[0001] 本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种聚苯乙烯塑料降解菌及利用其降解塑料的方法。背景技术：

[0002] 随着全球工业农业生产的快速发展及人类生活的需求，塑料制品产量逐年递增，然而每年只有10％左右的塑料能被回收利用，其余的则被焚烧或者掩埋，风化分解成细小碎片扩散迁移，从而广泛地分布在土壤和河道、海洋。当塑料尺寸小于5毫米，就变成了微塑料，它会作为一种持久性的污染物通过食物链进行累计，会阻碍生物体的免疫反应，增加患不孕不育、肥胖和癌症等疾病的风险。

[0003] 聚苯乙烯(PS)广泛应用在食品行业和装修行业，是全球塑料污染较为严重的塑料之一，因为其化学稳定性好，难以从自然环境中去除。与焚烧、热降解等处理方法相比，微生物原位降解方法具有条件温和、简便、环境友好等特点，为解决聚苯乙烯塑料污染问题提供了重要途径。尽管PS可以被微生物降解，但是目前已发现的PS降解功能菌种资源极少，亟需加大相关功能菌株的发掘力度，建立新型的PS微生物治理方法。发明内容：

[0004] 针对目前塑料降解功能菌种资源少、治理方法缺乏的问题，本发明的目的是提供一种聚苯乙烯塑料降解菌及利用其降解塑料的方法，为解决聚苯乙烯塑料污染问题提供菌种资源和技术手段。

[0005] 本发明的聚苯乙烯塑料降解菌为阿氏芽孢杆菌(Priestiaaryabhattai)Red22，该菌已于2023年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCCNo:63428。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种降解聚苯乙烯塑料的菌剂，其含有上述阿氏芽孢杆菌Red22作为活性成分。

[0007] 本发明的第三个目的是提供上述阿氏芽孢杆菌Red22在降解聚苯乙烯塑料中的应用。

[0008] 优选，所述的降解是以聚苯乙烯塑料为唯一碳源进行生长并定殖在塑料表面，逐步对塑料进行降解。

[0009] 本发明的第四个目的是提供一种降解聚苯乙烯塑料的方法，其将上述的阿氏芽孢杆菌Red22与聚苯乙烯塑料共同培养。

[0010] 优选，所述的被降解的塑料为聚苯乙烯的颗粒物，或者薄膜，或者粉末。

[0011] 优选，所述的被聚苯乙烯塑料可以在不同的水体中被阿氏芽孢杆菌Red22降解。

[0012] 优选，所述的阿氏芽孢杆菌Red22是阿氏芽孢杆菌Red22发酵液，其OD600为1.0～1.8，接种至含有聚苯乙烯塑料的液体中时，其接种量是1％～10％v/v。

[0013] 优选，所述的共同培养，其培养条件为：温度：25℃～37℃，震荡培养转速：150～220rpm。

[0014] 本发明从环境土壤掩埋的塑料废弃物中筛选分离出聚苯乙烯塑料降解菌及利用其降解塑料，该微生物广泛存在于土壤，具有培养简单，活性高、环境友好等特点，其降解聚苯乙烯塑料时能定殖在塑料表面并逐步进行降解。在降解培养一定时间后，Red22对聚苯乙烯塑料的失重率达到7.3％，而且，通过扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱和接触角等分析发现，降解后的聚苯乙烯塑料表面出现明显的沟壑和凹坑，且降解后的聚苯乙烯塑料发生了化学结构变化，亲水基团增加了，分子量降低了，证明该菌的降解效果明显。本发明提供的聚苯乙烯塑料降解菌Red22在不同环境的实际水体中也有明显的降解能力，证明菌Red22有良好的环境适应性，为聚苯乙烯塑料的生物降解提供了新的资源，具有较好的应用前景。

[0015] PriestiaaryabhattaiRed22，该菌已于2023年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCCNo:63428。附图说明：

[0016] 图1为本发明实施例3中所述的菌Red22降解聚苯乙烯塑料片45天后其在聚苯乙烯塑料片表面上的生长情况的激光共聚焦显微镜对比图：左图为对照组，右图为菌Red22的处理组；

[0017] 图2为本发明实施例3中所述的聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后的质量损失图；

