[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37及其应用。

[0002] 土壤在生态系统中占据重要地位。农田土壤中各化学物质含量直接影响着作物的生长，同时通过食物链积累危害食品安全和人类身体健康。其中，镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铜(Cu)、铅(Pb)、锌(Zn)和镍(Ni)这八大重金属元素是主要的无机污染物。许多非必需金属还表现出致癌性、遗传毒性和神经毒性(Qinet al.2021)。鉴于镉对环境和人体的危害，世界卫生组织公布的致癌物清单中将其列为1类致癌物，无机铅化合物为2A类。锌是人体所需的微量元素，但过量摄入也会对人体造成危害。

[0003] 传统的土壤重金属处理方法(如客土法、热力修复法、物理/化学固化和淋洗等)存在成本高、产生二次污染对环境不友好等缺点。与之相比，生物修复技术被认为是一种高效、经济、稳定、环保的方法，通过生物吸附、沉淀、转化、络合及碱化等反应钝化重金属，近年来许多针对重金属修复的微生物菌剂应运而生，但总体而言，该技术尚不成熟，可供选择的菌种单一且效果尚不能令人满意。例如，申请公布号为CN 107287129A的中国专利公开了一株能使重金属钝化的硫酸盐还原菌，修复重金属的原理是：利用还原硫酸盐产生的S2‑与重金属形成重金属硫化物沉淀而达到钝化重金属的功效。然而，这类微生物的作用效力受底物(硫酸盐)的影响，当环境中可用硫酸盐浓度低或不存在时则无法修复重金属污染。此外，申请公布号为CN 110076193A的中国专利公开了一株用于重金属污染修复的嫩巴黎假单胞菌，修复重金属的机制为：通过生成植物生长剂，促进高富集重金属植物的生长，属于间接修复重金属过程。这类微生物对重金属的修复能力取决高富集重金属植物的修复强度，故而修复效果不稳定，应用受到极大的限制。

[0004] 本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37，能够产铁载体，合成ACC脱氨酶，发挥促生作用，并且还可耐受重金属，直接与重金属作用而降低重金属毒性。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37，所述无色杆菌WL‑37的保藏编号为GDMCC NO：63875。

[0006] 本发明还提供了上述技术方案所述无色杆菌WL‑37或含有上述技术方案所述无色杆菌WL‑37的产品在治理重金属污染中的应用。

[0007] 本发明还提供了上述技术方案所述无色杆菌WL‑37或含有上述技术方案所述无色杆菌WL‑37的产品在制备重金属耐受制剂中的应用。

[0008] 优选的，所述重金属为Cd、Pb和Zn中的一种或多种。

[0009] 本发明还提供了上述技术方案所述无色杆菌WL‑37或含有上述技术方案所述无色杆菌WL‑37的产品在制备铁载体和/或ACC脱氨酶中的应用。

[0010] 优选的，所述铁载体为儿茶酚型铁载体。

[0011] 本发明还提供了上述技术方案所述无色杆菌WL‑37或含有上述技术方案所述无色杆菌WL‑37的产品在固氮中的应用。

[0012] 本发明还提供了一种去除水体中重金属污染的方法，包括如下步骤：

[0013] 在重金属污染水体中接种上述技术方案所述无色杆菌WL‑37，37℃震荡培养。

[0014] 优选的，所述重金属污染水体中包括Cd2+、Pb2+和Zn2+中的一种或多种；

[0015] 优选的，所述重金属污染水体中Cd2+的浓度≤600mg/L；

[0016] 所述重金属污染水体中Pb2+的浓度≤1800mg/L；

[0017] 所述重金属污染水体中Zn2+的浓度≤1000mg/L。

[0018] 有益效果

[0019] 本发明提供了一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37，保藏编号为GDMCCNO：63875。本发明提供的无色杆菌WL‑37能高效产生铁载体，能合成ACC脱氨酶且有固氮能力，
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
并且对Cd 、Pb 和Zn 具有高耐受性，能够有效去除Cd 、Pb 和Zn ，治理重金属污染，具有良好的应用前景。

[0020] 生物保藏信息

[0021] 无色杆菌WL‑37，分类学名称为Achromobacter sp，于2023年10月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC NO：63875。附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0023] 图1为菌株WL‑37在25‑100mg/L Cd下的生长曲线；

