[0001] 本发明涉及动物繁殖技术领域，特别是涉及槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释剂的应用。

[0002] 近年来，利用植物来源的生物分子改善雄性生殖性能已成为现代趋势。黄酮类化合物是一类分布广泛的植物化学物质，对动物健康和生产具有多种有益影响。许多天然黄酮类化合物与男性生殖细胞和组织有关，其中槲皮素这种物质值得研究人员进一步研究。槲皮素为黄酮醇类黄酮，存在于柑橘类水果、浆果、草本植物和香料、茶叶、可可以及红酒和果汁中。大量研究显示，槲皮素具有预防癌变、延缓衰老、保护心血管和神经系统等作用，与其较强的抗氧化功能密不可分。槲皮素通过维持氧化平衡表达其抗氧化活性，主要表现为清除氧自由基、鳌合金属离子、抑制ox‑LDL引起的氧化损伤及提高抗氧化酶活性。槲皮素通过调节信号通路和影响基因表达过程，在细胞和动物模型以及人体中发挥抗氧化作用。

[0003] 尽管现在成功地将精子储存在4℃，但仍然会对精子造成亚致死性损伤，比如脂质过氧化的破坏，活性氧的富集，损害精子的保存质量，进而影响人工繁殖的成功。此外，考虑到精液稀释液中含卵黄添加剂的生物安全问题，进一步研究对于评价配制稀释液的保存能力和以及是否可以添加其他抗氧化剂以最大限度地提高精子在4℃储存期间的存活率至关重要。

[0004] 研究发现，精子在常温和冷冻保存期间，经复苏后其受胎率均有所下降，而低温保存对比常温保存有储存时间较长的优势，对比冷冻保存复苏的精液有活力较高的优点。目前关于牛或猪的精液低温保存研究较多，但在羊方面的较少，并且现有技术中羊精液低温保存仍存在受胎率不高，保存质量相对其他物种较低等问题。

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释剂的应用。本发明所述槲皮素能够提高山羊精液的质量，尤其是精子活力和活率，而且受胎率高。

[0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 本发明提供了槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释液的应用。

[0008] 本发明提供了一种山羊精液低温保存用的稀释液，所述的精液保存用稀释液包括低温保护物质和基础低温稀释液；

[0009] 所述低温保护物质包括槲皮素；所述稀释液中槲皮素的浓度为5～50μM。

[0010] 优选的，所述基础低温稀释液包括营养物质、缓冲物质和抗菌物质。

[0011] 优选的，所述基础低温稀释液中营养物质的浓度为19～23g/L，缓冲物质的浓度为1g～1.12g/L，抗菌物质的浓度为1～1.1g/L。

[0012] 优选的，所述营养物质包括果糖和葡萄糖；所述缓冲物质包括柠檬酸钠和碳酸氢钠；所述抗菌物质包括青霉素和链霉素。

[0013] 本发明提供了上述技术方案所述的稀释液在提高山羊精液活力和/或精子活率中的应用。

[0014] 本发明提供了上述技术方案所述的稀释液或上述技术方案所述的应用，所述低温保存的温度为4℃。

[0015] 本发明提供了一种提高山羊精液活力和/或精子活率的方法，包括以下步骤：将山羊精液与所述稀释液混合后低温保存。

[0016] 优选的，所述山羊精液与稀释液的体积比为1～1.5：7～12。

[0017] 优选的，所述低温保存的温度为4℃。

[0018] 有益效果：本发明提供了槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释剂的应用。本发明具体实施例中差别挑选4组含不同浓度槲皮素的稀释液，在4℃低温保存稀释液稀释好的山羊精液，借助计算机辅助精子分析仪(CASA)，检测精子运动参数以及活力和活率等，实验结果表明：本发明所述槲皮素能够提高山羊精液的质量，尤其是精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率，而且在山羊场配种时发现添加槲皮素的处理组，低温保存精液镜检活动精子数高于对照组，冲胚时获得胚胎经计数也高于对照组，因此，采用槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释剂还具有受胎率高的优势。附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0020] 图1为羊精液低温保存第3天时添加不同浓度的槲皮素时精子T‑AOC含量；

