[0001] 本发明涉及一株既能促进牧草生长，又能在低温条件下促进堆肥发酵的多功能荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，属于农业生物技术科学领域。

[0002] 畜牧业会产生大量粪肥，粪便返回到草场，是维持草场土壤营养平衡的重要举措。生粪中含有大量有害微生物，寄生虫卵等，直接施用会导致病虫害的传播，污染环境；同时，生粪直接施用于土壤后，粪便发酵产生的NH3和H2S等有毒物质会导致“烧苗”现象，不利于作物的生长。因此，需要对生粪进行无害化处理后再作为有机肥使用。高温好氧堆肥是处理畜禽粪便较为经济有效的处理方式，接种外源微生物可加快高温好氧堆肥进程，可缩短发酵周期、高温持续时间延长、减少氮损失、提高堆肥品质，加快纤维素的降解，使堆肥快速进入腐熟阶段。但是，我国的草场多在北方，冬季气温低，持续时间长，致使堆肥无法升温，无法完成高温发酵，或发酵不彻底，从而无法杀灭堆肥中的各类病原菌，导致堆肥发酵无法启动、发酵周期延长、降低堆肥质量，开发能在低温条件下启动发酵的腐熟剂具有重要价值。
另一方面，普通堆肥腐熟剂基本上都只关注堆肥能否升温，不关注堆肥发酵菌本身对植物的影响。堆肥成熟后，主要是堆肥腐熟后，利用堆肥本身的营养促进植物生长。而利用植物益生菌作为腐熟剂，在堆肥发酵过程中，植物益生菌可以通过产生对植物有益的次生代谢产物，以及益生菌在堆肥中，会有部分残留，在堆肥施用到土壤中后，会在土壤中进一步发生促进植物生长的作用。这样，相较于直接培养植物益生菌，益生菌的培养成本更低。同时，由于堆肥发酵时间较长，益生菌产生的次生代谢产物更丰富。

[0003] 本发明的目的在于提供一种既能促进牧草生长，又能在动低温条件下，快速启动堆肥发酵的菌株，既解决冬季堆肥发酵困难的问题，又能使堆肥具有更加广泛的生理活性，有利于农业生产。

[0004] 本发明采用如下技术方案实现。

[0005] 一株细菌，所述细菌为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens北6TLR1；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号为GDMCC No:62684；保藏时间为2022年8月4日。

[0006] 本发明所述细菌的应用为使用菌株本身促进牧草生长。

[0007] 本发明所述细菌在低温条件下使用该细菌作为发酵剂应用于堆肥发酵。

[0008] 本发明所述细菌的应用为施用完成发酵的堆肥促进盆栽黑麦草的生长。

[0009] 本发明所述细菌发酵剂的制备方法步骤为：步骤1：将Pseudomonas fluorescens北6TLR1进行活化培养：将菌种北6TLR1在LB培养基上培养，15～30℃恒温培养箱中黑暗培养1‑3天，获得活化后的菌株；

[0010] 步骤2：将活化后的菌株进行一次发酵培养：将活化后的菌株于LB培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h；

[0011] 步骤3：将一次发酵培养后的种子液进行二次发酵培养：将所述一次发酵培养获得的种子液以4～10wt％的接种量接种于LB培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h制得发酵剂。

[0012] 本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂均匀撒到堆肥原料上，翻拌均匀，用量为堆体质量的0.2％‑4％。

[0013] 本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂加入灭菌后的辅剂，低温干燥后制成菌粉，在堆肥时按比例加入至堆肥堆体中。

[0014] 本发明所述辅剂为麦麸。

[0015] 本发明该细菌从中国云南省昭通市大关县牧草根际土壤中分离得到。

[0016] 本发明该细菌的培养基为LB培养基。

[0017] 本发明该细菌能够在0℃条件下生长，且能够在堆肥中生长，用于在低温条件下启动堆肥发酵。

[0018] 本发明该细菌发酵剂能用于低温堆肥发酵。

[0019] 本发明的有益效果为：1、该菌株能够在牛粪中生长，可以用于牛粪的堆肥发酵；2、该菌株能在0℃条件下生长，可以在低温条件下启动堆肥发酵；3、该菌株对黑麦草具有良好的促生长效果，故采用本发明制备的堆肥相对于普通堆肥腐熟剂，比普通堆肥更好的促进牧草生长的效果。

[0020] 下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

[0021] 图1为本发明菌株的正面图与反面图；

[0022] 图2为本发明菌株的系统发育树；

[0023] 图3为本发明使用菌株对牧草各项农艺性状起到促进作用的测量结果；

[0024] 图4为本发明使用菌株本身对牧草生长起到促进作用的对比图；

[0025] 图5为本发明菌株发酵剂使用时的堆肥现场图。

[0026] 见图1，图2所示。

[0027] 一株细菌，所述细菌为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens北6TLR1；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号为GDMCC No:62684；保藏时间为2022年8月4日。

