对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜属植物
阅读：451发布：2022-12-16
专利汇可以提供对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜属植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种南瓜属 植物 ，特别是一种南瓜植物，该植物对 马 铃薯Y病毒属，如小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）、西瓜花叶病毒（WMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）以及摩洛哥西瓜花叶病毒（MWMV）具有广谱抗性。还提供了通过标记辅助育种来选择一种具有广谱马铃薯Y病毒属抗性的南瓜植物的多种方法。，下面是对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜属植物专利的具体信息内容。
1.一种栽培的南瓜属植物，优选地西葫芦，包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对MWMV、PRSV、WMV和/或ZYMV的抗性的遗传决定子。
2.根据权利要求1所述的植物，其中所述遗传决定子是从中国南瓜的基因组中可获得的。
3.根据权利要求1或2所述的植物，包含至少两个所述能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和/或MWMV的抗性的遗传决定子。
4.根据权利要求1或2所述的植物，包含至少四个所述能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV的抗性的遗传决定子。
5.根据权利要求1到4所述的植物，其中
a.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或b.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的两个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后对应地用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
c.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
6.根据权利要求1到5所述的植物，其中
a.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：
正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
b.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的两个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后对应地用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
c.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
7.根据权利要求1到5所述的植物，其中
a.该遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
b.该遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后对应地用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；
c.该遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
8.根据权利要求1到7所述的植物，其中该（这些）遗传决定子是隐性遗传的并且彼此独立地分离。
9.根据权利要求1到8所述的植物，其中该植物是南瓜植物。
10.根据权利要求9所述的南瓜植物的种子，该种子能够生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。
11.根据权利要求10所述的种子的用途，用于生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。
12.选择对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
a.鉴定包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
iii.正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
iv.正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测；和/或
v.一种正向和反向引物，能够鉴定与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离的标记位点。
13.根据权利要求12所述的用于选择对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
a.鉴定包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种
268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
i.如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
ii.如果该标记位点为W1，则为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
iii.如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；
iv.如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤a)中选择的植物包含至少三个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV的抗性的遗传决定子；并且在步骤c)中选择的后代对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的三个标记位点分离。
15.根据权利要求13到14所述的方法，其中在步骤a)中鉴定的南瓜植物是一种根据权利要求1到9所述的植物。
16.根据权利要求14和15所述的方法，包括使在步骤c)中获得的病毒抗性植物与在步骤b)的易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步骤。
17.一种用于产生对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜的杂种种子的方法，包括a.种植雄性不育雌性植物和雄性能育植物，其中所述雄性不育雌性植物或雄性能育植物之一是一种根据权利要求1到9中任一项所述的植物，
b.在两个株系之间实现异花授粉，
c.使该植物生长直到座果，
d.收集这些果实；以及
e.获得这些杂种种子。
18.一种用于获得马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物的方法，包括
a.提供种间非活性胚，该胚是由使权利要求1到10所述的植物与另一植物杂交而获得的；
b.挽救所述胚；
c.从步骤c)的所述胚再生出一种植物；以及
d.选择一种对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV、MWMV中的至少之一具有抗性的步骤d)的植物。
19.一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的，其中
a.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
b.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的至少一个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
c.该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
20.一种鉴定包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遗传决定子的南瓜植物的方法，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
i.如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；或
ii.如果该标记位点为W1，则为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
iii.如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
iv.如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜属植物
[0002] 马铃薯Y病毒组（它的原型成员称为马铃薯Y病毒（PVY））是当前已识别的34个植物病毒组和家族中最大的（沃德和舒克拉，1991；国际病毒学32,269-296（Ward&Shukla,1991;Intervirology32,269-296））。这个组包含至少180个确定的和可能的成员（占所有已知的植物病毒的30%），这些成员在农业、畜牧业、园艺以及观赏作物中造成重大损失（沃德和舒克拉，1991；国际病毒学32,269-296）。
[0003] 南瓜栽培中的一个主要问题是出现了损害植物和果实的马铃薯Y病毒属。有至少四种最经常感染南瓜的马铃薯Y病毒属，即小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）、西瓜花叶病毒（WMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）、摩洛哥西瓜花叶病毒（MWMV）。南瓜中的马铃薯Y病毒属疾病的症状包括花叶病、黄化、细长形叶子、发育迟缓以及果实和种子畸形。
[0004] 稳定的马铃薯Y病毒属抗性是南瓜育种者的关键驱动因素，因为多种病毒倾向于突变并且战胜现存的抗性基因。南瓜中迄今已知的唯一的稳定抗性已通过遗传修饰方法实现。在欧洲，南瓜种植者在这些“抗性”品种中日益看到马铃薯Y病毒属感染。因而，对方便并且经济上可持续的防止南瓜植物被马铃薯Y病毒属感染的策略的需要未被满足。
[0005] 本发明通过提供对总体上影响南瓜的不同的马铃薯Y病毒属具有稳定并且广泛的抗性的南瓜植物来解决这个需要。这种抗性是由已通过经典种间杂交和胚挽救引入到南瓜植物中的至少3个隐性遗传决定子提供。
发明内容
[0006] 本发明涉及一种栽培的南瓜属植物，包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的1个或多个的抗性的遗传决定子。
[0007] 在一个实施例中，所述遗传决定子是从中国南瓜（Cucurbita moschata），优选地从中国南瓜尼日利亚变种（C.moschata var.Nigeria）可获得的。
[0008] 在另一实施例中，根据任何前述实施例的植物包含所述至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染的抗性的遗传决定子。
[0009] 在另一实施例中，根据任何前述实施例的植物包含至少两个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染的抗性的遗传决定子。
[0010] 在另一实施例中，根据任何前述实施例的植物包含至少三个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染，优选地对ZYMV和MWMV感染的抗性的遗传决定子。
[0011] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的植物，其中
