技术领域
[0001] 本
发明涉及海洋
生物技术和医药领域，具体涉及一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽及其应用。
背景技术
[0002] 北部湾火水母(Tamoya alata Uchida)是仅分布在我国北部湾海域的一种大型剧毒水母，触腕长且具有大量的刺丝囊细胞，内含主要活性成分为
蛋白质/多肽的毒液，与人或动物
接触时该刺细胞会扎入
皮肤，可深入到真皮部位，并释放细胞内贮存的毒素，造成蛰伤。根据受伤严重程度不同，受害者被蛰处即时出现皮肤红肿、刺痛、流血、皮肤溃烂等现象，严重者虚弱，发热，呕吐，甚至死亡。究其原因，水母触腕的刺细胞内含有大量的水母毒素，主要是结构新颖的蛋白类物质。
[0003] 水母种类不同，其生理结构以及体内所含的毒素成分和活性也存在较大差异，这就致使不同种类水母的毒素的分离纯化工作难以效仿，只能通过繁杂的试验摸索得到。所以水母毒素的分离纯化工作具有很大的难度。
发明人对火水母毒液进一步研究，从该毒液中可以分离出一种具有显著抗
肿瘤活性的多肽，该毒液具有显著的抗肿瘤活性，相应活性成分是一种蛋白质。
[0004] 鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和
侧壁的
恶性肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为
耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。鼻咽癌大多对
放射治疗具有中度敏感性，
放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术
切除和化学药物治疗亦属于不可缺少的手段。因此，亟需一种保守的治疗方法是亟需解决的技术问题。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或
缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽，其能够抑制鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1，CNE-2生长，诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2凋亡。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种所述多肽的提取方法，操作简单，分离步骤少，适宜于快速分离；分离条件温和，能最大程度地保存所得蛋白质的抗肿瘤活性。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种所述多肽的应用。
[0009] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽，
氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010] 一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，从火水母刺细胞毒液中提取毒液蛋白，之后依次使用Histrap SP强阳离子交换柱和Histrap Q强阴离子交换柱从毒液蛋白中分离如
权利要求1所述的多肽。
[0011] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取多肽的提取方法，还包括以下步骤：
[0012] 步骤一、从活的火水母取触腕，与0-4℃的去离子水按照体积比为1∶1-1.5混合，搅拌、静置后，取沉淀重复2-4次，第一次离心，收集沉淀物；
[0013] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总
磷酸盐浓度为0.025mol/L，pH为5.5-6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照
质量体积比1g∶40-60mL混合，
超声波破碎，第二次离心，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0014] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0.025mol/L，pH为5.5-6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释3-5倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱，按照4-6倍柱体积加入
氯化钠浓度为0.035-0.045mol/L、pH为5.5-6.5的第一磷酸盐缓冲溶液进行第一次淋洗，然后按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.045-0.060mol/L、pH为5.5-6.5的第二磷酸盐缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0015] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐浓度为0.025mol/L，pH为7.5-8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经Histrap Q强阴离子交换柱，按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.020-0.040mol/L、pH为7.5-8.5的第三磷酸盐缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为
0.040-0.050mol/L、pH为7.5-8.5的第四磷酸盐缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0016] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液进行第三次离心
超滤浓缩，收集上清液，减压
冷冻干燥，即得所述多肽。
[0017] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，还包括以下步骤：
[0018] 步骤一、从活的火水母取触腕，与2℃的去离子水按照体积比为1∶1.3混合，搅拌、静置后，取沉淀重复3次，第一次离心，收集沉淀物；
[0019] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度为0.025mol/L、pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比1g∶50mL混合，
超声波破碎，第二次离心，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0020] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释4倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱，按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.040mol/L、pH为6.0的第一磷酸盐缓冲溶液进行一次淋洗，然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.055mol/L、pH为6.0的第二磷酸盐缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0021] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐浓度为0.025mol/L、pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经经过Histrap Q强阴离子交换柱，按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.030mol/L、pH为8.0的第三磷酸盐缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.045mol/L、pH为8.0的第四磷酸盐缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0022] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液进行第三次离心超滤浓缩，收集上清液，减压冷冻干燥，即得所述多肽。
