玉米转殖项5307
阅读：741发布：2022-12-08
专利汇可以提供玉米转殖项5307专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在此披露了一种新颖的被命名为5307的转基因玉米转殖项。本 发明 涉及被插入到玉米基因组中的重组构建体的DNA序列以及位于导致该5307转殖项的插入位点侧翼的基因组序列的DNA序列。本发明进一步涉及用于检测5307的DNA序列的存在的测定法，涉及包含5307的基因型的玉米 植物 以及玉米 种子 ，并且涉及通过将包含该5307基因型的玉米植物与自身或另一种玉米品种进行杂交用来产生玉米植物的方法。，下面是玉米转殖项5307专利的具体信息内容。
1.源于转殖项(event)5307转基因玉米植物的核酸分子，其中所述植物包含连接到玉米基因组DNA序列上的插入的核酸序列，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5、及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，其中所述核酸分子包含编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因、编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，且包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
2.多核苷酸引物对，包括第一多核苷酸引物以及第二多核苷酸引物，在样品中源于包括玉米转殖项5307的转基因玉米植物细胞的DNA模板的存在下它们一起起作用从而产生对于玉米转殖项5307是诊断性的扩增子，其中所述玉米转殖项5307含有插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因、编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5、及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，其中该第一多核苷酸引物包含来自如SEQ ID NO：5中所列出的位置1-1348的至少10个连续核苷酸，SEQ ID NO：6中所列出的位置1-1093的至少10个连续核苷酸，或它们的互补物，并且其中该第二多核苷酸引物包含来自如SEQ ID NO：7中所列出的位置1-6206的至少10个连续核苷酸，或它们的互补物。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14，或它们的互补物。
4.根据权利要求2所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72，或它们的互补物。
5.根据权利要求2所述的多核苷酸引物对，其中该第二多核苷酸引物包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68，以及它们的互补物。
6.在包含玉米核酸的样品中检测对于源于转殖项5307转基因玉米植物的DNA独特的核酸分子的存在的方法，其中所述植物包含插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该方法包括：
a)从玉米中分离核酸分子；
b)将该核酸分子与核酸引物序列对SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72与SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68，或它们的互补物相组合；
c)进行核酸扩增反应，这产生扩增子；以及
d)对该扩增子进行检测。
7.在包含玉米核酸的样品中检测对于源于转殖项5307转基因玉米植物的DNA独特的核酸分子的存在的方法，其中所述植物包含插入的核酸序列并且SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：
2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该方法包括：
a)从玉米中分离核酸分子；
b)将该核酸分子与核酸引物序列对SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：89，分别地连同它们的探针序列SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：87以及SEQ ID NO：90一起进行组合；
c)进行核酸扩增反应，这产生包含该探针的扩增子；以及
d)对该探针进行检测。
8.DNA分子，包括由权利要求6或7所述的方法生产的扩增子。
9.从转殖项5307玉米植物、种子、组织、或细胞的生物样品中得到的提取物，其中所述转殖项5307包含插入的核酸序列，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因和编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，其中所述提取物包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的提取物，其中该序列用核酸扩增或核酸杂交方法在该提取物中是可检测的。
11.如权利要求9所述的提取物，其中该样品选自由下列各项组成的组：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类。
12.一种培育包含转殖项5307的昆虫控制性状的玉米植物的方法，其中所述转殖项
5307含有插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，其中所述转殖项5307遗传连接到分子标记或其互补物上，其中所述分子标记是使用SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：102或它们的互补物进行鉴定的。
13.对于转殖项5307的昆虫控制性状标记辅助选择的方法，其中所述转殖项5307含有插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该方法包括：
a)从玉米中分离核酸分子；
b)将该核酸分子与核酸引物序列对和探针SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：102或它们的互补物相组合；
c)进行核酸扩增反应，这产生扩增子；
d)对该扩增子进行检测；以及
e)为了培育抗昆虫玉米的目的选择植物。
14.生产对鞘翅目昆虫具有抗性的杂交玉米植物的方法，包括以下步骤：
a)播种第一近交玉米植物的种子，以及具有与该第一近交玉米植物不同基因型的第二近交玉米植物的种子；
b)培养所述第一和第二玉米植物直至产生花；
c)将在该第一亦或该第二近交玉米系开花(flowing)的时间产生的所述花去雄；
d)用该去雄近交植物的花粉将未去雄的植物进行授粉导致杂交玉米；以及
e)收获所产生的杂交玉米种子。
15.权利要求14的方法，其中所述第一近交玉米植物的种子为被保藏为ATCC登录号PTA-9561的种子。
16.检测样品中存在相应于源于转殖项5307玉米植物的DNA的核酸分子的方法，其中所述植物包含插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该方法包括：
a)将样品与包括核苷酸序列SEQ ID NO：7的探针进行接触，该探针在高严谨条件下与来自玉米转殖项5307的基因组DNA杂交并且在高严谨条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；
(b)使该样品以及探针经受高严谨杂交条件；以及
(c)检测该探针与该DNA的杂交。
17.用于检测生物样品中存在来源于转殖项5307玉米植物的核酸的试剂盒，其中所述植物包含插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该试剂盒包括至少一种DNA分子，该DNA分子包括足够长度的连续核苷酸，该DNA分子是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：
4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或与其互补，该DNA分子作为对于玉米转殖项
5307具有特异性的DNA引物或探针而起作用。
18.核苷酸序列，其包含位于染色体5上的用于靶向整合的玉米染色体靶位点和异源核酸，其中所述染色体靶位点在SEQ ID NO：103的核苷酸1与核苷酸161,752之间。
19.根据权利要求18所述的核苷酸序列，其中所述靶位点位于SEQ ID NO：103的核苷酸
75,908和75,946之间。
20.根据权利要求18所述的核苷酸序列，其中所述靶位点的5′侧翼是SEQ ID NO：103的核苷酸55,980至75,908，并且3′侧翼是SEQ ID NO：103的核苷酸75,946至95,946。
21.检测样品中存在相应于源于转殖项5307转基因玉米(maize)植物的DNA的核酸分子的方法，其中所述植物包含插入的核酸序列并且包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述插入的核酸序列包括编码FR8a杀虫蛋白质的FR8a基因，编码PMI选择性标记蛋白质的pmi基因，其中所述插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，所述玉米基因组DNA序列位于所述插入的异源DNA序列的末端的侧翼，其中所述插入的核酸序列从5′至3′为右边缘区域、CMP启动子、FR8a基因、NOS终止子、ZmUbInt启动子、PMI基因、NOS终止子、和左边缘区域，且5′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：5，及3′侧翼植物基因组序列包括SEQ ID NO：6，其中所述右边缘区域至所述左边缘区域包括在SEQ ID NO：7中，该方法包括：