[0018] 图3为本发明实施例3中所述的聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后的SEM对比图：左图为对照组，右图为菌Red22的处理组；

[0019] 图4为本发明实施例3中所述的聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后的FTIR变化图；

[0020] 图5为本发明实施例3中所述的聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后的接触角变化图；

[0021] 图6为本发明实施例3中所述的聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后的分子量变化图；

[0022] 图7为本发明实施例4中所述的聚苯乙烯塑料在不同的实际水体中被菌Red22降解50天后的质量损失图。
具体实施方式：

[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

[0024] 实施例1

[0025] 1、聚苯乙烯塑料降解菌株的分离纯化与鉴定：

[0026] (1)聚苯乙烯塑料降解菌株的分离纯化：将从掩埋在土壤里的塑料废弃物用无菌水轻轻冲洗后裁剪小块，放入无菌的三角瓶中，加入生理盐水和玻璃珠，放置于30℃的摇床200rpm转速下振荡培养6h，制成菌悬液。将菌悬液以体积比10％接种量转接到含有已紫外灭菌的聚苯乙烯粉末(2g/L)的无碳源矿物盐培养基中，加入18％的甘油，在30℃的摇床
180rpm转速下振荡培养15天，定期取样测OD600值，等培养体系变浑浊后继续转接到无碳源的含聚苯乙烯粉末(2g/L)的矿物盐培养基中，重复培养3次。挑选生长迅速的培养体系进行‑3 ‑6
梯度稀释(10 ～10 )，用稀释涂布平板法(LB平板)分离菌株，并多次划线纯化分离到一株黄白色的纯菌株，命名为red22。将分离得到的菌株采用斜面培养基和甘油管进行保菌。

[0027] 所述的分离筛选的无碳源矿物盐培养基，其配制方法是将Na2HPO4：0.52g、KH2PO4·3H2O：0.50g、NH4Cl：1.5g、CaCl2：0.03g、MgSO4·7H2O：0.8g、FeSO4·7H2O：0.01g、ZnSO4·7H2O：0.02g、CuSO4·5H2O：0.02g、MnSO4·H2O：0.006g溶于1L水中，混合均匀，灭菌即得。

[0028] (2)聚苯乙烯塑料降解菌株的鉴定：提取分离得到的Red22菌株的DNA，委托上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序，16SrRNA扩增采用广谱引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTAYGACTT。根据鉴定结果显示，发现Red22菌株为阿氏芽孢杆菌(Priestiaaryabhattai)，命名为阿氏芽孢杆菌
(Priestiaaryabhattai)Red22，所以本发明所使用的聚苯乙烯塑料降解菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株。

[0029] 阿氏芽孢杆菌(Priestiaaryabhattai)Red22于2023年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCCNo：63428。

[0030] 该菌株16SrRNA基因序列如下所示：

[0031] GTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCT[0032] 实施例2

[0033] 1、聚苯乙烯塑料降解菌Red22对聚苯乙烯塑料片的降解，包括以下步骤：

[0034] (1)聚苯乙烯塑料片的制备：为了方便塑料的表征和回收称重的准确性，本实验采用聚苯乙烯塑料片进行降解实验。将买的纯的聚苯乙烯粉末加入到二甲苯中(3g/mL)，机械搅拌后放置1晚溶解，搅拌均匀后吸取5毫升透明液体平铺在90mm的玻璃培养皿中固化36小时，然后把成膜后的聚苯乙烯薄膜裁剪成0.5*0.5mm的小片，分别用75％乙醇和无菌水清洗干净后自然干燥。

[0035] (2)菌种的活化：将聚苯乙烯塑料降解菌‑阿氏芽孢杆菌Red22接种于LB琼脂平板上，30℃培养24小时，待菌落成熟。

[0036] (3)种子培养：将活化后的阿氏芽孢杆菌Red22挑单菌落接种到10mLLB液体培养基中进行恒温震荡培养，在30℃、180rpm下恒温震荡培养16h，得到种子液。

[0037] (4)发酵培养：将种子培养液按体积比2％接种量接种到LB液体培养基中进行恒温震荡培养，在30℃、180rpm下恒温震荡培养16h。将发酵培养结束后所得的菌悬液按6000×g的离心力离心5min，收集菌体沉淀，并用PBS缓冲液洗涤2次。将沉淀重新悬浮于无碳源矿物盐培养基中，调节重悬菌液OD600值为1.5。

