[0001] 本发明涉及重金属污染土壤修复技术领域，更具体的说是涉及一株萎缩芽孢杆菌DH179及其在缓解植物镉毒害中的应用。

[0002] 随着大气沉降、矿产开采和冶炼等全球环境变化和在工农业活动的日益影响下，土壤重金属污染愈发严重。目前，土壤重金属污染已成为全球性的环境问题之一。土壤中的可溶态重金属可迁移至地下水，污染地下水资源，严重威胁人类健康。因此，重金属污染土壤的修复、治理与复垦已成为环境科学和生态学的研究热点。上世纪80年代起，国外就已针对土壤修复技术开展了相关研究，而国内相对来说起步较晚。国家为加强土壤修复工作，于2016年5月和2018年8月分别印发和通过了《土壤污染防治行动计划》和《中华人民共和国土壤污染防治法》。

[0003] 土壤修复技术主要包括物理修复、化学修复和生物修复等。其中，物理和化学修复治理速度快、效果明显，但其投入多、成本高、扰动大，且会损害土壤结构，更容易造成二次污染。相比之下，生物修复技术是利用生物代谢活动以减少污染土壤中的重金属含量或减弱其毒性，具有低成本、高效益且不易产生二次污染等优点，因此在重金属污染土壤修复方面具有广阔的应用前景。微生物修复技术在生物修复技术中研究热度最高，该技术可通过微生物代谢活动实现对重金属离子的吸附、转化和沉淀作用，从而降低土壤中的重金属离子的浓度和毒性，在重金属污染土壤修复过程中表现出良好的应用效果。在微生物修复技术的实际应用中，将特定微生物与相关营养物按照一定比例混合，可制备复合微生物肥。这样不仅可以为植物提供生长所需的营养物质，还可以利用微生物群落降低土壤重金属含量，有效缓解重金属对植物的毒害作用。

[0004] 镉是一种生物体中非必需的微量营养元素，在自然界中通常以化合物形式存在，一般含量很低，不会给人类健康和生态环境造成很大风险。然而，由于环境变化或人类活动的影响，镉会通过植物吸收而在植物体内产生富集，对植物产生严重的毒害作用，阻碍植物的正常生长，也会通过食物链富集进一步威胁到人类健康。目前，研究较多的耐重金属污染细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus sp.)、链霉菌(Streptomyces)、球菌(Micrococcus)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)和根瘤菌(Rhizobium frank)等，还有一些功能微生物(例如解磷菌)具有钝化重金属的能力，但是不同菌属或菌种之间对重金属的耐受性存在差异，其耐镉能力亦不相同。基于此，筛选能耐受高浓度镉环境的菌株对于开发稳定、高效、应用于重金属镉污染土壤修复的微生物菌剂具有重要的农业生产价值。

[0005] 因此，提供一株萎缩芽孢杆菌DH179及其在缓解植物镉毒害中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

[0006] 有鉴于此，本发明提供了一株萎缩芽孢杆菌DH179及其在缓解植物镉毒害中的应用，萎缩芽孢杆菌DH179具有耐镉和降低镉浓度的特性，尤其能在低浓度镉环境中快速扩繁，并有效缓解植物镉毒害，显著促进植物生长。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DH179，对镉具有高耐受性并能有效缓解植物镉毒害，其保藏编号为CGMCC No.26843，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年03月17日，分类命名为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。

[0009] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在耐受镉胁迫中的应用。

[0010] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在降低环境中镉浓度的应用。

[0011] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下缓解玉米镉毒害中的应用。

[0012] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下促进玉米生物量增加中的应用。

[0013] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下促进玉米光合作用中的应用。

[0014] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在促进玉米光合作用中的应用。

[0015] 进一步，所述的萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下促进玉米抗氧化酶活中的应用。

[0016] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株萎缩芽孢杆菌DH179及其在缓解植物镉毒害中的应用，萎缩芽孢杆菌DH179能耐受高浓度镉胁迫，并在较高浓度镉环境中(0.9mM CdCl2)显著降低镉含量；萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下，对玉米幼苗的生长具有显著的促进作用；萎缩芽孢杆菌DH179在镉胁迫环境下，对玉米幼苗光合作用和抗氧化酶活等有不同程度的促进作用；萎缩芽孢杆菌DH179可应用于生产，具有促进植物生长以及缓解植物镉毒害的作用，对于重金属污染土壤修复、实现资源可持续具有重要意义。附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