[0012] 这些遗传决定子中的至少一个与西葫芦栽培品种（C.pepo cv.）268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1（5'AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3'）和反向引物SEQ ID NO:2（5'CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3'），随后用抗性等位基因特异性探针：FAM-CACTTCCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:7）和/或易感等位基因特异性探针：VIC-CACTTTCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:8）进行检测；和/或
[0013] 这些遗传决定子中的至少两个与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3（5'GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3'）和反向引物SEQ ID NO:4（5'GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3'），随后用抗性等位基因特异性探针：FAM-TCATTGCACCCAACATG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:9）和/或易感等位基因特异性探针：VIC-TCATTGCACTCAACATGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:10）进行检测；
[0014] 和/或正向引物SEQ ID NO:5（5'TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3'）和反向引物SEQ ID NO:6（5'TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3'），随后用抗性等位基因特异性探针：FAM-TTTGTTTGCTTGAGCTGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:11）和/或易感等位基因特异性探针：
VIC-TTTGTTCGATTGAGCTGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:12）进行检测；和/或
VIC-TTTGTTCGATTGAGCTGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:12）进行检测；和/或
[0015] 这些遗传决定子中的至少一个与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13（5'TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3'）和反向引物SEQ ID NO:14（5'GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3'），随后用抗性等位基因特异性探针：
FAM-AGTTGCGACTTTCCA-MGB-NFQ（SEQ ID NO:15）和/或易感等位基因特异性探针：
TET-AGTTGCGACTTTTCATT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:16）进行检测。
FAM-AGTTGCGACTTTCCA-MGB-NFQ（SEQ ID NO:15）和/或易感等位基因特异性探针：
TET-AGTTGCGACTTTTCATT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:16）进行检测。
[0016] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的植物，其中
[0017] 该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；
[0018] 和/或这些遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或[0019] 该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0020] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的植物，其中
[0021] 该遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0022] 该遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0023] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0024] 该遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0025] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的植物，其中该（这些）遗传决定子是隐性遗传的并且彼此独立地分离。
[0026] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的植物，其中该植物是南瓜植物。
[0027] 本发明还涉及一种根据任何前述实施例的南瓜植物的种子，该种子能够生长成马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。本发明还涉及所述种子的用途，用于生长成马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。
[0028] 本发明还涉及一种用于产生对马铃薯Y病毒属，优选地对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的至少一个展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
[0029] a)选择一种包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离，并且可以在PCR中用至少一个以下PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0030] i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0031] ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0032] iii.正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0033] iv.正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测；和/或
[0034] v.一种正向和反向引物，它能够鉴定与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离的一个标记位点；
[0035] b)使步骤a)的所述植物与易感染马铃薯Y病毒属或对至少一种所述马铃薯Y病毒属展现中等抗性水平的南瓜植物杂交；以及
[0036] c)从所述杂交中选择一个后代，该后代对马铃薯Y病毒属展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的所述至少一个标记位点分离。
[0037] 本发明还涉及一种用于产生根据任何前述实施例的对马铃薯Y病毒属展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
[0038] a)选择一种包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与马铃薯Y病毒属抗性共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0039] i.如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；或
[0040] ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0041] iii.如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0042] iv.如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测；
[0043] b)使步骤a)的所述植物与易感染马铃薯Y病毒属或对至少一种所述马铃薯Y病毒属展现中等抗性水平的南瓜植物杂交；以及
[0044] c)从所述杂交中选择一个后代，该后代对马铃薯Y病毒属展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的所述至少一个标记位点分离。
[0045] 在一个实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的方法，其中在步骤a)中选择的该植物包含至少两个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子；并且在步骤c)中选择的该后代对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与在步骤a)的两个标记位点分离。
[0046] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的方法，其中在步骤a)中选择的植物包含至少三个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV的抗性的遗传决定子；并且在步骤c)中选择的该后代对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的三个标记位点分离。
[0047] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的方法，其中步骤a)的供体植物是如在此描述的一种植物。
[0048] 在另一实施例中，本发明涉及一种根据任何前述实施例的方法，包括使步骤c)中获得的该病毒抗性植物与步骤b)的该易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步骤。
[0049] 本发明还涉及一种用于产生对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜的杂种种子的方法，包括种植一种雄性不育雌性植物和一种雄性能育植物，其中所述雄性或雌性株系中的至少一个是如在此描述的植物，从而在两个株系之间实现异花授粉，使该植物生长直到座果，收集这些果实并且获得这些杂种种子。
[0050] 本发明还涉及一种用于获得马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物的方法，包括[0051] a)通过如在此描述的一种方法来获得如在此描述一种植物；
[0052] b)使所述植物与一种易感染马铃薯Y病毒属的植物或一种中等抗性南瓜植物杂交；
[0053] c)挽救由步骤b)的该杂交产生的一个胚；
[0054] d)从步骤c)的所述胚再生出一种植物；以及
[0055] e)选择对马铃薯Y病毒属具有抗性的步骤d)的一种植物。
[0056] 本发明还涉及一种用于获得对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜果实的方法，包括播种如在此描述的或通过一种如在此描述的方法获得的一种植物的种子；和使所述植物生长以便产生果实并且收获由所述植物产生的该果实。
[0057] 本发明还涉及一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的，并且其中
[0058] 该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0059] 该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0060] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0061] 该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0062] 本发明还涉及一种鉴定包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遗传决定子的南瓜植物的方法，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离，并且可以在PCR中通过用包括以下的PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0063] 如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；或