[0021] 图2为羊精液低温保存第3天时添加不同浓度的槲皮素时精子ATP水平；

[0022] 图3为羊精液低温保存第3天时添加不同浓度的槲皮素时精子ROS水平；

[0023] 图4为羊精液低温保存第3天时添加不同浓度的槲皮素时精子MDA水平；

[0024] 图5为羊精液低温保存第3天时添加不同浓度的槲皮素时精子SOD水平。

[0025] 如无特殊要求，本发明所述组分均为本领域技术人员常规购买所得即可。

[0026] 本发明提供了槲皮素作为山羊精液低温保存用的稀释剂的应用。在本发明中，所述低温保存的温度优选为4℃；所述山羊优选包括关中奶山羊、阿尔卑斯羊或湖羊，更优选为关中奶山羊。本发明将槲皮素应用到山羊精液低温保存用的稀释液中能够有效提升精液品质，尤其是精子活力、活率和顶体完整率，并保持较高受胎率。因此，本发明为优化山羊精液低温保存用的稀释液提供了参考依据。

[0027] 本发明提供了一种山羊物精液低温保存用的稀释液，所述稀释液包括低温保护物质和基础低温稀释液；所述低温保护物质包括槲皮素。在本发明中，所述低温保存的温度优选为4℃。本发明所述稀释液中槲皮素的浓度优选为5～50μM，进一步优选为10～45μM，还优选为15～40μM，最优选为25～35μM。本发明在山羊精液低温保存用的稀释液中添加合适浓度的槲皮素，可以有效提高山羊精子保存第3天活率、活力、质膜完整率和顶体完整率，有效提高了精子中ATP含量，总抗氧化能力(T‑AOC)水平，超氧化物歧化酶(SOD)含量，有效降低了精子中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量。在低温中保存3天活力达到71.74±1.17％左右，达到了输精标准。

[0028] 在本发明中，所述基础低温稀释液优选包括营养物质、缓冲物质和抗菌物质。本发明所述基础低温稀释液中营养物质的浓度优选为19～23g/L，更优选为20～22g/L，缓冲物质的浓度优选为1g～1.12g/L，更优选为1.05～1.2g/L，抗菌物质的优选浓度为1～1.1g/L。

[0029] 在本发明中，所述营养物质优选包括果糖和葡萄糖；所述果糖和葡萄糖的质量比优选为10～12：9～11，更优选为10:9；所述缓冲物质优选包括柠檬酸钠和碳酸氢钠；所述柠檬酸钠和碳酸氢钠的质量比优选为0.9～1.1：0.1～0.14，更优选为1：0.12；所述抗菌物质优选包括青霉素和链霉素；所述青霉素和链霉素的质量比优选为1：1，即抗菌物质的用量优选为10万单位/100mL，青霉素和链霉素的用量均优选为5万单位/100mL。本发明以果糖、葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、青霉素和链霉素搭配槲皮素用于山羊精液低温保存的稀释，充分利用果糖和葡萄糖为精子细胞提供能量底物和糖，为精子细胞代谢提供关键底物；同时柠檬酸钠和碳酸氢钠为pH缓冲成分，维持峰值呼吸代谢率，槲皮素作为抗氧化活性成分，也使得青霉素、链霉素等抗生素抑制细菌生长作用有效发挥，综合来保证精子保存质量。

[0030] 基于上述优势，本发明提供了上述技术方案所述的稀释液在提高山羊精液活力和/或精子活率中的应用。在本发明中，所述山羊优选为奶山羊。本发明所述低温保存的温度优选为4℃。