a)将样品与探针进行接触，该探针在高严谨条件下与来自玉米转殖项5307的基因组DNA杂交并且在高严谨条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；
(b)使该样品和探针经受高严谨杂交条件；以及
(c)检测该探针与该DNA的杂交；
其中探针包括选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，和SEQ ID NO：4组成组的序列。
22.权利要求21的方法，其中探针包括SEQ ID NO：1。
23.权利要求21的方法，其中探针包括SEQ ID NO：2。
玉米转殖项5307
发明领域
[0001] 本发明总体上涉及植物分子生物学、植物转化，以及植物育种的领域。更具体地说，本发明涉及包含一个新颖的转基因基因型的抗昆虫的转基因玉米植物并涉及检测样品及其组合物中玉米(corn)植物DNA的存在的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 植物害虫是在全世界重要农作物损失中的一个主要因素。由于非哺乳动物害虫(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。玉米根虫的多个种被认为是最具破坏性的玉米害虫。重要的根虫害虫种类包括西方玉米根虫(Diabrotica vlrgifera vlrgifera)、北方玉米根虫(D.longicornis barberi)、南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi)、以及墨西哥玉米根虫(D.vlrgifera zeae)。
[0004] 玉米根虫主要是由密集施用化学杀虫剂来控制的。由此可以达到好的玉米根虫的控制，但这些化学品有时也能影响有益的生物。由化学杀虫剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗药性昆虫品种。通过各种抗药性管理实践已部分地缓和了这一状况，但对可替代的虫害控制策略仍有不断增加的需求。一种这样的替代方案包括在转基因植物中表达编码杀虫蛋白的外来基因。这种方法已经提供了一种保护以免受选定昆虫害虫侵袭的有效方法，并且表达杀虫毒素的转基因植物已经被商业化，这允许农业工作者减少化学杀虫剂的应用。
[0005] 植物中外来基因的表达可以被它们的染色体位置所影响，这可能是由于染色质结构或转录调节元件的紧密地接近于整合位点(参见，例如，Weising et al，1988，″Foreign Genes in Plants，″Ann.Rev.Genet.22：421-477)。因此，通常的做法是生产几百种不同的转殖项(event)并且筛选这些转殖项得出单个的转殖项，该单个的转殖项具有对于商业目的所希望的转基因表达水平和模式。一个具有希望的转基因表达水平或模式的转殖项对于使用常规育种方法通过有性远交将该转基因渗入至其他遗传背景中是有用的。这样杂交的子 代保持该原始转化体的转基因表达特性。使用这一策略来确保在许多已很好地适应了当地生长条件的品种中可靠的基因表达。
[0006] 它将有利地能够检测出特殊转殖项的存在，以便确定有性杂交的子代是否包含一种感兴趣的转基因。另外，检测一种特定的转殖项的一个方法有助于遵循条例，这些条例要求例如上市前批准以及源自重组农作物植物的食品标签。这有可能通过任何熟知的核酸检测方法检测出转基因的存在，该检测方法包括但不限于使用多核苷酸引物的热扩增(聚合酶链式反应(PCR))或者使用核酸探针的DNA杂交。典型地，为了用于检测特异DNA构建体(该DNA构建体已被用于转化不同的植物品种)的试剂和方法学的简易性和一致性，这些检测方法一般集中于频繁使用的遗传元件上，例如，启动子、终止子以及标记基因，因为对于许多DNA构建体而言，该编码序列区域是可互换的。结果，此类方法对于仅在编码序列上不同的构建体之间进行区分可能是无用的。此外，此类方法对于在不同转殖项之间进行区分可能是无用的，特别是使用同样的DNA构建体所产生的那些，除非邻近该插入的异源DNA的染色体DNA的序列(“侧翼DNA”)是已知的。
[0007] 本发明包括一种抗昆虫转基因玉米转殖项，该转殖项已经将一个FR8a基因结合到它的基因组中，这披露于2008年10月9日公开的国际公开号WO 08/121633中，该专利通过引用结合在此，该基因编码一个FR8a杀昆虫毒素，该毒素在控制叶甲属(Diabrotica spp.)种类的昆虫害虫方面是有用的。该转基因玉米转殖项还已经将PMI基因结合到它的基因组中，该基因编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)，这披露于美国专利号5,767,378中，该专利通过引用结合在此，该酶作为选择性标记是有用的，这允许该植物利用甘露糖作为碳源。本发明进一步包括新的分离的核酸序列，这些序列对于该转基因玉米转殖项是独特的，对于鉴定该转基因玉米转殖项以及对于检测生物样品中的来自转基因玉米转殖项的核酸、以及多种试剂盒是有用的，这些试剂盒包括用于检测在生物样品中的这些核酸所必需的试剂。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及转基因玉米转殖项(命名为5307)，该转殖项包括新的转基因基因型，该基因型包括FR8a基因以及PMI基因，该PMI基因对应地将昆虫耐受性以及利用甘露糖作为碳源的能力赋予该5307玉米转殖项及其子 代。本发明还提供了包括本发明的基因型的转基因玉米植物、来自包括本发明的基因型的转基因玉米植物的种子、以及通过将包括本发明的基因型的玉米近交系与自身或不同基因型的另一种玉米系进行杂交来生产包括本发明的基因型的转基因玉米植物的方法。除了通过本发明的新型基因型给予这些玉米植物的特征之外，本发明的转基因的玉米植物可能基本上具有对应的同基因的非转基因玉米植物的所有形态学及生理学特征。本发明还提供了用于检测在生物样品中来自转殖项5307的核酸类的存在的组合物以及方法，这是基于插入至该玉米基因组的产生该5307转殖项的重组体表达盒的DNA序列，以及位于插入点侧翼的基因组序列的DNA序列。该5307转殖项可以通过分析FR8a以及PMI蛋白的表达水平以及通过测试抗玉米根虫的效能来进一步表征。
[0010] 根据一个方面，本发明提供了一种优选地分离的核酸分子，该核酸分子包括被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少10个连续核苷酸以及在被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组DNA的至少10个连续核苷酸。根据这个方面的优选地分离的核酸分子可以包括被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少20个或至少50个连续核苷酸以及在被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组DNA的至少20或至少50个连续核苷酸。
[0011] 根据另一个方面，本发明提供了优选地分离的核酸分子，该核酸分子包括选自下组的转殖项5307的至少一个连接序列，该组由下列各项组成：SEQID NO：1和SEQ ID NO：2，以及它们的互补物。连接序列跨越包含被插入到该玉米基因组中的表达盒的异源DNA与来自插入点侧翼的玉米基因组的DNA之间的接点，并且对于5307转殖项是诊断性的。
[0012] 根据另一个方面，本发明提供了一种优选地分离的核酸，该核酸将一种异源DNA分子连接至玉米转殖项5307中的玉米植物基因组中，该转殖项包含从约11至约20个连续核苷酸的序列，该序列选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，以及它们的互补物。
[0013] 根据另一个方面，本发明提供了优选地分离的核酸分子，该核酸分子包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，以及它们的互补物。
[0014] 根据本发明的另一个方面，提供了包括本发明的核酸分子的扩增子。
[0015] 还根据本发明的另一个方面，提供了用于检测转殖项5307的侧翼序列引物。这类侧翼序列引物包括优选地分离的核酸序列，该核酸序列包括来自如SEQ ID NO：5中所列出的核苷酸1-1348的至少10-15个连续核苷酸(在此任意地命名为5′侧翼序列)，或它们的互补物(还被披露为SEQ ID NO：111)。在这个方面的一个实施方案中，该侧翼序列引物是选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：14，以及它们的互补物。
[0016] 在本发明的另一个方面，这些侧翼序列引物包括优选地分离的核酸序列，该核酸序列包括来自如SEQ ID NO：6中所列出的核苷酸1-1093的至少10-15个连续核苷酸(在此任意地命名为3′侧翼序列)，或它们的互补物。在这个方面的一个实施方案中，该侧翼序列引物是选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72，以及它们的互补物。
[0017] 根据本发明的另一个方面，提供了例如对于核酸扩增有用的引物对。这类引物对包括第一引物，该引物包括至少10-15个连续核苷酸长度的核苷酸序列，该核苷酸序列是上述基因组侧翼序列(SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6)或与之互补；以及第二引物，该引物包括被插入到该转殖项5307基因组中的异源DNA的至少10-15个连续核苷酸的核苷酸序列。该第二引物优选地包括核苷酸序列，该核苷酸序列邻近于如SEQ ID NO：7中所列出的植物基因组侧翼DNA序列的插入序列或与之互补。在这个方面的一个实施方案中，该插入序列引物是选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68，以及它们的互补物。
