一株沙福芽孢杆菌及其应用 |
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| 申请号 | CN202311630368.1 | 申请日 | 2023-11-30 | 公开(公告)号 | CN117866802A | 公开(公告)日 | 2024-04-12 |
| 申请人 | 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司; | 发明人 | 郑素娟; 赵琬玫; 闫明英; 王锦梅; 温胜国; 王文红; 仲伟华; 刘圣鹏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)CY1，保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27876，该菌株对于柴油的降解效率高，在30℃条件下，针对评价培养基中1％以下的柴油含量，72h的柴油降解率达到99％以上；且中度耐盐，在5％以下的 盐度 条件下生长时，活菌数几乎不受影响。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.27876。 |
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| 说明书全文 | 一株沙福芽孢杆菌及其应用技术领域背景技术[0002] 石油烃是石油中最主要的成分之一，主要由烷烃、芳香烃构成，也含有少量的含硫、含氮化合物。石油在勘探、开采、冶炼、运输、使用和储存等过程中的管理不当或突发渗漏事故，不可避免地会造成周边环境的石油烃污染问题，石油烃中的烷烃逐渐沉积到土壤、地下水与海洋中，极易造成持久性环境污染，芳香烃中的多环芳烃难以降解且具有致癌性，会通过食物链进入人体，威胁人类的生命健康。 [0003] 含油废水的来源非常广泛，除了石油开采及加工工业排出大量的含油废水外，固体燃料热加工、纺织工业中的洗毛废水、轻工业中的制革废水、铁路及交通运输业、屠宰及食品加工业以及机械工业中车削工艺产生乳化液等均会排放含油废水。 [0004] 当前，针对石油烃污染的处理方法主要分为物理法、化学法和生物法。其中生物处理技术具有二次污染小、去除效率高且污染物去除彻底、经济性能高等多个优点，因而成为现代废水处理技术的研究热点，受到越来越多的关注。 [0005] 目前，科学家们已经筛选出多种具有石油烃降解功能的菌株，如不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)等常见的石油烃降解细菌。但这些菌株对于石油烃的降解效果仍不够突出，因而需要筛选或构建出对石油烃降解效果更为突出的菌株。 发明内容[0007] 一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)CY1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27876，保藏日期为：2023年7月13日，其16s rDNA如SEQ ID NO:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的沙福芽孢杆菌均是指沙福芽孢杆菌CY1菌株。 [0008] 本发明提供的沙福芽孢杆菌的有益效果是： [0009] 1)该菌株对于柴油的降解效率高，在30℃条件下，针对评价培养基中1％以下的柴油含量，72h的柴油降解率达到99％以上； [0010] 2)该菌株具有高效的石油烃降解能力，针对初始含油量为110mg/L的蜡染废水，五天的石油烃降解率为96％，针对初始含油量为2％的石化油泥污染土壤，五周的石油烃降解率为98％； [0011] 3)该菌株中度耐盐，在5％以下的盐度条件下生长时，活菌数几乎不受影响，但不能耐受6％以上的盐度； [0012] 4)该菌株的培养方法简单，生长速度快且环境适应性强，安全性高且不破坏原始环境，无二次污染。 [0013] 本发明中所述的石油烃包含但不限于正烷烃、支链烷烃、环烷烃和芳烃。 [0014] 本发明还要求保护包含上述沙福芽孢杆菌的微生物菌剂。 [0017] (2)二级种子培养：无菌条件下，将沙福芽孢杆菌的一级种子培养液按照1‑10vol％的接种量接种于富集培养基中，于25‑35℃、150‑300rpm的条件下培养12‑48h，得到沙福芽孢杆菌的二级种子培养液； [0018] (3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的沙福芽孢杆菌的二级种子培养液按照5‑10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25‑35℃、转速150‑300rpm，在通气比为1:(1‑2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得到沙福芽孢杆菌的发酵液。 [0019] 本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。 [0021] 优选的，所述富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH＝7‑7.5。 [0022] 进一步，所述发酵培养基的组成为：碳源10‑30g/L、氮源5‑20g/L、PO43‑0.8‑1.5g/+ 2+ + 2+ 2+L、K0.5‑1.0g/L、Mg 0.05‑0.5g/L、Na0.1‑0.5g/L、Mn 0.03‑0.2g/L、Ca 0.01‑0.05g/L，溶剂为水，pH＝6～8。 [0023] 优选的，所述PO43‑的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵中的一种或多+种，所述K的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所 2+ + 述Mg 的来源为硫酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述Na 的来源为氯化钠、硝酸钠或硫酸钠 2+ 中的一种或多种，所述Mn 的来源为一水硫酸锰、四水硫酸锰、硝酸锰或氯化锰中的一种或 2+ 多种，所述Ca 的来源为氯化钙、硝酸钙中的一种或多种的复配。 [0025] 进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆干粉、硫酸铵、磷酸氢二铵或硝酸钾中的一种或多种。 [0026] 在实际应用过程中，可根据实际的使用和存储需要来确定最终的沙福芽孢杆菌产品的形态，当需要使用液态产品时，将发酵液稀释至所需要的浓度即可直接使用，当需要使用固态产品时，可将发酵液离心后获得菌泥，然后采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺制得固态菌粉。 [0028] 进一步，所述污废水中的石油烃浓度为1％以下，优选0.5％以下。 [0029] 进一步，所述污废水的盐度为5％以下，优选3％以下，最优选2％以下。 [0030] 进一步，所述沙福芽孢杆菌的活化液或微生物菌剂的接种量为1000ppm以上，优选1000‑20000ppm，最优选1000‑10000ppm。 [0031] 进一步，所述土壤中石油烃的浓度为10％以下，优选5％以下，最优选2％以下。 [0032] 本发明还要求保护上述的沙福芽孢杆菌和微生物菌剂在污废水或土壤的治理修复领域的应用。 [0034] 图1为沙福芽孢杆菌的菌落照片； [0035] 图2为沙福芽孢杆菌菌落经100倍显微镜放大后的照片。 具体实施方式[0036] 以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 [0037] 实施例中使用的各个培养基组成如下： [0038] 富集培养基：磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸铵1g，硫酸镁0.2g，硝酸钾1g，氯化钙0.01g，微量元素溶液1mL，定容至1L，pH＝7； [0039] 基础培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH＝7； [0040] 评价培养基：磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸铵1g，硫酸镁0.2g，硝酸钾1g，氯化钙0.01g，微量元素溶液1mL，定容至1L，pH＝7，根据需要调节不同的柴油浓度； [0041] 微量元素溶液：氯化铁1.5g，硫酸锰0.1g，氯化锌70mg，氯化铜2mg，氯化镍30mg，氯化钴200mg，钼酸钠5mg，定容至1L，pH＝7。 [0042] 实施例1.沙福芽孢杆菌的筛选分离与纯化 [0043] 1.水样富集 [0044] 在山东某化工厂的好氧池中取水样100mL，取10mL接种于装有100mL富集培养基的三角瓶中，富集培养基中加入0.05vol％柴油，于30℃、200r/min条件下振荡培养5天，每隔一天测量柴油的含量并调节pH；柴油含量下降到原浓度50％以下时，则转接下一级富集，即取培养后的培养液10mL再次接种于100mL富集培养基中，每次转接柴油的浓度均增加0.05vol％，重复培养4次至富集培养基中柴油浓度为0.2vol％。 [0045] 2.