一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因与应用专利检索-固体废物的处理被污染土壤的再生专利检索查询-专利查询网

一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因与应用
申请号	CN202311790537.8	申请日	2023-12-25	公开(公告)号	CN117737030A	公开(公告)日	2024-03-22
申请人	南京师范大学;			发明人	陈焱山; 韩雨; 赵菲; 谢文轩; 甄成浩; 闫萌; 张作伟; 周明曦; 王国祥;
摘要	本发明公开了一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明中蜈蚣草经砷处理后其根系和地上部的PvVP1基因表达水平均显著上调。同时本发明构建了植物表达载体，利用35S启动子将PvVP1基因在烟草中超表达，并通过实验发现该转基因烟草植株的生物量指标和各组织部位砷含量均显著高于野生型烟草植株。因此本发明为基因工程技术培育砷污染场地修复植物提供了基因资源和方法。
权利要求	1.一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1，其特征在于，所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因。 3.根据权利要求2所述的蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 4.权利要求1所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或权利要求2‑3任一项所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因在提高植物吸收积累砷中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草。 6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，培育PvVP1转基因植物株系用于含砷土壤的修复。 7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，培育PvVP1转基因植物株系用于含砷污水的处理。 8.一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草，其特征在于，利用权利要求1所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或权利要求2‑3任一项所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因转化得到。 9.一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草的培养方法，其特征在于，利用权利要求 1所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或权利要求2‑3任一项所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因培育，包括以下步骤： (1)提取蜈蚣草RNA，并取合成cDNA一链； (2)设计基因特异引物PvVP1‑F1和PvVP1‑R1，PCR扩增得到权利要求2‑3任一项所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1基因编码序列，PvVP1‑F1和PvVP1‑R1的核苷酸序列分别为： PvVP1‑F1:ATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA； PvVP1‑R1:TTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC； (3)设计带酶切位点引物PvVP1‑F2和PvVP1‑R2，PCR扩增获得带BamHI和SalI酶切位点的PvVP1基因，回收目的片段；PvVP1‑F2和PvVP1‑R2的核苷酸序列分别为： PvVP1‑F2:GGATCCATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA； PvVP1‑R2:GTCGACTTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC；其中，酶切位点PvVP1‑F2为左侧GGATCC，PvVP1‑R2为左侧GTCGAC； (4)将载体质粒pCAMBIA1301‑35S‑NOS和带酶切位点的PvVP1基因编码序列进行BamHI和SalI双酶切，回收目的片段； (5)通过T4连接酶将PvAVP1基因连接到pCAMBIA1301‑35S‑NOS目的载体上，得到载体pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1； (6)将载体pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1通过电击法转化农杆菌c58，得到农杆菌c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1； (7)将c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1通过叶盘法转化烟草，得到蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草。 10.根据权利要求8所述的获得方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增选用的酶为Primer Star，扩增程序为：98℃10s，55℃30s，72℃130s，35cycles；72℃for 10min；10℃for ever。