[0024] 图2为菌株WL‑37在200‑600mg/L Cd下的生长曲线；

[0025] 图3为菌株WL‑37在25‑100mg/L Cd下的去除率曲线；

[0026] 图4为菌株WL‑37在200‑600mg/L Cd下的去除率曲线；

[0027] 图5为菌株WL‑37的形态学鉴定结果；其中，左图为菌落图；右图为电镜染色图；

[0028] 图6为菌株WL‑37基于16S rRNA基因序列同源性的系统发育树；

[0029] 图7为50mg/L Cd，不同接种量条件下，无色杆菌WL‑37的生长曲线；

[0030] 图8为50mg/L Cd，不同接种量条件下，无色杆菌株WL‑37的Cd去除率曲线；

[0031] 图9为50mg/L Cd，不同pH条件下，无色杆菌WL‑37的生长曲线；

[0032] 图10为50mg/L Cd，不同pH条件下，无色杆菌WL‑37的Cd去除率曲线；

[0033] 图11为无色杆菌WL‑37在(50‑600mg·L‑1)Zn下的去除率曲线；

[0034] 图12为无色杆菌WL‑37在(50‑600mg·L‑1)Pb下的去除率曲线；

[0035] 图13为无色杆菌WL‑37产铁载体能力定性图(左为对照，右为处理)；

[0036] 图14为无色杆菌WL‑37产铁载体类型定性图(左为对照，右为处理)；

[0037] 图15为无色杆菌WL‑37连续三次划线在ADF培养上的菌落图；

[0038] 图16为无色杆菌WL‑37在无氮阿须贝氏培养基上生长的菌落图。

[0039] 本发明提供了一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37，所述无色杆菌WL‑37的保藏编号为GDMCC NO：63875。

[0040] 在本发明中，所述无色杆菌WL‑37的16S rRNA基因序列优选如SEQ ID NO.1所示，具体为：5'‑ACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAA CGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTAGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGGCAGGAAAGAAACGTCGCGGGCTAATACCTCGCGAAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGTCTTCGGACCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATGCCGAAGAGATTTGGCAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG‑3'。本发明所述无色杆菌WL‑37能够高效产生铁载体，能合成ACC脱氨酶且有固氮能力。实施例结果表明，所述无色杆菌WL‑37在以酵母提取物为单一碳源的培养基中培养2d、3d和4d，铁载体活性单位依次为65.93％、88.14％和85.91％；在以果糖为单一碳源的培养基中培养2d、3d和4d，铁载体活性单位依次为63％、81.32％和62.89％。并且本发明所述
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
无色杆菌WL‑37对Cd 、Pb 和Zn 具有高耐受性，能够有效去除Cd 、Pb 和Zn ，治理重金属
2+ 2+
污染。实施例结果表明，无色杆菌WL‑37对50mg/L Cd 的去除率可达69％，对Cd 的最低抑
2+ 2+
制浓度为600mg/L；对600mg/LPb 去除率可达93％，对Pb 的最低抑制浓度为1800mg/L；对
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
50mg/LZn 去除率可达47％，对Zn 的最低抑制浓度为1000mg/L。且在Cd 、Pb 和Zn
2+ 2+ 2+
(750mg/L，Cd 、Pb 和Zn 浓度比为1：1：1)同时存在的情况下也能生长，展现出较好的耐复合污染能力。

[0041] 鉴于本发明提供的无色杆菌WL‑37的优势，所述无色杆菌WL‑37或含有所述无色杆菌WL‑37的产品在治理重金属污染，制备重金属耐受制剂中的应用同样属于本发明的保护范围。本发明所述重金属优选为Cd、Pb和Zn中的一种或多种。

[0042] 鉴于本发明提供的无色杆菌WL‑37的优势，所述无色杆菌WL‑37或含有所述无色杆菌WL‑37的产品在制备铁载体和/或ACC脱氨酶中的应用同样属于本发明的保护范围。在本发明中，所述铁载体优选为儿茶酚型铁载体。