[0018] 图1附图为本发明萎缩芽孢杆菌DH179菌株的菌落形态；

[0019] 图2附图为本发明不同浓度CdCl2对萎缩芽孢杆菌DH179的生物量OD600的影响；

[0020] 图3附图为本发明不同浓度CdCl2下萎缩芽孢杆菌DH179对Cd2+含量的影响；

[0021] 图4附图为本发明不同浓度CdCl2下萎缩芽孢杆菌DH179对玉米叶片Cd2+含量的影响；

[0022] 图5附图为本发明不同浓度CdCl2下萎缩芽孢杆菌DH179对玉米生物量的影响；

[0023] 其中，A：玉米鲜重；B：玉米干重；

[0024] 图6附图为本发明不同浓度CdCl2下萎缩芽孢杆菌DH179对玉米光合作用的影响；

[0025] 其中，A：净光合速率；B：气孔导度；C：蒸腾速率；D：胞间CO2浓度；

[0026] 图7附图为本发明不同浓度CdCl2下萎缩芽孢杆菌DH179对玉米抗氧化酶活的影响；

[0027] 其中，A：SOD活性；B：POD活性；C：CAT活性；D：MDA含量；

[0028] 图3‑图7中，+，表示菌株DH179处理；‑，表示无菌株处理。

[0029] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0030] 实施例1萎缩芽孢杆菌DH179菌株的分离和鉴定

[0031] 1)DH179菌株的分离和纯化，具体步骤如下：

[0032] (1)样品来源于陕西定边盐湖的土壤样品；

[0033] 各培养基成分如下：

[0034] 无机磷固体培养基成分如下：参考NBRIP培养基成分略有修改，该培养基含有(每升)10g葡萄糖、5g Ca3(PO4)2、0.03g FeSO4·7H2O、0.5g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g KCl、0.3gNaCl、0.03g MnSO4和18g琼脂，补蒸馏水至1000ml，并将琼脂培养基的pH调节至7.0‑8.0。

[0035] LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L、琼脂18g/L，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

[0036] LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

[0037] LB固体选择培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L、琼脂18g/L、0.75mM氯化镉，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

[0038] LB液体选择培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L、(0mM、0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM和1.5mM)不同浓度氯化镉，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

[0039] (2)分离和纯化：首先，称取10g盐碱土溶解在90ml无菌水中，150rpm振荡培养‑530min后，逐次稀释至10 。在无机磷固体培养基平板上接种0.2ml稀释液，在28℃恒温培养箱倒置培养7天后，挑选可以产生清晰透明光晕的菌落继续在在无机磷固体培养基平板上重新划线2‑3次进一步纯化菌株，直至琼脂平板上生长出单一菌落。其次，将筛选分离得到的解磷细菌接种在LB固体选择培养基，重复操作2次，培养7天后，观察比较菌株的生长；为
2+
了确定Cd (CdCl2)对细菌的抗性水平，在LB培养基上进行了0.75mM的抑制浓度试验，将能在LB固体选择培养基上正常生长菌株鉴定为能耐受镉毒性菌株，于4℃斜面保存。

[0040] 2)采用焦磷酸测序法对DH179菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：

[0041] (1)细菌基因组总DNA的制备：用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)提取DH179菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。

[0042] (2)基因的PCR扩增：

[0043] 参照TransFast Taq DNA Polymerase试剂盒说明书的反应体系，以细菌全长通用引物27F和1492R进行PCR扩增反应。

[0044] 通用引物27F和1492R的引物序列如下：

[0045] 27F：5’‑AGRGTTTGATYNTGGCTCAG‑3’；SEQ ID NO.1；

[0046] 1492R：5’‑TASGGHTACCTTGTTASGACTT‑3’；SEQ ID NO.2。

[0047] 反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共循环30次；72℃延伸10min。

[0048] (3)PCR产物纯化、测序和分析

[0049] 将PCR扩增产物提交给北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司进行测序，测定16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。将测序返回的序列登录美国国立生物技术信息中心网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在数据库中进行BLAST比对鉴定，结果表明DH179菌株与萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的16S rRNA基因序列的同源一致性在99.44％，因此分离菌株被鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。

[0050] CACTCGTCACTTCGGCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTCTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGGTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTA

[0051] GCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCG

[0052] GTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTAC

[0053] CCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCA

[0054] TCTGTCCGCTCGACTGCAGTATAGGCGCGCATTCACACTCGTCACTTCG

[0055] GCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAAACT

[0056] CTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC

[0057] GCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGA

[0058] GTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTA

[0059] ACCTCGCGGTCTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAG

[0060] CCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC

[0061] GGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAAC

[0062] TAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG

[0063] ACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAG

[0064] GGGAAGCCCTATCTCTAGGGGTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAG

[0065] GTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGG

[0066] GCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCCAG

[0067] GCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCC

[0068] TAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT

[0069] CCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGA

[0070] GAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCG

[0071] CTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTC

[0072] CAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGA

[0073] AACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCA

[0074] CCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG

[0075] TTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCC

[0076] TAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTT

[0077] GCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC

[0078] CGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCT

[0079] CAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTA

[0080] GCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTT

[0081] ATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTT

[0082] CCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACC

[0083] CGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCAGTATAGGCGCGCATTCA；SEQ ID NO.3。

[0084] 3)萎缩芽孢杆菌DH179菌株的形态鉴定特征如下：

[0085] DH179菌株属于厚壁菌门，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性。在无机磷固体培养基上形成边缘清晰的不规则菌落，中间呈浅褐色，周围呈白色，中间具乳状突起，如图1所示。能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和半乳糖作为唯一碳源，不能利用木糖和乳糖作为唯一碳源；唯一氮源可利用硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钠和硝酸钾。

[0086] 实施例2萎缩芽孢杆菌DH179菌株的生理生化特征

[0087] (1)淀粉水解试验

[0088] 含0.2％可溶性淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制：牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂粉18g/L，调节pH＝7～8，121℃高温高压灭菌20min，在超净工作台内倒平板待用。鲁哥氏碘液：1g碘，2g碘化钾，先用少量去离子水将碘化钾溶解，再加入碘完全溶解，加水稀释至300mL。将菌株接种于平板培养基，30℃恒温培养箱倒置培养3～5天，形成菌落后，滴加鲁哥氏碘液，均匀铺满平板。片刻之后观察，若培养基呈深蓝色，菌落周围出现无色透明圈，表明菌株可分泌淀粉酶水解淀粉，即为阳性反应；若菌落周围没有透明圈，表明菌株不能水解淀粉，即为阴性反应。

[0089] (2)V‑P试验

[0090] 培养基配制：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，调节pH＝7.0～7.2，分装每个试管10mL，121℃灭菌20min。试剂：40％KOH，6％α‑萘酚无水乙醇溶液。在超净工作台内，将菌株接种于上述培养基中，于30℃恒温摇床振荡培养3天，取培养液5mL，向试管中加入300μl 40％KOH溶液，再加300μl6％α‑萘酚溶液，用力振荡混匀，再放入37℃恒温培养箱中保温15～30min，若培养液出现红色，即为V‑P阳性反应，有些细菌需要放置4h才会出现红色，若
4h后仍不显现红色，可判定为阴性反应。

[0091] (3)M‑R试验

[0092] 培养基配制：与V‑P试验一致。

[0093] M‑R试剂：称量0.04g甲基红，先在60mL 95％乙醇溶液中溶解，然后加入40mL超纯水定容至100mL。

[0094] 在超净工作台内，将菌株接种于上述培养基中，于30℃恒温摇床振荡培养3d后，用移液器吸取5mL培养液于无菌离心管中，向其加入100μl M‑R试剂(变色范围pH＝4.2～6.3，颜色由红变黄)，如果出现红色，即为M‑R阳性反应；变为黄色则为阴性反应。

