[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗砷相关蛋白质及其相关的生物材料与应用。

[0002] 砷是一种自然界中广泛存在的重金属元素，因其强毒性为人所熟知。人类长期食用含砷的食物可引起其在人体中富集，进而引发多种健康问题。目前土壤砷污染状况严重，亟需研发土壤砷污染修复的生物技术。植物修复技术是应用于土壤重金属污染的一种环保有效的手段，近年来逐渐成为研究的热点。

[0003] 蜈蚣草作为砷的超富集植物，能迅速地将砷富集到地上部分，从而降低土壤砷含量，是一种良好的植物修复材料。但由于其生长缓慢，环境适应性差等原因，在工程应用上有一定的局限性。但作为砷超富集的模式植物，对其超富集砷的分子机制的阐明可为植物修复新型工程植株的培育提供分子元件，为植物修复技术的实施提供理论依据，是砷污染植物修复技术大范围应用和长远发展的基础保证。

[0004] 然而目前对蜈蚣草超富集砷的分子机制的研究还存在许多不足。砷超富集的四个环节中，只有砷的吸收、还原和区隔化这三个环节中的少数功能基因被鉴定得到，距离解析蜈蚣草砷代谢通路相差甚远。砷的运输环节还未有功能基因被鉴定得到，挖掘蜈蚣草砷运输环节的关键基因对填补目前研究的空白，更全面地阐述蜈蚣草超富集砷的分子机制具有重要意义。

[0005] 细胞水平砷的外排过程与蜈蚣草砷的强转运能力密切相关：在砷的短距离转运过程中，细胞水平砷的外排是砷在细胞间进行转运的基础；而在根的长距离运输中，砷在木质部的装载过程也依赖于周围薄壁细胞砷的外排作用。而目前在蜈蚣草砷外排方面还未有功能基因被挖掘到。因此，充分挖掘砷外排相关基因，并对其进行功能表征，对蜈蚣草超富集砷的分子机制尤其是砷运输环节机制的解析至关重要。

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何调控生物的抗砷性。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗砷蛋白质，名称为PvAsE1，来源于蜈蚣草，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

[0008] A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

[0009] A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗砷性相关的蛋白质；

[0010] A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

[0011] 上述蛋白质中，序列表中的序列1由578个氨基酸残基组成。

[0012] 上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0013] 上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein‑tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

[0014] 上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

[0015] 上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

[0016] 上述蛋白质中，所述PvAsE1可来源于蜈蚣草。

[0017] 与PvAsE1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

[0018] 本发明所提供的与PvAsE1相关的生物材料，为下述B1)‑B9)中的任一种：

[0019] B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

[0020] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

[0021] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

[0022] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

[0023] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0024] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

[0025] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

[0026] B8)降低或抑制上文所述所述蛋白质表达的核酸分子；

[0027] B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

[0028] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0029] 上述材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)所示的基因：

[0030] 1)编码序列(ORF)是序列表中序列2第1‑1737位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

[0031] 2)核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。

[0032] 上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列2的第1‑1737位核苷酸所示的DNA分子中任意片段反向互补的DNA分子，如与序列表中序列2的第215‑418为核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。

[0033] 其中，序列表中的序列2由1737个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列2，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。

[0034] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码PvAsE1的核酸分子的表达盒(PvAsE1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PvAsE1的DNA，该DNA不但可包括启动PvAsE1基因转录的启动子，还可包括终止PvAsE1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979‑992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑‑7‑硫代羟酸S‑甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利
5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利
2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047‑3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：
985
Odell等人(I )Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；
Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,
15:9627)。

[0035] 可用现有的植物表达载体构建含有所述PvAsE1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391‑Xa或pCAMBIA1391‑Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖‑6‑磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0036] 上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

[0037] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了生物抗砷剂和/或植物生物修复材料。

[0038] 本发明所提供的生物抗砷剂和/或生物修复材料含有所述蛋白质或/和所述蛋白质相关的生物材料。

[0039] 上述生物抗砷剂和/或生物修复材料的活性成分可为所述蛋白质或所述蛋白质相关的生物材料，上述生物抗砷剂和/或生物修复材料的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗砷效果确定。

[0040] 上述蛋白质、或上述生物材料的下述P1‑P5中的任一种应用也属于本发明的保护范围：

[0041] P1、所述蛋白质或所述生物材料在调控生物抗砷性中的应用；

[0042] P2、所述蛋白质或所述生物材料在制备提高生物抗砷性产品中的应用；

[0043] P3、所述蛋白质或所述生物材料在培育抗砷生物中的应用；

[0044] P4、所述蛋白质或所述生物材料在制备生物抗砷产品中的应用；

[0045] P5、所述蛋白质或所述生物材料在生物育种中的应用。

[0046] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了调控基因表达的物质的下述P1‑P5中的应用：

[0047] P1、调控基因表达的物质在调控生物抗砷性中的应用，

[0048] P2、调控基因表达的物质在制备提高生物抗砷性产品中的应用，

[0049] P3、调控基因表达的物质在培育抗砷生物中的应用，

[0050] P4、调控基因表达的物质在制备生物抗砷产品中的应用，

[0051] P5、调控基因表达的物质在生物育种中的应用；

[0052] 上述P1‑P5中，所属基因编码上文中所述的蛋白质。

[0053] 上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

[0054] 上述应用中，所述调控基因表达可为提高所述基因的表达也可为抑制或降低所述基因表达。

[0055] 上述应用中，所述调控基因表达的物质可为提高所述基因表达的试剂。提高所述基因表达的试剂可含有所述生物材料。

[0056] 上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为沉默所述基因的试剂或敲除所述基因的试剂。沉默所述基因的试剂可含有如下式I所示的DNA片段：

[0057] SEQ正向‑X‑SEQ反向

[0058] 式I。

[0059] 式I中，所述SEQ正向可为编码链的核苷酸序列是序列表中的序列2的第215‑418位核苷酸的双链DNA，SEQ反向的序列与SEQ正向的序列反向互补，X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。所述X可为pKANNIBAL的XhoI和BamHⅠ识别位点间的片段(小片段)。

