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一种氰化物降解菌剂及其在降解氰化物中的应用
申请号	CN202410055470.1	申请日	2024-01-15	公开(公告)号	CN117866836A	公开(公告)日	2024-04-12
申请人	上海第二工业大学;			发明人	郑春丽; 段耀庭; 樊丽; 苏瑞景; 刘诺; 吴俊;
摘要	本发明公开了一种氰化物降解菌剂及其在降解氰化物中的应用，属于土壤修复技术领域，所述氰化物降解菌剂所用菌株为解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusthiaminolyticus sp.)LS‑1，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为27817，本发明解决了工程实际应用中菌液扩培和发酵过程中易染菌、有效活菌数低和运输困难等瓶颈问题，且微生物通过氧化、水解、吸附和替代/取代作用破坏氰根离子，将其降解为二氧化碳和氨，并用作自身生长代谢的能源物质，因此具有成本低、操作简便、安全、绿色高效且不改变尾矿原有的结构等优势，具有良好的应用前景。
权利要求	1.一种解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusthiaminolyticus sp.)LS‑1，其特征在于，所述解硫胺素芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为27817。 2.一种微生物菌粉，其特征在于，包含权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1。 3.如权利要求2所述的微生物菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、菌种活化：将权利要求1‑2任一项所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1在无菌条件下转移至20℃～30℃的条件下活化12h～24h，得到活化后的菌株； S2、菌液制备：将步骤S1中所制备的活化后的菌株接种至培养基中于150‑200r/min、30～35℃摇床内培养20～48h，得到发酵菌液； S3、大规模菌液发酵：将步骤S2中所得到的发酵菌液进一步接种于含液体发酵用培养基的发酵罐中，以7L‑50L‑8L逐级发酵的方式进行，得到大规模发酵菌液； S4、真空干燥：将步骤S3中所得到的大规模发酵菌液在‑0.08MPa条件下，35℃干燥24～ 36h得到微生物菌粉。 4.根据权利要求3所述的微生物菌粉的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养基的成分包括：葡萄糖10.0g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸钙0.2g/L、磷酸氢二钾 0.2g/L，所述培养基的pH值为7.8。 5.根据权利要求3所述的微生物菌粉的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述液体发酵用培养基的碳源选用糖蜜、麸皮、玉米粉、可溶性淀粉和蛋白胨；培养基氮源选用硫酸铵、硝酸钠、磷酸氢二氨和牛肉膏；吸附性载体选用滑石粉；所述液体发酵条件为：恒温30± 3 1℃、搅拌速度250～300rpm、通风量0.25～0.30M/min、罐压0.035～0.055MPa，持续发酵36～48h。 6.一种如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或权利要求2所述的微生物菌粉在降解氰化物中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降解氰化物为深层氰化尾渣堆的氰化物降解和表层氰化尾渣中氰化物的降解。 8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用深层注浆方式注射所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉、搅拌方式注入所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉、直接喷洒淋洗方式注入所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉以及喷洒同时搅拌方式注入所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉来降解氰化物。 9.一种降解氰化物的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或权利要求2所述的微生物菌粉接种于含有氰化物的氰化尾渣。 10.一种氰化物降解剂，其特征在于，包含权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或权利要求2所述的微生物菌粉。