[0018] 根据本发明的另一个方面，提供了检测在生物样品中存在相应于转殖项5307的DNA的方法。这类方法包括：(a)使包含DNA的样品与引物对(当这些引物被用在由来自玉米转殖项5307的基因组DNA进行的核酸扩增反应中时)进行接触，产生扩增子，该扩增子对于玉米转殖项5307是诊断性的；(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；以及(c)对该扩增子进行检测。在这个方面的一个实施方案中，该扩增子包含选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的互补物。
[0019] 根据另一个方面，本发明提供了检测生物样品中存在相应于该5307转殖项的DNA的方法。这类方法包括：(a)使包含DNA的样品与一种探针进 行接触，该探针在高严谨条件下与来自玉米转殖项5307的基因组DNA杂交并且在高严谨条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样品以及探针经受高严谨杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。该被检测的杂交的DNA序列包括下列各项的至少一个多核苷酸序列，包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的互补物。
[0020] 根据本发明的另一个方面，提供了试剂盒用来检测在生物样品中的转殖项5307核酸。该试剂盒包括至少一个DNA序列，该序列包括足够长的多核苷酸，该多核苷酸是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或与其互补，其中该DNA序列作为与来自转殖项5307的分离的DNA杂交的引物或探针是有用的，并且当扩增样品中的核酸序列或与其杂交随后对该扩增子或与该目标序列的杂交进行检测时，这些引物或探针是对于样品中存在来自转殖项5307的核酸序列是诊断性的。该试剂盒进一步包括使核酸杂交或者扩增方法能够完成的必需的其他材料。
[0021] 在另一个方面，本发明提供了检测生物样品中玉米转殖项5307蛋白的一种方法，包括：(a)从玉米转殖项5307组织的样品中提取蛋白；(b)使用免疫方法来测定该提取的蛋白，该方法包括对于由该5307转殖项产生的杀虫性或选择性标记蛋白特异性的抗体；以及(c)检测所述抗体与该杀虫性或选择性标记蛋白的结合。
[0022] 在另一方面，本发明提供了从转殖项5307玉米植物、组织、或种子得到的一种生物样品，其中该样品包括核酸，该核酸包括核苷酸序列，该序列是选自下组的序列或与其互补，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2，并且该序列在该样品中使用核酸扩增或核酸杂交的方法是可检测的。在这个方面的一个实施方案中，该样品选自下组，该组由下列各项组成：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。
[0023] 在另一个方面，本发明提供了从包含一种核苷酸序列的转殖项5307玉米植物、组织、或种子得到的提取物，该序列是选自下组的核苷酸序列或与其互补，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2。在这个方面的一个实施方案中，在该提取物中该序列用一种核酸扩增或核酸杂交的 方法是可检测的。在这个方面的另一个实施方案中，该样品选自下组，该组由下列各项组成：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。
[0024] 根据本发明的另一个方面，提供了包括本发明的核酸分子的玉米植物以及种子。在本发明的一个实施方案中，转殖项5307玉米种子的保存物是根据2008年10月15日的布达佩斯条约存放到美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所述种子的样品被存放为ATCC登录号：
PTA-9561。
PTA-9561。
[0025] 根据另一个方面，本发明提供了用于生产至少抗玉米根虫侵染的玉米植物的一种方法，包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交，其中该第一或第二亲本玉米植物包括玉米转殖项5307DNA，由此产生大量的第一代子代植物；(b)选择第一代子代植物，该植物至少是抗玉米根虫侵染的；(c)将该第一代子代植物自交，由此产生大量的第二代子代植物；(d)从该第二代子代植物中选择植物，该植物至少是抗玉米根虫侵染的；其中该第二代子代植物包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4。
[0026] 然而根据另一个方面，本发明提供了用于生产玉米种子的方法，包括将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行杂交，并且收集得到的第一代玉米种子，其中该第一或第二亲本玉米植物是本发明的近交玉米植物。
[0027] 根据另一个方面，本发明提供了生产杂交玉米种子的一种方法，包括以下步骤：(a)播种根据本发明的第一近交玉米系的种子以及具有不同基因型的第二近交玉米系的种子；(b)培养从所述种子得到的玉米植物直至开花的时间；(c)将这些玉米近交系之一的玉米植物的花去雄；(d)允许发生其他近交系的授粉，以及(e)收获由此生产的杂种种子。
[0028] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了选择染色体5上包括转殖项5307的核酸分子的玉米植物以及种子的方法。在本发明的一个实施方案中，使用了多态性标记来选择或跟踪对于5307玉米转殖项特异性的序列。本发明提供了选择对于5307玉米转殖项特异性的序列的方法，包括以下步骤：(a)对多态性标记序列进行检测；(b)为了检测该标记的目的设计测定法；(c)在来自多个玉米系的玉米核酸序列上运行该测定法；以及(d)基于具有对于玉米转殖项5307具有特异性的核苷酸的序列来选择玉米系。
[0029] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了染色体5上的位点用于靶向整合异源核酸。本发明提供了选择对于5307玉米转殖项特异的用于靶向整合的序列的方法，包括以下步骤：(a)基于该插入位点或载体序列来设计同源序列；(b)在目标基因座处使用这些同源序列；(c)使用锌指核酸酶从而在该目标基因座处产生断裂；以及(d)将异源供体分子插入对于玉米转殖项5307特异的核苷酸或pS YN12274的载体序列中。这种技术的一个实例被证明于Shukla等人（Nature vol.459,21May2009）中。
[0030] 本发明一方面涉及制备转基因玉米植物的方法，包括将异源核酸插入在染色体5上的位置处，该位置位于umcl475分子标记与uazl90分子标记之间。另一方面，在所述的方法中，其中所述异源核酸被插入到染色体5上，位于在SEQ ID NO:103的核苷酸75,908与75,946之间。在一方面，在所述的方法中，其中所述被插入的异源核酸的5'侧翼是SEQ ID NO:
103的核苷酸5,454至25,454，并且3'侧翼是SEQ ID NO:103的核苷酸25,513至45,513。
103的核苷酸5,454至25,454，并且3'侧翼是SEQ ID NO:103的核苷酸25,513至45,513。
[0031] 本发明上述以及其他方面将从以下详细说明中变得更清楚。
[0033] SEQ ID NO:1是5'基因组-插入片段接点。
[0034] SEQ ID NO:2是3'插入片段-基因组接点。
[0035] SEQ ID NO:3是5'基因组+插入片段序列。
[0036] SEQ ID NO:4是3'插入片段+基因组序列。
[0037] SEQ ID NO:5是5'基因组+插入片段序列。
[0038] SEQ ID NO:6是3'玉米基因组侧翼序列。
[0039] SEQ ID NO:7是转殖项5307全长插入片段。
[0040] SEQ ID NO:8-14是本发明中有用的5'侧翼序列引物。
[0041] SEQ ID NO:15-68是本发明中有用的5307转基因插入片段引物。
[0042] SEQ ID NO:69-72是本发明中有用的3'侧翼序列引物。
[0043] SEQ ID NO:73-75是FR8a TAQMAN引物以及探针。
[0044] SEQ ID NO:76-78是PMI TAQMAN引物以及探针。
[0045] SEQ ID NO:79-81是ZmAdh TAQMAN引物以及探针。
[0046] SEQ ID NO:82-90是本发明中有用的5307转殖项特异性引物以及探针。
[0047] SEQ ID NO:91-102是本发明中有用的玉米基因组引物以及探针。
[0048] SEQ ID NO:103是AC202955染色体5序列，其中N是任何碱基（“A”、“T”、“G”或“C”）。
[0049] SEQ ID NO:104是umcl475标记区域。
[0050] SEQ ID NO:105-106是umcl475引物。
[0051] SEQ ID NO:107是uazl90标记区域。
[0052] SEQ ID NO:108-109是uazl90引物。
[0053] SEQ ID NO:110是SEQ ID NO:103（AC202955染色体5序列）的反向互补物，其中N是任何碱基（“A”、“T”、“G”或“C”）。
[0054] SEQ ID NO:111是5'玉米基因组侧翼序列。
[0056] 图1说明了被命名为pSYN12274的一个植物表达载体。该质粒图谱鉴定出用于Southern分析的Smal和Pmel限制性位点。
[0057] 图2是一个绘制的图谱，该图说明了这些元件的结构，这些元件包括被插入到玉米的基因组中以产生转殖项5307的异源核酸序列，并且列出了多个相对位置，在这些位置处这些被插入的核酸序列被连接到玉米基因组DNA序列上，这些玉米基因组DNA序列位于这些被插入的异源DNA序列的末端的侧翼。l=5'侧翼植物基因组（SEQ ID NO:5）；2=右边缘区域；3=CMP启动子；A=FR8a基因：5=NOS终止子；6=ZmUbINT启动子；I=PMI基因；8=NOS终止子；9=左边缘区域（区段2至9被包含在SEQ IDNO:7中）；并且10=3'侧翼植物基因组（SEQ ID NO:6）。