[0064] 如果该标记位点为W1，则为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0065] 如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；或
[0066] 如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0067] 本发明还涉及了得自一种如在此描述的南瓜植物的马铃薯Y病毒属抗性繁殖材料的用途，用于生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物以便产生果实并且收获所述果实。
[0068] 定义
[0069] 如在此所使用，短语“建立的育种群体”是指在育种计划，例如商业育种计划中产生的和/或用作亲本的潜在育种配偶体的集合。建立的育种群体的成员典型地在基因和/或表型方面得到充分表征。例如，可能已经评估感兴趣的若干表型性状，例如在不同的环境条件下、在多个位置和/或在不同的时间。作为替代方案或另外，可能已经鉴定一个或多个与表型性状的表达相关的基因位点，并且可能已经就该一个或多个基因位点方面以及就与该一个或多个基因位点相关的一个或多个基因标记方面对育种群体的一个或多个成员进行基因型分析。
[0070] 栽培的西葫芦植物在本发明的范围内被理解为是指不再是呈天然状态，而是已经通过人类的照料进行发育和驯化并且供农业使用和/或人类消费的植物。作为实例，根据本发明的西葫芦植物将被认为是一种栽培的植物，并且可以选自下组，该组包括宝石南瓜、夏南瓜、冬南瓜、小西葫芦、黄色曲颈南瓜、黄色夏南瓜、西葫芦、扇形南瓜、直颈南瓜以及菜瓜。在本发明的上下文中，“栽培的西葫芦植物”适于栽培并且展现疾病抗性，特别是中等抗性，如小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）中等抗性。栽培的南瓜属植物应进一步被理解为不包括那些包含了本发明主题的性状作为天然性状和/或其天然遗传学的一部分的野生型物种。
[0071] 为了避免疑义，中国南瓜尼日利亚变种是抗性的“野生来源”并且不应被认为是一种栽培的植物。
[0072] 如在此所使用，短语“二倍体个体”是指具有两组染色体的个体，典型地，一组来自它的两个亲本中的每一个。然而，应理解在一些实施例中，二倍体个体可以从相同的单一生物体接收它的“母本”和“父本”组的染色体，如当植物自体授粉以产生植物的继代时。
[0073] “纯合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应位点处的相同的等位基因。
[0074] “杂合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应位点处的不同的等位基因。
[0075] “回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种后代与亲本之一重复往回杂交的方法。不同的轮回亲本可以被用在随后的回交中。
[0076] “位点”在本发明的范围内应理解为是指染色体上包含基因或对性状有贡献的任何其他基因成分或要素的一个区域。
[0077] 如在此所使用，“标记位点”是指染色体上包含了存在于个体的基因组中并且与一个或多个感兴趣的位点相关的核苷酸或多核苷酸序列的一个区域，该区域可能包含基因或对性状有贡献的任何其他基因成分或要素。“标记位点”还指染色体上包含与基因组序列互补的多核苷酸序列（如用作探针的核酸的序列）的一个区域。
[0078] “遗传连锁”在本发明的范围内应理解为是指由于基因在同一染色体上的位置邻近而引起的遗传特征关联性，通过位点之间的重组百分比来量度（厘摩，cM）。
[0079] 位点之间的距离通常由同一染色体上的位点之间的交换频率来量度。两个位点相隔越远，它们之间就越可能发生交换。反之，如果两个位点紧密地靠在一起，则它们之间不太可能发生交换。按照惯例，一厘摩（cM）等于位点（标记）之间的1%重组。当QTL可以通过多个标记指示时，端点标记之间的基因距离指示QTL的大小。
[0080] 短语“与标记位点遗传连锁”将被认为是意指标记位点与提供抗性性状的遗传决定子相距不超过10cM，更优选地5cM，更优选地2cM，最优选地1cM。
[0081] “指导或控制表达的遗传决定子”在此应理解为是指能够在DNA自身的水平上、在最终多肽产物的翻译、转录和/或活化的水平上对性状的表达有贡献，从而引起该性状的表型表达的可遗传的基因成分。
[0082] 出于本发明的目的，术语“共分离”是指以下事实：针对性状的等位基因和针对标记的等位基因倾向于一起传递，这是因为它们在同一染色体上物理地紧靠在一起（它们之间的重组由于它们物理的邻近而减少），导致它们的等位基因由于它们在同一染色体上的邻近而非随机关联。“共分离”还指单一植物内存在两种或更多种性状，已知其中至少一种是遗传的并且这些性状不能轻易地用偶然性解释。
[0084] 如在此所使用，短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明披露的主题的上下文中是指配子融合以产生后代（例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子）。“有性杂交”或“异体受精”在一些实施例中是一个个体被另一个体受精（例如，植物中的异花授粉）。术语“自体受精”在一些实施例中是指通过自体受精或自体授粉来产生种子；即，花粉和胚珠是来自同一植物。
[0085] 如在此所使用，短语“基因标记”是指个体的基因组中与一个或多个感兴趣的位点相关的特征（例如，存在于个体的基因组中的核苷酸或多核苷酸序列）。在一些实施例中，基因标记在感兴趣的群体中是多态性的，或位点被多态性占据，取决于上下文。基因标记包括例如单一核苷酸多态性（SNP）、插入或缺失（即，插入/缺失）、简单序列重复（SSR）、限制片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、裂解扩增多态性序列（CAPS）标记、多样性阵列技术（DArT）标记以及扩增片段长度多态性（AFLP）以及许多其他实例。基因标记可以例如用于对包含染色体上对表型性状的可变性有贡献的等位基因进行定位的基因位点。短语“基因标记”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，如用作探针的核酸的序列。
[0086] 短语“与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应基因组决定子互补”将被认为是意指在染色体DNA的一个区域上发现的一个基因（或它的启动子区），所述区域的长度是0.5MB、1MB、2MB、3MB、4MB、5MB或10MB，该基因与在西葫芦栽培品种268NiW染色体DNA的相应区域上发现的相同基因（或它的启动子区）一致。
[0087] 基因标记可以物理地定位于染色体上在与它关联的基因位点内部或外部（即，对应地是基因内的或基因外的）的一个位置。换句话说，尽管在相应于感兴趣的位点的基因或功能突变在染色体上的位置（例如，在基因外部的控制元件内）还没有被鉴定并且基因标记与感兴趣的位点之间存在非零重组率时典型地使用多个基因标记，但本发明披露的主题还可以使用物理地处于基因位点的边界内的基因标记（例如，在相应于基因的基因组序列内部，如但不限于基因的内含子或外显子内的多态性）。在本发明披露的主题的一些实施例中，该一个或多个基因标记包含在一个与十个之间的标记，并且在一些实施例中，该一个或多个基因标记包括多于十个基因标记。
[0088] 如在此所使用，术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体的单倍型中存在的一个或多个基因标记位点的具体等位基因。如本领域中已知，基因型可以涉及单一位点或多个位点，无论这些位点是相关还是非相关的，和/或是连锁还是非连锁的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为这些基因中的一个或多个参与感兴趣的表型（例如，如在此定义的数量或质量性状）的表达。因而，在一些实施例中，基因型包括个体内在数量或质量性状的一个或多个基因位点处存在的一个或多个等位基因的汇总。在一些实施例中，基因型从单倍型（定义于下文中）方面来表达。
[0089] 如在此所使用，术语“种质”是指一个群体或其他个体组（例如，一个物种）的基因型的总体。术语“种质”还可以指植物材料；例如，一组充当不同的等位基因的贮藏处的植物。短语“改适过的种质”是指例如对于给定的环境或地区具有经过证明的遗传优越性的植物材料，而短语“未改适过的种质”、“原始种质”以及“外来种质”是指例如对于给定的环境或地区具有未知的或未经证明的遗传价值的植物材料；因而，短语“未改适过的种质”在一些实施例中是指不是建立的育种群体的一部分并且与建立的育种群体的成员不具有已知的关系的植物材料。
[0090] 如在此所使用，术语“杂种”、“杂种植物”以及“杂种后代”是指由在遗传不同的亲本产生的个体（例如，遗传上杂合的或主要是杂合的个体）。
[0091] 如在此所使用，短语“单次杂交F1杂种”是指由两个近交系之间的杂交产生的F1杂种。
[0092] 如在此所使用，短语“近交系”是指遗传上纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交系可以通过若干循环的兄弟/姐妹育种或自体受精或双单倍体产生来获得。在一些实施例中，近交系针对一个或多个感兴趣的表型性状进行纯育。“近交”、“近交个体”或“近交后代”是来自一个近交系的单独的样品。
[0093] 如在此所使用，术语“双单倍体株系”是指由花药栽培得出的稳定的近交系。在特殊介质和环境中栽培的一些花粉粒（单倍体）可以发育成含有n个染色体的小植株。然后使这些小植株“加倍”并且包含2n个染色体。这些小植株的后代称为“双单倍体”并且基本上不再分离（稳定的）。
[0094] 如在此所使用，术语“连锁”和它的语法变体是指同一染色体上不同的位点处的等位基因在它们的传递是单独的情况下倾向于比偶然所预期的更经常地分离的。
[0095] 如在此所使用，短语“核酸”是指可能相应于核苷酸串的任何物理单体单元串，包括核苷酸的聚合物（例如，典型的DNA、cDNA或RNA聚合物）、修饰过的寡核苷酸（例如，包括对于生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸）等等。在一些实施例中，核酸可以是单股、双股、多股或它们的组合。除非另外指示，否则本发明披露的主题的具体核酸序列任选地包括或编码除了明确指示的任何序列以外的互补序列。
[0096] 如在此所使用，短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
[0097] 如在此所使用，短语“抗性”是指当与易感植物比较时在类似的环境条件和病原体压力下植物能够限制指定病原体的生长和发展和/或它们所引起的损伤。抗性植物在病原体压力，例如ZYMV病原体压力下可能展现一些疾病症状或损伤。
[0098] 如在此所使用，短语“易感性”是指植物不能够充分地限制指定病原体，例如马铃薯Y病毒属病原体，如ZYMV的生长和发展。
[0099] 抗性植物在以下实例中定义的测试条件下将显示无或极少的坏死以及无或极稀少的孢子形成。
[0100] 如在此所使用，术语“多个”是指多于一个。因而，“多个个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。
[0101] 如在此所使用，术语“后代”是指具体杂交的一个或多个子代。典型地，后代由两个个体的育种产生，但一些物种（特别是一些植物和雌雄同体的动物）可以自体受精（即，同一个植物充当雄性和雌性配子两者的供体）。这一个或多个后代可以是例如F1、F2或任何继代。
[0102] 如在此所使用，短语“质量性状”是指受一个或几个展现大多数表型作用的基因控制的表型性状。因此，质量性状典型地被简单地遗传。在植物中的实例包括但不限于花的颜色、果实的颜色和若干已知的疾病抗性。
[0103] “基于标记的选择”在本发明的范围内应理解为是指例如使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状遗传连锁，以鉴定出携带令人希望的（或不希望的）性状的基因的植物，使得在选择性育种计划中可以使用（或避免）那些植物。
[0104] “聚合酶链反应（PCR）”在本发明的范围内应理解为是指产生基因组的DNA或一个或多个子集的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。