[0060] 敲除所述基因的试剂可为通过同源重组敲除所述基因的试剂，通过CRISPR‑Cas9敲除所述基因的试剂。

[0061] 所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

[0062] 所述调控生物抗砷性可为提高或降低植物对砷的抗性。

[0063] 上述生物抗砷剂和/或生物修复材料、上文中所述的应用中，所述生物为微生物或植物。

[0064] 上文中，所述微生物为下述任一种：

[0065] M1)真菌，

[0066] M2)子囊菌，

[0067] M3)半子囊菌纲真菌，

[0068] M4)内孢霉目真菌，

[0069] M5)酵母科真菌，

[0070] M6)酿酒酵母；

[0071] 所述植物为下述任一种：

[0072] C1)蕨类植物门植物，

[0073] C2)蕨纲植物，

[0074] C3)真蕨目植物，

[0075] C4)凤尾蕨科植物，

[0076] C5)凤尾蕨属植物，

[0077] C6)蜈蚣草；

[0078] C7)种子植物门植物，

[0079] C8)裸子植物亚门植物，

[0080] C9)被子植物亚门植物，

[0081] C10)双子叶植物，

[0082] C11)单子叶植物。

[0083] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗砷生物的方法。

[0084] 本发明所提供的培育抗砷植物的方法，包括提高目的植物中上文所述蛋白质的核酸在目的生物中的表达量，得到抗砷生物；所述抗砷生物的抗砷性高于所述目的生物的抗砷性。

[0085] 上述方法中，所述提高编码所述蛋白质的核酸在目的生物中的表达量是通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的生物实现的。

[0086] 上述方法中，其中所述蛋白质的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的生物中，以达到更好的表达效果：

[0087] 1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在生物中已知的有效的序列进行修饰；

[0088] 2)与各种生物表达的启动子连接，以利于其在生物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0089] 3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

[0090] 4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

[0091] 所述蛋白质的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411‑463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

[0092] 上述方法中，所述抗砷生物可为转基因生物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的生物。

[0093] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗砷性降低的转基因植物的方法。

[0094] 本发明所提供的培育抗砷性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达，得到抗砷性低于所述目的植物的转基因植物。

[0095] 上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达可通过将上述式I所示的DNA片段导入所述目的生物实现的。

[0096] 上述方法中，所述转基因生物理解为不仅包含第一代到第二代转基因生物，也包括其子代。对于转基因生物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因生物包括植物种子、植物愈伤组织、完整植物植株、微生物菌株和细胞。

[0097] 上文中，所述生物为微生物或植物。

[0098] 上文中，所述微生物可为上述M1)‑M6)中的任一种，所述植物和所述目的植物可为下述C1)‑C11)中的任一种：

[0099] C1)蕨类植物门植物，

[0100] C2)蕨纲植物，

[0101] C3)真蕨目植物，

[0102] C4)凤尾蕨科植物，

[0103] C5)凤尾蕨属植物，

[0104] C6)蜈蚣草；

[0105] C7)种子植物门植物，

[0106] C8)裸子植物亚门植物，

[0107] C9)被子植物亚门植物，

[0108] C10)双子叶植物，

[0109] C11)单子叶植物。

[0110] 上文中，所述砷可为AsⅢ(As3+)或AsⅤ(As5+)。

[0111] 转基因酵母实验证明，PvAsE1基因提高了酿酒酵母对砷的抗性，PvAsE1基因及其编码蛋白与砷抗性相关，可用于调控生物对砷的抗性。转基因植物实验证明，PvAsE1蛋白在蜈蚣草中起到外排砷的作用，可用于植物抗砷性研究和应用。附图说明

[0112] 图1为Δacr3‑PvAsE1对砷酸盐和亚砷酸盐的抗性分析。(A)Δacr3‑vec、Δacr3‑PvAsE1分别在0、100、200μM AsⅤ和AsⅢ处理下的平板表型；“No As”表示无砷固体培养基，“100μM AsⅤ”表示100μM AsⅤ固体培养基，“200μM AsⅤ”表示200μM AsⅤ固体培养基，“100μM AsⅢ”表示100μM AsⅢ固体培养基，“200μM AsⅤ”表示200μM AsⅤ固体培养基。(B)Δacr3‑vec(vector)、Δacr3‑PvAsE1(PvAsE1)分别在100、200μM AsⅢ处理下的砷含量测定结果。(C)Δacr3‑vec(vector)、Δacr3‑PvAsE1(PvAsE1)分别在100、200μM AsⅤ处理下的砷含量测定结果。星号(****)表明Δacr3‑PvAsE1与Δacr3‑vec之间差异极显著，P<0.01。

[0113] 图2为Δacr3‑PvAsE1在砷酸盐和亚砷酸盐处理下的生长曲线测定。(A)Δacr3‑vec、Δacr3‑PvAsE1分别在0、100、200μM AsⅤ处理下的生长曲线。(B)Δacr3‑vec、Δacr3‑PvAsE1分别在0、100、200μM AsⅢ处理下的生长曲线。

[0114] 图3为RNAi载体构建。(A)pKANNIBAL载体表达框结构与多克隆位点中选取的酶切位点。(B)pKANNIBAL‑hpPvAsE1载体的构建。(C)发卡RNA结构。

[0115] 图4为RNAi配子体筛选与鉴定。(A)qRT‑PCR测定野生型配子体(Control)和RNAi配子体(rnai‑pvase1)中PvAsE1基因的相对表达水平。(B)基因枪转化配子体荧光观察。Control为野生型配子体，rnai‑pvase1为RNAi配子体。标尺＝100μm。星号(****)代表差异极显著，P<0.01。