[0043] 鉴于本发明提供的无色杆菌WL‑37的优势，所述无色杆菌WL‑37或含有所述无色杆菌WL‑37的产品在固氮中的应用同样属于本发明的保护范围。

[0044] 本发明还提供了一种去除水体中重金属污染的方法，包括如下步骤：

[0045] 在重金属污染水体中接种所述无色杆菌WL‑37，37℃震荡培养。

[0046] 在本发明中，所述重金属污染水体中优选包括Cd2+、Pb2+和Zn2+中的一种或多种。本2+
发明所述重金属污染水体中Cd 的浓度优选≤600mg/L，进一步优选≤50mg/L，更优选为
2+
50mg/L。本发明所述重金属污染水体中Pb 的浓度优选≤1800mg/L，进一步优选为50～
2+
600mg/L，更优选为600mg/L。本发明所述重金属污染水体中Zn 的浓度优选≤1000mg/L，进一步优选为50～600mg/L，更优选为50mg/L。本发明所述重金属污染水体中重金属离子为
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Cd 、Pb 和Zn 时，所述重金属离子的浓度优选为750mg/L，其中Cd 、Pb 和Zn 的浓度比优选为1：1：1；

[0047] 在本发明中，所述接种的接种量优选为1％‑10％v/v，进一步优选为2％‑8％v/v，更优选为5％。本发明接种用无色杆菌WL‑37的悬浮液的OD600值优选为0.5‑1.0。本发明所述震荡培养前，优选调整接种所述无色杆菌WL‑37后的重金属污染水体pH至5.0‑9.0，进一步优选为6.0‑8.0，更优选为7.0。本发明所述震荡培养的转速优选为180rpm；所述震荡培养的时间优选≤168h，进一步优选24h‑168h，更优选为48h‑144h，最优选为72h‑120h，更优选为96h。

[0048] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株产铁载体耐重金属的无色杆菌WL‑37及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0049] 实施例1

[0050] 菌株分离和其对Cd的耐受及去除率

[0051] (1)在尾砂矿土培养的植物根际附近随机取几处土样，置于锥形瓶加入一定量的‑1超纯水后放入37℃，180r·min 的摇床培养30min。通过富集培养法分离出耐镉菌株。将富‑5 ‑6 ‑1 ‑1
集后的菌液进行梯度稀释，选取10 和10 的梯度涂布在含有50mg·L Cd、50mg·L Zn和‑1
50mg·L Pb的LB固体培养上(LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 
10g/L，固体培养基额外加琼脂10‑20g)；倒置于恒温培养箱中，在37℃下培养48h。观察到平板上仅有一种形态类似的菌落，标记为WL‑37；

[0052] (2)将菌株WL‑37的指数期菌液接种到Cd浓度为25、50、75、100、200、300、400和‑1 ‑1600mg·L (CdCl2)的LB液体培养基中，并在37℃，180r·min 的摇床上培养，每隔24h取菌液进行OD600测定，观察其生长状况，每个处理组设置3个平行，结果如表1和图1～2所示。

[0053] 表1不同浓度Cd2+胁迫下菌株WL‑37的生长情况

[0054]

[0055] 根据表1和图1～2可以看出，菌株WL‑37对Cd的最低抑制浓度最高为600mg·L‑1。

[0056] (3)根据步骤(2)的检测结果，将在液体LB培养基中生长的菌株WL‑37(菌悬液OD6002+ ‑1
＝1.0‑1.5)接种到Cd 浓度为25、50、75、100、200、300和400mg·L (CdCl2)的LB培养基中，‑1
在37℃，180r·min 的摇床上振荡培养168h。以不加菌的培养基作对照，其他处理相同。每个实验进行三次重复。每间隔24h取样，监测168h内细菌生长情况，并监测120h内处理组上
2+ 2+
清液中Cd 的剩余含量和对照组上清液的实际Cd含量，按照下述公式计算细菌对Cd 的去除潜力：

[0057] 去除率(％)＝(C0‑Ce)/C0×100％。式中C0表示溶液的Cd2+初始质量浓度(mg/L)；Ce2+
表示上清液中残余的Cd 质量浓度(mg/L)；

[0058] 具体测定方法如下：取3mL的菌液于紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公‑1司)600nm处检测其吸光度(OD)，即为菌体的浊度(或浓度)。将菌液8000r·min 离心10min后，取上清液使用电感‑等离子体发射光谱(ICP‑OES，美国Qpetima7000DV)测定培养基中的镉含量。用移液枪取1mL的上清液于10mL灭菌离心管中，加9ml 2％硝酸稀释10倍，然后过滤置于4℃冰箱待测，每个处理组设置3个平行，去除率测量结果如表2和图3～4。

[0059] 表2不同时间Cd2+的去除率

[0060]

