蹄甲多肽的制备方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及
汽车涉
水领域。更具体地说，本发明涉及一种
蹄甲多肽的制备方法。
背景技术
[0002] 蹄甲多肽是从猪蹄甲中经
水解获取的具有
生物活性的多肽组分，具有显著的
止血、抗炎、调整内分泌、提高
机体免疫等功能，对功能性子宫出血症、月经不调等妇科
疾病，具有独特的
治疗作用，而且未出现任何毒
副作用，临床上已广泛应用。目前，生产蹄甲多肽的方法主要
碱水解法，或者碱水解法与酶解结合的方法，但蹄甲多肽的得率和及药效均不太理想。
[0003] 而且蹄甲多肽中，相对分子
质量在30000以上的多肽药理作用较弱，相对分子质量在10000以下的多肽具有显著的凝血和抗炎作用，并表现有抑制子宫收缩的倾向，相对分子质量在3500以下的多肽具有显著的兴奋子宫作用，促凝血和抗炎作用也较强，相对分子质量在10000到3500的多肽均含有分子大小相近而电荷不同的多肽，而现有蹄甲多肽的制备方法均要么水解过度，
氨基氮含量过高，而相对分子质量在10000到3500的多肽占比较少，要么水解不够，相对分子质量在30000以上的多肽占比较多，因此提高蹄甲多肽中相对分子质量在10000到3500的占比，可以提高药效
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0005] 本发明还有一个目的是提供一种蹄甲多肽的制备方法，不仅可以提高蹄甲多肽得率，还可以提高相对分子质量为10000～3500的
蛋白质或多肽的占比。
[0006] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种蹄甲多肽的制备方法，包括以下步骤，以下原料按重量份数计：
[0007] 步骤一、原料前处理：将蹄甲置于
淀粉溶液中浸泡2h，然后将蹄甲和淀粉溶液一起依次置于45℃水浴条件下搅拌30min，置于零下10℃条件下冷冻30min，进行超声处理，超声处理条件为80KHz
频率、60℃、15min，然后取出蹄甲用纯水冲洗干净；
[0008] 其中，淀粉溶液的配制方法为：将10份玉米淀粉、2份面粉、1份苏打、0.5份玉米油、0.5份香葱粉、以及50份水混合，并于70℃水浴条件下搅拌20min，搅拌速度为1000转/min，即得淀粉溶液；
[0009] 步骤二、第一次酶解：将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热
风干燥50min，然后
粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份生姜蛋白酶溶液混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，加入0.7份
乙醇，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至9，再加入0.3份
角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，再加入0.2份乙醇，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液；
[0010] 其中，生姜蛋白酶溶液的制备方法为：将100份纯水、5份生姜蛋白酶、5份卵磷脂、以及1份维生素B混合均匀，即得生姜蛋白酶溶液；
[0011] 步骤三、第二次酶解：待步骤三中的蹄甲滤液冷却至65℃以下后，调节PH值至5.5，然后向
混合液中加载
电流，加入0.2份无花果蛋白酶，置于65℃水浴条件下搅拌1h，加入0.1份猕猴桃蛋白酶，继续于65℃水浴条件下搅拌1.5h，再于100℃水浴条件下静置10min，停止向混合液中加载电流，冷却至30℃以下后，调节PH值至7，再向混合液中加载电流，加入0.15份菠萝蛋白酶，于30℃水浴条件下搅拌3h，再于70℃水浴条件下静置10min，再于78℃水浴条件下搅拌4h，再停止向混合液中加载电流；
[0012] 其中，上述加载电流的具体方法为采用电流装置进行加载，所述电流装置包括一对中空的圆柱形的
电极罩，所述电极罩底部敞开、顶部连接有
导线，一
对电极罩上的导线分别与正电源和负电源连接，所述电极罩底部敷设绝缘环，所述电极罩
侧壁靠下部位套设有环形的重
力块，所述重力块由绝缘材料制成，所述正电源和所述负电源之间的
电压为36V，所述电极罩的直径为10cm；
[0013] 步骤四、将步骤三处理后得到的混合液过滤取蹄甲酶解液，干燥后即得蹄甲多肽粉末。
[0014] 优选的是，所述重力块的材质为陶瓷。
[0015] 优选的是，所述绝缘环的材质为玻璃
纤维。
[0016] 优选的是，一对电极罩用于加载电流时，一对电极罩之间的间距大于5cm、小于20cm。