[0105] “PCR引物”在本发明的范围内应理解为是指DNA的具体区域的PCR扩增中所使用的相对较短的单股DNA片段。
[0106] “表型”在本发明的范围内应理解为是指遗传上控制的性状的可区分的特征。
[0107] 如在此所使用，短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
[0108] “多态性”在本发明的范围内应理解为是指一个群体中存在两种或更多种不同形式的基因、基因标记或遗传性状或例如通过交替剪接、DNA甲基化等可获得的基因产物。
[0109] “选择性育种”在本发明的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种计划。
[0110] “测试”植物在本发明的范围内应理解为是指用于遗传上表征将被测试的植物中的性状的植物。典型地，使将被测试的植物与“测试”植物杂交，并且对杂交后代中的性状的分离比率进行评分。
[0111] 如在此所使用的“探针”是指能够识别并且结合于具体目标分子或细胞结构并且因而允许目标分子或结构的检测的一组原子或分子。特别地，“探针”是指可以用于通过分子杂交来检测互补序列的存在并且对其定量的经过标记的DNA或RNA序列。
[0112] 如在此所使用的术语“杂交”是指常规的杂交条件，优选地是指以下杂交条件，即：使用5x SSPE、1%SDS、1x Denhardts溶液作为溶液和/或杂交温度在35℃与70℃之间，优选地65℃。杂交后，优选地首先用2x SSC、1%SDS并且随后用0.2x SSC在35℃到75℃之间的温度下、特别地在45℃到65℃之间、但尤其在59℃下进行洗涤（关于SSPE、SSC和Denhardts溶液的定义，参见上述引文中的萨姆布鲁克（Sambrook）等人）。如例如以上萨姆布鲁克等人中所述的高严格度杂交条件是特别优选的。特别优选的严格杂交条件例如在如上指示杂交和洗涤在65℃下进行时存在。例如杂交和洗涤在45℃下进行的非严格杂交条件是不太优选的并且在35℃下是更不太优选的。
[0113] “序列同源性或序列一致性”在此可互换地使用。在两个或更多个核酸或蛋白序列的背景下，术语“一致”或“一致性”百分比是指如使用以下序列比较算法之一或通过目测进行测量，当比较和比对最大相应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果将彼此进行比较的两个序列长度不同，则序列一致性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基一致的较短序列的核苷酸残基的百分比。常规地通过使用计算机程序例如Bestfit程序（威斯康星序列分析包，针对Unix操作系统的版本8，遗传学电脑集团，大学研究园，科学先驱路575号，麦迪逊，WI53711)可以确定序列一致性。Bestfit使用史密斯和华特曼,应用数学进展2（1981），482-489（Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics2(1981),482-489）的局部同源性算法以便找到两个序列之间具有最大序列一致性的区段。当使用Bestfit或其他序列比对程序来确定是否一个具体的序列与本发明的一个参照序列具有例如95%一致性时，优选地对参数进行这样的调整从而在参照序列的整个长度上对一致性的百分比进行计算并且允许该参照序列中同源性缺口占核苷酸总数的高达5%。当使用Bestfit时，优选地将所谓的任选的参数保留在它们预设（“默认”）值。在一个给定的序列和上述本发明的序列之间的比较中出现的偏差可能是由例如加入、缺失、取代、插入或重组引起的。优选地还可以使用程序“fasta20u66”（版本2.0u66，1998年9月，由威廉·R.·皮尔逊（William R.Pearson）和弗吉尼亚大学编写，还参见W.R.皮尔逊（1990），酶学方法183,63-9a（W.R.Pearson(1990),Methods in Enzymology183,63-9a）、所附的实例以及http://workbench.sdsc.edu/）进行这样一种序列比较。对于这个目的，可以使用“缺省”参数设定。两个核酸序列实质上一致的另一指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指一个分子在严格条件下仅与一个特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于一种复合混合物（例如，总细胞）DNA或RNA中时进行的。“实质上结合”是指在一个探针核酸与一个目标核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低该杂交介质的严格度来容纳，以实现该目标核酸序列的所希望的检测。
[0114] 在核酸杂交实验（如，南方和北方杂交）的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是依赖于序列的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列特定地在较高的温度下杂交。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森（1993）生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交第2章第I部分“杂交原理和核酸探针检验策略综述”，爱思唯尔，纽约（Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier,New York）。总体而言，对于在限定的离子强度和pH值下的具体序列，高严格杂交和洗涤条件被选择为比热熔点低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的目标子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
[0115] 热熔点是50%的目标序列与完全匹配的探针杂交时温度（在限定的离子强度和pH值下）。极严格条件被选择为等于对于具体探针的Tm。对于在南方或北方印迹中在过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的一个实例是在42℃下，含1mg肝素的50%甲酰胺，其中将杂交进行过夜。高度严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃下，持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下，0.2x SSC洗涤，持续15分钟（关于SSC缓冲液的说明，参见萨姆布鲁克，以下）。经常，高严格度洗涤之前会先进行低严格度洗涤，以去除背景探针信号。对例如超过100个核苷酸的双链体进行中等严格度洗涤的一个实例是在45℃下，1x SSC，持续15分钟。对例如超过100个核苷酸的双链体进行低严格度洗涤的一个实例是在40℃下，4-6x SSC，持续15分钟。对于短探针（例如，大约10到50个核苷酸），严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地约0.01到1.0M的Na离子浓度（或其他盐类），在pH7.0到8.3下，并且该温度典型地是至少约
30℃。还可以通过加入去稳定试剂（如甲酰胺）来实现严格条件。总体而言，在具体的杂交检验中，信噪比是针对非相关的探针所观测到的2倍（或更高）指示检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白是实质上一致的，则它们仍然是实质上一致的。例如，当使用遗传密码所允许的最大程度的密码子简并而生成一个核酸拷贝时发生这种情况。
30℃。还可以通过加入去稳定试剂（如甲酰胺）来实现严格条件。总体而言，在具体的杂交检验中，信噪比是针对非相关的探针所观测到的2倍（或更高）指示检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白是实质上一致的，则它们仍然是实质上一致的。例如，当使用遗传密码所允许的最大程度的密码子简并而生成一个核酸拷贝时发生这种情况。
[0116] “植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。
[0117] “植物细胞”是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或培养细胞的形式，或作为高等组织化单位（如植物组织、植物器官或整株植物）的一部分。
[0118] “植物细胞培养物”意指植物单元（如例如原生质体，细胞培养物细胞、处于不同的发育阶段的植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及胚中的细胞）的培养物。
[0119] “植物材料”或“从植物可获得的植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
[0120] “植物器官”是植物的一个独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
[0121] 如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。结合如以上列出的任何具体类型的植物组织或由这个定义涵盖的其他植物组织或在不存在其时使用这个术语并不打算排除任何其他类型的植物组织。
[0122] 发明详细说明
[0123] 本发明涉及新颖的南瓜植物，这些南瓜植物对马铃薯Y病毒属感染具有抗性，并且因而避免遭受由这种病原体所致的损害。本发明还涉及制造和使用这些植物的方法。
[0124] 根据本发明的植物可以通过杂交两个或更多个亲本基因型来获得，这些基因型中的至少一个可以具有一个或多个等位基因，特别是对马铃薯Y病毒属抗性有贡献的相应位点处的一个或多个等位基因，该一个或多个等位基因缺乏其他亲本基因型或补充其他基因型以获得根据本发明和如在此描述的植物。如果多于一个位点对抗性性状的表达有贡献并且两个原始的亲本基因型不提供整组等位基因，则育种群体中可以包括其他来源。其他亲本基因型可以贡献令人希望的性状，包括市场所需求的作物品质。
[0125] 亲本基因型可以彼此杂交以产生后代种子。亲本基因型可以是通过从田间选择的杂合植物利用不受控制的或开放的授粉进行自体受精并且使用轮回选择程序发育而成的近交系。使出众的植物自体受精并且在继代中加以选择。在这些继代中，作为自体授粉和选择的结果，杂合条件为同质株系提供途径。利用近交的继代，植物在后代植物内变得越来越纯合和均一。典型地，可以实践自体受精和谱系选择的五到七代或更多代（F1到F2；F3到F4；F4到F5）以获得植物和种子特征均一并且在持续自体受精下仍将均一的近交系。
[0126] 在近交的过程中，杂合位点处的许多不希望的等位基因将被更有利的等位基因置换，并且从后代中消除不利的或不希望的等位基因。此外，通过基于标记的选择，可以使有利的等位基因的数目最大化，其中鉴定更不利的等位基因并且相继用更有利的等位基因置换。
[0127] 在一个方面，根据本发明的植物可以通过使来自祖先植物（特别是野生祖先植物）的能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子渗入到栽培的南瓜植物（特别是栽培的西葫芦植物）中来获得。
[0128] 在本发明的一个具体实施例中，可以从中获得能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的野生祖先是野生中国南瓜，特别是野生中国南瓜尼日利亚变种，或来自包含所述遗传决定子的其后代或祖先。在替代方案中，根据本发明的马铃薯Y病毒属抗性性状（该性状向表达这个性状的植物提供对马铃薯Y病毒属感染，优选地对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的1个或多个的抗性）可以从西葫芦栽培品种268NiW（它的代表性种子被以登录号NCIMB41727保存在NCIMB），或从西葫芦栽培品种268NiW的包含能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的后代或祖先获得。
[0129] 因此，在本发明的一个具体实施例中，对马铃薯Y病毒属抗性性状有贡献的亲本基因型是一种近交系，它具有本发明所保存的西葫芦栽培品种268NiW的相关特性，即，在与马铃薯Y病毒属抗性相关联的位点处实质上相同的基因组构造，西葫芦栽培品种268NiW的种子样品已经在2010年6月14日以登录号NCIMB41727保存在NCIMB。西葫芦栽培品种268NiW对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV具有抗性。抗性是由遗传决定子Zn、Ni+、W1以及W2提供。这些决定子在268NiW中是纯合隐性遗传的。这些决定子在多个基因背景之间是可转移的。抗性检验已证明，这些遗传决定子在这些不同的背景（例如黄南瓜）中继续提供针对马铃薯Y病毒属的广谱抗性。对不同的马铃薯Y病毒属病毒株的抗性水平示于表2中。当用马铃薯Y病毒属攻击植物时，具有所有4个遗传决定子的有益作用示于表2和图10中。