[0023] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述步骤五超滤所使用的超滤管的截留分子量为30K。
[0024] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述一次离心的操作条件为：离心
力1000G，4℃，15min；所述二次离心的操作条件为：
离心力13000G，4℃，2h；所述三次离心的操作条件为：离心力5000G，4℃，1h。
[0025] 优选的是，所述的从火水母刺细胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述的第一磷酸盐缓冲溶液和第二磷酸盐缓冲溶液均为总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液；第三磷酸盐缓冲溶液和第四磷酸盐缓冲溶液均为总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液。
[0026] 一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽在制备抗鼻咽癌的药物的应用。
[0027] 本发明至少包括以下有益效果：
[0028] 第一、本发明从火水母刺细胞毒液中提取一种新的多肽，是依次经过Histrap SP强阳离子交换柱和Histrap Q强阴离子交换柱，从毒液蛋白中分离得到的，是具有抗鼻咽癌肿瘤活性的新蛋白，属于开创性发明；
[0029] 第二、将触腕以1∶1-1.5体积比浸泡在0-4℃的去离子水中，防止
温度高导致触腕蛋白变性以及便于低温下触腕自解，搅拌静置多次破坏和分解触腕的
胶原蛋白和保护层；
[0030] 第三、一次离心在1000G，4℃，15min下进行，需要将触腕完全溶解为触细胞；二次离心在13000G，4℃，2h下进行，需要将触细胞破碎后毒液蛋白全部溶出，超声波破碎细胞残片粒径越小需要的离心力越大；三次离心在5000G，4℃，1h下进行，需要将经过层层分离后得到蛋白进行浓缩；
[0031] 第四、将毒液蛋白经过Histrap SP强阳离子交换柱，弱酸性的缓冲溶液使得大部分毒液蛋白与H+结合然后带正电荷，强阳离子交换柱
吸附带正电荷的毒液蛋白，依次用氯化钠浓度为0.035-0.045mol/L的第一磷酸盐缓冲溶液和氯化钠浓度为0.045-0.060mol/L的第二磷酸盐缓冲溶液淋洗，摒弃一部分不需要的蛋白，然后交换缓冲溶液为0.025mol/L，pH为7.5-8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，弱
碱性的缓冲溶液使得大部分蛋白质带负电荷，再经过Histrap Q强阴离子交换柱，强阴离子交换柱吸附带负电荷的蛋白，依次用氯化钠浓度为0.020-0.040mol/L的第三磷酸盐缓冲溶液和氯化钠浓度为0.040-0.050mol/L的第四磷酸盐缓冲溶液淋洗，获得目标蛋白；
[0032] 第五、本发明得到的多肽经过实验证明具有抗鼻咽癌活性，抑制鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1，CNE-2生长，诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2凋亡，采用本发明的方法可以大批量处理火水母刺细胞毒液，分离出其中含有的抗肿瘤活性蛋白。操作简单，分离步骤少，适宜于快速分离；分离条件温和，能最大程度地保存所得蛋白质的抗肿瘤活性。
[0033] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
[0034] 本发明所涉及到的术语定义
[0035] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0036] 术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶，两个或两个以上的氨基
酸化学聚合成肽，一个蛋白质的原始
片段，是蛋白质生成的前体，氨基酸广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物，正如它的名字所说的那样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-
碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。在自然界中共有300多种氨基酸，其中α-氨基酸21种，α-氨基酸是肽和蛋白质的构件分子，也是构成生命大厦的基本砖石之一。
[0037] 术语“多肽”意指α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质
水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等，通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10000道尔顿，能透过半透膜，不被三氯乙酸及
硫酸铵所沉淀，也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。
附图说明
[0038] 图1为本发明所述的多肽对鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1，CNE-2作用的效果图。
[0039] 图2为本发明所述的多肽诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2发生凋亡的效果图。
具体实施方式
[0040] 下面结合
实施例对发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0041] 实施例1：
[0042] 一种多肽分子，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0043] SEQ ID No.1：
[0044]
[0045]
[0046] 实施例2：
[0047] 本发明所述的多肽的提取：
[0048] 步骤一、从活的火水母取触腕，与0℃的去离子水按照体积比为1∶1混合，搅拌、静置后，取沉淀重复2次，第一次离心，离心条件为：离心力1000G，4℃，15min，收集沉淀物；
[0049] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比1g∶40mL混合，超声波破碎，第二次离心，离心条件为：离心力13000G，4℃，2h，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0050] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释3倍，使之缓慢流经过Histrap SP强阳离子交换柱，按照4倍柱体积加入氯化钠浓度为0.035mol/L、pH为5.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第一次淋洗，然后按照4倍柱体积加入氯化钠浓度为0.045mol/L、pH为5.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0051] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐浓度为0.025mol/L、pH为7.5-8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经Histrap Q强阴离子交换柱，按照4-6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.020mol/L、pH为7.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照4倍柱体积加入氯化钠浓度为0.040mol/L、pH为7.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0052] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液，用截留分子量为30K的超滤管进行第三次离心超滤浓缩，离心条件为：离心力5000G，4℃，1h，收集上清液，减压冷冻干燥，即得所述多肽。
[0053] 实施例3：
[0054] 本发明所述的多肽的提取：
[0055] 步骤一、从活的火水母取触腕，与4℃的去离子水按照体积比为1∶1.5混合，搅拌、静置后，取沉淀重复4次，第一次离心，离心条件为：离心力1000G，4℃，15min，收集沉淀物；