[0038] (5)阿氏芽孢杆菌Red22降解聚苯乙烯：将0.5*0.5mm的聚苯乙烯塑料片称重后在超净台中用75％乙醇浸泡灭菌1h，取出后用超净台中的无菌气流挥发掉表面的液体。在大试管中加入15mL的无碳源矿物盐培养基和表面灭菌后的聚苯乙烯塑料片(约0.01g/mL)，并以10％(v/v)的接种量接种上述收集的阿氏芽孢杆菌Red22重悬液。以不接菌处理为对照组，每种处理设置6个平行样。将上述试管放置于30℃、180rpm的恒温震荡培养箱中培养，定期取样分析聚苯乙烯塑料片的质量损失、表面形貌变化、官能团变化以及其表面的疏水性变化等。

[0039] 实施例3

[0040] 阿氏芽孢杆菌Red22降解聚苯乙烯塑料片的效果：

[0041] (1)阿氏芽孢杆菌Red22在聚苯乙烯塑料表面的生长情况：阿氏芽孢杆菌Red22降解聚苯乙烯塑料片45天后，取出3片聚苯乙烯塑料片后马上用PBS缓冲液轻轻地清洗一次，然后用细菌的死活探针染料染色，放到激光共聚焦显微镜下拍聚苯乙烯塑料片表面的Red22菌株的生长情况。从图1可以看出，阿氏芽孢杆菌Red22可以均匀地在聚苯乙烯塑料片表面定殖形成生物膜，且培养降解45天后阿氏芽孢杆菌Red22的活性还比较好，大多数都是活的细胞，这就说明菌株Red22能适应聚苯乙烯塑料创造的生存环境，并能正常生长，进一步证明阿氏芽孢杆菌Red22能附着在聚苯乙烯塑料表面以其为碳源进行生长的同时降解聚苯乙烯。

[0042] (2)聚苯乙烯塑料片的质量损失测试：阿氏芽孢杆菌Red22降解聚苯乙烯45天后，抽滤采集试管中所有的聚苯乙烯塑料片，首先用2％的SDS清洗液超声清洗1小时，再用75％无水乙醇超声清洗20min，去除聚苯乙烯塑料片表面的生物膜，再用无菌水洗涤2次，最后将洗涤干净的聚苯乙烯塑料片放到50℃的真空干燥箱中干燥12小时。将干燥后的聚苯乙烯塑料片进行称重，计算其失重率。聚苯乙烯塑料片的失重率(％)＝(聚苯乙烯的初始质－降解后质量)÷初始质量×100％。由图2的失重率数据可见，菌株Red22降解聚苯乙烯塑料片45天后，塑料片的失重率达到7.3％，而没有加菌的对照组的失重率只有2.2％，这说明阿氏芽孢杆菌Red22可以以聚苯乙烯塑料片为碳源进而降解了聚苯乙烯塑料片。

[0043] (3)阿氏芽孢杆菌Red22降解聚苯乙烯后的表面形貌变化：降解后的聚苯乙烯塑料片清洗干燥后，用扫描电子显微镜(SEM)观察其表面形貌，结果如图3所示，聚苯乙烯塑料片被菌Red22降解45天后其表面出现一些明显的不规则沟壑或者凹坑，而没有加菌的对照组的聚苯乙烯塑料片表面比较平滑。表面菌株Red22在生长过程，能以聚苯乙烯为唯一碳源，通过侵蚀塑料片，破坏其表面结构，从而对聚苯乙烯塑料片产生明显的降解作用。

[0044] (4)聚苯乙烯降解后的表面官能团变化：用傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量菌株‑1Red22降解聚苯乙烯塑料片前后的表面官能团变化，光谱测量范围是400～4000cm ，结果如图4所示，与降解前的聚苯乙烯塑料片对比，阿氏芽孢杆菌Red22降解后的聚苯乙烯塑料片‑1
在3400～3700cm 处产生了新的特征峰，这是O‑H键的伸缩振动峰，此外，降解后的聚苯乙烯‑1
塑料片在1750cm 处产生了新的特征峰，这是C＝O键的伸缩振动峰，可以得出聚苯乙烯塑料片在被菌Red22降解氧化产生了一些羟基或羰基等活泼官能团，从而证明聚苯乙烯塑料片被Red22处理后表面发生明显的降解，一些大分子就和我发生部分解聚或者断链等，并产生新的氧化产物。