[0031] 本发明提供了一种提高山羊精液活力和/或精子活率的方法，包括以下步骤：将山羊精液与所述稀释液混合后，低温保存。在本发明中，所述山羊优选为奶山羊；所述山羊精液与稀释液的体积比优选为1～1.5：7～12，还优选为1～1.5：7～11；更优选为1:7～9。

[0032] 所述低温保存前，本发明优选将山羊精液和稀释液的混合液平衡3～5min后，进行稀释，更优选为平衡5min后，进行稀释。本发明优选将所述混合液与稀释液按照体积比1:4进行稀释。本发明在每次稀释后需要稀释所得液体轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。采用本发明所述方法保存山羊精液能够有效保证精子活率、活力以及顶体完整率，有效提高了精子中ATP含量，总抗氧化能力(T‑AOC)水平，超氧化物歧化酶(SOD)含量，有效降低了精子中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量。在低温中保存3天活力达到71.74±1.17％左右，达到了输精标准。

[0033] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0034] 准备例1

[0035] 山羊精液低温保存用的稀释液的配置：

[0036] 配置槲皮素溶液

[0037] 购买20mg槲皮素标准品，用DMSO将槲皮素标准品在样品瓶中溶解，再将其转移到无菌的10mL离心管中，再用DMSO稀释为5mL，获得浓度为4g/L的槲皮素溶液，最后用5μm滤器过滤，4℃密封保存。不同浓度的槲皮素溶液的制备方法如下：

[0038] (1)取浓度为4g/L的槲皮素溶液750μL加250μL DMSO，稀释至1mL，得到0.01M的槲皮素溶液，备用；

[0039] (2)取(1)中500μL槲皮素溶液后添加500μL DMSO，稀释至1mL，得到0.005M的槲皮素溶液，备用；

[0040] (3)取(2)中400μL槲皮素溶液后添加600μL DMSO，稀释至1m，得到0.002M的槲皮素溶液，备用；

[0041] (4)取(3)中500μL槲皮素溶液后添加500μL DMSO，稀释至1mL，得到0.001M的槲皮素溶液，备用。

[0042] 配置基础低温稀释液

[0043] 用分析天平准确称取葡萄糖1.2g，果糖1g，柠檬酸钠1g，碳酸氢钠0.12g，小心加入100mL广口瓶中，联合添加青霉素、链霉素各5万单位，超纯水定容到100mL，调节pH为7备用。

[0044] 将配好的基础稀释液分装在4个离心管，每管用移液枪先加入9950μL的基础稀释液，然后离心管中分别添加50μL(1)～(4)制备得到的不同浓度的槲皮素溶液，使其低温稀释液中槲皮素溶液的总体积为0.5％，依次得到槲皮素终浓度为50μM、25μM、10μM和5μM的山羊精液低温保存用的稀释液。

[0045] 注意：山羊精液低温保存用的稀释液应现配现用，精液采集前将青霉素、链霉素添加进稀释液中。

[0046] 奶山羊精液的采集

[0047] 试验所用精液来自于陕西省富平县关中奶山羊原种场，选用的羊为关中奶山羊种羊。采精前先对羊进行处理。母羊用温水擦拭阴道处，公羊用温水擦拭包皮。先允许公羊爬跨训练，等其性欲旺盛时再采用假阴道采精。

[0048] 精液检查

[0049] 选择气味，颜色正常的精液用于试验，在光学显微镜下观察，用移液枪吸取10μL置于载玻片上，37℃下镜检活率，并选择精子活率在0.8以上的精液用于试验。

[0050] 准备例2

[0051] 山羊精液低温保存用的稀释液的配置：

[0052] 准确称取葡萄糖1.2g，果糖1g，柠檬酸钠1g，碳酸氢钠0.12g，青霉素、链霉素各0.05g，无菌水定容到100mL。

[0053] 实施例1‑1

[0054] 山羊的精液稀释

[0055] 本实施例中采用的是准备例1制备得到的槲皮素终浓度为5μM的山羊精液低温保存用的稀释液，下面简称稀释液。

[0056] 将稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为：首先精液与稀释液按照体积比1：1混合稀释，稀释后将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：4的比例稀释，所得液体中精液和稀释液的体积比为1:9；稀释后都将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。