[0116] 图5为PvAsE1基因沉默对蜈蚣草配子体砷抗性的影响。PvAsE1沉默配子体(rnai‑pvase1：转化DsRed+hpPvAsE1)在无砷(No As)或含0.5mM AsⅢ(ASⅢ0.5mM)固体培养基中培养10d(10Days)和25d(25Days)后的表型，只转化DsRed载体的配子体作为对照(Control)。标尺＝100μm(10Days),1mm(25Days)。

[0117] 图6为蜈蚣草配子体面积统计结果。PvAsE1沉默配子体(rnai‑pvase1)在无砷(No As)或含0.5mM AsⅢ(AsⅢ0.5mM)固体培养基中培养10d后的平均面积(n＝30)。只转化DsRed载体的配子体作为对照(Control)。星号(****)代表差异极显著，P<0.01。

[0118] 图7为RNAi配子体砷微区分布。由黑色过渡到红色代表砷含量由低到高。标尺＝1mm。“Control”代表只转化DsRed载体的配子体对照，“rnai‑pvase1”代表转化DsRed+hpPvAsE1的PvAsE1沉默配子体。

[0119] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0120] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。试验所得数据用Excel软件处理,并用SPSS17.0软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析和多重比较。

[0121] 实施例1、PvAsE1基因的获得与抗砷性鉴定

[0122] 1、PvAsE1基因的克隆

[0123] 将蜈蚣草孢子撒在土壤(营养土:蛭石＝1:1)中萌发，盖上保鲜膜保持湿润。待长出配子体后移栽到穴盘中继续培养。培养条件为16h光照/8h黑暗，25±1℃。待孢子体长到约6‑8cm提取总RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。F1：5’‑GCTCTAGAATGGAGCTAGCATCCACCA‑3’；R1：5’‑CCGCTCGAGTTAACCTCTTATTAGTGGAAGACCG‑3’。测序结果表明该PCR扩增产物含有PvAsE1基因，PvAsE1基因是编码链的核苷酸是序列表中序列2的双链DNA分子。PvAsE1基因编码序列表中序列1所示的蛋白质PvAsE1。

[0124] 用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切质粒pAG413GAL‑ccdB(#14141，Addgene)，回收骨架载体。

[0125] 将该PCR扩增产物和该骨架载体进行连接，得到重组质粒pAG413‑PvAsE1。测序结果表明pAG413‑PvAsE1是将pAG413的XbaI和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中序列2的双链DNA分子(PvAsE1基因)，并保持pAG413的其它核苷酸不变得到的重组载体。

[0126] 2.转PvAsE1基因重组酿酒酵母的获得

[0127] 酵母转化参照酵母转化试剂盒(酷来搏生物科技有限公司)说明书进行操作。

[0128] 2.1酵母感受态细胞的制备：

[0129] (1)将‑80℃保存的酿酒酵母菌株砷外排基因(ScACR3基因)的突变体Δacr3(YPR201W，horizon，https://horizondiscovery.com/en/Gene‑Landing‑Page？nodeid＝yeast‑ypr201w以下简称酵母突变体)在YPD固体培养基上划线活化，30℃培养箱倒置培养2‑3天。

[0130] (2)挑取单菌落接种于3ml YPD液体培养基中，30℃下200rpm过夜培养。

[0131] (3)第二天将活化起来的酵母转移到含30ml YPD液体培养基的三角瓶中继续培养到OD600nm到0.4‑0.5范围内。

[0132] (4)1000g，离心5min收集细胞，去除上清。

[0133] (5)将收集的细胞用30ml无菌的去离子水重悬，1000g，离心5min并去上清。

[0134] (6)沉淀用1ml 1/10浓度的醋酸锂悬浮，得到酵母细胞悬浮液。

[0135] (7)将酵母细胞悬浮液分装到1.5ml离心管中，每管100μl。1000g离心5min去除上清，得到酵母感受态细胞。

[0136] 2.2转PvAsE1基因的重组酿酒酵母Δacr3‑PvAsE1的制备

[0137] (1)按以下顺序加入试剂，配制预混液

[0138]

[0139] (2)将预混液加入到酵母感受态细胞中，用枪头吹打混匀，使酵母细胞完全散开。

[0140] (3)30℃金属浴孵育30min，每10min混匀一次。

[0141] (4)45℃金属浴热激30min，每10min混匀一次。

[0142] (5)以12000rpm离心1min，去除上清。

[0143] (6)沉淀用100μl无菌的去离子水悬浮。

[0144] (7)将菌液用涂布棒涂到组氨酸营养缺陷型平板(SD‑His)上，30℃培养箱倒置培养2‑3d，得到转入pAG413‑PvAsE1的重组酿酒酵母，简称Δacr3‑PvAsE1。Δacr3‑PvAsE1为转PvAsE1基因的重组酿酒酵母。

[0145] 2.3转空载体酿酒酵母的制备

[0146] 将2.2中的pAG413‑PvAsE1替换为pAG413GAL‑ccdB，得到转入pAG413空载体的重组酿酒酵母，简称Δacr3‑vec。Δacr3‑vec为转空载体酿酒酵母。

[0147] 3.转PvAsE1基因重组酿酒酵母抗砷性分析

[0148] 3.1重组酵母平板砷抗性分析

[0149] 将转PvAsE1基因的重组酿酒酵母Δacr3‑PvAsE1进行酵母平板砷抗性分析，转空载体酿酒酵母作为对照，进行平行实验。

[0150] 分别将Δacr3‑PvAsE1和Δacr3‑vec以1：100的比例接种于无砷液体培养基中，30℃，220rpm摇床过夜培养，得到活化好的酵母液。将活化好的酵母液进行OD600nm值的测定，并用无菌水将酵母OD600nm逐级稀释为1、0.1、0.01、0.001(以无砷液体培养基作为空白对照)，得到4种酵母含量梯度的Δacr3‑PvAsE1悬浮液和Δacr3‑vec悬浮液。将4种酵母含量梯度的Δacr3‑PvAsE1悬浮液和Δacr3‑vec悬浮液各取2μl依次点在无砷固体培养基平板上、100μM AsⅤ固体培养基平板上、200μM AsⅤ固体培养基平板上、100μM AsⅢ固体培养基平板上和200μM AsⅢ固体培养基平板上，转空载体酿酒酵母Δacr3‑vec作为对照。点好的平板在30℃培养箱中倒置培养2‑3d后进行表型观察。每种处理设3张平板。