[0017] 优选的是，所述重力块的直径小于15cm、沿所述电极罩高度方向的长度小于2cm，所述重力块下表面距离所述电极罩下端面的距离小于1cm、距离所述绝缘环下端面的距离小于2cm。
[0018] 优选的是，步骤二中的过滤方法具体为：先采用微孔膜滤除颗粒粒径大于10μm的固体物质，再采用
超滤膜滤除颗粒粒径大于0.02μm的固体物质；
[0019] 步骤四中的过滤为采用用分子量不大于50000道尔顿的超滤膜进行过滤。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果：
[0021] 第一、提高蹄甲多肽得率和相对分子质量为10000～3500的蛋白质或多肽的比例；
[0022] 第二、将10份玉米淀粉、2份面粉、1份苏打、0.5份玉米油、0.5份香葱粉、以及50份水混合，并于70℃水浴条件下搅拌20min，搅拌速度为1000转/min，配制得到的淀粉溶液，对蹄甲进行前处理，可以提高蹄甲多肽的得率和总氮含量，得率分别提高了19.18％和14.85％，总氮分别提高了8.02％和6.71％；
[0023] 第三、第一次酶解：即将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热风干燥50min，然后粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份生姜蛋白酶溶液混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，加入0.7份乙醇，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至9，再加入0.3份角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，再加入0.2份乙醇，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液，可以减少氨基氮的产生，阻止蹄甲粉末分解成过多的氨基氮，保留多肽和蛋白质的分子结构，与对比例3～4比较，氨基氮分别下降了27.58％、15.88％、以及30.57％；
[0024] 第四、第二次酶解：待步骤三中的蹄甲滤液冷却至65℃以下后，调节PH值至5.5，然后向混合液中加载电流，加入0.2份无花果蛋白酶，置于65℃水浴条件下搅拌1h，加入0.1份猕猴桃蛋白酶，继续于65℃水浴条件下搅拌1.5h，再于100℃水浴条件下静置10min，停止向混合液中加载电流，冷却至30℃以下后，调节PH值至7，再向混合液中加载电流，加入0.15份菠萝蛋白酶，于30℃水浴条件下搅拌3h，再于70℃水浴条件下静置10min，再于78℃水浴条件下搅拌4h，再停止向混合液中加载电流，且采用一对中空的圆柱形的电极罩加载电流，可以完全酶解掉相对分子质量为80000～30000的蛋白质或多肽，提高相对分子质量为10000～3500的蛋白质或多肽，与对比例6～8比较，相对分子质量为10000～3500的蛋白质或多肽分别提高了42.51％、35.95％、以及33.59％。
[0025] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0026] 图1为本发明的其中一个
实施例的剖面结构示意图。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0028] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述
试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或
位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0029] <实施例1>
[0030] 蹄甲多肽的制备方法，包括以下步骤，以下原料按重量份数计：
[0031] 步骤一、原料前处理：将蹄甲置于淀粉溶液中浸泡2h，然后将蹄甲和淀粉溶液一起依次置于45℃水浴条件下搅拌30min，置于零下10℃条件下冷冻30min，进行超声处理，超声处理条件为80KHz频率、60℃、15min，然后取出蹄甲用纯水冲洗干净；
[0032] 其中，淀粉溶液的配制方法为：将10份玉米淀粉、2份面粉、1份苏打、0.5份玉米油、0.5份香葱粉、以及50份水混合，并于70℃水浴条件下搅拌20min，搅拌速度为1000转/min，即得淀粉溶液；
[0033] 步骤二、第一次酶解：将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热风干燥50min，然后粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份生姜蛋白酶溶液混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，加入0.7份乙醇，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至9，再加入0.3份角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，再加入0.2份乙醇，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液；
