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植物内菌生木糖氧化无色杆菌L451在降解有机污染物中的应用
申请号	CN202210763652.5	申请日	2022-06-30	公开(公告)号	CN115181700B	公开(公告)日	2024-04-02
申请人	广东药科大学;			发明人	刘丽辉; 沈晗; 郑静明; 旷怡婷; 黄孜仪;
摘要	本发明公开了植物内生菌木糖氧化无色杆菌L451在降解有机污染物中的应用。本发明提供的植物内生菌木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451是从野生稻中筛选分离得到，具有降解邻苯二甲酸酯和抗生素的特性，能够耐受50mg/L的四环素或环丙沙星，能以DBP、DEHP、四环素、环丙沙星为唯一碳源生长，能降解DBP、DEHP、四环素、环丙沙星，其中对环丙沙星(5mg/L)的降解率达62.19±0.20％，是环丙沙星高效降解菌。本发明为降解有机污染物中的微生物资源提供了优良菌种，木糖氧化无色杆菌L451能适应现实环境中邻苯二甲酸酯和抗生素复合污染的土壤并生长，具有很好的土壤修复能力。
权利要求	1.植物内生菌木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451在降解有机污染物中的应用，其特征在于，所述L451菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61951；所述有机污染物为邻苯二甲酸酯中的邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸二酯、抗生素中的四环素和/或环丙沙星。 2.植物内生菌木糖氧化无色杆菌L451或其菌液在修复有机污染物的土壤中的应用，其特征在于，所述L451菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61951；所述有机污染物为邻苯二甲酸酯中的邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸二酯、抗生素中的四环素和/或环丙沙星。 3.植物内生菌木糖氧化无色杆菌L451或其菌液在制备有机污染物降解菌剂中的应用，其特征在于，所述L451菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61951；所述有机污染物为邻苯二甲酸酯中的邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸二酯、抗生素中的四环素和/或环丙沙星。 4.一种有机污染物降解菌剂，其特征在于，含木糖氧化无色杆菌L451或其菌液，所述L451菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO： 61951。 5.根据权利要求4所述降解菌剂，其特征在于，所述菌液为菌悬液。 8 6.根据权利要求5所述降解菌剂，其特征在于，所述菌悬液的浓度为1×10 ～1× 10 10 cfu/mL。 7.一种降解有机污染物的方法，其特征在于，采用木糖氧化无色杆菌L451或权利要求4～6任一所述降解菌剂直接对邻苯二甲酸酯和/或抗生素或被污染的土壤进行处理；所述木糖氧化无色杆菌L451已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61951；所述邻苯二甲酸酯和/或抗生素污染为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二酯、四环素和/或环丙沙星污染。
说明书全文	植物内菌生木糖氧化无色杆菌L451在降解有机污染物中的应用技术领域 [0001] 本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及植物内生菌木糖氧化无色杆菌L451在降解有机污染物中的应用。背景技术 [0002] 当前土壤环境中的污染物正趋于多元化和复杂化，环境污染不是单一污染的理想状态，而是以有机污染物和各种新型污染物构成的复合污染。其中，抗生素的广泛使用导致其在环境中普遍存在，所引发的抗性基因问题已对全球公共卫生构成重大威胁。目前抗生素的使用主要有四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素类等。而环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是人工合成使用最为广泛的喹诺酮类抗生素，是恩诺沙星的代谢产物，对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都具有广谱抗菌性，已被证明具有基因毒性。抗生素广泛地应用于医疗、畜牧养殖及农业生产，超过70％是以药物原形随粪尿排出而进入污水处理系统或直接进入环境，抗生素土壤污染和危害日益被人们所发现和重视。土壤是环境中抗生素的重要汇集场所，抗生素暴露会对土壤生物带来危害，甚至会间接对人体健康造成潜在风险，因此需采取有效手段修复抗生素污染的土壤。 [0003] 邻苯二甲酸酯(Phthalate ester acids，PAEs)已成为全球最普遍的污染物之一，主要作为增塑剂被广泛应用于塑料、包装、化妆品、润滑剂和香料等各个行业。PAEs经生产、使用、焚化掩埋等进入到大气、水体、土壤等环境介质后，通过呼吸、水源、食物等途径进入生物体。自然环境中PAEs浓度一般较低，其通过生物浓缩、生物积累和生物放大作用进入生物体后对生物体产生“三致”危害，对生物体造成不可逆损伤。由于PAEs对整个生态系统危害的潜伏性、广泛性和深远性，其污染普遍性和对整个生态系统的危害性已受到越来越多的关注。微生物降解被认为是去除环境中PAEs的最佳途径。 [0004] 植物内生菌是一类生活在植物的组织或器官中但不会引发宿主产生明显病害的微生物，在污染严重的地区，植物内生菌还会发生一些变化来增强植株对逆境的耐受性，从而更好地适应环境。目前，大量高效降解有机污染物的微生物分离自土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等各类环境中，虽然具有较强的降解能力，但只能应用于土壤或者水体污染，而其在土壤中存活率偏低，且与植物很难互利共生，鲜少报道有应用于降解土壤微生物的植物内生菌。如现有技术公开的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)能够降解头孢菌素类抗生素，分离自头孢菌素药渣堆放的土壤中；而木糖氧化无色杆菌N4菌株能降解吲哚醌和邻氨基苯甲酸，分离自牛仔布印染废水处理池的活性污泥；且鲜有能够降解PAEs污染物的木糖氧化无色杆菌报道。目前有关能降解其他有机污染物的植物内生菌的种质资源匮乏，需要筛选出新的植物内生菌能很好地适应自然环境中复合污染的土壤，有利于降解更多的有机污染物。发明内容 [0005] 本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供植物内菌生木糖氧化无色杆菌L451在降解有机污染物中的应用。 [0006] 本发明的目的是提供木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451的新应用。 [0007] 本发明另一目的是提供一种有机污染物降解菌剂。 [0008] 本发明再一目的是提供一种降解有机污染物的方法。 [0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： [0010] 本发明提供了植物内生菌木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451在降解有机污染物中的新应用，该菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61951，保藏地址为广州市先烈中路100号。本发明提供的木糖氧化无色杆菌是从野生稻中筛选分离得到，能够降解有机污染物，具有降解邻苯二甲酸酯和抗生素的特性，能够耐受50mg/L的四环素、环丙沙星，能以DBP、DEHP、四环素、环丙沙星为唯一碳源生长，在以环丙沙星(5mg/L)为唯一碳源的无机盐液体培养基中培养5d后，降解率高达62.19±0.20％，是环丙沙星高效降解菌。 [0011] 因此，本发明提供植物内生木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451在降解有机污染物中、在修复有机污染物的土壤、在制备有机污染物降解菌剂中的应用。 [0012] 进一步地，所述有机污染物为邻苯二甲酸酯和/或抗生素。 [0013] 更进一步地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸二酯；抗生素为四环素和/或环丙沙星。 [0014] 本发明提供一种有机污染物降解菌剂，含木糖氧化无色杆菌L451或其菌液。 [0015] 优选地，所述菌液为菌悬液。 [0016] 优选地，所述所述菌悬液的浓度为1×108～1×1010cfu/mL。 [0017] 本发明提供一种降解有机污染物的方法，采用木糖氧化无色杆菌L451或上述降解菌剂直接对邻苯二甲酸酯和/或抗生素或被污染的土壤进行处理。 [0018] 特别地，由于土壤环境中污染物底物浓度低，富含其他碳源物质，而L451菌株还能以其他污染物为碳源进行生长，能更好地适应污染土壤；因此，可以通过调整有机污染物底物浓度、适量添加葡萄糖等碳源或优化降解条件来提高降解能力，增加菌株对土壤污染物的降解率。 [0019] 本发明具有以下有益效果： [0020] 本发明提供植物内生木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451在降解有机污染物中的新应用，本发明研究表明L451菌株具有降解邻苯二甲酸酯和抗生素的特性，能够耐受50mg/L的四环素、环丙沙星，能以DBP、DEHP、四环素、环丙沙星为唯一碳源生长，能够降解DBP、DEHP、四环素、环丙沙星，其中对环丙沙星(5mg/L)的降解率达62.19±0.20％，是环丙沙星高效降解菌。本发明为降解有机污染物的微生物资源提供了优良菌种，木糖氧化无色杆菌L451能适应现实环境中邻苯二甲酸酯和抗生素复合污染的土壤并生长，具有很好的土壤修复能力。