[0151] 其中，无砷液体培养基是在酵母菌SD‑His培养基(PM2030和PM2120，酷来搏生物科技有限公司)中加入半乳糖至半乳糖含量为2％(质量百分含量)得到的液体培养基；无砷固体培养基是在酵母菌SD‑His培养基(PM2030和PM2120，酷来搏生物科技有限公司)中加入半乳糖至半乳糖含量为2％(质量百分含量)，加入琼脂1％(质量百分含量)得到的固体培养基；100μM AsⅤ固体培养基、200μM AsⅤ固体培养基、100μM AsⅢ固体培养基和200μM AsⅢ固体培养基分别是在上述酵母菌SD‑His培养基中加入半乳糖至半乳糖含量为2％(质量百5+ 3+
分含量)，加入琼脂1％(质量百分含量)，分别加入砷酸钠AsⅤ(As )和亚砷酸钠AsⅢ(As )至两者含量分别为100μM和200μM得到的四种固体培养基。

[0152] 实验结果表明在含半乳糖的SD诱导培养基上，Δacr3‑PvAsE1酵母可受半乳糖的诱导表达。结果如图1中A所示，在无砷固体培养基平板上两种酵母生长情况一致；在100和5+
200μM AsⅤ(As )处理的平板(100μM AsⅤ固体培养基、200μM AsⅤ固体培养基)上、100和
3+
200μM AsⅢ(As )处理的平板(100μM AsⅢ固体培养基、200μM AsⅢ固体培养基)上，对照Δacr3‑vec(图1中A的Δacr3‑vector)酵母生长受到明显抑制，Δacr3‑PvAsE1酵母对AsⅤ和AsⅢ的抗性与对照相比明显增强。其中，OD600nm为0.001的对照Δacr3‑vector悬浮液在100μM AsⅤ和AsⅢ固体培养基上完全不能生长；OD600nm为0.01和0.001的对照Δacr3‑vector悬浮液在200μM AsⅤ和AsⅢ固体培养基上完全不能生长；而OD600nm为0.01的Δacr3‑PvAsE1悬浮液和OD600nm为0.001的Δacr3‑PvAsE1悬浮液在100μM AsⅤ和AsⅢ固体培养基上和200μM AsⅤ和AsⅢ固体培养基上均能生长，说明PvAsE1基因提高了酿酒酵母对砷的抗性，PvAsE1基因及其编码蛋白与砷抗性相关，可用于调控生物对砷的抗性。

[0153] 3.2重组酵母生长曲线测定

[0154] 将转PvAsE1基因的重组酿酒酵母Δacr3‑PvAsE1进行酵母生长曲线测定，转空载体酿酒酵母Δacr3‑vec作为对照，进行平行实验。

[0155] 分别将Δacr3‑PvAsE1和Δacr3‑vec以1：100的比例接种于无砷液体培养基中，30℃，220rpm摇床过夜培养，得到活化好的酵母液。在50ml锥形瓶中加入20ml无砷液体培养基，加入合适体积的活化后的酵母在锥形瓶中进行OD600nm值的测定，并用无菌水将酵母OD600nm调整为0.1(3.1中的无砷液体培养基作为空白对照)，得到Δacr3‑PvAsE1悬浮液和Δacr3‑vec悬浮液。然后分别用100和200μM AsⅤ和100和200μM AsⅢ进行处理，并设置无砷处理的相应酵母生长作为对照。在6h、12h、18h和24h分别取菌液测定其OD600nm值，记录酵母在砷酸盐AsⅤ和亚砷酸盐AsⅢ处理条件下的生长曲线(图2所示)。

[0156] 不同浓度的砷酸盐AsⅤ(砷酸钠)和亚砷酸盐AsⅢ(亚砷酸钠)处理溶液的配置方法如下：

[0157] 3.2.1Δacr3‑PvAsE1无砷处理(图2中记为“PvAsE1‑0μM AsⅢ”或“PvAsE1‑0μM AsⅤ”)

[0158] 在50ml锥形瓶中加入20ml 3.1中的无砷液体培养基，加入Δacr3‑PvAsE1使锥形瓶中酵母悬浮液的OD600nm值为0.1(以无砷液体培养基为空白对照)。在摇床中30℃继续培养，每隔6h取1ml酵母培养液稀释3倍进行OD600nm测定，测定到24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0159] 3.2.2Δacr3‑vec无砷处理(图2中记为“vector‑0μM AsⅢ”或“vector‑0μM AsⅤ”)

[0160] 除了将3.2.1中的酵母由Δacr3‑PvAsE1替换为Δacr3‑vec外，其它均相同。

[0161] 3.2.3Δacr3‑PvAsE1+100μM AsⅤ处理(图2中记为“PvAsE1‑100μM AsⅤ”)[0162] 在50ml锥形瓶中加入20ml 100μM AsⅤ液体培养基，加入Δacr3‑PvAsE1使锥形瓶中酵母悬浮液的OD600nm值为0.1(以100μM AsⅤ液体培养基为空白对照)。在摇床中30℃继续培养，每隔6h取1ml酵母培养液稀释3倍进行OD600nm测定，测定到24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0163] 3.2.4Δacr3‑PvAsE1+200μM AsⅤ处理(图2中记为“PvAsE1‑200μM AsⅤ”)[0164] 在50ml锥形瓶中加入20ml 200μM AsⅤ液体培养基，加入Δacr3‑PvAsE1使锥形瓶中酵母悬浮液的OD600nm值为0.1(以200μM AsⅤ液体培养基为空白对照)。在摇床中30℃继续培养，每隔6h取1ml酵母培养液稀释3倍进行OD600nm测定，测定到24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0165] 3.2.5Δacr3‑vec+100μM AsⅤ处理(图2中记为“vector‑100μM AsⅤ”)[0166] 除了将3.2.3中的酵母由Δacr3‑PvAsE1替换为Δacr3‑vec外，其它均相同。