[0034] 其中，生姜蛋白酶溶液的制备方法为：将100份纯水、5份生姜蛋白酶、5份卵磷脂、以及1份维生素B混合均匀，即得生姜蛋白酶溶液；
[0035] 步骤三、第二次酶解：待步骤三中的蹄甲滤液冷却至65℃以下后，调节PH值至5.5，然后向混合液中加载电流，加入0.2份无花果蛋白酶，置于65℃水浴条件下搅拌1h，加入0.1份猕猴桃蛋白酶，继续于65℃水浴条件下搅拌1.5h，再于100℃水浴条件下静置10min，停止向混合液中加载电流，冷却至30℃以下后，调节PH值至7，再向混合液中加载电流，加入0.15份菠萝蛋白酶，于30℃水浴条件下搅拌3h，再于70℃水浴条件下静置10min，再于78℃水浴条件下搅拌4h，再停止向混合液中加载电流；
[0036] 其中，上述加载电流的具体方法为采用电流装置进行加载，所述电流装置包括一对中空的圆柱形的电极罩1，所述电极罩1底部敞开、顶部连接有导线2，一对电极罩1上的导线2分别与正电源和负电源连接，所述电极罩1底部敷设绝缘环3，所述电极罩1侧壁靠下部位套设有环形的重力块4，所述重力块4由绝缘材料制成，所述正电源和所述负电源之间的电压为36V，所述电极罩1的直径为10cm，电流装置如图1所示；
[0037] 步骤四、将步骤三处理后得到的混合液过滤取蹄甲酶解液，干燥后即得蹄甲多肽粉末；
[0038] 其中，所述重力块4的材质为陶瓷，所述绝缘环3的材质为玻璃纤维，一对电极罩1用于加载电流时，一对电极罩1之间的间距大于5cm、小于20cm，所述重力块4的直径小于15cm、沿所述电极罩1高度方向的长度小于2cm，所述重力块4下表面距离所述电极罩1下端面的距离小于1cm、距离所述绝缘环3下端面的距离小于2cm；
[0039] 步骤二中的过滤方法具体为：先采用微孔膜滤除颗粒粒径大于10μm的固体物质，再采用超滤膜滤除颗粒粒径大于0.02μm的固体物质，步骤四中的过滤为采用用分子量不大于50000道尔顿的超滤膜进行过滤。
[0040] <对比例1>
[0041] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是原料前处理，原料前处理的方式为将蹄甲置于纯水中浸泡2h，然后将蹄甲和纯水一起依次置于45℃水浴条件下搅拌30min，置于零下10℃条件下冷冻30min，进行超声处理，超声处理条件为80KHz频率、60℃、15min，然后取出蹄甲用纯水冲洗干净。
[0042] <对比例2>
[0043] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是原料处理中淀粉溶液的制备方法不同，淀粉溶液的制备方法具体为10份玉米淀粉和50份水混合，并于70℃水浴条件下搅拌20min，搅拌速度为1000转/min，即得淀粉溶液。
[0044] <对比例3>
[0045] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第一次酶解，第一次酶解具体为：将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热风干燥50min，然后粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份生姜蛋白酶溶液混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至9，再加入0.3份角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液。
[0046] <对比例4>
[0047] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第一次酶解，第一次酶解具体为：将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热风干燥50min，然后粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份纯水混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，加入0.7份乙醇，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至
9，再加入0.3份角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，再加入0.2份乙醇，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液。