说明书全文	一种氰化物降解菌剂及其在降解氰化物中的应用技术领域 [0001] 本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种氰化物降解菌剂及其在降解氰化物中的应用。技术背景 [0002] 黄金作为一种稀有贵金属，具有优异的物理化学特性，被广泛应用于电子、现代通讯、航天航空、首饰等领域。目前，氰化法提工艺是金矿石冶选工业占有统治性地位，但每生产1吨的金精矿，会产生38.26吨的氰化尾渣。早在2017年出台的《固体废物鉴别标准‑通则》(GB34330‑2017)将其列入危险废物的名单。大量氰化尾渣露天堆放过程中，所含有的氰化物和氰化物‑重金属等污染物质给矿区周边土壤、水体和大气造成了污染。 [0003] 因此，无论是将氰化尾渣进行填埋或综合利用(如建材)等，如何绿色高效的降解尾渣中的氰化物是黄金行业的首要问题。传统的物理和化学方法如电解、热解、过氧化氢和氯化物氧化等不仅成本高、工艺复杂，且引入化学药剂容易导致二次污染。同传统降解方法相比，微生物修复技术可以通过氧化、水解、吸附和替代/取代作用破坏氰根离子，并用作自身生长代谢的能源物质，因此具有成本低、操作简便、安全、绿色高效且不改变尾矿原有的结构等优势。 [0004] 中南大学提出处理金矿的堆浸氰化尾渣的方法、复合菌群、菌剂及制备(中国发明专利CN 115851547A)，属于环境微生物技术领域，该方法将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida strain)、甲基红杆菌(Methylorubrumpseudosasae)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)几种配合构建复合菌群使用，以有效去除氰化物、硫氰化物和金属‑氰络合物。然而，其使用的菌液在大规模发酵过程中不仅易染菌，且存在有效活菌数低、储存和运输困难等问题。发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供一种氰化物降解菌剂及其在降解氰化物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过制备出活菌数高的氰化物降解功能菌粉，以提高氰化尾渣脱氰速率，解决实际工程中菌液发酵困难等技术难题。 [0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的： [0007] 本发明提供了一种解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusthiaminolyticus sp.)LS‑1，所述解硫胺素芽孢杆菌藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为27817。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会。保藏日期：2023年7月6日。 [0008] 本发明还提供了一种微生物菌粉，包含所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1。 [0009] 本发明还提供了一种微生物菌粉的制备方法，包括以下步骤： [0010] S1、菌种活化：将权利要求1‑2任一项所述的解硫胺素芽孢杆菌LS‑1在无菌条件下转移至20℃～30℃的条件下活化12h～24h，得到活化后的菌株。 [0011] S2、菌液制备：将步骤S1中所制备的活化后的菌株接种至培养基中于150‑200r/min、30～35℃摇床内培养20～48h，得到发酵菌液； [0012] S3、大规模菌液发酵：将步骤S2中所得到的发酵菌液进一步接种于含液体发酵用培养基的发酵罐中，以逐级发酵(7L‑50L‑8L)的方式进行，得到大规模发酵菌液。 [0013] S4、真空干燥：将步骤S3中所得到的大规模发酵菌液在‑0.08MPa条件下，35℃干燥24～36h得到微生物菌粉。 [0014] 进一步的，在步骤S2中，所述培养基的成分包括：葡萄糖10.0g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸钙0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L，所述培养基的pH值为7.8。 [0015] 进一步的，在步骤S3中，所述液体发酵用培养基的碳源选用糖蜜、麸皮、玉米粉、可溶性淀粉和蛋白胨；培养基氮源选用硫酸铵、硝酸钠、磷酸氢二氨和牛肉膏；吸附性载体选用滑石粉。所述液体发酵条件为：恒温30±1℃、搅拌速度250～300rpm、通风量0.25～0.30M3/min、罐压0.035～0.055MPa，持续发酵36～48h。 [0016] 本发明还提供了一种所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉在降解氰化物中的应用。 [0017] 进一步的，所述降解氰化物为深层氰化尾渣堆的氰化物降解和表层氰化尾渣中氰化物的降解。 [0018] 进一步的，所述应用包括采用深层注浆方式注射菌剂、搅拌方式注入菌剂、直接喷洒淋洗方式注入菌剂以及喷洒同时搅拌方式注入菌剂来降解氰化物。 [0019] 本发明还提供了一种降解氰化物的方法，包括将所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉接种于含有氰化物的氰化尾渣的步骤。 [0020] 本发明还提供了一种氰化物降解剂，包含所述解硫胺素芽孢杆菌LS‑1或所述微生物菌粉。 [0021] 本发明有益效果在于： [0022] 本发明通过逐级发酵和干燥喷粉制备了微生物菌粉，便于储存和运输，菌粉制备13 9 过程中，其细菌数量达到1.8×10 CFU/mL，远超原菌液的6.9×10CFU/mL。同时，本发明通过LB培养基将菌粉活化后，使用表面喷洒和搅拌方式将菌剂注入氰化尾渣中，使其充分混匀，后经20天的修复，氰化尾渣中氰化物平均可削减率达99％以上。本发明解决了工程实际应用中菌液扩培和发酵过程中易染菌、有效活菌数低和运输困难等瓶颈问题，且微生物通过氧化、水解、吸附和替代/取代作用破坏氰根离子，将其降解为二氧化碳和氨，并用作自身生长代谢的能源物质，因此具有成本低、操作简便、安全、绿色高效且不改变尾矿原有的结构等优势，具有良好的应用前景。附图说明 [0023] 图1解硫胺素芽孢杆菌LS‑1的聚类分析图； [0024] 图2为深层注浆方式注射菌剂的注射方案及氰化物降解效果图，其中，A、B、C均为注射方案，D为氰化物降解效果； [0025] 图3为搅拌方式降解氰化物的降解效果图； [0026] 图4为喷洒方式降解氰化物的降解效果图； [0027] 图5为喷洒和搅拌同时进行降解氰化物的降解效果图。具体实施方式 [0028] 下述实验例和实施例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。 [0029] 实施例1 [0030] 本实施例中所用菌株源于氰化尾渣筛选、纯化而来，是氰化尾渣土著细菌，经测试可耐受40ppm的氰化钠溶液，经鉴定为解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusthiaminolyticus sp.)LS‑1。解硫胺素芽孢杆菌LS‑1的聚类分析图如图1所示 [0031] 1.氰化物降解菌粉的制备： [0032] 菌株活化：将‑80℃保藏的菌株在无菌条件下转移至20℃～30℃的条件下活化12h～24h备用。 [0033] 菌液制备：将活化后的菌株接种至培养基中于150‑200r/min、30～35℃摇床内培9 养20～48h，得到发酵菌液，最终培养得到6.9×10CFU/mL的发酵菌液。其中培养基的成分包括：葡萄糖10.0g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、硫酸钙0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L，所述培养基的pH值为7.8。 [0034] 大规模菌液发酵：将菌液进一步接种于含工业级培养基的发酵罐中，以逐级发酵(7L‑50L‑8L)的方式进行；所述液体发酵用培养基碳源选用糖蜜、麸皮、玉米粉、可溶性淀粉和蛋白胨；培养基氮源选用硫酸铵、硝酸钠、磷酸氢二氨和牛肉膏；吸附性载体选用滑石粉，其中大规模发酵后的菌液与吸附性载体的质量比为1：(0.5‑1.5均可)。其中液体发酵条件3 为：恒温30±1℃、搅拌速度250‑300rpm、通风量0.25‑0.30M /min、罐压0.035～0.055MPa， 13 持续发酵36～48h，最终得到1.8×10 CFU/mL的大规模发酵菌液。 [0035] 干燥喷粉：利用芽孢耐高温作用对所制得的大规模发酵菌液进行真空干燥，其干燥喷粉条件为：‑0.08MPa条件下，35℃干燥24～36h得到氰化物降解菌粉，最终得到的氰化物降解菌粉有效活菌数超过1000亿/克。 [0036] 所述氰化物降解菌为氰化尾矿中筛选而来，经测试可耐受40ppm的氰化钠溶液。 [0037] 微生物降解氰化尾渣中氰化物的原理：微生物释放氰化物水合酶将尾渣中氰化物和氰化物‑重金属络合物加速降解为氨和二氧化碳，同时将降解产物作为自身生命活动的氮源和碳源被消纳。具体反应式如下： [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] 实施例2 [0043] 深层注浆方式注射菌剂降解氰化物：适用于深层氰化尾渣堆的氰化物降解，所需降解的氰化物包括单一氰化物和铜氰、铬氰和镍氰络合物。 [0044] 菌粉配制：在大白桶内配制菌液溶液。首先，配制LB培养基，即1L去离子水中添加5g 酵母浸出粉、10g氯化钠和10g蛋白胨，使用NaOH和HCl调整pH为7～7.5间。取制备好的降氰功能菌粉，按照5(1～10g/L均可)g/L比例溶于LB培养基中，充分搅拌均匀，在28(25～30℃均可)℃下活化22h(20～24h均可)后备用。 [0045] 使用注浆机进行深层地下菌剂注射，注射方案如图1所示。 [0046] 注浆位点设置：将移动式注浆设备开至预定位置，在A注浆孔周边间距0.5、1.0、1.5、2.0处，以直推方式钻观察孔。 [0047] 直推式注浆头推入地下2m。 [0048] 启动双液注浆泵，将甲乙溶液抽至泵内充分混合，并以10(5～15均可)Mpa的脉冲3 压注入尾矿堆体内。注射量控制在50L/m，停泵。 [0049] 提升注浆头至地下1m。 [0050] 启动双液注浆泵，将剩余溶液注入尾矿堆体内，完全注入后停泵。 [0051] 抬升注浆头，将移动式注浆设备移动至下一孔处，待溶液配制完成后重复以上流程。氰化尾渣中氰化物降解率在95.28％以上。 [0052] 实施例3 [0053] 以搅拌方式注入菌剂降解氰化物：通过菌剂与尾渣充分混合，达到高效氰化物降解目的，所需降解的氰化物包括单一氰化物和铜氰、铬氰和镍氰络合物。 [0054] 菌粉配制：同实施例2。 [0055] 取1kg新鲜的氰化尾渣平铺于混凝土模具内，利用自吸泵直接注入活化好的菌液灌入量为300(150～400均可)ml；通过搅拌机使得尾矿与菌剂充分均匀混合，每隔3天灌入1次，灌入数为5(4～7均可)次。 [0056] 利用通过异烟酸‑巴比妥酸分光光度法测定尾渣中总氰化物(T‑CN)和可交换氰化物(F‑CN)降解含量变化。在第20d内测定氰化物降解率，结果如图2所示。氰化尾渣中F‑CN和T‑CN降解率达到95.05％和91.87％。 [0057] 实施例4 [0058] 以直接喷洒淋洗方式注入菌剂降解氰化物：适用于表层氰化尾渣中氰化物的降解，所需降解的氰化物包括单一氰化物和铜氰、铬氰和镍氰络合物。 [0059] 菌粉配制：同实施例2。 [0060] 取1kg新鲜的氰化尾渣平铺于沙盘内，将活化的菌剂装入喷洒器内，使用喷洒器均匀的喷洒至尾矿表面，喷洒量为300(150～400均可)ml；每隔3天喷洒1次，喷洒次数为5(4～7均可)次。 [0061] 利用通过异烟酸‑巴比妥酸分光光度法测定尾渣中总氰化物(T‑CN)和可交换氰化物(F‑CN)降解含量变化。在第20d内测定氰化物降解率，结果如图3所示。氰化尾渣中F‑CN和T‑CN降解率达到94.54％和88.13％。 [0062] 实施例5 [0063] 利用喷洒同时搅拌方式微生物菌剂降解氰化物，所需降解的氰化物包括单一氰化物和铜氰、铬氰和镍氰络合物。 [0064] 菌粉配制：同实施例2。 [0065] 将活化的菌剂装入喷洒器内，使用喷洒器均匀的喷洒至尾矿表面，喷洒量为150～400ml，优选300(150～400均可)ml；每隔3天喷洒1次，反复翻倒尾渣后，再次均匀喷洒配制好的菌液使用旋耕机或搅拌机使得尾矿与菌剂充分混合搅拌，重复上述步骤，5(4～7均可)次。菌剂喷洒淋洗过程中温度保持在20～35℃下进行。 [0066] 在第20d内测定尾矿淋滤液中氰化物含量，结果如图4所示所示。菌剂降解氰化物削减率均在99％以上。 [0067] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

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