[0130] 为确定近交系的实用性和它遗传上对杂种后代有贡献的潜能，与另一近交系进行测试杂交，并且对所得后代在表型上进行评估。
[0131] 在本发明的另一具体实施例中，对抗性性状有贡献的亲本基因型是一种杂种，它具有本发明所保存的西葫芦栽培品种268NiW的相关特性，即，在与马铃薯Y病毒属抗性相关联的位点处实质上相同的基因组构造，西葫芦栽培品种268NiW的种子样品已经在2010年6月14日以登录号NCIMB41727保存在NCIMB。
[0132] 西葫芦栽培品种268NiW是由野生中国南瓜尼日利亚变种作为马铃薯Y病毒属抗性性状的供体与西葫芦近交系杂交产生的。将这次杂交的马铃薯Y病毒属抗性后代与不同基因背景的其他近交系杂交以最终获得西葫芦栽培品种268NiW。
[0133] 因此，西葫芦栽培品种268NiW或包含能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的任何其他植物株系可以被用作源材料，用于使所述抗性性状渗入到任何所希望的基因背景中以获得根据本发明对马铃薯Y病毒属感染具有高度抗性的南瓜植物，可以进一步包括一个或多个令人希望的性状，如市场所需求的作物品质性状。除了作物品质以外，还有农艺学上重要的特征，如例如良好的植物构造、高产量以及对病原体的基本抗性。
[0134] 基于本发明的描述，拥有如在此描述的西葫芦栽培品种268NiW（它的样品已经被以登录号NCIMB41727保存在NCIMB有限公司）或包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的其后代或祖先的技术人员不难使用本领域中众所周知的育种技术将本发明的所述至少一个遗传决定子转移到不同的类型的其他南瓜植物。本发明的性状可以例如被转移到其他南瓜属。因此，在一个实施例中，本发明的植物是能够抗马铃薯Y病毒属感染的南瓜植物。在本发明的一个实施例中，使南瓜植物生长以获得（杂种）种子或用于商业南瓜生产。
[0135] 因此，在另一实施例中，本发明披露一种将根据本发明的至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子转移到缺乏所述性状的南瓜植物的方法，包括a)获得包括所述性状的植物；b)使它与缺乏所述性状的植物杂交；c)获得步骤b)的杂交的植物；d)选择根据本发明的能够抗马铃薯Y病毒属感染的步骤c)的植物。在一个实施例中，该方法进一步包括e)使由步骤d)产生的植物与南瓜植物回交，和f)选择根据本发明的能够抗马铃薯Y病毒属感染的南瓜植物。在一个实施例中，该方法进一步包括获得一种根据本发明能够抗马铃薯Y病毒属感染的近交南瓜植物，并且在一个实施例中，该方法进一步包括使所述近交南瓜植物与另一南瓜植物杂交以产生一种根据本发明的能够抗马铃薯Y病毒属感染的杂种南瓜植物。在一个实施例中，如在此描述，南瓜植物是通过确定存在或不存在马铃薯Y病毒属来选择。在一个实施例中，包括所述性状的步骤a)的植物是西葫芦栽培品种268NiW（它的代表性种子被以登录号NCIMS41727保存在NCIMB）或所述植物的后代或祖先。
[0136] 还可以使用标记辅助育种来鉴定出包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性和/或侧接如在此所描述的标记位点或与其连锁的标记位点的遗传决定子的那些个体。
[0137] 基于标记的选择可能已经被用于近交发育的早期阶段，经常与很大程度上基于可以在视觉上确定并且涉及与植物用于商业杂种生产的适合性相关的关键性能指标的表型特征的筛选方法组合。选择还可以基于分子标记，这些分子标记可能与或可能不与感兴趣的性状连锁。
[0138] 特别地，基于标记的选择可以与表型选择组合或在表型选择之后应用以鉴定其中之前在此描述的所有本发明相关位点都具有有利的纯合基因型的那些个体。
[0139] 有若干类型的分子标记可以被用于基于标记的选择，包括但不限于限制片段长度多态性（RFLP）、多态性DNA的随机扩增（RAPD）以及扩增的限制片段长度多态性（AFLP）。
[0140] RFLP涉及在具体的短限制部位使用限制酶来切割染色体DNA，由这些部位之间的复制或缺失或这些限制部位处的突变产生多态性。
[0141] RAPD利用低严格度聚合酶链反应（PCR）扩增与具有任意序列的单一引物来产生匿名DNA片段的病毒株特异性阵列。该方法仅需要很少的DNA样品并且分析大量的多态性位点。
[0142] AFLP需要在使用PCR和引物中的选择性核苷酸扩增具体片段之前用限制酶消化细胞DNA。利用这种方法、目测所获得的片段的技术，可以针对每个引物组合测量多达100个多态性位点，并且每一测试仅需要少量的DNA样品。
[0143] SSR分析是基于广泛分布在真核生物的基因组中的微卫星DNA（短重复）序列，将这些序列选择性地扩增以检测简单序列重复中的变化。SSR分析仅需要很少的DNA样品。SNP使用可有效地获得点突变的PCR延伸检验。该程序每份样品需要极少DNA。在典型的基于标记的选择育种计划中可以使用上述方法中的一种或两种。
[0144] 实现了跨越植物基因组多态性区的核苷酸片段的扩增的最优选的方法使用聚合酶链反应（“PCR”）（穆利斯等人，冷泉港定量生物学讨论会51:263-273（1986）（Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.BioI.51:263273(1986)）），它使用了包括一个正向引物和一个反向引物的成对引物，这些引物能够呈其双股形式与界定了多态性的邻近序列杂交。
[0145] 可以使用替代方法来扩增片段，如“连接酶链反应”（“LCR”）（巴拉尼，美国国家科学院院刊88:189-193（1991）（Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.SA)88:189193(1991)），它使用两对寡核苷酸探针来指数扩增具体目标。每一对寡核苷酸的序列经过选择以允许这一对与该目标的同一股的邻接序列杂交。这种杂交形成了模板依赖性连接酶的底物。正如PCR，如此所得产物在随后的循环中充当模板，并且获得所希望的序列的指数扩增。
[0146] 可以利用具有多态性部位的同一股的近端和远端序列的寡核苷酸来进行LCR。在一个实施例中，任一寡核苷酸将被设计成包括多态性的实际多态性部位。在这种实施例中，选择反应条件以使得寡核苷酸仅在目标分子包含或缺乏与寡核苷酸上存在的多态性部位互补的特异性核苷酸的情况下可以被连接在一起。作为替代方案，可以选择寡核苷酸以使得它们不包括多态性部位（参见赛格（Segev），PCT申请WO90101069）。
[0147] 可以作为替代方案使用的另一方法是“寡核苷酸连接检验”（“OLA”）（兰德格伦等人，科学241:1077-1080（1988）（Landegren et aI.,Science241:10771080(1988)））。OLA方案使用了被设计成能够与目标的单股的邻接序列杂交的两个寡核苷酸。如同LCR，OLA特别适合于检测点突变。然而，不同于LCR，OLA获得目标序列的“线性”而非指数扩增。
[0148] 可以作为替代方案使用的再另一方法是“侵入式检验”，它使用结构特异性片状核酸内切酶（FEN）来裂解由等位基因特异性重叠寡核苷酸与包含单一核苷酸多态性（SNP）部位的目标DNA杂交而形成的三维复合物。使与目标分子中的SNP等位基因互补的寡核苷酸退火通过热稳定性FEN裂解而触发寡核苷酸的裂解。裂解可以通过若干不同的方法来检测。最常见的是，裂解产物在荧光共振能量转移（FRET）盒上触发二次裂解反应以释放荧光信号。作为替代方案，裂解可以通过使用荧光偏振（FP）探针或通过质谱分析直接地检测。裂解反应具有高度特异性，具有低失败率，并且可以检测10-21摩尔量的目标DNA。尽管该检验在传统上已被用于每次反应查询一份样品中的一个SNP，但经过测试，新颖的基于芯片或基于珠粒的途径已使其成为一种适于多路高通量SNP基因型分析的有效而精确的检验。
[0149] 尼克森（Nickerson）等人已经描述了一种核酸检测检验，它组合了PCR和OLA的属性（尼克森等人，美国国家科学院院刊87:8923-8927（1990））。在这种方法中，PCR被用于实现目标DNA的指数扩增，然后使用OLA检测。
[0150] 基于在具有所得“二寡核苷酸”的序列的核酸的存在下连接两个（或更多个）寡核苷酸，从而扩增该二寡核苷酸的方案也是已知的（吴等人，基因组4:560569（1989）（Wu et al.,Genomics4:560569(1989)）），并且可以针对本发明的目的被容易地改适。
[0151] 在一个实施例中，分子标记是通过PCR扩增的一个DNA片段，例如SSR标记或RAPD标记。在一个实施例中，经过扩增的DNA片段的存在或不存在表明性状自身或该性状的特定等位基因的存在或不存在。在一个实施例中，经过扩增的DNA片段的长度差异表明性状的特定等位基因的存在，并且因而使得能够区分性状的不同等位基因。
[0152] 在本发明的一个具体实施例中，SNP标记被用于鉴定亲本植物和/或其祖先中以及由所述亲本植物的杂交产生的后代植物中的能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的本发明遗传决定子。SNP标记是通过端点读数Taqman技术可检测的，并且除了特定正向和反向引物序列以外，还可以使用探针（例如，如在此所披露）来检测每一标记位点处的R和/或S等位基因的存在。所以，所披露的基因标记中的每一个是由四个而不是仅两个序列构成：扩增目标区的正向和反向引物以及鉴定目标SNP的两个探针。
[0153] 在本发明中，与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离的本发明的一个或多个DNA标记可以在PCR中用由以下构成的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0154] i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0155] ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0156] iii.正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0157] iv.正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测，
[0158] 所述引物在一个PCR反应中产生一种扩增产物，它展现了基本上与在一个利用一致的成对引物的PCR反应中从西葫芦栽培品种268NiW可获得的相应PCR扩增产物一致的分子量或核苷酸序列，或可以被视为该相应PCR扩增产物的等位基因，西葫芦栽培品种268NiW的样品已经被以登录号NCIMB41727保存在NCIMB有限公司。
[0159] 在第一个步骤中，DNA或cDNA样品是通过使用已知的技术提取DNA或RNA而从合适的植物材料，如叶组织获得。然后，侧接一个包含在此披露的能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的基因组区域内的SNP的区域的引物被用于使用聚合酶链反应（PCR）法来扩增DNA样品。
[0160] 在替代方案中，所希望的等位基因的存在或不存在可以通过使用双股DNA染料的实时PCR或荧光报告探针法来确定。
[0161] 标记分析可以在植物发育早期使用从极幼小植物的叶组织或从种子提取的DNA样品来进行。这允许在育种周期的早期鉴定具有令人希望的基因组成的植物并且在授粉之前丢弃不包含所希望的发明相关等位基因的植物，因而减小育种群体的大小并且降低表型分析的要求。
[0162] 此外，通过使用分子标记，可以区分在能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的至少一个遗传决定子处携带所希望的发明相关等位基因的两份拷贝的纯合植物与仅携带一份拷贝的杂合植物和不包含有利等位基因的任何拷贝的植物。
[0163] 因而，可以因此发展替代标记并用于鉴定和选择根据本发明并且如在此所披露的具有质量性状位点的等位基因或一组等位基因的植物。例如，可以获得通过以下方式获得的扩增产物的核苷酸序列：在PCR扩增中使用由以下组成的一个PCR寡核苷酸引物对：
[0164] i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0165] ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0166] iii.正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0167] iv.正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测，