[0028] 菌株名：北6TLR1

[0029] 以细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩增

[0030]

[0031] 1.细菌总DNA的提取

[0032] 在100ml无菌水中加入5g chelex‑100混匀，用灭菌竹签在每个斜面培养基中挑取适量菌体置于PCR管中，各加入100μl chelex‑100水溶液，充分震荡使菌体分散后，使用PCR仪，99℃孵育20min，离心取上清即为菌体总DNA，可直接用于细菌16srRNA的扩增。

[0033] 2.PCR扩增

[0034] 反应体系：总体系为25.0μl

[0035]

[0036] PCR反应程序如下：

[0037]

[0038] 3.PCR产物的检测——1％琼脂糖凝胶电泳

[0039] (1)配制1％琼脂糖凝胶：称量琼脂糖0.4g，量取1×TAE缓冲液40ml，共同倒入三角瓶内，微波炉加热熔化后，加入0.5μl核酸染料混匀，倒入凝胶槽，插入25孔制胶梳，待凝胶冷却后拔出梳子，确保凝固过程中不要产生气泡。

[0040] (2)点样：各取5μl PCR扩增产物加入点样孔中，最后一个点样孔加入5μlDL2000Marker。

[0041] (3)电泳：设置程序140V、20min，按“start”开始运行。

[0042] (4)取出凝胶块，使用凝胶成像分析仪观察，目的片段长度在1500bp左右，对比DL2000Marker看是否有正确条带。

[0043] 4.菌种16srRNA鉴定

[0044] 扩增成功的PCR产物于擎科生物科技有限公司进行测序，如下：GGCGGAGGGCTACCATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTAGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACTTCAATGAACTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGAACATTGAAAAGGTGTTGCATGGTGGCCCCACTCCGGGCCGGAAAGTTGGGTAAACCCCGACAGAGG。

[0045] 5.系统发育树构建

[0046] 测序结果通过EZbiocloud进行序列比对，去LPSN下载假单胞菌属的模式种序列。以假单胞菌属(Pseudomonas)为本系群，在假单胞菌属水平上使用软件MEGA构建其NJ系统发育树。

[0047] 见图3，图4，图5所示。

[0048] 本发明所述细菌的应用为使用菌株本身促进牧草生长。

[0049] 本发明所述细菌在低温条件下使用该细菌作为发酵剂应用于堆肥发酵。

[0050] 本发明所述细菌的应用为施用完成发酵的堆肥促进盆栽黑麦草的生长。

[0051] 本发明所述细菌发酵剂的制备方法步骤为：步骤1：将Pseudomonas fluorescens北6TLR1进行活化培养：将菌种北6TLR1在LB培养基上培养，15～30℃恒温培养箱中黑暗培养1‑3天，获得活化后的菌株；

[0052] 步骤2：将活化后的菌株进行一次发酵培养：将活化后的菌株于LB培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h；培养结束时OD600为1.0‑1.2；

[0053] 步骤3：将一次发酵培养后的种子液进行二次发酵培养：将所述一次发酵培养获得的种子液以4～10wt％的接种量接种于LB培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h制得发酵剂。

[0054] 本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂均匀撒到堆肥原料上，翻拌均匀，用量为堆体质量的0.2％‑4％。

[0055] 配方设计：取新鲜牛粪1吨，北6TLR1菌液20L，作物秸秆粉30kg。

[0056] 建立堆体：先在地上铺一层谷草，然后将部分发酵菌液用喷壶均匀喷洒在秸秆粉上，接着覆盖一层牛粪，再铺一层秸秆粉，洒菌，再铺牛粪，重复操作，直至将菌液完全加入堆内，该操作的目的是使菌液在堆肥中分布均匀。将堆体中牛粪与谷草翻拌均匀，堆成高1.2m的四棱柱形堆体，用大棚布将其覆盖防止落入雨雪。

[0057] 后续的翻堆和其他管理措施和普通堆肥相同。

[0058] 本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂加入灭菌后的辅剂，低温干燥后制成菌粉，在堆肥时按比例加入至堆肥堆体中。本发明所述辅剂为麦麸。

[0059] 本发明该细菌从中国云南省昭通市大关县牧草根际土壤中分离得到。

[0060] 本发明该细菌的培养基为LB培养基。

[0061] 本发明该细菌能够在0℃条件下生长，且能够在堆肥中生长，用于在低温条件下启动堆肥发酵。

[0062] 本发明该细菌发酵剂能用于低温堆肥发酵。

[0063] 以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。