[0058] 定义
[0059] 提供了下列定义和方法以更好地定义本发明并且指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另作说明，此处所使用的术语应根据相关领域的那些普通技术人员的常规用法来理解。在分子生物学中普通术语的定义还可以在Rieger et al.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5ss edition,Springer-Verlag:New York,1994中找到。
[0060] 如在此所使用的，术语“扩增的”是指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核苷酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应（PCR）系统、连接酶链式反应（LCR）系统、基于核酸序列的扩增（NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario）、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统（TAS），以及链置换扩增（SDA）。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications,D.H.Persing et al,Ed.,American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1993)。扩增产物被称为扩增子。
[0061] “生物样品”是一种植物、植物材料或包括植物材料的产品。术语“植物”旨在包括玉米(玉蜀黍)植物组织(处于任何成熟阶段)，以及从任何一个这样的植物取得或得到的细胞、组织、器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如在此所使用的“植物材料”是指从植物获得或衍生的材料。包括植物材料的产品涉及食物、饲料或使用植物材料来生产的或可以被植物材料污染的(contaminated)其他产品。应当理解的是在本发明的上下文中是针对对于玉米转殖项5307特异的核酸的存在(暗示样品中存在核酸)来测试这样的生物样品。因此，在此提到的用来鉴定生物样品中的玉米转殖项5307的方法涉及鉴定生物样品中的核酸，这些核酸来自转殖项5307玉米植物并且对于转殖项5307是诊断性的。
[0062] “编码序列”是被转录成RNA的核酸序列，例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA。优选地，该RNA然后在生物体中被翻译以产生蛋白质。
[0063] 此处所用的“检测试剂盒”是指用来在样品中检测来自转殖项5307玉米植物的DNA存在或不存在的一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的核酸探针和引物(它们在高严谨的条件下特异性地与靶DNA序列杂交)以及使核酸杂交或者扩增方法能够完成所必要的其他材料。
[0064] 如此处所用，术语转基因的“转殖项”是指一种通过用异源DNA(例如，包括感兴趣的基因的表达盒)转化和再生单个的植物细胞而产生的重组植物。术语“转殖项”是指包含该异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“转殖项”也指在该转化体与另一个玉米系之间通过有性远交而产生的子代。即使在重复回交至轮回亲本后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。通常，植物组织的转化产生多个转殖项，每个转殖项代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组的不同位置上。基于该转基因的表达或其他希望的特征，选择了特殊的转殖项。因此，如在此使用的“转殖项5307”、“5307转殖项”、或“5307”是指初始的5307转化体和/或5307转化体的子代，包括从其得到的任何植物。
[0065] 如在此使用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引特殊核苷酸序列的表达的一种核酸分子，包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列(其可操作地连接到终止信号上)上的启动子。它还典型地包含正确翻译该核苷 酸序列所需的序列。该表达盒还可以包含一些在感兴趣的核苷酸序列的直接表达中不是必需的但是由于方便的限制位点为了从表达载体去除该表达盒而存在的序列。包含该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合体的，意味着它的至少一个组分相对于它的至少一个其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以在对异源表达有用的重组体形式而获得的。然而，典型地，该表达盒对于该宿主是异源的，即，该表达盒的特殊核酸序列不是天然发生在该宿主细胞内，且必须是通过本领域已知的转化方法被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可能是在组成型启动子或由诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特殊的外界刺激时才引发转录。在多细胞生物体的情况下，例如一种植物，该启动子还可以对特殊组织、或器官、或者发育阶段是特异的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的序列”或者“插入序列”。
[0066] “基因”是定义的区域，该区域位于基因组之内并且，除了前述的编码核酸序列之外，它包含其他(主要是调控性的)负责编码部分的表达(也就是转录和翻译)的控制的核酸序列。基因也可包含其他5′和3′未转译序列以及终止序列。其他可能存在的元件是，例如，内含子。
[0067] “感兴趣的基因”是指任何基因，当被转移至植物时，它赋予该植物一种所希望的特征，例如抗生素抗性、病毒抗性、抗虫性、抗病性，或者其他害虫抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值，在工业过程改进的性能或者改变的繁殖能力。“感兴趣的基因”还可以是这样基因，该基因被转入植物用来在该植物中生产商业上有价值的酶或代谢产物。
[0068] 如在此使用的“基因型”是由亲本玉米植物遗传的遗传物质，并不是所有这些遗传物质都必然地表达在后代玉米植物中。该5307基因型是指转化进植物的基因组的异源遗传物质以及位于插入序列侧翼的遗传物质。
[0069] “异源”核酸序列是这样核酸序列，该序列与将其引入的宿主细胞并非天然相关联，包括天然发生的核酸序列的非天然发生的多个拷贝。
[0070] “同源”核酸序列是与将其引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。
[0071] 当术语“分离的”用于与核酸相关时，是指这样核酸序列，该核酸序列从至少一个污染物核酸中被鉴定并且分离出来，该污染物核酸通常是以其天然来源与该核酸序列相结合的。分离的核酸是以与其在自然界中被发现的不同 的一种形式或设置而存在的。相比之下，未分离的核酸(例如DNA和RNA)发现处于它们自然存在的状态下。分离的核酸可以是位于转基因植物中并且仍然被认为是“分离的”。
[0072] “可操作地连接”是指在单一核酸片段上多个核酸序列的关联，这样使得一个的功能影响另一个的功能。例如，当启动子能够影响编码序列或者功能RNA的表达时(即，该编码序列或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码序列或者功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码序列能够与调节序列可操作地连接。
[0073] 如在此使用的“引物”是分离的核酸，它们通过核酸杂交被退火为互补靶DNA链，以在该引物与该靶DNA链之间形成杂交，然后通过一种聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着该靶DNA链延长。多对或多组引物可以用于一种核酸分子的扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他常规的核酸扩增方法。
[0074] “探针”是分离的核酸分子，一种常规的可检测的标记或报道分子附接到该核酸分子上，例如一种放射性同位素、配体、化学发光体试剂或者酶。这样一种探针与一种靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自玉米转殖项M5307的基因组DNA的一条链互补。转殖项5307的基因组DNA可以是来自玉米植物或来自样品，该玉米植物或样品包括来自该转殖项的DNA。根据本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包含与靶DNA序列特异地结合并且可以用来检测靶DNA序列的存在的聚酰胺类以及其他探针材料。
[0075] 通常这些引物和探针的长度是在10至15个核苷酸之间或更长，这些引物和探针还可以长度是在至少20个核苷酸或更长，或至少25个核苷酸或更长，或长度是在至少30个核苷酸或更长。这类引物和探针在高严谨杂交条件下特异地与靶序列杂交。根据本发明的引物和探针可能具有与该靶序列互补的完整序列，虽然与该靶序列不同并保留与该靶序列杂交的能力的探针可通过常规方法进行设计。