[0168] 并且基于PCR扩增产物的新确定的核苷酸序列来设计新引物或成对引物。此外，根据本发明和之前在此披露的标记可以在南瓜或其他物种的基因图谱上定位，并且相同或同源或直接同源区域中的已知标记作图可以被用作发展新标记的起点。
[0169] 因此，本发明中明确披露的标记还可以被用于鉴定和/或发展新的或附加的与对马铃薯Y病毒属的抗性相关联的标记，这些新的或附加的标记然后又可以被用于标记辅助育种和/或寻找侧接马铃薯Y病毒属抗性位点的重组体，和/或精细作图，和/或克隆马铃薯Y病毒属抗性位点。
[0170] 有若干种可利用的方法或办法，它们可以被用于鉴定和/或发展呈连锁不平衡和/或与感兴趣的区域连锁和/或位于感兴趣的区域中的标记，以及代表着引起马铃薯Y病毒属抗性性状的实际因果突变的标记。在不十分全面的情况下，一些途径包括：
[0171] -在杂交途径中使用所披露的序列/标记来鉴定感兴趣的区域中的其他序列。
[0172] -在PCR途径中使用所披露的序列/标记来鉴定感兴趣的区域中的其他序列。
[0173] -在PCR途径中使用所披露的序列/标记来鉴定感兴趣的区域中的其他序列。
[0174] -在作图和/或比较作图途径中使用所披露的序列/标记来鉴定相同区域中的标记（在其他图谱上定位所述至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子）。
[0175] -在“通过计算机进行的”途径中使用所披露的序列/标记来鉴定附加的序列/标记/（候选）基因。
[0176] -在物理作图途径中使用所披露的序列/标记（在物理作图或基因组序列上定位所述遗传决定子）。
[0177] -使用所披露的序列/标记在其他（物理）图谱或基因组上定位所述至少一个遗传决定子。
[0178] -使用所披露的序列/标记选择适当的个体，允许通过基因途径鉴定感兴趣的区域中的标记。
[0179] -使用所披露的信息寻找（位置上的）候选基因。
[0180] 对于基因型分析、作图或关联作图，DNA是从合适的植物材料，如例如叶组织中提取。具体来说，收集多个植物的大批叶子。使用多种多态性SSR、SNP或覆盖整个南瓜基因组的任何其他合适的标记类型对DNA样品进行基因型分析。
[0181] 基因型和表型数据的联合分析可以使用标准软件来进行。可以针对在此披露的相应的至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子处的等位基因，基于与所述至少一个遗传决定子连锁的标记位点处的标记或已知位于同一染色体上的任何其他标记的核苷酸序列和这些等位基因的分子量，使用在此披露的或本领域的普通技术人员已知的一种或多种技术来筛选植物引种和种质。
[0182] 标记、连锁标记或在此披露的至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的核酸序列可以通过技术人员已知的方法来确定。例如，可以从马铃薯Y病毒属抗性供体植物中，通过破碎所述植物的基因组并且选择具备一个或多个指示所述至少一个遗传决定子的标记的那些片段来分离出包括所述至少一个遗传决定子或其抗性赋予部分的核酸序列。随后，或作为替代方案，指示所述抗性位点的标记序列（或其部分）可以被用作（PCR）扩增引物，以便从获自所述植物的基因组核酸样品或基因组片段扩增包含所述抗性位点的一个或多个核酸序列。所述至少一个遗传决定子和/或其中包含的任何附加标记的核苷酸序列可以通过标准测序方法来获得。
[0183] 因此，本发明还涉及一种分离的核酸（优选地为DNA但不限于DNA）序列，它包括本发明的至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子或其抗性赋予部分。因而，所披露的标记可以被用于从南瓜或其他蔬菜作物中鉴定和分离一个或多个与马铃薯Y病毒属抗性连锁或编码马铃薯Y病毒属抗性的标记或基因。
[0184] 与本发明的所述至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子连锁的附加标记的核苷酸序列还可以例如通过确定与所述至少一个遗传决定子相关联的一个或多个标记的核苷酸序列，并且针对所述标记的所述序列设计引物，然后所述引物可以被用于进一步确定所述标记外部的序列来解析。例如，在此披露的SNP标记或预计在所述至少一个遗传决定子的区域中和/或与所述区域连锁的任何其他标记的核苷酸序列可以通过本领域中众所周知的方法对所述标记的PCR扩增产物进行测序，或作为替代方案在一个PCR中使用所述标记序列或用作杂交探针以通过例如但不限于BAC筛选来鉴定连锁的核苷酸序列来获得。
[0185] 种子保存详情
[0186] 2010年6月14日根据布达佩斯条约（the Budapest Treaty）的规定以先正达公司（Syngenta Participations AG）的名义将以下种子样品保存在英国苏格兰阿伯丁郡AB219YA贝克斯伯恩的克莱伯斯通庄园弗格森大厦的NCIMB（Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,Scotland,UK）：
[0187] NCIMB41726西葫芦栽培品种PP415
[0188] NCIMB41727西葫芦栽培品种268NiW
[0189] 本发明的实施例
[0190] 1.一种栽培的南瓜属植物，优选地西葫芦，包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的1个或多个的抗性的遗传决定子。
[0191] 2.根据实施例1的植物，其中所述遗传决定子是从中国南瓜，优选地中国南瓜尼日利亚变种可获得的。
[0192] 3.根据实施例1或2的植物，其中所述遗传决定子是以一种纯合状态存在。
[0193] 4.根据实施例1到3的植物，包含至少一个所述能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染的抗性的遗传决定子。
[0194] 5.根据实施例1到3的植物，包含至少两个所述能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染的抗性的遗传决定子。
[0195] 6.根据实施例1到3的植物，包含至少四个所述能够指导或控制对马铃薯Y病毒属感染，优选地对ZYMV和MWMV感染的抗性的遗传决定子。
[0196] 7.根据任何前述实施例的植物，其中
[0197] a)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0198] b)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的两个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，这些标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0199] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0200] c)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0201] 8.根据任何前述实施例的植物，其中
[0202] a)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0203] b)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的两个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，这些标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0204] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0205] c)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在西葫芦栽培品种268NiW基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0206] 9.根据任何前述实施例的植物，其中
[0207] a)该遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0208] b)该遗传决定子与标记位点W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0209] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0210] c)该遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段在所述植物基因组中将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0211] 10.根据任何前述实施例的植物，其中该（这些）遗传决定子是隐性遗传的。
[0212] 11.根据任何前述实施例的植物，其中该植物是一种非转基因南瓜植物。
[0213] 12.根据任何前述实施例的植物，其中该植物是一个近交系、一个双单倍体或一个杂种。
[0214] 13.根据任何前述实施例的植物，其中该植物是雄性不育的。
[0215] 14.一种植物材料，是从根据任何前述实施例的植物中可获得的，包括但不限于叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或该植物的任何其他部分或产物，该植物材料仍展现一种马铃薯Y病毒属抗性表型，特别是当生长成一个植物时。
[0216] 15.根据任何前述实施例的植物的多个植物部分，包括但不限于植物种子、植物器官（如例如根、茎、叶、花蕾或胚等）、胚珠、花粉小孢子、植物细胞、植物组织、植物细胞培养物（如例如原生质体、细胞培养物细胞、处于不同的发育阶段的植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及胚中的细胞等）；这些植物部分仍展现一种马铃薯Y病毒属抗性表型，特别是当生长成一个植物时。
[0217] 16.一种根据任何前述实施例的南瓜植物的种子，该种子能够生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。
[0218] 17.根据实施例16的种子，其中所述种子是杂种种子。
[0219] 18.根据实施例17的种子，被以登录号41727保存在NCIMB有限公司。
[0220] 19.一种实施例16到18的种子的用途，用于生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物。
[0221] 20.一种用于检测南瓜植物中能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的试剂盒，其中所述试剂盒包括能够扩增与该遗传决定子连锁的DNA标记的一个PCR寡核苷酸引物或一个PCR寡核苷酸引物对，并且其中所述DNA标记可以在一个PCR中用选自以下的一个PCR寡核苷酸引物对进行扩增：
[0222] a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0223] b)正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0224] c)正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0225] d)正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0226] 21.一种DNA标记，与能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子连锁并且可以在一个PCR中用选自以下的一个PCR寡核苷酸引物对进行扩增：
[0227] a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0228] b)正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0229] c)正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0230] d)正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0231] 22.根据实施例21的任何一种DNA标记的用途，用于诊断性选择南瓜中一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子。