[0095] (4)明胶水解试验

[0096] 培养基配制：蛋白胨0.5g，明胶12g，去离子水100mL，pH＝7.2～7.4。分装每个试管10mL，121℃灭菌20min。

[0097] 在超净工作台内，用长牙签挑取菌株穿刺接种于明胶中间约2/3深度，于20℃恒温培养7天，每天观察试验结果，若因培养温度高使明胶本身液化应不能摇动，静置4℃冰箱中2h凝固，观察明胶是否被细菌液化，若被液化，则明胶水解阳性反应，反之则为阴性反应。

[0098] (5)吐温80水解试验

[0099] 培养基配制：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，氯化钙0.2g/L，吐温80 10mL/L，琼脂粉18g/L，pH＝7～8，121℃高温高压灭菌20min，倒平板待用。在超净工作台内，将菌株接种于培养基平板，30℃恒温倒置培养3～5天后观察，若菌落周围有白色光晕圈即为阳性反应，反之则为阴性反应。

[0100] (6)过氧化氢酶活性

[0101] 于1.5mL离心管中加入600μl 3％过氧化氢溶液，用移液器吸取400μl LB菌液添加其中，30秒内观察气泡的产生。有气泡产生的即为过氧化氢酶阳性反应，无气泡产生则为过氧化氢酶阴性反应。

[0102] LB菌液制备：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母浸粉10g/L，调节pH＝7～8，于100mL三角瓶分装50mL，121℃高温高压灭菌30min备用。接种DH179菌株于LB液体培养基，30℃、180rpm振荡培养3天，最终LB菌液浓度稀释至OD600＝0.6。以下所有需要接种菌液的实验，制备步骤都是与此一样。

[0103] (7)产H2S能力测定

[0104] 培养基配制：蛋白胨20g/L，NaCl 5g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，Na2S2O3·5H2O0.5g/L，琼脂10g/L，调pH＝7.2，将蛋白胨、琼脂熔化，冷却至60℃加入其它成分，用移液器吸取10mL分装试管，112.6℃灭菌30min，直立搁置凝固待用。

[0105] 用灭菌长牙签蘸取LB菌液，穿刺接种H2S试验用培养基，置于28℃恒温培养箱静置培养3d，若有黑色沉淀线出现，则表明有硫化物产生，即为阳性反应，反之则为阴性反应。

[0106] (8)水解柠檬酸盐能力测定

[0107] 培养基配制：NH4H2PO41g/L，K2HPO41g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，柠檬酸钠2g/L，琼脂粉18g/L，将上述各成分加热溶解后，调pH＝6.8，然后加入1％溴麝香草酚蓝乙醇溶液指示剂，摇匀，呈黄绿色，用移液器吸取10mL分装至试管，121℃灭菌20min后制成斜面培养基。

[0108] 用移液器吸取100μl LB菌液接种至柠檬酸盐斜面培养基，置于28℃培养箱静置培养3d，观察细菌是否生长及培养基变色情况：黄色或蓝色为阳性反应；绿色为阴性反应。

[0109] 淀粉水解试验、V‑P试验、M‑R试验、明胶水解试验、吐温80水解试验、过氧化氢酶活性、产H2S能力测定、水解柠檬酸盐能力测定结果见表1。

[0110] 表1DH179菌株生理生化特征

[0111]

[0112] 注：+，阳性反应；‑，阴性反应。

[0113] 实施例3萎缩芽孢杆菌DH179的耐镉和去镉能力测定

[0114] (1)在pH＝7～8条件下，添加浓度为0mM、0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM和1.5mM的CdCl2至液体培养基，分别接种0.5mL DH179菌株的培养物(LB菌液)于50mL上述以氯化镉为2+
唯一镉源的含不同浓度Cd 的LB液体培养基中，于30℃恒温摇床180rpm振荡培养5天，以不同培养条件为横坐标，菌株扩繁指标OD600值为纵坐标绘图，结果见图2。

[0115] 根据图2可知，随着CdCl2浓度增加，DH179菌株对镉胁迫的耐受能力逐渐降低，即菌株扩繁能力OD600值由1.36(0mM CdCl2)一直下降至0.09(1.5mM CdCl2)，说明DH179菌株可以适应一定浓度的镉胁迫，尤其在低浓度(0.3mM CdCl2)镉胁迫下仍有良好的扩繁能力。

