农药残留问题严重的农业行业中具有一定的开发潜力，可替代杀菌剂抑制细菌、真菌类病原菌，也可在受农药残留污染的农田中正常繁殖促进植物生长。 [0121] 表3菌株农药抗敏性研究结果 [0122] [0123] [0124] 注：+：微长，++：正常生长，+++：大量生长，‑：不长。 [0125] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。 |
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