[0232] 23.根据实施例21到22所述的任何一种DNA标记的用途，用于鉴定植物中一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的存在和/或用于监测南瓜中该能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的基因渗入。
[0233] 24.多核苷酸，是用以下方式可获得的：在一个PCR中通过用选自以下的一个PCR寡核苷酸引物对扩增一个DNA片段：
[0234] a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0235] b)正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0236] c)正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0237] d)正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测，
[0238] 所述多核苷酸包含在统计上相关并且因而与一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子遗传连锁的一种DNA标记，并且其中所述多核苷酸相应于在一个PCR中利用相同的成对引物从西葫芦栽培品种268NiW可获得的一种扩增产物，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，其条件是，对应的标记位点仍存在于所述西葫芦栽培品种268NiW植物中，和/或可以被视为其等位基因。
[0239] 25.一种多核苷酸，与实施例24的多核苷酸的序列具有至少90%、特别是至少95%、特别是至少96%、特别是至少97%、特别是至少98%、特别是至少99%序列一致性。
[0240] 26.一种多核苷酸，展现与实施例25的多核苷酸的核苷酸序列杂交的一种核苷酸序列。
[0241] 27.一种用于将至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子引入到缺乏所述遗传决定子的南瓜植物中的方法，包括：
[0242] a)获得一个根据任何一个前述实施例的第一南瓜植物；
[0243] b)使所述第一南瓜植物与一个第二南瓜植物杂交，其中所述第二南瓜植物缺乏所述等位基因；以及
[0244] c)鉴定一种由该杂交产生的展现增加的对马铃薯Y病毒属的抗性并且包含至少一个与所述马铃薯Y病毒属抗性共分离的DNA标记的植物；以及
[0245] d)任选地，分离所述植物；以及
[0246] e)任选地，使所述植物与该第一或第二南瓜植物回交。
[0247] 28.一种用于获得根据任何前述实施例的植物的种子的方法，包括以下步骤：
[0248] a)获得一个根据任何一个前述实施例的第一南瓜植物；
[0249] b)使所述第一南瓜植物与一个第二南瓜植物杂交，其中所述第二南瓜植物缺乏所述遗传决定子；以及
[0250] c)鉴定一种由该杂交产生的展现增加的对马铃薯Y病毒属的抗性并且包含至少一个与所述马铃薯Y病毒属抗性共分离的DNA标记的植物；以及
[0251] d)从所述杂交收获包含至少一个与所述马铃薯Y病毒属抗性共分离的DNA标记的后代种子。
[0252] 29.根据实施例27或28中任何一个的方法，其中在步骤c)中，一种由该杂交产生并且包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的植物可以在PCR中通过用选自以下的一个PCR寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：
[0253] a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0254] b)正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0255] c)正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0256] d)正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0257] 30.根据实施例29的方法，其中确定一个或多个成对引物的扩增产物的片段尺寸。
[0258] 31.一种用于产生对马铃薯Y病毒属，优选地对MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的1个或多个展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
[0259] a)选择一种包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0260] i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0261] ii.正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0262] iii.正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0263] iv.正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测；和/或
[0264] v.一种正向和反向引物，它能够鉴定与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离的一个标记位点；
[0265] b)使步骤a)的所述植物与一种易感染马铃薯Y病毒属或对至少一种所述马铃薯Y病毒属展现中等抗性水平的南瓜植物杂交；以及
[0266] c)从所述杂交中选择一个后代，该后代对马铃薯Y病毒属展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的所述至少一个标记位点分离。
[0267] 32.根据实施例31的用于产生对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一展现抗性的南瓜植物的方法，包括以下步骤：
[0268] a)选择一种包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子的南瓜植物，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与对马铃薯Y病毒属的抗性共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0269] i.如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0270] ii.如果该标记位点为W1，则为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；和/或
[0271] iii.如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；
[0272] iv.如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测；
[0273] b)使步骤a)的所述植物与一种易感染马铃薯Y病毒属或对至少一种所述马铃薯Y病毒属展现中等抗性水平的南瓜植物杂交；以及
[0274] c)从所述杂交中选择一个后代，该后代对马铃薯Y病毒属展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的所述至少一个标记位点分离。
[0275] 33.根据实施例31或32的方法，其中步骤a)中选择的该植物包含至少两个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子；并且步骤c)中选择的该后代展现一种马铃薯Y病毒属抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的两个标记位点分离。
[0276] 34.根据实施例31或32的方法，其中步骤a)中选择的该植物包含至少三个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV的抗性的遗传决定子；并且步骤c)中选择的该后代对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV展现一种抗性表型，并且其中所述抗性表型与步骤a)的这些标记位点分离。
[0277] 35.根据任何前述实施例31到34的方法，其中步骤a)的该供体植物是一种任何前述实施例1到13的植物。
[0278] 36.根据实施例31到35的方法，包括使步骤c)中获得的该病毒抗性植物与步骤b)的该易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步骤。
[0279] 37.一种用于产生对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜的杂种种子的方法，包括[0280] a)种植一个雄性不育雌性植物和一个雄性能育植物，其中所述雄性不育雌性植物或雄性能育植物之一是一种根据任何前述实施例1到13的植物，
[0281] b)在两个株系之间实现异花授粉，
[0282] c)使该植物生长直到座果，
[0283] d)收集这些果实；以及
[0284] e)获得这些杂种种子。
[0285] 38.一种用于获得马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物的方法，包括
[0286] a)通过任何前述实施例的方法获得任何前述实施例的植物或；
[0287] b)使所述植物与一种易感染马铃薯Y病毒属的植物或中等抗性南瓜植物杂交；
[0288] c)挽救由步骤b)的该杂交产生的一个胚；
[0289] d)从步骤c)的所述胚再生出一种植物；以及
[0290] e)选择对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一具有抗性的步骤d)的一种植物。
[0291] 39.一种用于获得对马铃薯Y病毒属具有抗性的南瓜果实的方法，包括
[0292] a)播种一种根据任何前述实施例中的任何一个的或通过根据任何前述实施例中的任何一个的方法获得的植物的种子；以及
[0293] b)使所述植物生长以便产生果实，并且收获由所述植物产生的该果实。
[0294] 40.一种能够指导或控制对马铃薯Y病毒属的抗性的遗传决定子，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的，其中
[0295] a)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点ZN遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV和PRSV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；和/或
[0296] b)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子中的至少一个互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点W1和/或W2遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种MWMV抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；
[0297] 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；和/或
[0298] c)该遗传决定子与西葫芦栽培品种268NiW中所存在的相应遗传决定子互补，该西葫芦栽培品种268NiW的代表性种子以登录号NCIMB41727保存在NCIMB，所述相应遗传决定子与标记位点Ni+遗传连锁，该标记位点与马铃薯Y病毒属抗性性状，优选地与一种ZYMV抗性性状，更优选地与一种ZYMV病毒株Nivir抗性性状共分离，并且可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增DNA片段将其鉴定：正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0299] 41.一种鉴定包含至少一个能够指导或控制对马铃薯Y病毒属，优选地对ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遗传决定子的南瓜植物的方法，其中所述遗传决定子是从西葫芦栽培品种268NiW的基因组中可获得的并且与至少一个标记位点遗传连锁，该至少一个标记位点与所述马铃薯Y病毒属抗性表型中的至少一种共分离，并且可以在PCR中用包括以下的至少一个PCR寡核苷酸引物对将其鉴定：