[0061] 根据表2和图3～4可以看出，在48h内菌株WL‑37对Cd还原率最高达62％。低浓度‑1 ‑1(25‑100mg·L )去除率在50mg·L 达到最高，可能是因为更高的Cd浓度对加强了对菌株‑1
胁迫；而高浓度(200‑400mg·L )去除率随Cd浓度升高而升高，可能是因为Cd浓度升高增多了与菌株表面的接触。不同浓度Cd去除率的波动，这可能是由于生物蓄积的Cd会从细胞释放出来，以最大程度地减少对细胞的损伤；在较低的Cd浓度下，菌株生长几乎不受Cd的影响。同时重金属离子也可能会和培养基里的固有的某些物质产生络合反应。另外还发现在培养168h后，培养基pH均为碱性(9.31‑9.58)，这可能是由于菌株分泌了一些有机物质导致的。

[0062] 实施例2

[0063] 菌株的鉴定

[0064] 1.形态学鉴定

[0065] 将菌株WL‑37在含有150mg/L Cd2++150mg/L Pb2++150mg/LZn2+的固体LB培养基上划线，37℃培养48h拍照并进行革兰氏染色，具体步骤如下：

[0066] (1)涂片：在灭菌后的载玻片中央滴一滴待检样品，用烧红冷却后的接种环将液体铺匀；

[0067] (2)干燥：载玻片置于酒精灯上加热至水分蒸发；

[0068] (3)固定：载玻片在酒精灯火焰上快速过2至3次，用2至3秒后待冷却；

[0069] (4)初染：滴加1至2滴草酸氨结晶紫染液，染色时间约一分钟；

[0070] (5)水洗：用小水流冲洗载玻片，冲洗至水呈无色；

[0071] (6)媒染：滴适量革兰氏染液，染色时间约一分钟；

[0072] (7)水洗：同步骤(5)；

[0073] (8)脱色：在载玻片上滴加95％乙醇，至流下乙醇不呈紫色，大约用时半分钟后水洗；

[0074] (9)复染：滴加1至2滴沙黄染液，染色时间约一分钟；

[0075] (10)水洗：同步骤(5)；

[0076] (11)干燥、观察：待标本片干燥后在电镜下观察，紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

[0077] 结果表明，菌株WL‑37形态特征表现为淡黄色的圆形菌落、革兰氏阴性杆菌(图5)。

[0078] 2.生理生化鉴定

[0079] 将菌株WL‑37送至北京麦克罗科技有限公司进行生理生化特性测试，结果显示己二酸同化反应、硝酸盐(还原)反应、葡萄糖酸钾同化反应等均为阳性，而吲哚产物反应、明胶液化反应、葡萄糖发酵反应等均为阴性；在可利用碳源测试中对蔗糖、葡萄糖和甘露醇等为阴性，对果糖、L‑天门冬氨酸、L‑鼠李糖等为阳性。对二甲胺四环素、万古霉素和林可霉素等抗生素反应为阳性。

[0080] 3.16S rRNA序列检测

[0081] 用DNA提取试剂盒(广州艾基生物)提取菌株WL‑37的DNA。然后使用16S引物组27F/1492R(27F：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'(SEQ  ID  NO.2)和1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'(SEQ ID NO.3))进行PCR扩增，得到约1400bp的PCR产物；将获得的PCR产物纯化后委托北京麦克罗有限公司完成测序，具体序列为如SEQ ID NO.1所示。然后通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库进行比对分析。
最后利用MEGA7 .0软构建系统发育树，并进行同源性分析。发现WL‑3与
Achromobacterxylosoxidans的相似性最高，同源性达到99.5％(图6)，确定菌株WL‑37隶属于无色杆菌属(Achromobacter sp.)，命名为无色杆菌WL‑37，并于2023年10月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCCNO：63875。

[0082] 实施例3

[0083] 无色杆菌WL‑37去除Cd的最佳接种量与pH值

[0084] 1.最佳接种量的确定

[0085] 将实施例2的无色杆菌WL‑37菌悬液(OD600＝0.5‑1.0)接种到Cd浓度为50mg/L的LB‑1液体培养基中(pH为5)进行还原实验，研究固定温度37℃，摇床转速180r·min 条件下，不同接种量(1％v/v、2％v/v、5％v/v、8％v/v和10％v/v)对无色杆菌WL‑37的生长和去除Cd的影响。

[0086] 每个接种量条件每隔24h取样，培养168h监测细菌生长情况，培养120h检测上清液中的Cd含量，具体的测定方法如实施例1步骤(3)，每组实验设置3个重复。结果如表3和图7和图8所示。

[0087] 表3不同接种量下无色杆菌WL‑37的生长情况和Cd2+的去除率

[0088]