[0076] “严谨条件”或“严谨杂交条件”包括在其下一种探针与它的靶序列杂交的所指条件，以达到比其他序列更高的可检出程度。严谨条件是靶序列依赖的，并取决于多核苷酸的结构而不同。通过控制该杂交和/或洗涤条件的严谨度，能够鉴定与该探针(同源探查)100％互补的靶序列。可替代地，可调 整严谨条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探查)。更长的序列在更高温度下特异地杂交。在“Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier：New York；以及Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel et ai，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience：New York(1995)，并且还有Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(5thEd.Cols Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)”中找到了对于核酸杂交的广泛指导。
[0077] 特异性典型地是杂交后洗涤的功能，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。通常，对于处于定义的离子强度和PH值条件下的特异序列，高严谨杂交和洗涤条件被选择为比热熔点(Tm)约低5℃。Tm是50％的该靶序列与一种完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和PH值条件下)。典型地，在高严谨调节下，一种探针将与它的靶子序列杂交，而不与其他序列杂交。
[0078] 对于互补核酸(这些互补核酸在Southern印迹或Northern印迹的滤纸上具有多于100个互补残基)的杂交的高严谨杂交条件的一个实例是50％甲酰胺与1mg肝素，在42℃进行杂交过夜。非常高严谨的洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃下约洗涤15分钟。高严谨洗涤条件的一个实例是0.2x SSC洗涤，在65℃下进行15分钟(参见，Sambrook，下文，对于SSC缓冲液的描述)。
[0079] 本发明的示例性杂交条件包括在7％SDS、0.25M NaPO4、pH 7.2、67℃条件下杂交过夜，然后在5％SDS、0.20M NaPO4、pH 7.2、65℃条件下洗涤两次，每次30分钟，并在1％SDS、0.20M NaPO4、pH7.2、65℃条件下洗涤两次，每次30分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链核苷酸的示例性的中等严谨洗涤是1x SSC，在45℃进行15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链核苷酸的示例性的低严谨洗涤是4-6x SSC，在40℃进行15分钟。
[0080] 对于约10至50个核苷酸的探针，高严谨条件典型地涉及在pH 7.0至8.3下小于约1.0M Na离子的盐浓度，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30℃。高严谨条件还可以通过 加入去稳定试剂(例如甲酰胺)来实现。一般而言，相比于不相关的探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的信噪比就表明检测到特异的杂交。如果它们编码的蛋白质基本相同，则在高严谨条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本相同的。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成核酸的拷贝时，则发生这种情况。
[0081] 以下是可以被用于杂交与本发明的参考核苷酸序列基本上相同的核苷酸的示例性的多组杂交/洗涤条件：在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA下一个参考核苷酸序列优选地与该参考核苷酸序列杂交，在50℃下在2X SSC、0.1％SDS中进行洗涤，更优选地在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA下杂交，在50℃下在1X SSC、0.1％SDS下进行洗涤；并且更希望地在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA下杂交，在50℃下在0.5X SSC、0.1％SDS下进行洗涤；优选地在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA下杂交，在50℃下在0.1X SSC、0.1％SDS下进行洗涤；更优选地在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、
1mM EDTA下杂交，在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS下进行洗涤。本发明的这些序列可以使用所有以上条件进行检测。为了定义本发明的目的，使用了高严谨条件。
1mM EDTA下杂交，在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS下进行洗涤。本发明的这些序列可以使用所有以上条件进行检测。为了定义本发明的目的，使用了高严谨条件。
[0082] “转化”是将异源核酸引入至一种寄主细胞或生物体中的过程。具体地说，“转化”是指将DNA分子稳定整合进感兴趣的生物体的基因组中。
[0083] “转化的/转基因的/重组的”是指已经引入了异源核酸分子的宿主生物体，例如细菌或植物。该核酸分子能够被稳定地整合进入该宿主的基因组中或者该核酸分子也能作为染色体外的分子而存在。这样染色体外的分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应理解为不仅包含转化过程的最后产物，还包含其转基因的子代。“非转化的”、“非转基因的”，或“非重组的”宿主是指一种野生型生物体，即，一种细菌或植物，它不包含异源核酸分子。如在此所使用的，“转基因的”是指一种植物、植物细胞、或多个具有结构或没有结构的植物细胞，这些细胞通过熟知的基因操作和基因插入技术已将代表感兴趣的基因的核酸整合进该植物基因组中，并典型地整合进细胞核的染色体中、线粒体或其他包含染色体的细胞器中(在与天然植物或植物细胞中正常存在的位点不同的一个位点处或以多于在天然植物或植物细胞中正常 存在的拷贝数)。转基因植物来自这种核酸序列的操作和插入(与天然发生的突变相反)，以产生一种非天然发生的植物或具有一种非天然发生的基因型的植物。植物和植物细胞的转化技术在本领域是熟知的，并可能包含例如电穿孔、显微注射、土壤杆菌属介导的转化、以及基因枪转化(ballistic transformation)。
[0084] 在此使用了如在37C.F.R.§1.822中对于DNA碱基和氨基酸给出的命名法。
[0085] 发明详述
[0086] 本发明涉及一种遗传改进的玉米系，该玉米系产生昆虫控制蛋白质FR8a、以及允许该植物利用甘露糖作为碳源的磷酸甘露糖异构酶(PMI)。本发明特别涉及被命名为转殖项5307(包含新型基因型)的转基因玉米转殖项，以及检测在生物样品中的来自这个转殖项的核酸的组合物以及方法。本发明进一步涉及包含该转殖项5307基因型的玉米植物，涉及来自该玉米植物的转基因种子，以及涉及通过将包含该转殖项5307基因型的玉米近交体与其自身或与另一种玉米系进行杂交而产生包含该转殖项5307基因型的一种玉米植物的方法。包括本发明的转殖项5307基因型的玉米植物在控制鞘翅目昆虫害虫方面是有用的，这些昆虫害虫包括西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera，western com rootworm)、墨西哥玉米根虫(D.virgifera zeae，Mexican com rootworm)、以及北方玉米根虫(D.longicornis barber i，northern corn rootworm)。包括本发明的转殖项5307基因型的玉米植物还能够利用甘露糖作为碳源。
[0087] 在一个实施方案中，本发明包括一种转殖项5307玉米植物的转基因玉米种子。所述种子的一个样品被存放为ATCC登录号：PTA-9561。转殖项5307的转基因种子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6、以及它们的互补物。这些序列定义了被插入到该玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的一种异源DNA序列的插入点。在另一个实施方案中，本发明包括一种优选地分离的核酸分子，该分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。在另一个实施方案中，本发明包括一种优选地分离的核酸分子，其中该核酸分子被包含在以ATCC登录号PTA-9561存放的的玉米种子中。
[0088] 在一个实施方案中，本发明包括一种优选地分离的核酸分子，该核酸分子包括被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的至少10个或更多个(例如15、20、25、或50个)连续核苷酸以及位于被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点的侧翼的玉米植物基因组DNA的至少10个或更多个(例如，15、20、25、或50个)连续核苷酸。还包括这样的核苷酸序列，这些核苷酸系列含有来自转殖项5307的连续插入序列的10个或更多个核苷酸以及来自邻近该插入序列的转殖项5307的侧翼DNA的至少一个核苷酸。这类核苷酸序列是对于转殖项5307是诊断性的。来自5307转殖项的基因组DNA的核酸扩增产生了包括这类诊断性核苷酸序列的一种扩增子。