[0167] 3.2.6Δacr3‑vec+200μM AsⅤ处理(图2中记为“vector‑200μM AsⅤ”)[0168] 除了将3.2.4中的酵母由Δacr3‑PvAsE1替换为Δacr3‑vec外，其它均相同。

[0169] 3.2.7Δacr3‑PvAsE1+100μM AsⅢ处理(图2中记为“PvAsE1‑100μM AsⅢ”)[0170] 在50ml锥形瓶中加入20ml 100μM AsⅢ液体培养基，加入Δacr3‑PvAsE1使锥形瓶中酵母悬浮液的OD600nm值为0.1(以100μM AsⅢ液体培养基为空白对照)。在摇床中30℃继续培养，每隔6h取1ml酵母培养液稀释3倍进行OD600nm测定，测定到24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0171] 3.2.8Δacr3‑PvAsE1+200μM AsⅢ处理(图2中记为“PvAsE1‑200μM AsⅢ”)[0172] 在50ml锥形瓶中加入20ml 200μM AsⅢ液体培养基，加入Δacr3‑PvAsE1使锥形瓶中酵母悬浮液的OD600nm值为0.1(以200μM AsⅢ液体培养基为空白对照)。在摇床中30℃继续培养，每隔6h取1ml酵母培养液稀释3倍进行OD600nm测定，测定到24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0173] 3.2.9Δacr3‑vec+100μM AsⅢ处理(图2中记为“vector‑100μM AsⅢ”)[0174] 除了将3.2.7中的酵母由Δacr3‑PvAsE1替换为Δacr3‑vec外，其它均相同。

[0175] 3.2.10Δacr3‑vec+200μM AsⅢ处理(图2中记为“vector‑200μM AsⅢ”)[0176] 除了将3.2.8中的酵母由Δacr3‑PvAsE1替换为Δacr3‑vec外，其它均相同。

[0177] 其中，100μM AsⅤ液体培养基和200μM AsⅤ液体培养基是在上述酵母菌SD‑His培5+
养基中加入半乳糖至半乳糖含量为2％(质量百分含量)，加入砷酸钠至AsⅤ(As )含量分别为100μM和200μM得到的2种AsⅤ含量不同的液体培养基；100μM AsⅢ液体培养基和200μM AsⅢ液体培养基是在上述酵母菌SD‑His培养基中加入半乳糖至半乳糖含量为2％(质量百
3+
分含量)，加入亚砷酸钠至AsⅢ(As )含量分别为100μM和200μM得到的2种AsⅢ含量不同的液体培养基。

[0178] 结果显示Δacr3‑PvAsE1酵母(图2中PvAsE1)与对照Δacr3‑vec酵母(图2中vector)相比，在无砷处理条件下(图2中0μM AsⅢ和0μM AsⅤ)，PvAsE1和对照vector的生长曲线OD值无显著差异；在100和200μM亚砷酸盐AsⅢ处理条件下(图2中A)和100和200μM砷酸盐AsⅤ处理条件下(图2中B)，对照vector生长明显减弱，处理浓度越高减弱越明显，而重组酵母PvAsE1生长曲线OD值均高于对照vector，这表明Δacr3‑PvAsE1酵母在砷处理条件下生长受砷影响较小，转PvAsE1基因增强了Δacr3突变酵母对砷的抗性。

[0179] 3.3重组酵母砷含量测定

[0180] 将转PvAsE1基因的重组酿酒酵母Δacr3‑PvAsE1进行酵母砷含量测定，转空载体酿酒酵母Δacr3‑vec作为对照，进行平行实验。

[0181] 分别将Δacr3‑PvAsE1和Δacr3‑vec以1：100的比例接种于无砷液体培养基中，30℃，220rpm摇床过夜培养，得到活化好的酵母液。分别将过夜活化好的酵母Δacr3‑PvAsE1和Δacr3‑vec以1：100的比例接种于无砷液体培养基中，30℃，220rpm摇床过夜培养，得到活化好的酵母液。在300ml锥形瓶中加入90ml无砷液体培养基，然后加入合适体积的活化后的酵母进行OD600nm值测定，并用无菌水将酵母OD600nm调整为0.1(以3.1中的无砷液体培养基作为空白对照)，得到Δacr3‑PvAsE1或Δacr3‑vec酵母液。37℃，200rpm培养至OD600nm值为1后分别加入下面配制的(亚砷酸钠)AsⅢ或(砷酸钠)AsⅤ砷溶液进行砷处理平行实验：

[0182] 不同浓度的砷酸盐AsⅤ(砷酸钠)和亚砷酸盐AsⅢ(亚砷酸钠)处理溶液的处理方法如下：

[0183] 3.3.1 100μM AsⅤ处理

[0184] 加入砷酸钠至AsⅤ(As5+)含量为100μM，30℃继续培养24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0185] 3.3.2 200μM AsⅤ处理

[0186] 加入砷酸钠至AsⅤ(As5+)含量为200μM，30℃继续培养24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0187] 3.3.3 100μM AsⅢ处理

[0188] 加入亚砷酸钠至AsⅢ(As3+)含量为100μM，30℃继续培养24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0189] 3.3.4 200μM AsⅢ处理

[0190] 加入亚砷酸钠至AsⅢ(As3+)含量为200μM，30℃继续培养24h。实验重复3次，每次重复3瓶。

[0191] 将经过3.3.1‑3.3.4处理的90ml酵母培养液分3份离心收菌，再用去离子水清洗3遍后80℃烘干。烘干的酵母进行称重，并加1ml浓硝酸(优级纯)冷消化过夜。200℃消煮炉中消煮6h，冷却后将消解液定容至15ml，用滤纸过滤到10ml离心管中。总砷含量用电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP6300，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行测定。