[0089]

[0090] 根据表3和图7～8可以看出，在pH值为5、温度为37℃、接种量为2％时，菌株WL‑37对Cd的去除率最佳。

[0091] 2.最佳pH的确定

[0092] 将实施例2的无色杆菌WL‑37菌悬液(OD600＝0.5‑1.0)接种到Cd浓度为50mg/L的LB‑1液体培养基中进行还原实验，接种量为2％，研究固定温度37℃，摇床转速180r·min 条件下，不同LB液体培养基pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)对无色杆菌WL‑37的生长和去除Cd的影响。

[0093] 每个pH条件每隔24h取样，培养168h监测细菌生长情况，培养120h检测上清液中的Cd含量，具体的测定方法如实施例1步骤(3)，每组实验设置3个重复。结果如表4和图9～10所示。

[0094] 表4不同pH条件无色杆菌WL‑37的生长情况和Cd2+的去除率

[0095]

[0096]

[0097]

[0098] 根据表4和图9～10可以看出，无色杆菌WL‑37的最适生长pH为5.0～7.0，在48h内对50mg/L Cd去除率可达69％。

[0099] 实施例4

[0100] 1.无色杆菌WL‑37对锌(Zn)的耐受及去除率

[0101] 为了探究无色杆菌WL‑37对Zn的耐受及去除率，通过单独添加Zn(NO3)2的形式将Zn2+
(NO3)2添加进LB液体培养基，使得Zn 的浓度为50mg/L、200mg/L、400mg/L和600mg/L，将实
2+
施例2无色杆菌WL‑37的悬浮液(OD600＝0.5‑1.0)，按照1％v/v的接种量接种至含有Zn 的LB‑1
液体培养基中，温度37℃，摇床转速180r·min 条件下培养，每隔24h取样，培养120h检测上清液中的Zn含量，具体的测定方法如实施例1步骤(3)，每组实验设置3个重复，结果如图11所示。

[0102] 根据图11可以看出，无色杆菌WL‑37对50mg/LZn2+的去除率可达47％，MIC为2+
1000mg/LZn 。

[0103] 2.无色杆菌WL‑37对铅(Pb)的耐受及去除率

[0104] 为了探究无色杆菌WL‑37对Pb的耐受及去除率，通过单独添加Pb(NO3)2的形式将Pb2+
(NO3)2添加进LB液体培养基，使得Pb 的浓度为50mg/L、200mg/L、400mg/L和600mg/L，将实
2+
施例2无色杆菌WL‑37的悬浮液(OD600＝0.5‑1.0)，按照1％v/v的接种量接种至含有Pb 的LB‑1
液体培养基中，温度37℃，摇床转速180r·min 条件下培养，每隔24h取样，培养120h检测上清液中的Pb含量，具体的测定方法如实施例1步骤(3)，每组实验设置3个重复，结果如图12所示。

[0105] 根据图12可以看出，无色杆菌WL‑37对600mg/LPb2+的去除率可达93％，MIC为2+
1800mg/LPb 。

[0106] 实施例5

[0107] 1.以果糖为唯一碳源配置天门冬氨酸培养基，具体组方如下：20g/L果糖、2g/LL‑天门冬氨酸、1g/LK2HPO4、0.5g/LMgSO4·7H2O，pH＝7±0.2；

[0108] 将实施例2得到的无色杆菌WL‑37接种于液体LB培养基，37℃，180r·min‑1培养12h，然后将OD600＝1.5的菌悬液以1％的接种量接种于上述天门冬氨酸培养基(以果糖为唯‑1
一碳源)，37℃，180r·min 培养。

[0109] 2.以酵母提取物为唯一碳源配置天门冬氨酸培养基，具体组方如下：5g/L酵母提取物、2g/LL‑天门冬氨酸、1g/LK2HPO4、0.5g/LMgSO4·7H2O，pH＝7±0.2；

[0110] 将实施例2得到的无色杆菌WL‑37接种于液体LB培养基，37℃，180r·min‑1培养12h，然后将OD600＝1.5的菌悬液以1％的接种量接种于上述天门冬氨酸培养基(以酵母提取‑1
物为唯一碳源)，37℃，180r·min 培养。

[0111] 3.无色杆菌WL‑37的产铁载体能力的定性定量检测

[0112] 机理：CAS、铁离子和HTDMA会络合形成蓝色复合物，当一种对Fe3+有更高亲和力的配体，复合物中的铁会转移到配体上，溶液颜色由蓝色变为黄色、紫色或红色，能力越强颜色越深；