菌株的筛选与分离 [0046] 取最后一级培养液0.5mL，使用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10‑4，10‑5，10‑6，‑7 ‑810 和10 倍，取稀释后的培养液涂布于营养固体培养基平板上，后置于30℃培养箱中培养，待菌落长至合适大小后，观察菌落的形态特征，并挑取单菌落进行划线纯化，纯化三代后，进行4℃斜面保存，共分离出6株菌株，分别命名为CY1～CY5。 [0047] 3.复筛 [0048] 将初筛得到的5株菌株分别接种于基础培养基中，30℃条件下振荡培养24h，分别取培养液10mL在5000rpm条件下离心10min，弃上清液，再分别接种于100mL的评价培养基(柴油含量为0.2vol％)中，30℃条件下振荡培养，各实验组设置三组平行，并使用无菌水作为空白对照，定期检测培养基中柴油含量的变化，结果如表1所示。 [0049] 表1初筛所得菌株对柴油的评价结果 [0050] [0051] [0052] 由表1中的数据可知，菌株CY1对于柴油的去除效果最强，其对柴油的降解能力显著优于其他4株菌株。 [0053] 实施例2.菌种的鉴定 [0054] 1.形态观察 [0055] 将菌株CY1接种在营养固体培养基平板上，观察菌落的形态特征。CY1菌株的菌落照片见图1，100倍显微镜放大照片见图2，其菌落呈点状，不透明，乳白色，边缘整齐，清晰光滑，表面干燥。 [0056] 2.分子生物学鉴定 [0057] 提取菌株CY1的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA。 [0058] 16S rDNA引物： [0059] 16S rDNA‑F:5’‑TATGTTGCCCTTGTCGTGG‑3’， [0060] 16S rDNA‑R:5’‑CCGCGTTTGTAGGCCCTCGT‑3’。 [0061] 后提取PCR产物，使用测序仪ABI3730‑XL进行DNA测序。用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，发现其下属于芽孢杆菌属，鉴定为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，将其命名为沙福芽孢杆菌CY1。 [0062] 实施例3.沙福芽孢杆菌的盐度耐受性测试 [0063] 在无菌条件下，将沙福芽孢杆菌CY1接种于含有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得沙福芽孢杆菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为83亿CFU/mL。 [0064] 以基础培养基(盐度为1％)作为基础，分别在含100mL基础培养基的三角瓶中额外加入NaCl 0g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g后，设置为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％与10％的盐度梯度。分别取沙福芽孢杆菌的活化液各5mL，分别接入到具有不同盐度梯度的培养基中，后置于30℃摇床中振荡培养，定期测定其OD600值和活菌数，以确定菌株的生长程度，结果如表2所示。 [0065] 表2沙福芽孢杆菌在不同盐度条件下培养的OD600值和活菌数 [0066] [0067] 由表2中的数据可知，菌株CY1在盐度1‑5％时均可正常生长，1％为其最适生长盐度，且在盐度低于5％时菌株的生长状况明显优于盐度高于5％时。 [0068] 实施例4.沙福芽孢杆菌在不同柴油含量下的降解效率测定 [0069] 在无菌条件下，将沙福芽孢杆菌CY1接种于含有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得沙福芽孢杆菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为87亿CFU/mL。 [0070] 分别配制柴油体积含量为0.5％、1％、2％、3％、4％和5％的评价培养基，将沙福芽孢杆菌的活化液按1vol％的接种量分别接种至100mL已灭菌的各个评价培养基中，后置于30℃、200rpm摇床中振荡培养，每组设3个平行，将无菌水加入到评价培养基中作为空白对照，实验分组安排如表3，后每隔24h检测各个培养基中的柴油含量，结果如表4所示。 [0071] 表3各实验组评价培养基中的柴油含量 [0072] [0073] 表4各实验组和对照组评价培养基的柴油含量变化 [0074] [0075] [0076] 由表4中的数据可见，在柴油含量为1％以下时，沙福芽孢杆菌CY1均表现出优异的降解效果，72h的柴油降解率均达到99％以上。但是，当柴油含量在1％以上时，72h降解率最高仅有53.1％，并且随着柴油含量的升高，CY1的降解效率逐渐降低。因而此结果表明沙福芽孢杆菌能耐受1％的柴油，但对1％以上含量的柴油耐受较差。