[0089] 在另一个实施方案中，本发明包括一种优选地分离的核酸序列，该核酸序列包括这样的核苷酸序列，该核苷酸序列包括选自下组的转殖项5307的至少一个连接序列，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、以及它们的互补物，其中连接序列跨越被插入到该玉米基因组中的异源表达盒与来自位于该插入位点侧翼的玉米基因组的DNA之间的结点，并且是对于该转殖项是诊断性的。
[0090] 在另一个实施方案中，本发明包括优选地分离的核酸，该核酸将异源DNA分子连接至玉米转殖项5307中的玉米植物基因组中，该转殖项包含从约11至约20个连续核苷酸的序列，该序列选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，以及它们的互补物。
[0091] 在另一个实施方案中，本发明包括一种优选地分离的核酸分子，该核酸分子包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，以及它们的互补物。
[0092] 在本发明的一个实施方案中提供了扩增子，该扩增子包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，以及它们的互补物。
[0093] 在另一个实施方案中，本发明包含用于检测转殖项5307的侧翼序列引物。这类侧翼序列引物包括分离的核酸序列，该核酸序列包括来自SEQ ID NO：5(在此任意地命名为5′侧翼序列)的核苷酸1-1348的至少10-15个连续核苷酸，或它们的互补物(也被披露为SEQ ID NO：111)。在这个实施方案的一个方面，该侧翼序列引物是选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14，以及它们的互补物。这些侧翼序列可以被延伸以包括染色体5序列，其中特别强调的是包括SEQ ID NO：103的核苷酸在检测与5307玉米转殖项相关的序列方面是有用的。在SEQ ID NO：103的背景下，“N”被定义为任何碱基(“A”、“T”、“G”、或“C”)。SEQ ID NO：110是这个序列的反向互补物。在SEQ ID NO：110的背景下，“N”被定义为任何碱基(“A”、“T”、“G”、或“C”)。
[0094] 在另一个实施方案中，本发明包括侧翼序列引物，这些引物包括来自SEQ ID NO：6(在此被任意地命名为3′侧翼序列)的核苷酸1-1093的至少10-15个连续核苷酸，或它们的互补物。在这个实施方案的一个方面，该侧翼序列引物是选自下组，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72，以及它们的互补物。
[0095] 在又另一个实施方案中，本发明包括一对多核苷酸引物，包括第一多核苷酸引物以及第二多核苷酸引物，在样品中玉米转殖项5307DNA模板的存在下它们一起起作用从而产生对于玉米转殖项5307是诊断性的扩增子，其中该第一引物序列是位于被插入到玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列的插入点侧翼的玉米植物基因组或与其互补，并且该第二多核苷酸引物序列是被插入到该玉米转殖项5307的玉米植物基因组中的异源DNA序列或与其互补。
[0096] 在这个实施方案的一个方面，该第一多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：5的位置1-1348的至少10个连续核苷酸，或者它们的互补物。在这个实施方案的另一个方面，该第一多核苷酸引物包括在SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14中列出的核苷酸序列，或它们的互补物。
在这个实施方案的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：6的位置1-1093的至少10个连续核苷酸，或者它们的补体。在这个实施方案的另一个方面，该第一多核苷酸引物包括在SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72中列出的核苷酸序列，或它们的互补物。在这个实施方案的又另一个方面，该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO：7的至少10个连续核苷酸，或者它们的互补物。在这个实施方案的又另一个方面，该第二多核苷酸引物包括在SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68中列出的核苷酸序列，或它们的互补物。
在这个实施方案的另一个方面，该第一多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：6的位置1-1093的至少10个连续核苷酸，或者它们的补体。在这个实施方案的另一个方面，该第一多核苷酸引物包括在SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72中列出的核苷酸序列，或它们的互补物。在这个实施方案的又另一个方面，该第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO：7的至少10个连续核苷酸，或者它们的互补物。在这个实施方案的又另一个方面，该第二多核苷酸引物包括在SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68中列出的核苷酸序列，或它们的互补物。
[0097] 在这个实施方案的另一方面，该第一多核苷酸引物(在SEQ ID NO：8中列出)以及该第二多核苷酸引物(在SEQ ID NO：41中列出)在样品中在 玉米转殖项5307DNA模板存在下共同起作用，以产生如实例4中所描述的对于该玉米转殖项5307是诊断性的一种扩增子。在这个实施方案的另一方面，该第一多核苷酸引物(在SEQ ID NO：69中列出)以及该第二多核苷酸引物(在SEQ ID NO：72中列出)在一个样品中在一个玉米转殖项5307DNA模板存在下共同起作用，以产生如实例4中所描述的对于该玉米转殖项5307是诊断性的扩增子。
[0098] 本领域的技术范围之内容易获得进一步向外进入位于该插入的异源DNA序列的任何一端侧翼的基因组序列中的额外的序列，以此用作一种引物序列，该引物序列可用于这类引物对中以扩增对于该5307转殖项是诊断性的序列。为了本披露的目的，短语“进一步向外进入位于该插入的异源DNA序列的任何一端侧翼的基因组序列中”具体指序列运动，该运动远离该插入的异源DNA序列的末端(插入的DNA序列邻近天然基因组DNA序列的点)并且向外进入该特殊染色体的基因组DNA(该异源DNA序列被插入该特殊染色体)。优选地，对应于该插入序列的一部分的引物序列或与该插入序列的一部分互补的引物序列将DNA或RNA的一条新生链的转录延长部分引(prime)向最近的侧翼序列接点。因此，对应于该基因组侧翼序列的一部分或与该基因组侧翼序列的一部分互补的引物序列将DNA或RNA的一条新生链的转录延长引向最近的侧翼序列接点。引物序列可以是插入至该植物的染色体中的异源DNA序列或基因组侧翼序列，或者能够与其互补。本领域的一位普通技术人员将很容易认识到如下益处：引物序列是否需要是(或者是否需要是互补于)在该插入的异源DNA序列中给出的或在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中给出的序列取决于通过使用嵌套引物所希望获得的产品的性质，这些引物旨在用于扩增特定的侧翼序列，该侧翼序列包含在该基因组DNA序列与该插入的异源DNA序列之间的接点。此外，为了设计阳性对照的目的，本领域普通技术人员应该能够为多个天然玉米基因设计引物。一个这样的实例是玉米Adhl基因，其中用于通过核酸扩增来生产扩增子的适合的引物的实例被列出为SEQ ID NO：79以及SEQ ID NO：80。
[0099] 在另一个实施方案中，本发明包括检测生物样品中存在相应于转殖项5307的DNA的一种方法，其中该方法包括：(a)将包含DNA的样品与一种探针进行接触，该探针在高严谨条件下与来自玉米转殖项5307的基因组DNA杂交并且在高严谨条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样 品和探针经受高严谨杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。在这个实施方案的一个方面，该扩增子包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，以及它们的互补物。
1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，以及它们的互补物。
[0100] 在另一个实施方案中，本发明包括检测生物样品中存在相应于5307转殖项的DNA的一种方法，其中该方法包括：(a)将包含DNA的样品与一种探针进行接触，该探针在高严谨条件下与来自玉米转殖项5307的基因组DNA杂交并且在高严谨条件下不与对照玉米植物的DNA杂交；(b)使该样品以及探针经受高严谨杂交条件；以及(c)检测该探针与该DNA的杂交。可以通过本领域熟知的任何方法进行检测，包括但不限于荧光的、化学发光的、放射线学的、免疫学的、或其他的方法。在杂交旨在被用作扩增特殊序列的方法以产生对于该5307玉米转殖项是诊断性的一个扩增子的情况下，通过本领域熟知的任何方法进行的该扩增子的生产和检测旨在指示该目标序列的预期杂交(其中使用了探针或引物)或者用来指示一些序列的杂交(其中使用了两个或更多个探针或引物)。术语“生物样品”旨在包括一种含有或被怀疑含有一种核酸的样品，它包含在如下点的任一侧的五个和十个之间的核苷酸，在该点处插入的异源DNA序列的两个终止端的一个或另一个接触在该染色体内的该基因组DNA序列(该异源DNA序列被插入该染色体中)，此处也被称为接点序列。另外，该接点序列包含少至两个核苷酸：它们是在该侧翼基因组DNA内的第一核苷酸，邻近并共价连接至在该插入的异源DNA序列内的第一核苷酸。