附图说明 [0021] 图1为菌株L451在LB培养基上培养3天的生长形态； [0022] 图2为菌株L451的16S rRNA系统发育树； [0023] 图3为菌株L451在以DBP、DEHP、四环素、环丙沙星为唯一碳源的培养基中的生长情况图。具体实施方式 [0024] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。 [0025] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。 [0026] 实施例1植物内生菌的分离与鉴定 [0027] (1)培养基的配制 [0028] 无机盐培养基(g/L)：K2HPO4 5.8g，KH2PO4 4.5g，(NH4)2SO4 2.0g，MgCl20.16g，CaCl2 0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.0024g，KNO3 0.0012g，FeCl3 0.0018g，MnCl2·2H2O 0.0015g，调节培养基的pH为7.0； [0029] 牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，加超纯水至1L，调节pH为7.0； [0030] 培养基使用前先在121℃下高温灭菌20min。 [0031] (2)宿主植物的处理 [0032] 将采集的植物野生稻先冲洗干净后，放在超净工作台中处理，将宿主植物的根、茎、叶分别剪成大约4cm的小段，再用75％酒精浸泡5分钟，同时用无菌镊子进行搅拌；随后用0.1％升汞浸泡3分钟，同时用镊子搅拌；将升汞倒尽后，用无菌水震荡清洗7次，每次5分钟，并将最后一次洗涤的蒸馏水留下备用。随后用无菌剪刀将表面消毒完的根、茎、叶两端各剪去约1cm，再将其剪碎于无菌研钵中，充分研磨；再将研磨后的液体接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基。取最后一次洗涤的蒸馏水涂于牛肉膏蛋白胨固体培养基，观察是否有微生物生长，以确定宿主植物表面消毒是否彻底。 [0033] (3)菌株的分离纯化 [0034] 菌株培养条件：恒温培养箱中28℃养1～3天。待细菌长出来后，采用稀释涂布法和平板划线法对菌株进行分离纯化。将菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养7天，观察菌落形态特征，并进革兰氏染色和行生理生化特性测定。 [0035] 菌株形态如图1所示，菌落呈乳白色，不透明，圆形，表面光滑边缘规则。革兰氏染色为阴性，适宜的生长温度20～40℃，pH范围5～8，生化特性测定结果显示：能耐受1％NaCl，过氧化氢酶、硝酸盐还原、产氨试验均显示为阳性。 [0036] (4)菌株的16S rDNA分子鉴定和系统发育树分析 [0037] 将上述分离得到的菌株转接至牛肉膏蛋白胨液体培养基扩大培养，离心收集菌体，使用细菌DNA提取试剂盒(OMEGA厂家)提取菌体总DNA。用细菌16S rRNA基因通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。 [0038] PCR产物经测序后，将测序结果与GenBank中已报道的16S rRNA基因序列同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析，结果如图2所示，本发明分离纯化得到的菌株L451的16S rRNA基因序列与木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans ATCC 27061T(HG324050)同源性最高。因此，本发明筛选获得的菌株鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，命名为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451，将L451菌株于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：61951，保藏地址为：广东广州市越秀区先烈中路100号。 [0039] 实施例2菌株L451的抗生素耐受特性 [0040] 将菌株L451划线接种，分别接种至含有50mg/L四环素、50mg/L环丙沙星的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，每个处理重复三次，恒温培养箱中28℃养1～5天，观察菌株的生长情况。 [0041] 结果显示菌株L451能够在50mg/L四环素、50mg/L环丙沙星的培养上生长良好，显示菌株L451能够耐受浓度为50mg/L的两种抗生素。表明菌株L451在受抗生素污染的农业生态系统中有应用的潜力，耐受抗生素特性使得它们有较强的生存能力。 [0042] 实施例3菌株L451降解有机污染物效果分析 [0043] (1)菌种悬液的制备 [0044] 将纯化后的菌种L451接入含有10mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000rpm离心10min收集菌体，用pH7.0的0.05mol/LPBS缓冲液洗菌3次后重悬，调节OD600 nm＝1.0作为菌种悬液。 [0045] (2)菌株L451的降解性能测定 [0046] 定性测定：将菌株L451划线接种，分别接种至含有DBP(200mg/L)、DEHP(200mg/L)、四环素(5mg/L)、环丙沙星(5mg/L)为唯一碳源的无机盐固体培养基上，每个处理重复三次，恒温培养箱中28℃养1～5天，观察菌株的生长情况。 [0047] 定量测定：将灭菌的无机盐培养基，以每瓶50mL分装在250mL玻璃三角瓶中待用，分别加入DBP浓度为200mg/L，和环丙沙星浓度为5mg/L。得到以DBP或环丙沙星为唯一碳源的无机盐培养基。向无机盐培养基中接种1mL菌悬液，同时设置不接菌株处理为对照组(CK)，每组三个重复。将摇瓶置于恒温摇床30℃，150rpm/min的条件下避光培养5天。在第5d时取样并抽提样品，经GC/MS测定样品中DBP的浓度、高效液相色谱仪测定样品中环丙沙星的浓度。 [0048] (3)DBP提取和测定方法 [0049] 取上述培养样品置于三角瓶内，加入20mL色谱级的二氯甲烷，振荡10min，倒进分液漏斗中，待样品分层稳定后，取下层有机相转移到鸡心瓶中；将上层水相倒回原来的三角瓶并加入二氯甲烷重复萃取两遍，合并有机相二氯甲烷，并过15cm的无水Na2SO4柱，将过滤液全部转移至鸡心瓶中，旋转蒸发至近干，将浓缩液全部转移至10ml容量瓶中，并用色谱纯甲醇洗涤鸡心瓶加入容量瓶定容至10mL。取1mL经0.45um微孔滤膜过滤，滤液收集于进样瓶中，进行GC‑MS分析。 [0050] 采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP‑5柱子(0.25μm×0.25mm×30μm)，进样温度为250℃，离子源(EI)温度为220℃，采用不分流进样，进样体积1μL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100℃，30℃/min梯度上升至280℃，保持6min。采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。DBP的基质加标平均回收率为89.3～ 105.5％，相对偏差低于10.8％，仪器检测限为0.13～0.45ug/g。该方法满足痕量有机物定量分析要求。 [0051] (4)抗生素提取和测定方法 [0052] 将装有培养样品的三角瓶超声提取30min，随后用10％盐酸进行酸化溶菌处理，取5mL培养液清液，过HLB固相萃取小柱净化富集。用3mL洗脱液洗脱小柱，洗脱液在40℃水浴下用氮气吹干，用色谱甲醇‑高纯水(60:40，V/V)定容至1mL，溶液经0.45um微孔滤膜过滤待测。 [0053] 采用高效液相色谱进行四环素和环丙沙星定量分析，检测器为荧光检测器，ODS‑C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，Waters)。激发波长为280nm，发射波长为450nm，进样量20μL。流动相：乙腈‑0.067mol/L磷酸溶液(15:85，V/V)，流速1.0mL/min。 [0054] 结果如图3所示，显示菌株L451能在以DBP、DEHP、四环素、环丙沙星为唯一碳源的培养基生长，平板效果说明菌株L451能够降解和利用这些有机污染物作为碳源和能源。在以DBP(200mg/L)、DEHP(200mg/L)、四环素(5mg/L)、环丙沙星(5mg/L)为唯一碳源的无机盐液体培养基中培养5d后，菌株L451的降解率分别为4.29±1.06％、9.85±2.40％、8.66±0.40％、62.19±0.20％。在高浓度的以环丙沙星为唯一碳源的溶液中，株菌能高耐受抗生素并且发挥降解作用，说明该菌株有很好的应用价值。 [0055] 由于土壤环境中污染物底物浓度低，富含其他碳源物质，研究证明其他碳源的添加有助于微生物降解抗生素。可以将菌株L451继续驯化以提高降解能力，优化降解条件，降低有机污染物底物浓度适量添加葡萄糖等碳源，增加菌株L451对复合污染物的降解率。菌株L451还可以与其他菌株人工构建菌群，提高复合污染物生物降解率。菌株L451的降解酶尤其是对环丙沙星的降解酶可以分离提纯，用于环丙沙星的高效降解。 [0056] 综上所述，本发明提供植物内菌生木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)L451在降解有机污染物中的新应用，本发明研究显示L451菌株能够耐四环素和环丙沙星抗生素，能够在高浓度环丙沙星为唯一碳源的无机盐基础培养基中存活，还能降解DBP和DEHP、降解环丙沙星和四环素，对高浓度环丙沙星的降解率能达到62.19％左右。本发明为修复复合污染提供优良的植物内生菌种，在环境保护中具有很好的应用价值。 [0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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