说明书全文	一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因与应用技术领域 [0001] 本发明涉及一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因在提高植物砷积累中的应用，属于植物基因工程技术领域。背景技术 [0002] 土壤砷污染是全球范围内一个非常突出的环境问题。植物修复是当前最为经济有效的砷污染土壤修复技术之一，它主要依托砷超富集植物对砷的吸收积累特性实现砷的转移，达到净化土壤的目的，具有成本低、操作简单、环境友好等优点。 [0003] 蜈蚣草是世界上第一个被公开报道的砷超富集植物，也是一种理想的修复土壤砷污染的植物。根据蜈蚣草愈伤组织细胞中砷的分布情况，约91％的砷储存于液泡中，表明液+泡是蜈蚣草砷的主要储存部位。液泡膜上最重要的初级主动运输是H运输，在细胞质和液+ 泡之间建立pH梯度。液泡膜两侧H 浓度的平衡主要依靠质子焦磷酸酶(Pyrophosphatase，V‑PPase)和ATP酶(V‑ATPase)两种质子泵，分别通过水解无机焦磷酸盐(Inorganic pyrophosphate，PPi)和ATP作为能量来源。液泡膜上两种质子泵建立的跨液泡膜电化学梯度，为液泡膜上许多次级转运蛋白，包括介导砷液泡区隔化的砷转运蛋白提供了驱动力。目前对于模式植物拟南芥和其它植物质子焦磷酸酶VP基因的植物功能研究表明，该基因在促进植物生长、帮助植物抵御多种逆境胁迫及增加重金属镉的吸收积累方面发挥重要作用。但目前植物VP基因在植物砷代谢中的功能研究以及对植物砷积累的作用尚未见报道。挖掘蜈蚣草VP基因并研究其功能，对于阐明蜈蚣草砷富集机理并通过基因工程手段培育具有砷积累能力的生长较快、适应性强、生物量大的工程植物具有重要意义，可推动植物修复技术发展。发明内容 [0004] 发明目的：本发明的第一目的是提供一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1；本发明的第二目的是提供该该蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因；本发明的第三目的是提供该蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1及其编码基因在提高植物砷积累中的应用。 [0005] 技术方案：本发明所述种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1，所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有758个氨基酸的蛋白质。 [0006] 本发明所述一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因。 [0007] 进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因片段大小为2277bp。 [0008] 本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因或权利要求4所述重组菌在提高植物吸收积累砷中的应用。 [0009] 进一步地于，所述植物为烟草。 [0010] 进一步地于，培育PvVP1转基因植物株系用于含砷土壤的修复。 [0011] 进一步地于，培育PvVP1转基因植物株系用于含砷污水的处理。 [0012] 本发明还包括一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草，利用本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因转化得到。 [0013] 本发明还包括一种蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草的培养方法，利用本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1或本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1的编码基因培育，包括以下步骤： [0014] (1)提取蜈蚣草RNA，并取合成cDNA一链； [0015] (2)设计基因特异引物PvVP1‑F1和PvVP1‑R1，PCR扩增得到本发明所述蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1基因编码序列，PvVP1‑F1和PvVP1‑R1的核苷酸序列分别为： [0016] PvVP1‑F1:ATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA； [0017] PvVP1‑R1:TTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC； [0018] (3)设计带酶切位点引物PvVP1‑F2和PvVP1‑R2，PCR扩增获得带BamHI和SalI酶切位点的PvVP1基因，回收目的片段；PvVP1‑F2和PvVP1‑R2的核苷酸序列分别为： [0019] PvVP1‑F2:GGATCCATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA； [0020] PvVP1‑R2:GTCGACTTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC； [0021] 