[0192] 砷含量测定结果如图1中B和C显示。其中，在100、200μM亚砷酸盐AsⅢ处理的条件下，与对照酵母Δacr3‑vec(图1中B的vector)相比，Δacr3‑PvAsE1酵母(图1中B的PvAsE1)砷含量均极显著降低(P<0.01)，降低率在94.81％‑96.76％之间(图1中B所示)。砷酸盐AsⅤ处理酵母的砷含量测定结果与与亚砷酸盐AsⅢ处理一致。在100、200μM AsⅤ处理的条件下，与对照酵母Δacr3‑vec(图1中C的vector)相比，Δacr3‑PvAsE1酵母(图1中C的PvAsE1)砷含量极显著地降低(P<0.01)，降低率在81.80％‑89.17％之间，降低效率极高(图1中C所示)。

[0193] 砷酸盐被酵母吸收后还原为亚砷酸盐，以亚砷酸盐的形式被排出，从而达到砷解毒的目的。重组酵母的抗砷实验分析结果表明Δacr3‑PvAsE1重组酵母极显著地增强了酵母对砷的抗性，且极为有效地降低了酵母细胞内的砷积累量。砷含量的降低可能是由于砷外排的增加导致的。因此，Δacr3‑PvAsE1互补ScAcr3的功能，在酵母中可能起到砷外排的作用。

[0194] 实施例2、PvAsE1在蜈蚣草中的功能验证

[0195] 为了验证PvAsE1在蜈蚣草中是否同样具有砷外排的作用，本研究利用RNA干扰(RNAi)技术在蜈蚣草配子体中对PvAsE1基因进行沉默。本研究通过向细胞内导入发卡RNA来表达双链RNA，以沉默目的基因的表达。所用RNAi载体为pKANNIBAL(VECT0430,北京华越洋生物)，如图3中A所示，该载体具有一个35S启动子‑多克隆位点‑PDK内含子‑多克隆位点‑ocs终止子的表达框结构。在2个MCS中选取了2对酶切位点，分别为XhoⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ、BamHⅠ，利用双酶切法，通过2次酶切、连接、转化将PvAsE1基因目的插入片段分别以正向(PvAsE1‑S)和反向(PvAsE1‑A)构建到载体上，插入在内含子两端(图3中B)，最终形成如图3中C所示的发卡hpRNA。这种形成发卡结构的构建已被证明是蕨类配子体中内源基因沉默的有效手段(Rutherford et al.,2004)。

[0196] 用基因枪转化法将pKANNIBAL‑hpPvAsE1载体(发卡hpRNA)和带有红色荧光报告基因的pSAT6‑DsRed瞬时表达载体共同转化到蜈蚣草配子体中，只转化pSAT6‑DsRed的配子体作为对照。已有研究证明通过基因枪法导致的1个细胞内反义基因的表达可在几乎所有的配子体细胞中传播(Indriolo et al，2010；Rutherford et al.,2004)。具体方法如下：

[0197] 1RNAi重组表达载体构建

[0198] RNAi载体选用pKANNIBAL载体(VECT0430,北京华越洋生物)(Kan抗性)，采用双酶切法进行正反向序列的构建(图3)。正向序列构建过程如下：

[0199] (1)PvAsE1目的插入片段扩增

[0200] 选取的形成发卡结构的连接片段为序列表中的序列2的第215‑418位核苷酸的双链DNA。

[0201] 引物设计如下：

[0202]

[0203] 插入片段扩增利用KOD FX高保真酶(东洋纺(TOYOBO)生物科技有限公司)。

[0204] 反应体系如下：

[0205]

[0206] PCR扩增程序如下：

[0207]

[0208] 扩增完成后将PCR产物跑胶，并将正确条带进行胶回收。

[0209] (2)pKANNIBAL载体及PvAsE1插入片段双酶切

[0210] 在载体的MCS1选择两个合适的酶切位点进行双酶切(图3中A)。将第(1)步回收的目的片段用同样的酶进行双酶切。XhoI和EcoRI限制性内切酶来自于NEB(New England Biolabs)，反应体系如下：

[0211]

[0212] 37℃酶切15min，加入loading Buffer停止反应。0.8％琼脂糖凝胶跑胶10‑15min，并将正确的目的条带回收。

[0213] (3)连接

[0214] 采用T4连接酶(NEB)对载体和目的片段进行连接。反应体系如下：

[0215]

[0216] 载体:插入DNA片段摩尔比＝1:3。16℃过夜或室温放置10min后再65℃处理10min。冰上骤冷。

[0217] (4)反向序列构建

[0218] 反向序列构建在正向序列构建完的基础上进行，插入片段为正向插入片段的反向互补序列，步骤和试剂来源同正向构建。酶切位点在MCS2选取(图3中A)，反向插入片段的扩增引物设计如下：

[0219]

[0220] (5)重组产物转化和扩繁

[0221] ①将大肠杆菌F‑TOP10感受态细胞(01GC12,北京华越洋生物)从‑80℃冰箱拿出，冰上融化5min，加入10μl连接产物，冰上静置5min。

[0222] ②42℃热激45sec，冰上静止2min。

[0223] ③加入700μl不含抗生素的LB溶液，37℃，200rpm复苏10min。

[0224] ④12000rpm离心1min收菌，用100μl LB溶液重悬后涂板于含30μg/mL硫酸卡那霉素(Kan)的固体LB培养基平板上，37℃倒置培养过夜。