[0116] (2)在pH＝7～8条件下，添加浓度为0mM、0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM和1.5mM的CdCl2至液体培养基，分别接种0.5mL DH179菌株的培养物(LB菌液)于50mL上述以氯化镉为2+
唯一镉源的含不同浓度Cd 的LB液体培养基中，于30℃恒温摇床180rpm振荡培养5天。同时，
2+
设置无菌株处理为空白对照，以不同培养条件为横坐标，培养基Cd 含量为纵坐标绘图，结果见图3。结果表明，不同浓度CdCl2处理下菌株对镉的去除能力存在一定差异，在0.9mM处
2+
理下的去镉能力最为显著，培养基中的Cd 含量显著降低了2.9mg/L。

[0117] 综上可见，DH179菌株既可以耐受高浓度镉环境(1.5mM CdCl2)，又可以在较高浓度镉环境(0.9mM CdCl2)中具有良好的去除镉能力。

[0118] 实施例4镉胁迫下菌株DH179对玉米叶片Cd2+含量和生物量的影响

[0119] 将河沙用流水清洗，冲去表面残留矿物质养分，121℃灭菌1h，除去表面残留微生物。称取1.7kg处理好的河沙，置入干净花盆中。“郑单958”玉米种子用75％无水乙醇表面消毒10min，再用无菌水冲洗4‑5次，去除残留酒精，每个花盆种植2棵植株，出苗一周后进行接种处理，处理组接种10mL菌株DH179培养物(OD600＝0.6)三次，对照组接种同等体积无菌蒸馏水，每次间隔5天，生长期第一个月水分和霍格兰营养液正常管理幼苗。一个月后添加氯化镉，设置CdCl2浓度为0mM、4mM、8mM和12mM的四种重金属条件进行胁迫处理，每个花盆浇灌100mL，每个处理四个生物学重复，共计16盆植株。胁迫处理一个月后，收获植株，测定植株叶片镉和生物量，反映菌株DH179对镉胁迫的响应。同时设置无菌株处理作为空白对照，2+
四种CdCl2浓度与接种菌株一致，每个处理四个生物学重复，共计16盆植株。玉米叶片Cd 含量见图4，玉米生物量见图5。

[0120] 霍格兰营养液配制：四水硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸二氢钾136mg/L、七水硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5mL/L和微量元素液5mL/L。

[0121] 铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解于无菌去离子水，二者混合最终定容至500mL，调节pH＝5.5。

[0122] 微量元素液：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L和氯化钴0.025mg/L。

[0123] 叶片Cd2+含量的测定方法：

[0124] (1)样品处理

[0125] 称取0.3g充分研磨均匀的植物样品置于100mL消煮管中，加入5mL浓硫酸(98％)消煮，以仅含有浓硫酸(98％)的消煮管作为空白对照，先在240℃消煮40min，冷却至室温后加入2mL H2O2，混匀，再在360℃消煮40min，此时消煮液透明无色即为消煮完成，冷却至室温定容至100mL。将溶液的硫酸浓度调节为2.5mol/L(准确量取40mL溶液中加入3.97mL浓硫酸，即为2.5mol/L)。

[0126] (2)萃取分离

[0127] 吸取待测液和相同体积空白试验液10mL分别置于分液漏斗中，加25mL超纯水至溶液体积为35mL，再用移液器吸取16mL磷酸(85％，优级纯)加入漏斗中，慢慢混匀，并冷却至室温，加KI 5mL，混合均匀，静置5min，加MIBK试剂10mL，摇动3‑5min，萃取碘化物，静置分层后，分离出MIBK溶液于15mL离心管中(即上面有机层)。

[0128] (3)上机测定

[0129] 绘制镉标准曲线：吸取1mL 100μg/mL镉标准贮备液(CdCl2)于100mL容量瓶中，用浓度0.1mol/L HCl稀释定容至刻度线，即为1μg/mL的镉工作标准液，吸取0mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL和12.5mL标准液置于50mL容量瓶中，用浓度0.1mol/L HCl稀释定容至刻度线，即得到浓度为0μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.15μg/mL、0.2μg/mL和0.25μg/mL镉标准系列溶液。