[0113] 分别步骤1和2培养的第2、3和4d取培养液，8000r/min离心15min，取3ml上清液与3mL CAS染液(0.2703g六水合氯化铁溶于一升10mM盐酸中，得到氯化铁储备液；0.2421g CAS(铬天青)溶于200ml去离子水中，得到CAS铬天青储备液；称取0.0219g HTDMA溶于50ml水中，得到HTDMA溶液；称取4.3079g无水哌嗪溶于30ml水中，用盐酸调pH至5.6，得到哌嗪缓冲液；取1.5ml氯化铁储备液加入7.5mlCAS铬天青储备液混匀，边搅拌边加入50mlHTDMA溶液，再加入30ml哌嗪缓冲液，最后加入去离子水，最终配成100ml CAS检测液和哌嗪缓冲液)反应，以未接种菌株的培养基上清液为空白对照，避光常温下反应3h，测定OD630，加菌组OD630记为As，空白对照组OD630记为Ar，产铁载体活性单位Su＝(Ar‑As)/Ar×100％，以果糖为碳源的检测结果如图13(左为对照组，右为加菌组)所示。

[0114] 根据图13可以看出，无色杆菌WL‑37有高效的产铁载体能力。以酵母提取物为唯一碳源的处理组，第2、3和4天的Su分别为65.93％、88.14％和85.91％；以果糖为唯一碳源的处理组，第2、3和4天的Su分别为63％、81.32％和62.89％。两种培养方式的产铁载体能力均在培养的第三天达到最佳，可能是因为菌株的生长情况及其络合能力的变化。

[0115] 4.无色杆菌WL‑37的产铁载体类型的定性分析

[0116] 步骤1培养的第3d取培养液取1mL上清液，加入1mL 0.5mol/L盐酸，1mL 10％钼酸钠‑亚硝酸钠溶液，若溶液中存在邻苯二酚结构，则亚销酸分解，生成黄色配体，溶液颜色变黄。继续加入1mL 1mol/L氢氧化钠溶液，若含有儿茶酚型铁载体，则颜色变红，并且颜色至少能够保持一个小时不变色。本发明无色杆菌WL‑37产铁载体的类型为儿茶酚型铁载体(图14)，不含有氧肟酸型铁载体。

[0117] 实施例6

[0118] 无色杆菌WL‑37产ACC脱氨酶能力定性检测

[0119] 将实施例2得到的无色杆菌WL‑37接种于液体LB培养基，37℃，180r·min‑1培养24h，而后划线接种于ADF固体培养基(KH2PO44g/L，Na2HPO46g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.2g/L，葡萄糖2g/L，葡萄糖酸2mL，柠檬酸2g/L，ACC 3mmol/L，pH 7.5)上，将首次划线的ADF培养基上长出来的单菌落继续划线接种于以ACC为唯一氮源的固体培养基上培养，以反复验证各菌株利用ACC为唯一氨源生长的特性，重复3次，如图15所示(从左至右为三次接种无色杆菌WL‑37的生长情况)。根据图15可以看出，无色杆菌WL‑37可以在连续接种的情况下，在以ACC为唯一氮源的固体培养基上生长，证明该菌株有产生ACC脱氨酶的能力。而ACC脱氨酶可以将乙烯合成前体ACC水解为α‑酮丁酸和氨。

[0120] 实施例7

[0121] 无色杆菌WL‑37固氮能力检测

[0122] 将无色杆菌WL‑37接种于液体LB培养基，37℃，180r·min‑1培养24h，而后划线接种于Ashby无氮固体培养基(KH2PO40.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.2g/L，CaCO35.0g/L，甘露醇10.0g/L，CaSO40.1g/L，琼脂20g/L，pH＝6.8‑7.0)上，观察菌株是否能生长。结果表明，无色杆菌WL‑37能在Ashby无氮固体培养基上生长(图16)，该菌株可以利用空气中的氮元素，有固氮能力。

[0123] 根据上述内容可以看出，本发明提供的无色杆菌WL‑37能高效产生铁载体，能合成2+ 2+ 2+ 2+ 2+
ACC脱氨酶且有固氮能力，并且对Cd 、Pb 和Zn 具有高耐受性，能够有效去除Cd 、Pb 和
2+
Zn ，对治理重金属污染具有良好的应用前景。

[0124] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。