[0057] 实施例1‑2

[0058] 本实施例中采用的是准备例1制备得到的槲皮素终浓度为5μM的山羊精液低温保存用的稀释液，下面简称稀释液。

[0059] 将稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为：首先精液与稀释液按照体积比1：1混合稀释，稀释后将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：3的比例稀释，所得液体中精液和稀释液的体积比为1:7。

[0060] 对比例1

[0061] 山羊的精液稀释

[0062] 将准备例2制备得到的稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为首先按照精液与稀释液按照体积比1：1混合，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：4的比例稀释，每次稀释后都将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。

[0063] 实施例2

[0064] 山羊的精液稀释

[0065] 本实施例中采用的是准备例1制备得到的槲皮素终浓度为10μM的山羊精液低温保存用的稀释液，下面简称稀释液。

[0066] 稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为：首先精液与稀释液按照体积比1：1混合，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：4的比例稀释，每次稀释后都将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。

[0067] 实施例3

[0068] 山羊的精液稀释

[0069] 本实施例中采用的是准备例1制备得到的槲皮素终浓度为25μM的山羊精液低温保存用的稀释液，下面简称稀释液。

[0070] 稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为：首先精液与稀释液按照体积比1：1混合，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：4的比例稀释，每次稀释后都将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。

[0071] 实施例4

[0072] 山羊的精液稀释

[0073] 本实施例中采用的是准备例1制备得到的槲皮素终浓度为50μM的山羊精液低温保存用的稀释液，下面简称稀释液。

[0074] 稀释液添加进准备例1得到的精液中，注意添加时应缓慢旋转离心管贴壁加入，防止精子稀释时受到过大冲击。具体步骤为：首先精液与稀释液按照体积比1：1混合，平衡5min后，得到混合液，再按照混合液与稀释液按照体积比1：4的比例稀释，每次稀释后都将其轻轻摇匀防止精子沉淀影响活率。

[0075] 实施例1‑1～4以及对比例1稀释完成后，室温平衡1.5h，然后将其离心管外面包上18层纱布，放入4℃冰箱，每12小时应轻轻摇动精液防止精子沉淀，每24h检测其活率、活力和顶体完整率，其中精子的活率指的是一个画面中活精子数与总精子数的百分率，精子的活力是指显微镜一个画面中精子呈向前运动的精子占总精子数的百分率。

[0076] 在精液保存的第72h(第3天)，取一部分低温保存的精液复苏，并同时将载玻片在37℃预热，借助计算机辅助精子分析仪(CASA)检测精子的活率，活力以及形态正常率。

[0077] 实施例1‑1～5与对比例1的调查结果见表1。

[0078] 表1第3天精子活力、活率以及顶体完整率的调查结果

[0079]   活率(％) 活力(％) 质膜完整率(％) 顶体完整率(％)b c b b
对比例1 60.76±1.53 58.23±1.35 69.71±0.31 75.29±1.10
b bc b b
实施例1‑1 62.69±1.53 61..21±2.15 70.99±0.37 75.56±0.39
a b b ac
实施例2 73.25±0.63 65.98±0.59 71.46±0.77 78.32±0.37
a a a a
实施例3 72.85±1.06 71.74±1.17 78.18±0.21 80.47±0.68
b c c c
实施例4 62.51±0.22 58.49±2.26 75.72±0.88 76.77±0.91

[0080] 由表1可知，低温保存山羊精液第3天时，对比例1的精子的活率为60.76％±1.53％；活力为58.23％±1.35％；质膜完整率为69.71％±0.31％；顶体完整率75.29％±
1.10％。