[0225] 挑取上述含有Kan的LB平板上长出的阳性单克隆菌落，加入100ml的含30μg/mL Kan的LB的液体培养基中摇菌并送样进行测序(华大基因)。

[0226] 测序结果表明，得到SEQ正向‑X‑SEQ反向(PvAsE1)的重组表达载体，该重组表达载体的名称为pKANNIBAL‑hpPvAsE1。SEQ正向‑X‑SEQ反向是含有用于沉默PvAsE1基因的双链DNA分子，由SEQ正向、X和SEQ反向连接合成，SEQ正向是编码链的核苷酸序列是序列表中的序列2的第215‑418位核苷酸的单链DNA，SEQ反向的序列是与SEQ正向的序列反向互补的单链DNA；X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，是pKANNIBAL的XhoI和BamHⅠ识别位点间的片段(小片段)，含有PDK内含子。

[0227] pKANNIBAL‑hpPvAsE1是将pKANNIBAL的XhoI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为编码链的核苷酸序列是序列表中的序列2的第215‑418位核苷酸的双链DNA(SEQ正向)并将pKANNIBAL的HindⅢ和BamHⅠ识别位点间的片段(小片段)替换为SEQ反向(SEQ反向的序列与SEQ正向的序列反向互补)，并保持pKANNIBAL的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。

[0228] 2基因枪转化蜈蚣草

[0229] 有研究表明，沉默基因和DsRed共同表达的概率可达85％‑94％(Indriolo et al，2010)，因此可通过观察红色荧光的方式对转化成功的配子体进行初步筛选。用基因枪转化法将pKANNIBAL‑hpPvAsE1载体和带有红色荧光报告基因的pSAT6‑DsRed(pSAT6‑DsRed是将DsRed基因(GenBank Accession No.FJ226077.1)插入到载体pSAT6(庄盟生物)得到的表达红色荧光蛋白DsRed的重组表达质粒)瞬时表达载体共同转化到蜈蚣草配子体中。同时以只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体作为对照。同时为了更直接地分析PvAsE1作为亚砷酸盐转运蛋白在蜈蚣草砷抗性机制中的作用。采用对配子体生长的影响更为均匀的AsⅤ的还原产物AsⅢ(Indriolo et al，2010)对蜈蚣草配子体进行砷抗性分析。

[0230] 其中，基因枪转化蜈蚣草孢子方法如下：

[0231] 受体材料准备

[0232] (1)取适量蜈蚣草孢子，加入1ml灭菌水(10％NaClO+0.2％TritonX‑100)灭菌10min。

[0233] (2)3000rpm离心1min后去除上清。

[0234] (3)无菌水清洗3遍。

[0235] (4)用移液枪将蜈蚣草孢子悬浮液均匀接种在1/2MS培养基上。密度:2500‑3000个孢子/平板(直径6cm)，血球计数板计数。

[0236] (5)将培养皿置于铺有纱布的培养盘中，加水浸湿纱布，保证孢子萌发所需湿度。30℃持续光照培养1周。

[0237] 微弹载体制备

[0238] 金粉悬浮液配制

[0239] (1)称取60mg金粉于2ml离心管中。

[0240] (2)向离心管中加入1ml 75％乙醇，充分涡旋，静置15min，1500rpm离心5min。

[0241] (3)去除上清液，加入1ml无菌水，充分涡旋，静置15min，1500rpm离心5min。

[0242] (4)重复步骤(3)2次，小心去除上清，加入1ml无菌的50％甘油，充分涡旋，分装为20管，每管50μl，‑20℃保存备用。

[0243] DNA包埋

[0244] (1)取1管‑20℃保存50μl金粉，缓慢涡旋，加入5μl质粒DNA溶液(每微升含0.5μg pKANNIBAL‑hpPvAsE1和0.5μg pSAT6‑DsRed或每微升含1.0μg pSAT6‑DsRed)。

[0245] (2)一滴一滴加入50μl 2.5M CaCl2，缓慢涡旋。

[0246] (3)加入20μl 0.1M亚精胺溶液，缓慢涡旋。

[0247] (4)将上述混好的样品，涡旋1min，冰上静置1min，重复10次。

[0248] (5)冰上静置30min。10000rpm离心10sec，去上清。

[0249] (6)用250μl无水乙醇冲洗2次，10000rpm离心10sec，去上清。

[0250] (7)最后将沉淀用60μl无水乙醇重悬。

[0251] 基因枪轰击

[0252] (1)用75％酒精擦洗轰击室各配件及超净台台面，紫外灭菌30min。

[0253] (2)可裂膜、微粒载片和阻挡网在75％的酒精中浸泡10min，然后晾干待用。

[0254] (3)取10μl DNA包被的金粉点在颗粒子弹载体膜中间并晾干。

[0255] (4)打开基因枪电源开关、真空泵。氦气瓶阀打开，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压(1200psi)。

[0256] (5)旋下可裂膜挡盖，将可裂膜放在挡盖中央，再将挡盖旋上，用专用扳手加固。

[0257] (6)将阻挡网和微粒载片安装在微粒发射装置固定槽中。

[0258] (7)将样品盘放置在轰击室的适当位置(本研究采用6cm位置)，关上轰击室门。

[0259] (8)抽真空至表盘读数为27‑28in Hg，将开关调至HOLD位置，按住FIRE开关直到可裂膜爆破。

[0260] (9)放气，取出样品，完成轰击。

[0261] 2.1转RNAi载体蜈蚣草荧光观察

[0262] 将蜈蚣草孢子在不含砷的1/2MS培养基和含0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基(在1/2MS3+
培养基中加入亚砷酸钠至AsⅢ(As )含量为0.5mM得到的培养基)上萌发，培养一周后长出的配子体用基因枪进行轰击转化pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed或只转化pSAT6‑DsRed，分别得到pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共同转化的蜈蚣草配子体(图4中B以“rnai‑pvase1”表示)和蜈蚣草配子体(图4中B以“Control”表示)。两天后在荧光显微镜下观察荧光，确定转化情况。在荧光显微镜的Bright‑field(白光模式)下，找到能观察到两种配子体的视野(图4中B)后，切换到DsRed观察模式下观察荧光，结果显示，只转化pSAT6‑DsRed的Control蜈蚣草配子体可以观察到红色荧光(图4中B)，pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共同转化的蜈蚣草配子体rnai‑pvase1也能观察到红色荧光，表明基因枪轰击范围内的配子体绝大部分都成功转化。