实施例5.沙福芽孢杆菌的发酵过程 [0077] 沙福芽孢杆菌的发酵方法包括如下步骤： [0078] 1)用接种环挑取沙福芽孢杆菌的斜面种子，接种至100mL的基础培养基中，于25‑35℃、150‑300rpm培养18h，获得一级种子液； [0079] 2)将培养的一级种子液按照1‑10vol％的接种量接种至1L的基础培养基中，于25‑35℃、150‑300rpm培养18h，获得二级种子液； [0080] 3)于无菌条件下，将二级种子液按照5‑10vol％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉5g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸氢二胺0.5g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、氯化钙0.05g/L，控制温度为25‑35℃、转速150‑300rpm，通气比为1:(1‑2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得沙福芽孢杆菌的发酵液，经测试，该发酵液的活菌数为194亿CFU/mL。 [0081] 实施例6.沙福芽孢杆菌对含油石化废水的处理效果 [0082] 沙福芽孢杆菌CY1于无菌条件下接种至含有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，30℃、200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得沙福芽孢杆菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为86亿CFU/mL。 [0083] 山东东营某石化含油废水，处理前初含油量为2890mg/L，pH＝7.8。取此含油废水100mL分别置于两个相同的250mL锥形瓶中，实验组按照含油废水体积的1％接种菌株活化液，对照组中接入相同体积的无菌水，控制条件为温度30℃、200rpm摇床中振荡处理，pH值自然。在反应过程中，24h后每48h取样一次，结果如表5所示。 [0085] 表5石化含油废水中油含量随时间的变化 [0086] [0087] 由表5中的数据可知，在投加菌株活化液后的六天时间内，油降解率为54％，这表明本发明的沙福芽孢杆菌具有一定的高浓度石油烃降解能力。 [0088] 实施例7.沙福芽孢杆菌对含油蜡染废水的处理效果 [0089] 沙福芽孢杆菌CY1于无菌条件下接种至含有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化得活化液，经测试，该活化液的活菌数为86亿CFU/mL。 [0090] 山东省某含油蜡染废水，处理前初含油量为110mg/L，pH＝7.8。取此含油废水100mL分别置于两个相同的250mL锥形瓶中，实验组按照废水体积的1％接种菌株活化液，对照组中接入相同体积的无菌水，控制条件为温度30℃、200rpm摇床中振荡处理，pH值自然。 在反应过程中每24h取样一次，结果如表6所示。 [0091] 其中，油检测方法按照《GB/T16488‑1996水质石油类和动植物油的测定红外光度法》执行。 [0092] 表6含油蜡染废水中油含量随时间的变化 [0093] [0094] 由表6中的数据可知，在投加菌株活化液后的五天时间内，石油烃降解率为96％，这表明本发明的沙福芽孢杆菌具有高效的石油烃降解能力。 [0095] 实施例8.沙福芽孢杆菌对含油土壤的处理效果 [0096] 沙福芽孢杆菌CY1于无菌条件下接种至含有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得沙福芽孢杆菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为88亿CFU/mL。 [0097] 烟台某石化油泥污染土壤，处理前初含油量为2％，检测数值为20200mg/L，pH＝8.2。 [0098] 取此含油土壤100g分别置于两个相同的250mL烧杯中，实验组按照含油土壤质量的10％接种菌株活化液，对照组中接入相同质量的无菌水，控制条件为30℃恒温培养箱中处理，投菌前调整pH值在7‑8之间，后期pH自然。在反应过程中随时补充水分，补充氮元素和磷元素保证CNP比例为100:10:1。每7天取样一次，结果如表7所示。 [0099] 表7含油土壤中的油含量随时间的变化 [0100] [0101] 由表7中的数据可知，在投加菌株活化液后的五周，石油烃降解率为97.9％，这表明本发明提供的沙福芽孢杆菌具有高效的石油烃降解能力。 |
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