其中，酶切位点PvVP1‑F2为左侧GGATCC，PvVP1‑R2为左侧GTCGAC； [0022] (4)将载体质粒pCAMBIA1301‑35S‑NOS和带酶切位点的PvVP1基因编码序列进行BamHI和SalI双酶切，回收目的片段； [0023] (5)通过T4连接酶将PvAVP1基因连接到pCAMBIA1301‑35S‑NOS目的载体上，得到载体pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1； [0024] (6)将载体pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1通过电击法转化农杆菌c58，得到农杆菌c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1； [0025] (7)将c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1通过叶盘法转化烟草，得到蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1转基因烟草。 [0026] 进一步地于，步骤(2)中，所述PCR扩增选用的酶为Primer Star，扩增程序为：98℃10s，55℃30s，72℃130s，35cycles；72℃for 10min；10℃for ever。 [0027] 进一步地于，步骤(3)和步骤(4)中，回收目的片段均采用0.8％琼脂糖凝胶电泳获得。 [0028] 技术效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点： [0029] 本发明首次报道蜈蚣草质子焦磷酸酶PvVP1基因的CDS核苷酸序列，且能够在烟草中进行超表达，并通过潮霉素初步筛选、PCR方法和基因测序得以验证。本发明中成功培育出多个PvVP1转基因烟草株系，并将其在砷处理条件下的表型和各组织部位砷含量与野生型烟草株系进行比较，发现多个PvVP1转基因株系根、茎和叶中砷积累量显著提高。这说明PvVP1基因及其编码蛋白能够提高烟草砷的吸收积累。因此，本发明为通过基因工程技术培育具有砷污染高效修复能力的植物提供了理论基础。附图说明 [0030] 图1为实施例1中蜈蚣草在0.2mM和1.0mM AsⅤ暴露1天后其根部和地上部PvVP1基因的表达水平图； [0031] 图2为实施例3中PvVP1转基因与野生型烟草在30mg/L潮霉素(Hygromycin B)平板中的生长对比图； [0032] 图3为实施例3中多个PvVP1转基因与野生型烟草PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图； [0033] 图4为实施例4中多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理30天后根部表型对比图； [0034] 图5为本实施例4中多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理生物量指标示意图； [0035] 图6为实施例4中多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理30天后根部、茎秆和叶片砷含量示意图； [0036] 图7为实施例4中多个PvVP1转基因与野生型烟草水培10μM AsⅤ暴露1天后根部、茎秆和叶片砷含量示意图。具体实施方式 [0037] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。 [0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0040] 实施例1砷处理条件下蜈蚣草体内PvVP1基因的表达水平 [0041] 在蜈蚣草转录组测序数据信息中获得PvVP1基因的CDS序列，其长度为2277bp，如SEQ ID NO.1所示，编码含有758个氨基酸的蛋白质，PvVP1基因的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。 [0042] PvVP1基因的核苷酸序列 [0043] [0044] PvVP1基因编码的蛋白质的氨基酸序列 [0045] [0046] PvVP1基因的表达模式鉴定：选取具有5‑6片羽叶且长势一致的蜈蚣草置于1/5霍格兰营养液(Hoagland Nutrition Solution，HNS)中预培养1‑2周，在其生长出茂盛的幼嫩新根后将其转移至分别含有0.2mM AsⅤ和1.0mM AsⅤ的1/5HNS中进行砷处理，每组4个重复，并设置对照组(No As)，24h后收集样品并立即置于‑80℃冷冻。首先利用RNA提取试剂盒提取各处理组蜈蚣草根部和地上部的RNA，去除基因组DNA(4×gDNA wiper Mix 4μL，模板RNA加至总RNA浓度1pg‑1μg，RNase‑free ddH2O加至总体系16μL，移液器轻轻吹打混匀后，42℃、2min，并立即反转录成cDNA一链(向上述反应液中加入4μL 5×No RT Control Mix，逆转录反应程序为37℃、15min，85℃、5s)。随后配制实时荧光定量PCR(Quantitative Real‑time PCR；qRT‑PCR)反应体系：qRT‑PvVP1‑F引物(0.4μL)、qRT‑PvVP1‑R引物(0.4μL)、 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(10μL)、cDNA加至1pg‑1μg(1μL)、ddH2O(8.2μL)。 [0047] qRT‑PCR扩增引物序列如下： [0048] qRT‑PvVP1‑F:GGGCTGGCCTGATTATTGGT(SEQ ID No.3)； [0049] qRT‑PvVP1‑R:GTAGCCCAAGGCTAAGCCAA(SEQ ID No.4)； [0050] 扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40次循环；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s进行溶解曲线采集。