[0101] 在又另一个实施方案中，本发明包括用来检测生物样品中存在转殖项5307核酸的一种试剂盒，其中该试剂盒包括与选自下组的核苷酸序列同源或互补的足够长度的连续核苷酸的至少一种核酸分子，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、以及SEQ ID NO：4，该核苷酸序列作为DNA引物或对于转殖项5307特异的探针起作用，以及使核酸杂交或扩增能够实现所必需的其他物质。能够使用多种检测方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)、热扩增、连接酶链反应、Southern杂交、ELISA法，以及比色和荧光检测法。
具体地，本发明提供了用于检测在包含来自转殖项5307的基因组核酸的样品中的目标序列(即转殖项5307中插入的DNA与玉米植物的基因组DNA的结点中的至少一个)的存在的试剂盒。该试剂 盒包含至少一种多核苷酸，该多核苷酸能够结合至该靶位点上或基本上邻近该靶位点，以及至少一种手段，该手段用于检测该多核苷酸与该靶位点的结合。这些检测手段可为荧光的、化学发光的、比色的或者同位素的手段，并且可以加上至少免疫学方法以检测该结合。还构思了试剂盒，它能够检测在样品中的该靶位点的存在，即，转殖项5307中插入DNA与玉米植物的基因组DNA的接点中至少一个，利用了两种或更多种多核苷酸序列，这些多核苷酸序列在一起能结合至邻近该靶序列核苷酸序列或在该靶序列的约100个碱基对之内、或在约200个碱基对之内、或在约500个碱基对之内或在约1000个碱基对之内，并且这些多核苷酸序列能向彼此延伸以形成包含至少该靶位点的扩增子。
具体地，本发明提供了用于检测在包含来自转殖项5307的基因组核酸的样品中的目标序列(即转殖项5307中插入的DNA与玉米植物的基因组DNA的结点中的至少一个)的存在的试剂盒。该试剂 盒包含至少一种多核苷酸，该多核苷酸能够结合至该靶位点上或基本上邻近该靶位点，以及至少一种手段，该手段用于检测该多核苷酸与该靶位点的结合。这些检测手段可为荧光的、化学发光的、比色的或者同位素的手段，并且可以加上至少免疫学方法以检测该结合。还构思了试剂盒，它能够检测在样品中的该靶位点的存在，即，转殖项5307中插入DNA与玉米植物的基因组DNA的接点中至少一个，利用了两种或更多种多核苷酸序列，这些多核苷酸序列在一起能结合至邻近该靶序列核苷酸序列或在该靶序列的约100个碱基对之内、或在约200个碱基对之内、或在约500个碱基对之内或在约1000个碱基对之内，并且这些多核苷酸序列能向彼此延伸以形成包含至少该靶位点的扩增子。
[0102] 在另一个实施方案中，本发明包括用于检测生物样品中转殖项5307蛋白的一种方法，该方法包括：(a)从玉米转殖项5307组织的样品中提取蛋白；(b)使用一种免疫学方法来测定所提取的蛋白，该方法包括对于由该5307转殖项产生的杀虫性或选择性标记蛋白具有特异性的抗体；以及(c)检测所述抗体与该杀虫性或选择性标记蛋白的结合。
[0103] 本发明的另一个实施方案包括一种包括该转基因转殖项5307的基因型的玉米植物或其多个部分，其中该基因型包括以下各项中列出的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或它们的互补物。
[0104] 在这个实施方案的一个方面，该玉米植物是来自以下近交玉米系：CG5NA58、CG5NA58A、CG3ND97、CG5NA01、CG5NF22、CG4NU15、CG00685、CG00526、CG00716、NP904、NP948、NP934、NP982、NP991、NP993、NP2010、NP2013、NP2015、NP2017、NP2029、NP2031、NP2034、NP2045、NP2052、NP2138、NP2151、NP216j5、NP2161、NP2171、NP2174、NP2208、NP2213、NP2222、NP2275、NP2276、NP2316、BCTT609、AF031、H8431、894、BUTT201、R327H、2044BT、以及2070BT。然而本领域的技术人员将认识到该转殖项5307基因型能够被基因渗入至任何能用玉米进行育种的植物品种(包括野生型玉蜀黍种)中，因此这个实施方案的优选的近交系并不意味着是限制性的。
[0105] 在另一个实施方案中，本发明包含玉米植物，该植物包含至少一个第一DNA序列和一个第二DNA序列，它们连接在一起形成连续的核苷酸序列， 其中该第一DNA序列在连接序列内并且包含至少约10-15个连续核苷酸，这些核苷酸选自下组，该组由下列各项组成：核苷酸SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、以及它们的互补物，其中该第二DNA序列在选自下组的异源插入DNA序列之内，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：68，以及它们的互补物；并且其中该第一和第二DNA序列作为核苷酸引物或探针对于检测在生物样品中的玉米转殖项5307核酸序列的存在是有用的。在这个实施方案的一个方面，该核苷酸引物被用在DNA扩增方法中以扩增来自从该玉米植物中提取的模板DNA的靶DNA序列，并且该玉米植物通过对应于包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA序列的扩增子的产生而可以从其他玉米植物中鉴定出来。
[0106] 本发明的玉米植物可以被进一步表征：用限制性内切核酸酶Smal和Pmel消化该植物的基因组DNA导致在高严谨条件下使用全长探针产生一种单一的杂交带。此处举例证明的是包含SEQ ID NO：7中给出的核苷酸序列的一种全长探针。
[0107] 在一个实施方案中，本发明提供了一种玉米植物，其中该转殖项5307基因型赋予该玉米植物对昆虫的抗性或利用甘露糖的能力。在这个实施方案的一个方面，赋予该玉米植物对昆虫的抗性的基因型包括一种FR8a基因。在这个实施方案的另一个方面，对该玉米植物赋予利用甘露糖的能力的基因型包括一种PMI基因。
[0108] 在一个实施方案中，本发明提供了从转殖项5307玉米植物、组织、或种子得到的生物样品，其中该样品包括一种选自下组的序列或与其互补的核苷酸序列，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4，并且其中在该样品中的该序列使用核酸扩增或核酸杂交的方法是可检测的。因此，该基因序列作为一种检测手段而起作用。在这个实施方案的一个方面，该样品选自以下各项：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。
[0109] 在另一个实施方案中，本发明提供了从包含一种核苷酸序列的转殖项5307玉米植物、组织、或种子得到的提取物，该核苷酸序列是选自下组的一种核苷酸序列或与其互补，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4。这样的种子的一个实例被存放在ATCC 的登录号PTA-9561下。在这个实施方案的一个方面，使用一个核酸扩增或核酸杂交的方法检测了在该提取物中的该序列。在这个实施方案的另一个方面，该样品选自以下各项：玉米面粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。
[0110] 在又另一个实施方案中，本发明提供了用于生产至少抵抗一种玉米根虫侵染的玉米植物的方法，包括：(a)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包括玉米转殖项5307DNA，由此产生大量的第一代子代植物；(b)选择第一代子代植物，该植物是对于至少一种玉米根虫侵染是抵抗性的；(c)将该第一代子代植物自交，由此产生大量的第二代子代植物；以及(d)从该第二代子代植物中选择一种植物，该植物是至少抗玉米根虫侵染的；其中该第二代子代植物包括选自下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4。
[0111] 在另一个实施方案中，本发明提供了生产杂交玉米种子的一种方法，包括：(a)播种第一近交玉米系的种子，该玉米系包含选自下组的一种核苷酸序列，该组由下列各项组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、以及SEQ ID NO：4，并且播种具有不同基因型的一种第二近交系的种子；(b)培育来自所述播种的玉米植物直到开花的时期；(c)将这些玉米近交系中的植物的所述的花去雄；(d)将这两种不同的近交系彼此有性杂交；以及(e)收获由此生产的杂交种子。在这个实施方案的一个方面，该第一近交玉米系提供了母本。在这个实施方案的另一个方面，该第一近交玉米系提供了父本。本发明还包括通过实施的方法产生的种子以及由该种子长成的杂交植物。
[0112] 在另一个实施方案中，本发明提供了选择与玉米转殖项5307相关的标记的方法，包括：(a)筛选玉米转殖项5307染色体5序列，(b)将这些与非转基因NP2222序列进行比较，(c)为了检测序列变异的目的来比较这些序列，(d)将这些序列变异用作手段来开发与玉米转殖项5307相关的标记，(e)使用这些标记来筛选系，以及(f)检测该标记证实在染色体5上存在玉米转殖项5307序列。
[0113] 本领域的普通技术人员将认识到本发明的转基因基因型能通过育种而基因渗入至包含不同转基因基因型的其他玉米系中。例如，可以将包含本发明的转基因基因型的玉米近交系与包含抗鳞翅目的Bt11转殖项的转基因基 因型的玉米近交系进行杂交，这是本领域已知的，从而产生了包括本发明的转基因基因型和该Bt11转基因基因型两者的玉米种子。其他转基因转殖项的实例(这些转殖项可以与本发明的近交系进行杂交)包括草甘膦除草剂耐受性转殖项GA21以及NK603、草甘膦耐受性/鳞翅目昆虫抗性的MON802转殖项、鳞翅目昆虫抗性转殖项DBT418、鳞翅目昆虫抗性转殖项DAS-06275-8、鳞翅目昆虫抗性转殖项MIR162、雄性不育转殖项MS3、草胺膦耐受性转殖项B16、鳞翅目昆虫抗性转殖项MON 80100、草胺膦除草剂耐受性转殖项T14以及T25、鳞翅目昆虫抗性转殖项176、鞘翅目昆虫抗性转殖项MIR604以及鞘翅目昆虫抗性转殖项MON863，所有这些在本领域中都是已知的。将进一步认识到可以用本发明的转基因的基因型进行其他组合，并因此这些实例不应被视为是限制性的。