[0130] 测定镉含量。使用镉空心阴极灯，测定波长为228.8nm，燃烧器用空气‑乙炔火焰，按照镉的仪器测定条件设定灯电流、狭缝、气体流量、燃烧器高度等参数，用MIBK喷雾，调节仪器零点。将萃取分离到MIBK层中的标准系列溶液、待测液和空白试验溶液进行直接喷雾，测定它们的吸收值或浓度值。

[0131] 4)结果计算

[0132] 叶片Cd2+含量(mg/kg)＝(ρ‑ρ0)×V×ts/m

[0133] 式中，

[0134] ρ——测定溶液中镉的质量浓度；

[0135] ρ0——空白试验溶液中镉的质量浓度；

[0136] V——MIBK溶液体积(mL)；

[0137] ts——分取倍数，待测溶液总定容体积(100mL)/测定时吸取待测液体积(10mL)；

[0138] m——样品质量(g)。

[0139] 根据图4可知，菌株DH179能显著降低4mM和8mM浓度处理下玉米叶片Cd2+含量，说明接种菌株DH179能显著抑制玉米对镉的吸收，从而缓解镉对玉米的胁迫。根据图5A和图5B可知，菌株DH179能在所有镉胁迫处理下显著增加玉米鲜重生物量(增重超过20％)，并在无镉(0mM CdCl2)和低镉(4mM CdCl2)环境中显著增加玉米干重生物量(增重超过30％)。

[0140] 综上可见，菌株DH179不仅能在低、中浓度镉(4mM、8mM菌株DH179)处理条件下显著缓解镉对玉米的胁迫和毒害作用，并可在高浓度镉(12mM CdCl2)胁迫下显著促进玉米生长发育。

[0141] 实施例5镉胁迫下菌株DH179对玉米光合作用和抗氧化酶活性的影响

[0142] (1)选取上述实施例4中玉米植株，每个植株选取3片展开叶片，每片叶片计数10次，用Li‑6400便携式光合仪(LI‑COR Inc.,Lincoln,NE,USA)测定玉米光合作用(净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度)对镉胁迫的响应。相关结果见图6。

[0143] 根据图6可知，菌株DH179能缓解镉胁迫对玉米光合作用的不利影响。除4mM CdCl2处理以外，其他镉胁迫处理下接种菌株DH179均能显著增加玉米的光合速率；此外，与无菌株处理的玉米相比，在低浓度镉(4mM CdCl2)处理下，菌株DH179能显著促进气孔导度、蒸腾速率及维持较低的胞间CO2浓度。

[0144] (2)选取上述实施例4中玉米植株，每盆取3g新鲜叶片保存，每个处理四个生物学重复，共计32个样品。提取粗酶液，测定SOD、POD、CAT活性和MDA含量。相关结果见图7。

[0145] 粗酶液的提取方法：称取3g新鲜玉米叶片，加入约15mL粗酶提取液，冰浴充分研磨，10000rpm低温离心20min，取上清液冷藏备用。

[0146] 粗酶提取液配制：以50mmol·L‑1pH＝7.8的PBS配制，含有0.1mmol·L‑1EDTA、质量浓度为0.3％Triton X‑100和质量浓度为4％聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)(罗恩)，其中TritonX‑100(罗恩)及PBS提前混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀备用。

[0147] 50mmol·L‑1pH＝7.8的PBS配制：

[0148] A液：配制500mL 0.2M NaH2PO4·H2O(沪试)，称取13.8g，定容至500mL；

[0149] B液：配制1L 0.2M Na2HPO4·12H20(沪试)，称取71.6g/L，定容至1L；

[0150] 50mmol·L‑1PBS(pH7.8)：A液85mL+B液915mL＝1000mL，稀释4X，即得到4L ‑150mmol·L PBS。

[0151] 1)SOD的测定方法

[0152] 取10mL离心管，分别加入3mL反应混合液(在54mL 14.5mmol·L‑1DL‑蛋氨酸(麦克‑1 ‑1 ‑1林)中，分别加入2mL 3μmol·L EDTA、2mL 2.25mmol·L NBT(麦克林)和2mL 60μmol·L核黄素溶液(麦克林))和粗酶液0.02mL，混合后放在透明离心管架上，在光照培养箱内照光(8000Lux)，照光10min后立即避光迅速测定A560值，以不加粗酶液的照光管作对照，计算反应被抑制的百分比，以能抑制NBT光化学反应的50％为一个酶单位。