[0300] i.如果该标记位点为ZN，则为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，随后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8进行检测；或
[0301] ii.如果该标记位点为W1，则为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4，随后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10进行检测；或
[0302] iii.如果该标记位点为W2，则为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，随后用SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12进行检测；或
[0303] iv.如果该标记位点为Ni+，则为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14，随后用SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16进行检测。
[0304] 42.得自根据任何一个前述实施例的南瓜植物的马铃薯Y病毒属抗性繁殖材料的用途，用于生长成一种马铃薯Y病毒属抗性南瓜植物以便产生果实并且收获所述果实。
[0305] 实例
[0306] 实例1
[0307] 南瓜中与ZYMV和MWMV抗性基因紧密连锁的标记的发现
[0308] 1.1材料
[0309] 出于标记发现的目的，从中国南瓜尼日利亚栽培品种产生多个能分离出ZYMV（R株系[PP452]x S株系[TOSCA]）和MWMV（S株系[PP477]x R株系[PP477/(PP415/(PP419/(尼日利亚/PP432)]）抗性基因的F2群体并且取样；并且对应地针对ZYMV和MWMV抗性对它们的相应F3后代进行表型分析。
[0310] 通过对由相应于不同的类型和市场区隔的96个南瓜株系和品种组成的多样性验证小组进行基因型分析来评估发展的检验的预计值。
[0311] 1.2标记发现
[0312] 对具有相反的抗性和易感表型的不同F2DNA池进行群体分离分析（Bulked Segregant Analysis，BSA），该分析使用随机扩增多态性DNA（RAPD）标记（得自加利福尼亚州阿拉米达的奥佩隆技术公司（Operon technologies,Alameda,Calif.）和加拿大温哥华的英属哥伦比亚大学（University of British Columbia,Vancouver,Canada））。在F2群体的个别成员中对从BSA筛选鉴定的候选标记（RAPD带显示F2R和S群体之间明显的存在/不存在模式）进一步测试连锁；并且选择最紧密连锁的标记用于更具特异性的检验发展。
[0313] 对于ZYMV，选择在F2群体中显示与ZYMV抗性表型完美相关（共分离）的单一RAPD标记OPBB09_451用于Taqman端点读数（EPR）检验的发展。
[0314] 对于MWMV，在两个不同位点（QTL）对与MWMV抗性表型相关的RAPD标记进行作图，并且选择最佳标记OPAR13_507和UBC385_656，它们显示对应地与QTL1和QTL2最高关联（连锁）。
[0315] 对于Ni+，通过将这两个群体再测序来进行BSA。已经将所获得的读数与南瓜的参考序列进行比对，并且已经检测到SNP。然后选择最紧密连锁的SNP用于进行更具特异性的Taqman EPR检验发展。
[0316] 1.3Taqman EPR检验发展
[0317] 根据乙酸钾+蛋白酶K方案分离所有植物DNA。对于等位基因测序，在所选择的RAPD候选片段的5'和3'端设计多达3种不同的PCR引物组合。使用来自抗性和易感株系小组的株系获得这些标记的PCR产物和DNA序列。
[0318] Taqman EPR检验发展是基于在序列小组中发现的等位基因特异性SNP。EPR检验发展是根据标准指南来进行，包括对不同的PCR混合物、DNA浓度和退火温度进行测试。探针是FAM-MGB和VIC-MGB Taqman探针（欧洲基因技术公司（Eurogentec））。
[0319] 1.4Taqman EPR检验方案
[0320] 1.用标准DNA提取乙酸钾+蛋白酶K方案来分离DNA基因组。最后，获得150μl DNA溶液。
[0321] 2.将模板DNA稀释到1/15。
[0322] 3.将4μl每一个被稀释的DNA样品吸移到单独的384PCR板的孔中。
[0323] 4.将该板盖上并离心，并且放在冰上。
[0324] 5.制造母液混合物。每次反应如下：
[0325]蔬菜项目混合物Platinum 体积（μl） 最终浓度
Platinum缓冲液10x 1 1x
MgCl250mM 0.6 3mM
dNTP10mM（各2.5mM） 0.8 0.8mM（各0.2mM）
Taq platinum5U/μl 0.066 0.33U
ZN R等位基因VIC-MGB-NFQ探针10μM 0.1 100nM
ZN S等位基因FAM-MGB-NFQ探针10μM 0.1 100nM
ZN正义引物12.5μM 0.16 200nM
ZN反义引物12.5μM 0.16 200nM
ROX50x 0.1 0.5x
Qsp H2O 2.914
总体积 6
Platinum缓冲液10x 1 1x
MgCl250mM 0.6 3mM
dNTP10mM（各2.5mM） 0.8 0.8mM（各0.2mM）
Taq platinum5U/μl 0.066 0.33U
ZN R等位基因VIC-MGB-NFQ探针10μM 0.1 100nM
ZN S等位基因FAM-MGB-NFQ探针10μM 0.1 100nM
ZN正义引物12.5μM 0.16 200nM
ZN反义引物12.5μM 0.16 200nM
ROX50x 0.1 0.5x
Qsp H2O 2.914
总体积 6
[0326] 6.将6μl母液混合物添加到每一个PCR板孔（其中已含有4μl模板DNA）中。
[0327] 7.短暂地旋转。
[0328] 8.将该384板装载在PCR机上。
[0329] 9.基于ABI GENEAMP PCR9700-384板格式的PCR计划如下：
[0330] 2分钟，94℃
[0331] 15秒，94℃
[0332] 1分钟，60℃
[0333] 40X
[0334] 5分钟，72℃
[0335] 10.在AB17900上对该板进行读数。
[0336] 1.5EPR检验引物和探针序列
[0337] 1.5.1.ZYMV-尼日利亚
[0338] 正向引物：5'AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3'（SEQ ID NO:1）
[0339] 反向引物：5'CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3'（SEQ ID NO:2）
[0340] 抗性等位基因特异性探针：FAM-CACTTCCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:7）[0341] 易感等位基因特异性探针：VIC-CACTTTCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:8）[0342] Ni+
[0343] 正向引物：5'TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3'（SEQ ID NO:13）
[0344] 反向引物：5'GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3'（SEQ ID NO:14）
[0345] 抗性等位基因特异性探针：FAM-AGTTGCGACTTTCCA-MGB-NFQ（SEQ ID NO:15）[0346] 易感等位基因特异性探针：TET-AGTTGCGACTTTTCATT-MGB-NFQ（SEQ ID NO:16）[0347] 1.5.2.MWMV-尼日利亚
[0348] 1.5.2.1QTL1
[0349] 正向引物：5'GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3'（SEQ ID NO:3）
[0350] 反向引物：5'GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3'（SEQ ID NO:4）
[0351] 抗性等位基因特异性探针：FAM-TCATTGCACCCAACATG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:9）[0352] 易感等位基因特异性探针：VIC-TCATTGCACTCAACATGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:10）[0353] 1.5.2.1QTL2
[0354] 正向引物：5'TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3'（SEQ ID NO:5）
[0355] 反向引物：5'TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3'（SEQ ID NO:6）
[0356] 抗性等位基因特异性探针：FAM-TTTGTTTGCTTGAGCTGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:11）[0357] 易感等位基因特异性探针：VIC-TTTGTTCGATTGAGCTGG-MGB-NFQ（SEQ ID NO:12）[0358] 实例2
[0359] 疾病测试方案
[0360] 2.1方案的使用
[0361] 以下方案可适用于南瓜以及南瓜属和黄瓜（黄瓜属）上的所有病毒（CMV、ZYMV、WMV、MWMV）。
[0362] 2.2病毒株的保存
[0363] 将新被感染的叶子（1g）称重。然后用解剖刀将这些叶子细细地切碎并且放在纸质称重托盘上。将该称重托盘放在一个包含无水氯化钙的皮氏培养皿（55mm）上。用石蜡膜将盒子密封。在盒子上指示病毒株的名称、保存日期以及所制备的新鲜叶子的重量，并且记录盒子的数目。将这些盘子保持在冰箱中的抽屉“蔬菜”中。
[0364] 2.3来自脱水制剂的病毒的增殖
[0365] 在一个或多个陶罐中播种易感品种。当植物处于“子叶”阶段时，由脱水制剂进行接种（参见下文，测试物的接种）。在1周到10天之后，第一症状将会出现，并且处于该病毒最具侵袭性的阶段。
[0366] 2.4接种物的制备
[0367] 从陶罐中挑出被感染的嫩叶。对于1克叶子，准备0.1克煤和4cc缓冲溶液。在添加该煤和最后添加该缓冲溶液之前，将这些叶子弄碎。将金刚砂撒到该混合物中。利用1克新鲜叶子，可以接种2到3个陶罐（1陶罐=80到100个植物）。
[0368] 2.5测试物的接种
[0369] 将这些接种物放在一个冰床上。在子叶阶段对这些植物进行接种。用这些接种物摩擦这些子叶，必要时每小时更新该溶液。在干燥15分钟之后，然后给该植物浇水。第一次读数可以在接种之后5到6天时进行。然后可以在7到10天之后进行第二次读数以证实并且完善信息。为了结束测试，将叶子密封在塑料袋中并且放在生物废物中。进行该测试的最佳温度条件是日间25℃±2°和夜间20℃±2°。
[0370] 2.6大事记
[0371] 第0-8天 增殖的陶罐的播种
[0372] 第0-2天 陶罐的接种
[0373] 第0天 测试物的播种
[0374] 第0+6天 测试物的接种
[0375] 第0+14天 读数的开始
[0376] 第0+30天 测试物的破坏
[0377] 实例3
[0378] 对夏南瓜（西葫芦）进行马铃薯Y病毒属病理学测试的指南
[0379] 3.1评级指南
[0380] 以下指南被用于确定叶子和果实上的ZYMV、WMV、PRSV、MWMV感染的程度。从第3叶阶段直到成熟植物阶段（具有植物学上成熟的果实），自始至终对作物进行读数、评估以及评级。
[0381] 根据以下指南在从1到9的量表上进行评级，其实例示于图1到9中。
[0382] 表1马铃薯Y病毒属测试的指南
[0383]
[0384] 表2.基于若干筛选对保存株系268Niw的评级
[0385] 对于ZYMV和WMV，区分这些病毒株的轻度和严重形式。
[0386]
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