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和qRT‑PCR预混液均购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，实验方法均参照试剂盒说明书。最后使用StepOne‑ΔΔCt实时荧光定量PCR系统(赛默飞世尔科技有限公司)进行检测，通过相对定量2 的计算PvVP1基因的表达水平，结果如图1所示。图1为蜈蚣草在0.2mM和1.0mM AsⅤ暴露1天后其根部和地上部PvVP1基因的表达水平图，由图1可见，0.2mM AsⅤ和1.0mM AsⅤ处理24h后蜈蚣草根系和地上部PvVP1基因表达水平均显著上调，说明该基因可参与蜈蚣草砷代谢过程。 [0051] 实施例2PvVP1基因超表达株系的获得 [0052] 1、PvVP1基因超表达烟草株系的获得 [0053] 剪取少量蜈蚣草叶片，在液氮中研磨成粉磨后，用invitrogen公司的Plant RNA Purification Reagent试剂并按照其说明书提取蜈蚣草RNA。用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript First‑Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit并按照其说明说提取合成cDNA一链。 [0054] 根据上述获得的PvVP1基因的序列，设计基因特异引物，序列如下： [0055] PvVP1‑F1:ATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA(SEQ ID No.5)； [0056] PvVP1‑R1:TTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC(SEQ ID No.6)； [0057] 以cDNA为模板，以PvVP1‑F1/PvVP1‑R1为引物扩增获得PvVP1基因编码序列(2277bp)。PCR扩增所选用的酶为Primer Star，扩增所使用的程序为98℃10s，55℃30s，72℃130s，35cycles；72℃for 10min；10℃for ever，得到PvVP1基因编码序列。 [0058] 将上述PCR产物(PvVP1基因编码序列)稀释50倍为模板，设计带酶切位点引物，PCR扩增引物序列如下(小写字母为酶切位点)： [0059] PvVP1‑F2:ggatccATGCCGATCCTCACCACTGTGTGGA(SEQ ID No.7)； [0060] PvVP1‑R2:gtcgacTTAACTACCAATTTTGAAGAGCCAC(SEQ ID No.8)； [0061] PCR扩增获得带BamHI和SalI酶切位点的PvVP1基因。PCR扩增所选用的酶为Primer Star，扩增所使用的程序为98℃10s，55℃30s，72℃130s，35cycles；72℃for 10min；10℃for ever，得到带BamHI和SalI酶切位点的PvVP1基因序列。0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，即带酶切位点的PvVP1基因编码序列。 [0062] 将载体质粒pCAMBIA1301‑35S‑NOS和带酶切位点的PvVP1基因编码序列进行BamHI和SalI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，得到PvAVP1基因。通过T4连接酶将PvAVP1基因连接到pCAMBIA1301‑35S‑NOS目的载体上，得到载体pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1。将构建的载体(pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1)通过电击法转化农杆菌c58，得到带有构建载体质粒的农杆菌c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1。 [0063] 将带有构建载体质粒的农杆菌(c58‑pCAMBIA1301‑35S‑PvAVP1)通过叶盘法转化烟草。 [0064] (1)农杆菌液准备：挑取接种转化用的农杆菌单克隆于10毫升LB培养基中(50mg/L Rif+50mg/L Kan)，过夜培养，得到农杆菌液。 [0065] (2)烟草的农杆菌侵染：将无菌苗叶片取出在无菌玻璃皿上切成约0.5‑1cm2的小块，用镊子将切好的叶片夹到OD值为0.4‑0.6的农杆菌液中浸泡8‑10分钟。 [0066] (3)倒掉农杆菌液，吸干叶片上的农杆菌液 [0067] (4)吸干农杆菌液的叶片放置到共培养培养基(MS培养基+NAA(0.1mg/L)+6‑BA(1.5mg/L))上，25℃暗培养三天。 [0068] (5)将共培养三天后的烟草叶片转移到分化筛选培养基(MS+1.5mg/L 6‑BA+0.1mg/L NAA+100mg/L Kan+100mg/L Cef)上，25℃光照条件下培养。 [0069] (6)在光照培养室中培养两至三周长出烟草幼芽，将烟草幼芽剪出来转移到壮苗培养基(MS+0.1mg/L 6‑BA+0.01mg/L NAA+100mg/L Kan+100mg/L Cef)上，25℃光照条件下培养。 [0070] (7)约一周后，挑出长出根的烟草苗转移到生根培养基(MS+50mg/L Kan+50mg/L Cef)上，25℃光照条件下培养数周。 [0071] (8)对烟草苗进行PCR鉴定，获得转PvVP1基因阳性苗，即T0代PvVP1基因超表达烟草材料。 [0072] 实施例3PvVP1基因超表达株系的鉴定 [0073] 转化完成收到T0代PvVP1基因超表达烟草材料，于营养土中种植并收获T1代种子，将其在含有30mg/L潮霉素(Hygromycin B)的1/2MS培养基中萌发，以野生型烟草作为阴性对照(WT)，在平板中长势良好的幼苗为初筛阳性的转基因烟草(PvVP1‑OX)(比对结果如图2所示)。进一步取初筛阳性的转基因烟草样本进行DNA提取，对其进行PCR鉴定。扩增体系(50μL体系)为：PvVP1‑F3引物(2μL)、PvVP1‑R3引物(2μL)、2×Rapid Taq Master Mix(25μL)、模板DNA(1μL)、ddH2O(20μL)。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35次循环；72℃彻底延伸5min。 [0074] 特异性扩增引物序列如下： [0075] PvVP1‑F3：5’‑GCCACTTATGCCAATGCTCG‑3’(SEQ ID NO.9) [0076] PvVP1‑R3：5’‑CCCAAAGTCCAACAGCAACG‑3’(SEQ ID NO.10) [0077] 此后，取PCR反应液置于1％琼脂糖凝胶中跑电泳，鉴定电泳结果如图3所示。图3为本发明的多个PvVP1转基因与野生型烟草PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图，由图3可见，以野生型株系(WT)作为对照，转基因株系(A3‑12、A3‑25、A3‑26、A3‑29、A3‑35)均具有目的条带754bp，鉴定其为转基因阳性株系。 [0078] 实施例4砷处理条件下PvVP1基因对烟草砷吸收积累的影响 [0079] 以野生型株系WT和实施例3中的5个转基因株系烟草幼苗A3‑12，A3‑25，A3‑26，A3‑29和A3‑35作为处理材料。 [0080] 土培砷处理：选取同时期的长势一致的烟草幼苗转移至砷污染土(采自江苏南京栖霞山附近矿区污染田地，砷浓度为133ppm)中，处理15天时，剪取各株系新鲜叶片测量鲜重后立即浸入清水中约4h，测定叶片的饱和鲜重，随后将叶片置于75℃烘箱中烘干至恒重，按照下式测定叶片干重并计算叶片含水率： [0081] [0082] 土培30天后收集样品置于75℃烘箱中烘干，以备后续砷含量测定。 [0083] 水培砷处理：选择生长状态良好且长势基本一致的野生型株系WT和上述PvVP1转基因株系烟草幼苗A3‑12，A3‑25，A3‑26，A3‑29和A3‑35作为处理材料，在1/5霍格兰营养液中预培养1‑2周，使其生长出适应水培环境的白色新根，随后将其转移至含有10μM AsⅤ的1/5HNS中处理24h，用解吸附溶液(1mM K2HPO4，0.5mM Ca(NO3)2，5mM MES，pH＝6.0)浸泡根部10min，螯合除去根表的重金属后收集样品，于75℃烘箱烘干并测定砷含量。 [0084] 样品前处理与上述砷含量测定：称取0.1‑0.5g烘至恒重的烟草样品于消解管中，向其中加入10mL1:1(w/v)HNO3，置于105℃石墨炉消解仪中进行消解，消解液剩余1mL时，向其中加入2mL 30％ H2O2继续消解至剩余1mL时，结束消解程序。取出消解管冷却至室温后使用超纯水定容至25mL，稀释后的消解液过0.22μM滤膜，并用0.1mol/L的超纯硝酸(Sigma)稀释至电感耦合等离子体质谱(ICP‑MS)砷浓度测定的检出限范围内，在砷标准溶液(砷浓度分别为0.5ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10ppb、20ppb)、空白样和样品中加入内标铟(Indium，In)后上机测样。 [0085] 烟草根系表型结果如图4所示，图4为实施例4多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理30天后根部表型对比图，其中，以野生型株系WT、PvVP1转基因株系烟草幼苗A3‑12和A3‑29为例，每个样品选取2株进行拍照。由图4可以看出，转基因株系具有比野生型株系更发达的根系。 [0086] 根长、株高、鲜重增长率和15天叶片相对含水率如图5所示，图5为实施例4多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理生物量指标示意图，其中，A为处理0天和30天根长对比图；B为处理30天后株高增长率对比图；C为处理30天后鲜重增长率对比图；D为处理15后叶片相对含水率对比图。由图5A可见，土培处理后PvVP1转基因株系的根长比野生型株系增加14.8％‑36.7％株高、鲜重增长率和15天叶片相对含水率也分别增加26.5％‑49.6％、36.2％‑93.9％和5.70％‑9.33％。以上生物量数据表明，PvVP1基因可显著提高烟草在砷处理条件下的生物量和砷吸收积累能力。 [0087] 土培和水培砷处理条件下烟草各组织部位砷含量结果分别如图6、图7所示，[0088] 图6为实施例4的多个PvVP1转基因与野生型烟草土培砷处理30天后根部、茎秆和叶片砷含量示意图，由图6可见，土培处理30天后，转基因烟草根部、茎秆和叶片中积累的砷含量均显著高于野生型，分别增加29.4％‑70.0％、36.6％‑63.6％和13.7％‑80.0％；图7为实施例4多个PvVP1转基因与野生型烟草水培10μM AsⅤ暴露1天后根部、茎秆和叶片砷含量示意图，由图7可见，水培10μM AsⅤ暴露1天后，转基因烟草根部、茎秆和叶片中积累的砷含量亦显著高于野生型，分别增加47.5％‑116％、32.0％‑203％和76.1％‑287％。上述实验结果表明，利用35S启动子将PvVP1基因在烟草中无差别表达能够显著增加烟草各组织部位的砷含量，此结果暗示了PvVP1基因可参与蜈蚣草的液泡区隔过程，为完善蜈蚣草的砷富集的分子机理提供理论基础。

意见反馈