[0048] <对比例5>
[0049] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第一次酶解，第一次酶解具体为：将100份步骤一处理后的蹄甲置于70℃条件下热风干燥50min，然后粉碎至粒径小于25μm，将蹄甲粉末与100份纯水混合均匀，于60℃水浴条件下静置0.5h，继续于60℃水浴条件下静置1h，然后于70℃水浴条件下静置10min，冷却至45℃以下后，调节PH值至9，再加入0.3份角蛋白酶，置于45℃水浴条件下搅拌1.5h，继续于45℃水浴条件下静置2h，然后于70℃水浴条件下静置10min，过滤取蹄甲滤液。
[0050] <对比例6>
[0051] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第二次酶解，第二次酶解具体为：第二次酶解：待步骤三中的蹄甲滤液冷却至65℃以下后，调节PH值至5.5，加入0.2份无花果蛋白酶，置于65℃水浴条件下搅拌1h，加入0.1份猕猴桃蛋白酶，继续于65℃水浴条件下搅拌1.5h，再于100℃水浴条件下静置10min，冷却至30℃以下后，调节PH值至7，再向混合液中加载电流，加入0.15份菠萝蛋白酶，于30℃水浴条件下搅拌3h，再于70℃水浴条件下静置
10min，再于78℃水浴条件下搅拌4h。
[0052] <对比例7>
[0053] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第二次酶解中加载电流的电流装置，电流装置具体为：所述电流装置包括一对电极棒，一对电极棒上端均连接有导线，一对电极棒上的导线分别与正电源和负电源连接，所述正电源和所述负电源之间的电压为36V，所述电极棒的直径为1cm；
[0054] <对比例8>
[0055] 蹄甲多肽的制备方法同实施例1，其中，不同的是第二次酶解中加载电流的电流装置，电流装置具体为：所述电流装置包括一对电极棒，一对电极棒上端均连接有导线，一对电极棒上的导线分别与正电源和负电源连接，所述正电源和所述负电源之间的电压为36V，所述电极棒的直径为10cm。
[0056] <蹄甲多肽品质检测试验>
[0057] 对制备好的蹄甲多肽粉末检测氨基酸、总氮、以及灰分的含量，采用高效液相色谱与质谱联用对蹄甲多肽粉末在PH为7的水中溶解部分进行分离和检测，得到相对分子质量分别为80000～30000、30000～10000、10000～3500、以及3500以下的组分的含量，结果如表1所示；
[0058] 表1蹄甲多肽品质检测数据表％
[0059]
[0060]
[0061] 由表1中对比例1和对比例2的数据可知，采用本发明的方法配制的淀粉溶液对蹄甲进行前处理，可以提高蹄甲多肽的得率和总氮含量，得率分别提高了19.18％和14.85％，总氮分别提高了8.02％和6.71％；
[0062] 对比例3～4的数据可知，采用乙醇和生姜蛋白酶溶液相结合处理蹄甲粉末，可以减少氨基氮的产生，阻止蹄甲粉末分解成过多的氨基氮，保留多肽和蛋白质的分子结构，与对比例3～4比较，氨基氮分别下降了27.58％、15.88％、以及30.57％；
[0063] 对比例6～8的数据可知，在第二次酶解时，采用本发明的方法向混合溶液中加载电流可以完全酶解掉相对分子质量为80000～30000的蛋白质或多肽，提高相对分子质量为10000～3500的蛋白质或多肽，与对比例6～8比较，相对分子质量为10000～3500的蛋白质或多肽分别提高了42.51％、35.95％、以及33.59％。
[0064] <蹄甲多肽药效试验>
[0065] 1、使用实施例1所制得的蹄甲多肽粉末与采用市售的蹄甲多肽片，采用同等剂量制成注射液，分别给试验家兔注射用药三天，然后进行体外凝血试验对比，对照组注射同等剂量的生理盐水；
[0066] 2、使用实施例1所制得的蹄甲多肽粉末与采用市售的蹄甲多肽片，采用同等剂量制成注射液，分别给血小板减少的试验用小鼠注射用药七天，然后分别进行血小板数量检测，对照组注射同等剂量的生理盐水。
[0067] 表2蹄甲多肽药效试验数据
[0068]组别 家兔凝血时间min 小鼠血小板数量
9
实施例1 25 478×10
市售蹄甲多肽片 35 325×109
对照组 50 160×109
[0069] 由表2的数据可知，本发明实施例1的家兔凝血时间与对照组和市售蹄甲多肽片相比，分别减少了50％和28.6％，本发明实施例1的小鼠血小板数量与对照组和市售蹄甲多肽片相比，分别提高了198.75％和47.08％。
[0070] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改，因此在不背离
权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