[0263] 2.2转RNAi载体蜈蚣草PvAsE1表达量分析

[0264] 为了进一步验证PvAsE1基因蜈蚣草孢子体内的沉默情况，通过qRT‑PCR测定PvAsE1在基因枪转化10天后的配子体中的相对转录水平。具体方法如下：将蜈蚣草孢子在1/2MS培养基上萌发，培养一周后长出的配子体用基因枪进行轰击转化pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed或只转化pSAT6‑DsRed。在30℃培养10天后，提取配子体的总RNA，反转录为cDNA。利用组成性表达的PvActin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用‑△△CT
PvAsE1基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)分析，用2 法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real‑time ‑△△CT
quantitative PCR and the 2  method.Methods.25:402‑408)分析PvAsE1基因的表达情况，每组样品重复3次。

[0265] PvAsE1基因的特异引物如下：F2：5’‑GCTGTCCAAGATACCTATGCG‑3’；R2：5’‑ACATCACCACCAGATTGCT‑3’。

[0266] 结果如图4中A所示。与只转化pSAT6‑DsRed的配子体(图4中B以“Control”表示)相比，共转化pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed的配子体(图4中B以“rnai‑pvase1”表示)中的PvAsE1基因的表达量极显著降低，降低了67％(图4中A所示)。因此转RNAi载体极显著地降低了PvAsE1基因在蜈蚣草配子体中的表达，基因沉默后的配子体可用于砷抗性分析，探究PvAsE1基因在蜈蚣草中的功能。

[0267] 3.PvAsE1基因沉默配子体砷处理分析

[0268] 砷处理10天和25天后，在光学显微镜下挑取样品进行表型观察，比对基因枪沉默和野生型的表型差异。

[0269] 3.1PvAsE1基因沉默配子体砷抗性分析

[0270] 将蜈蚣草孢子在不含砷的1/2MS培养基和含0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基(在1/2MS3+
培养基中加入亚砷酸钠至AsⅢ(As )含量为0.5mM得到的培养基)上萌发，培养一周后长出的配子体用基因枪进行轰击转化pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed或只转化pSAT6‑DsRed。在30℃培养10天和25天，观察配子体生长情况。基因枪轰击范围内的配子体比正常野生型配子体生长较为缓慢，这可能是由基因枪轰击造成的。10天和25天后，取基因枪轰击范围内的且有红色荧光的配子体进行表型观察，结果如图5所示。配子体已生长到片状体和原叶体时期，在不含砷的平板上(图5中以“No As”表示)，只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体(图5中以“Control”表示)与pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转的蜈蚣草配子体(图5中以“rnai‑pvase1”表示)生长情况和大小基本一致。在含0.5mM AsⅢ的平板上(含
0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基，图5中以“AsⅢ0.5mM”表示)，pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转化的蜈蚣草配子体与只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体相比，生长更为缓慢，大小明显减小，暗示PvAsE1基因的沉默会导致蜈蚣草的配子体在砷处理环境下生长受到明显影响，因此PvAsE1基因在蜈蚣草配子体砷抗性中发挥了重要作用。

[0271] 此时的蜈蚣草配子体为单层细胞，因此，本研究通过测量蜈蚣草配子体的面积对其生长情况进行定量。将在无砷处理和0.5mM AsⅢ处理下的RNAi配子体选取30个进行面积统计，只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体作为对照，统计结果如图6所示。在无砷处理(用不含砷的1/2MS培养基培养，图6中以“No As”表示)的情况下，pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转的蜈蚣草配子体(图6中以“rnai‑pvase1”表示)平均面积与对照(只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体，图6中以“Control”表示)相比没有显著性差异。在0.5mM AsⅢ处理(用含0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基培养，图6中以“AsⅢ0.5mM”表示)的情况下，pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转的蜈蚣草配子体与只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体相比，平均面积极显著降低，降低了56％，进一步证明了PvAsE1基因在蜈蚣草配子体中的沉默可导致配子体对砷更为敏感。推测可能是由于PvAsE1基因的缺失导致蜈蚣草配子体砷外排功能的减弱，蜈蚣草配子体中积累的砷不能及时排出，造成蜈蚣草配子体在砷处理下生长变弱。因此，PvAsE1基因在蜈蚣草中可能也起到外排砷的作用。

[0272] 3.2PvAsE1基因沉默配子体砷含量分析

[0273] 将蜈蚣草孢子在含0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基(在1/2MS培养基中加入亚砷酸钠至3+
AsⅢ(As )含量为0.5mM得到的培养基)上萌发，培养一周后长出的配子体用基因枪进行轰击转化pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed。在30℃在含0.5mM AsⅢ的1/2MS培养基)中分别培养蜈蚣草配子体(只转化pSAT6‑DsRed)和pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转化配子体7周，在只转化pSAT6‑DsRed的蜈蚣草配子体和pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转化的蜈蚣草配子体中各选取1个，利用微区X射线荧光光谱仪(M4 TORNADO)进行了微区砷含量分布分析。结果如图7所示，由黑到红代表砷含量由低到高，以野生型的蜈蚣草配子体(图7中以“Control”表示)对照体内砷含量以蓝色为主，pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转化的蜈蚣草配子体(图7中以“rnai‑pvase1”表示)与野生型的蜈蚣草配子体相比，配子体中红色面积明显增多，可以直观地观察出pKANNIBAL‑hpPvAsE1和pSAT6‑DsRed共转化的蜈蚣草配子体中砷含量积累量升高。这说明PvAsE1基因表达量的降低使蜈蚣草配子体外排功能减弱，造成了蜈蚣草配子体中砷积累量的增加，更进一步地证明了PvAsE1基因外排砷的作用。