[0045] (5)聚苯乙烯降解后的表面疏水性变化：阿氏芽孢杆菌Red22降解后的聚苯乙烯塑料片清洗干燥后，用光学接触角测定仪测定水滴在聚苯乙烯塑料片表面的接触角。测定时，用双面胶将聚苯乙烯塑料片平整地粘贴在载玻片上，微注射器滴量为10微升，每个试样测试3个点，取平均值。接触角测试结果如图5所示，降解前的聚苯乙烯塑料片接触角是89.62°±1.51°，阿氏芽孢杆菌Red22降解后的聚苯乙烯塑料片的水接触角降到77.84°±1.13°，表明降解后聚苯乙烯塑料片表面疏水性显著下降，结合FTIR的结果，降解后的聚苯乙烯塑料片表面有亲水性的官能团产生，进一步说明了阿氏芽孢杆菌Red22对聚苯乙烯具有较高的降解能力。

[0046] (6)聚苯乙烯降解前后的分子量变化：用凝胶渗透色谱(GPC)来测定聚苯乙烯塑料被阿氏芽孢杆菌Red22降解前后的分子量变化，结果如图6所示，菌Red22降解后的聚苯乙烯塑料的质均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)均比降解前的低，而降解后的分子量分布指数(PDI＝Mw/Mn)比降解前高，PDI值越高，聚合物的分子量分布越宽，解聚程度越高，因此，进一步说明了阿氏芽孢杆菌Red22对聚苯乙烯具有较高的降解能力，能把聚苯乙烯的长链降解成碳链更短的产物。

[0047] 实施例4

[0048] 阿氏芽孢杆菌Red22在不同的实际水体中降解聚苯乙烯塑料的效果：

[0049] (1)阿氏芽孢杆菌Red22在不同实际水体中降解聚苯乙烯塑料的步骤：将0.5*0.5mm的聚苯乙烯塑料片称重后在超净台中用75％乙醇浸泡灭菌1h，取出后用超净台中的无菌气流挥发掉表面的液体。在大试管中加入15mL不同类型的实际水体(水厂上游水和脏河涌水)和表面灭菌后的聚苯乙烯塑料片(约0.01g/mL)，并以10％(v/v)的接种量接种实施例2的阿氏芽孢杆菌Red22发酵培养液。以不接菌Red22处理为对照组，每种处理设置6个平行样。将上述试管放置于30℃、180rpm的恒温震荡培养箱中培养，定期取样分析聚苯乙烯塑料片的质量损失、表面形貌变化及其表面的疏水性变化等。

[0050] (2)聚苯乙烯塑料片在不同水体中被阿氏芽孢杆菌Red22降解后的质量损失测试：阿氏芽孢杆菌Red22在不同实际水体中降解聚苯乙烯50天后，抽滤采集试管中所有的聚苯乙烯塑料片，首先用2％的SDS清洗液超声清洗1小时，再用75％无水乙醇超声清洗20min，去除聚苯乙烯塑料片表面的生物膜，再用无菌水洗涤2次，最后将洗涤干净的聚苯乙烯塑料片放到50℃的真空干燥箱中干燥12小时。将干燥后的聚苯乙烯塑料片进行称重，计算其失重率。聚苯乙烯塑料片的失重率(％)＝(聚苯乙烯的初始质－降解后质量)÷初始质量×
100％。由图6的失重率数据可见，阿氏芽孢杆菌Red22在干净的水厂上游水中降解聚苯乙烯塑料片50天后，塑料片的失重率达到4.1％，而没有加菌的对照组的失重率只有1.7％，阿氏芽孢杆菌Red22在比较脏的河涌水中降解聚苯乙烯塑料片50天后，塑料片的失重率达到
4.7％，而没有加菌的对照组的失重率只有1.9％，这证明菌株Red22可以在比较干净或者比较脏的水体中降解了聚苯乙烯塑料，进一步说明菌株Red22有良好的环境适应性，可在不同的实际环境中降解聚苯乙烯塑料。