[0081] 低温保存山羊精液第3天时，实施例1‑1的精子(5μmol/L)活率与对比例1没有显著差异(p＞0.05)，活力与对比例1没有显著差异(p＞0.05)，质膜完整率与对比例没有显著差异(p＞0.05)，顶体完整率与对比例1没有显著差异(p＞0.05)。虽然实施例1‑1的数据和对比例1相比后没有显著差距，但从数值的角度，实施例1‑1在活力、活率和质膜完整率与对比例1相比均有提高。

[0082] 低温保存山羊精液第3天时，实施例2的精子(10μmol/L)活力与对比例1有显著差异(p＜0.05)，活力与对比例1没有显著差异(p＞0.05)，质膜完整率与对比例1没有显著差异(p＞0.05)，顶体完整率与对比例1没有显著差异(p＞0.05)。

[0083] 低温保存山羊精液第3天时，实施例3的精子(25μmol/L)活率与对比例1有显著差异(p＜0.05)，活力与对比例1有显著差异(p＜0.05)，质膜完整率与对比例1有显著差异(p＜0.05)，顶体完整率与对比例1有显著差异(p＜0.05)。

[0084] 低温保存山羊精液第3天时，实施例4的精子(50μmol/L)活率与对比例1没有显著差异(p＜0.05)，活力与对比例1没有显著差异(p＜0.05)，质膜完整率与对比例1有显著差异(p＜0.05)，顶体完整率与对比例1有显著差异(p＜0.05)。由以上数据我们可以得知，在山羊低温基础稀释液中添加一定浓度的槲皮素对精液保存有显著的积极影响，其中最适添加浓度为25μmol/L。

[0085] 在精液保存的第72h(第3天)，取一部分低温保存的精液复苏，并测定复苏后精子的总抗氧化能力(T‑AOC)、活性氧(ROS)含量、ATP含量、丙二醛含量(MDA)超氧化物歧化酶(SOD)含量，检测方法如下：

[0086] T‑AOC水平检测采用总抗氧化能力(T‑AOC)测定试剂盒(南京建成生物研究所；货号：A015‑1比色法)酶标仪测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测采用总超氧化物歧化酶(T‑SOD)测定试剂盒(南京建成生物研究所；货号：A001‑1羟胺法)酶标仪测定；丙二醛含量的测定采用丙二醛(MDA)测试盒说明书(南京建成生物研究所；货号:A003‑1 TBA法)酶标仪测定；精液中ATP含量测定采用ATP含量检测试剂盒(Solarbio；紫外分光光度法；货号：BC0300)酶标仪测定；精液中活性氧(ROS)含量的测定采用活性氧(ROS)测定试剂盒(南京建成生物研究所；货号:E004‑1‑1化学荧光法100T‑500T)多功能酶标仪测定。检测结果见图1～图5。

[0087] 根据图1可知，羊精液低温保存第3天时添加25μM槲皮素能显著提高精子T‑AOC水平(p＜0.05)。根据图2可知，羊精液低温保存第3天时添加25μM槲皮素能显著提高精子ATP含量(p＜0.05)。根据图3可知，羊精液低温保存第3天时添加10μM槲皮素能显著降低精子ROS水平(p＜0.05)。根据图4可知，羊精液低温保存第3天时添加25μM槲皮素能显著降低精子MDA水平(p＜0.05)。根据图5可知，羊精液低温保存第3天时添加25μM槲皮素能显著提高精子SOD水平(p＜0.05)。

[0088] 综上可知，在山羊精液低温保存稀释液中添加合适浓度的槲皮素(25μM),可以有效提高山羊精子活率，活力，质膜完整率，顶体完整率，有效提高了精子中ATP含量，总抗氧化能力(T‑AOC)水平，超氧化物歧化酶(SOD)含量，有效降低了精子中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量。

[0089] 综上所述可知，本发明所述槲皮素能够提高山羊精液的质量，尤其是精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率，而且受胎率高。

[0090] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。