[0153] 计算公式为：

[0154] SOD总活性＝(Ack‑AE)×V/(0.5×Ack×W×Vt)

[0155] 式中，Ack为对照离心管吸光度；AE为样品管吸光度；V为提取液总体积(mL)；Vt为测定时样品用量体积(mL)；W为样品用量(g)。

[0156] 2)POD的测定方法

[0157] 采用愈创木酚法。在10mL离心管中加入3mL反应混合液和PBS磷酸缓冲液0.05mL，作为校零对照；另取10mL离心管加入反应混合液3mL和粗酶液0.05mL，迅速摇匀，立即测定A470值，于0、30s和60s分别计数一次，以每分钟每克鲜重的吸光度变化值表示酶活力单位，‑1单位为ΔA470/min·g·FW。反应混合液配制：0.05mL 50mmol·L PBS(pH＝7.8)，0.95mL 
0.2％愈创木酚(麦克林)和2mL 0.2％过氧化氢混合均匀。

[0158] 计算公式为：

[0159] POD活性(U)＝(ΔA470×V)/(0.001×Δt×Vs×W)

[0160] 式中，ΔA470为反应混合液的吸光度变化值(A470)；Δt为酶促反应时间(min)；V为样品提取液总体积(mL)；Vs为测定时所取样品提取液体积(mL)；W为样品质量(g)。

[0161] 3)CAT的测定方法

[0162] 取2.9mL反应混合液加入0.1mL粗酶液，迅速颠倒2‑3次充分混匀，立即测定A240值，分别于0，30s和60s计数一次。以每分钟每克鲜重的吸光度变化值(ΔA240/min·mg·FW)来表示。(反应混合液配制：1mL 0.2％过氧化氢(用pH＝7.8的PBS稀释)，添加蒸馏水1.9mL稀释)

[0163] 计算公式为：u/mg＝E240×3/0.0436×EW

[0164] 式中，E240为240nm处每分钟吸光度的减少值；EW为每0.1mL所用粗酶提取液中含样品的鲜重(mg)；0.0436为240nm处1μmol过氧化氢的吸光度；3为反应混合液的总体积。

[0165] 4)MDA的测定方法

[0166] 吸取3mL粗酶液和3mL 0.6％硫代巴比妥酸(麦克林)，混匀后在10mL离心管上加盖，于沸水浴上反应15min，迅速冰浴冷却后于4000rpm离心10min，取上清液测定A532，A450值。

[0167] 计算公式为：

[0168] MDA(μmol‑1)＝6.45A532‑0.56A450

[0169] MDA(nmol·g‑1)＝MDA(μmol‑1)×V/W×1000

[0170] 式中，V为粗酶提取液使用量；W为样品鲜重(g)。

[0171] 根据图7可知，菌株DH179可以降低玉米对镉胁迫响应而导致活性氧含量增加的不利影响。相比于无菌株处理的玉米，在无CdCl2胁迫条件下，菌株DH179能显著促进玉米增强POD活性；在4mM CdCl2胁迫条件下，菌株DH179能显著促进玉米增强SOD和POD活性，同时降低玉米MDA含量；在8mM CdCl2胁迫条件下，菌株DH179能显著促进玉米CAT活性和降低玉米MDA含量；在12mM CdCl2胁迫条件下，菌株DH179能显著促进玉米增强SOD活性。由此可见，在不同浓度镉胁迫处理下，玉米的抗氧化酶活性呈现出差异的显著性，但是整体上可以缓解镉对玉米造成的胁迫和毒害作用。

[0172] 综上可见，萎缩芽孢杆菌DH179菌株可以缓解镉胁迫对玉米光合作用的不利影响，促进玉米抗氧化酶活性的增强，以降低镉胁迫产生的活性氧对玉米的损伤。

[0173] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。