[0056] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比1g∶60mL混合，超声波破碎，第二次离心，离心条件为：离心力13000G，4℃，2h，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0057] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释5倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱，按照6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.045mol/L、pH为6.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第一次淋洗，然后按照6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.060mol/L、pH为6.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0058] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐浓度为0.025mol/L、pH为8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经Histrap Q强阴离子交换柱，按照6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.040mol/L、pH为8.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照6倍柱体积加入氯化钠浓度为0.050mol/L、pH为8.5、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0059] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液，用截留分子量为30K的超滤管进行第三次离心超滤浓缩，离心条件为：离心力5000G，4℃，1h，收集上清液，减压冷冻干燥，即得所述多肽。
[0060] 实施例4：
[0061] 本发明所述的多肽的提取：
[0062] 步骤一、从活的火水母取触腕，与2℃的去离子水按照体积比为1∶1.3混合，搅拌、静置后，取沉淀重复3次，第一次离心，离心条件为：离心力1000G，4℃，15min，收集沉淀物；
[0063] 步骤二、将步骤一得到的沉淀物与总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液按照质量体积比1g∶50mL混合，超声波破碎，第二次离心，离心条件为：离心力13000G，4℃，2h，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0064] 步骤三、取步骤二得到毒液蛋白，用总磷酸盐浓度0.025mol/L、pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释4倍，使之缓慢流经Histrap SP强阳离子交换柱，按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.040mol/L、pH为6.0、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第一次淋洗，然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.055mol/L、pH为6.0、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0065] 步骤四、取步骤三得到第二淋洗液进行缓冲溶液置换，变更缓冲溶液为总磷酸盐浓度为0.025mol/L、pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使之缓慢流经Histrap Q强阴离子交换柱，按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.030mol/L、pH为8.0、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第三次淋洗，然后按照5倍柱体积加入氯化钠浓度为0.045mol/L、pH为8.0、总磷酸盐浓度为0.025mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0066] 步骤五、取步骤四得到的第四淋洗液，用截留分子量为30K的超滤管进行第三次离心超滤浓缩，离心条件为：离心力5000G，4℃，1h，收集上清液，减压冷冻干燥，即得所述多肽。
[0067] 实施例5：
[0068] 本发明所述的多肽进行以下抗肿瘤实验：
[0069] 一、采用MTT法检测本发明所述的多肽对人鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1、CNE-2的作用效果
[0070] 实验方法：
[0071] 步骤一、收集对数期CNE-1和CNE-2细胞，用培养基调整细胞悬液浓度为105个细胞/毫升，取96孔板，每孔加入细胞悬液100μL，边缘用无菌水填充；
[0072] 步骤二、5％CO2，37℃培养24小时使细胞贴壁，加入不同浓度的目标多肽进行实验。设置5-7个梯度，每孔100μL，每个浓度梯度设置3-5个平行样；
[0073] 步骤三、5％CO2，37℃培养48小时，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时后终止培养，小心吸去孔内培养液；
[0074] 步骤四、每孔加入150μL二甲亚砜，置于摇床上低速振荡10min，使MTT与活细胞线粒体乳酸脱氢酶反应生成的甲瓒结晶充分溶解，以酶标仪或紫外可见光分光光度计测定490nm
波长下的吸光度。
[0075] 实验结果：
[0076] 实验结果如图1所示，结果表明，本发明所述的多肽对两种人鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2的生长具有抑制作用，这种抑制作用随着施加本发明所述的多肽的浓度提高而逐步增大。本发明所述的多肽对两种细胞的半致死浓度分别为：0.0081μg/mL和0.0073μg/mL。这说明，本发明所述的多肽能强烈抑制鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-1、CNE-2的增殖，且本发明所述的多肽对该肿瘤细胞的增殖抑制作用是浓度依赖的。
[0077] 二、本发明所述的多肽诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2发生凋亡的验证实验[0078] 实验方法：
[0079] 步骤一、收集对数期CNE-2细胞，调整细胞悬液浓度为106个细胞/毫升，取6孔板，每孔加入1mL；
[0080] 步骤二、5％CO2，37℃培养24小时使细胞贴壁，加入0.1μg/mL的目标多肽；
[0081] 步骤三、5％CO2，37℃培养48小时，用冷的无菌PBS清洗两次，随后加入胰酶消化，将细胞制成悬浮液并计数；
[0082] 步骤四、取1-5万重悬的细胞，1000G离心5min，弃去上清加入195μL的Annexin V-FITC结合缓冲液，轻微吹打，将细胞制成悬浮液；
[0083] 步骤五、往上述细胞悬液中，加入5μL的异硫氰酸
荧光素(fluorescein isothiocyanate)偶联的Annexin V和10μL碘化丙锭(PI)，轻微混匀，在室温下避光孵育15min；
[0084] 步骤六、孵育结束后，再往离心管中加入400μL结合缓冲溶液，随后送交双通道流式细胞计进行计数分析，选用激发光波长为488nm和535nm，检测发射光波长为525nm和615nm。
[0085] 所用annexin V-FITC、PI以及其它各种缓冲液均购于碧
云天生物
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[0086] 实验结果：
[0087] 实验结果如图2所示，流式细胞术的结果表明，本发明所述的多肽主要诱导CNE-2细胞发生早期凋亡和晚期凋亡，其中又以晚期凋亡为主，在本发明所述的多肽浓度下，发生早期凋亡的细胞约占细胞总数的10.89％，发生晚期凋亡的细胞约占细胞总数的79.58％。这说明，本发明所述的多肽能诱导鼻咽癌肿瘤细胞株CNE-2发生显著凋亡。
[0088] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