[0114] 本领域的普通技术人员也将认识到包含本本发明的转基因基因型的转基因玉米种子能用不同的种子处理化学品(包括杀虫剂)进行处理，以增强或协同该FR8a蛋白的杀虫活性。例如，可以用商购杀虫剂 来处理本发明的转基因玉米种子。可以使用这样一种组合用来增加活性谱并且用来增加表达的蛋白以及化学品的效果。
[0115] 育种
[0116] 本发明的转基因基因型能够采用本领域公认的育种技术而基因渗入至任何玉米近交系或杂种中。植物育种的目标是将不同的所希望的性状结合在单一品种或杂交种中。对于大田作物而言，这些性状可能包括对昆虫和疾病的抵抗性、对除草剂的耐受性、对热和旱的耐受性、减少农作物成熟的时间、更高的产量，以及更好的农艺学质量。随着许多农作物的机械收获，植物特征(例如发芽和植物丛建立、生长速率、成熟，以及植物和耳穗的高度)的均一性是很重要的。
[0117] 大田作物是通过利用了植物授粉方法的技术进行育种的。如果来自一朵花的花粉被转移至同一植物的同一朵花或另一朵花，则该植物是自花受粉的。如果花粉来自不同植物的花，则该植物是异花授粉的。
[0118] 已经自花授粉及对于许多代的类型进行了选择的植物在几乎所有基因位点变得纯合，并产生纯种子代(true breeding progeny)的均一种群。在两种不同纯合系之间的杂交产生杂交植物(对于很多基因位点可以是杂合的) 的均一种群。两种植物(每种在很多基因位点上是杂合的)的杂交将产生遗传上不同的并且将是不均一的杂交植物的种群。
[0120] 在植物中控制雄性育性的一个可靠方法为改善植物育种提供了机会。这对于开发依赖于某些雄性不育系统的玉米杂种尤其是成立的。对育种者而言有几个可用的控制雄性育性的选择，例如，手工或机械去雄(或去雄花穗)、细胞质雄性不育性、遗传雄性不育性、杀配子药等等。
[0121] 杂种玉米种子通常通过雄性不育系统结合手工或机械去雄花穗而典型地产生。两个玉米近交系以交错条带的方式种植在一块地上，并且从该近交系(雌性)中去除带花粉的雄花穗。假如能足够隔离外来玉米花粉源，则该去雄花穗近交系的耳穗将只从另一个近交系(雄性)受精，因此得到的种子是杂种并且将形成杂交植物。
[0122] 通过使用本领域中赋予遗传的雄性不育性的许多方法(每种方法都有其自身的优点和缺点)中的一种方法能够避免这种费力的且有时不可靠的去雄花穗的方法。这些方法采用多种途径，例如将一种编码细胞毒性物质的基因递送到该植物中，该细胞毒性物质与雄性组织特异性启动子或反义系统相关，其中对育性至关重要的基因被鉴定出来，并且该基因的反义引物被插入至该植物中(参见：Fabinjanski等EPO 89/3010153.8公开文件号329,308和公开号为WO 90/08828的PCT公开文件PCT/CA90/00037)。
[0123] 玉米近交系的开发
[0124] 使用雄性不育近交只是玉米杂种生产中的一个因素。本领域已知的且在玉米植物育种计划中使用的植物育种技术包括但不限于，轮回选择、回交、系谱育种、限制长度多态性增强选择、标记辅助选择和转化。在一个玉米植物育种计划中玉米杂种的开发通常需要纯合近交系的开发、这些系的杂交、以及这些杂交的评估。系谱育种和轮回选择育种方法被用来开发来自繁殖种群的近交系。玉米植物育种计划将来自两个或更多个近交系或各种其他种质源的遗传背景结合进入育种集合体中，从该集合体中通过自交和选择所希望的表型而开发新的近交系。这些新的近交体与其他近交系杂交，并且评价来 自这些杂交的杂种以确定它们当中哪些具有商业潜力。如在一个玉米植物育种计划中所实践的，植物育种和杂种开发是昂贵且耗时的过程。
[0125] 系谱育种开始于两个基因型的杂交，其中每个基因型可能具有一个或多个所希望的特征，这些特征在另一个中缺乏或补充另一个。如果这两种原始的亲本不能提供所有的所希望的特征，则可将其他源包含在该繁殖种群中。在该系谱方法中，将优良植物自交并在连续后代中进行选择。在这些后续代中，作为自花授粉和选择的结果，该杂合条件对均匀系让步。典型地，在自花授粉及选择的培育五代或更多代的系谱方法中按如下实行：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5；等。
[0126] 轮回选择育种(例如回交)可以用来改进近交系及使用这些近交体产生的杂种。回交可被用来将一个特异的希望的性状从一个近交系或来源转移至缺乏该性状的近交系。这可以通过例如将优良的近交体(轮回亲本)与携带对于所讨论的性状适当的一个或多个基因的供体近交体(非轮回亲本)进行杂交来完成。然后将这种杂交的子代配对回至该优良的轮回亲本，然后在得到的子代中对于从该非轮回亲本转移的所希望的性状进行选择。选择了所希望的性状的五代或更多代回交代之后，该子代对于控制被转移的特性的位点将是纯合的，但对于基本上所有其他基因将与该优良的亲本相像。然后，最后回交的子代进行自交以便对于被转移的一个或多个基因给出纯合子代。从包含被转移的一个或多个基因的近交体中发育的杂种与从没有被转移该一个或多个基因的同样的近交体发育的杂种基本上是一样的。
[0127] 良种近交系，即，纯种繁育的纯合近交系，还可作为起始材料被用于育种或作为由此发展其他近交系的源种群。源自良种近交系的这些近交系可以用以上描述的系谱育种和轮回选择育种方法来开发。作为一个实例，当在玉米植物育种计划中使用回交育种来创造这些衍生系时，良种近交体可以被用作亲本系或起始材料或源种群，并且可以作为供体或轮回亲本。
[0128] 玉米杂交体的开发
[0129] 单交玉米杂种来自两个近交系的杂交，这两个近交系中的每一个具有一个与另一个基因型互补的基因型。该第一代的杂种子代被命名为F1。在玉米植物育种计划中的商品杂种的开发中，仅仅搜索F1杂种植物。优选的F1杂 种比它们的近交亲本更有活力的。这种杂种活力或杂种优势可以在许多的多基因性状中表现出来，包括增加的植物生长及增加的产率。
[0130] 在一个玉米植物育种计划中的玉米杂种的开发涉及三个步骤：(1)从不同种质库选择植物用于起始育种杂交；(2)将从几代的育种杂交中选择的植物进行自交以产生一系列近交系，虽然这些近交系彼此不同，但是它们是纯种传代的且高度均一的；以及(3)将所选择的近交系与不同的近交系进行杂交以产生杂种子代(F1)。在玉米的同系繁殖过程中，这些系的活力下降。当两种不同的近交系杂交以产生杂种子代(F1)时活力被恢复。这些近交系的纯合性和均一性的重要结果是在已确定的近交对之间的杂种将总是一样的。一旦给出优良杂种的近交体被鉴定出来，只要保持这些近交亲本的均一性，就能无限地复制该杂种种子。通过F1杂种展示的许多杂种活力在下一代(F2)中消失。因此，来自杂种的种子不用于播种储备。
[0131] 杂种种子的生产需要将通过该母本产生的花粉消除或失活。花粉的不完全去除或失活为自花授粉提供了可能性。这个不注意地自花授粉的种子可能无意中与杂种种子一起收获并包装。
[0132] 一旦该种子被播种，有可能鉴定并选择这些自花授粉的植物。这些自花授粉的植物将与用来产生该杂种的雌性近交系在遗传上是等同的。
[0133] 如对本领域的一位普通技术人员很清楚的是，前述只是不同方式中的一些方式，通过这些方式那些寻求将本发明的转基因的基因型渗入至其他玉米系的人们可获得本发明的近交体。还有其他可供使用的手段，并且上述实例仅仅是说明性的。实施例
[0134] 通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是作为说明性的目的而提供的，并且不旨在进行限制，除非另外说明。在此所使用的标准的重组DNA以及分子克隆技术是本领域已知的，并且被Ausubel(ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(1994)；J.Sambrook，et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d Ed.，Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；and by T.J.Silhavy，M.L.Berman，and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)进行了描述。
[0135] 实例1.5307转殖项的转化和选择
[0136] 通过土壤杆菌属介导的转化近交玉米(玉蜀黍)系NP2222来产生5307转殖项。使用来自质粒pSYN12274的DNA片段，基本上如Negrotto等人(Plant Cell Reports 19：798-803，2000)(该文件通过引用结合在此)中所述转化未成熟胚(图1)。pSYN12274包含核苷酸序列，该序列包括串联表达盒。该第一表达盒包括CMP启动子序列(美国专利7,166,770)，该启动子序列可操作地连接到FR8a编码序列上，该编码序列进一步可操作地连接到胭脂碱合成酶3′端转录终止以及多腺苷酸化序列上。该第二表达盒包括玉米泛素启动子(ZmUbilnt)(Christensen et al.1992PMB 18：675)，该启动子可操作地连接到PMI编码序列上，该序列进一步可操作地连接到胭脂碱合酶3′端转录终止以及多腺苷酸化序列上。
[0137] 从8至12天的耳穗上切下未成熟胚并用新鲜的培养基冲洗以为转化作准备。将胚与包含转化载体pSYN12274的土壤杆菌属细胞的悬浮液混合，涡旋30秒，并允许孵育另外的5分钟。抽吸过量的土壤杆菌属溶液，然后将胚移至含有非选择性培养基的平板上。将胚在
22℃、黑暗条件下与剩余的土壤杆菌属共培养2至3天。将胚转移至补充有替卡西林(100mg/ml)和硝酸银(1.6mg/l)的培养基中，并在黑暗条件下孵育10天。将产生胚性愈伤组织的胚转移至含有甘露糖的细胞培养基中。
22℃、黑暗条件下与剩余的土壤杆菌属共培养2至3天。将胚转移至补充有替卡西林(100mg/ml)和硝酸银(1.6mg/l)的培养基中，并在黑暗条件下孵育10天。将产生胚性愈伤组织的胚转移至含有甘露糖的细胞培养基中。
[0138] 用 PCR分析(参见实例2)测试再生的小植株，以测试PMI和FR8a这两种基因的存在、以及抗生素抗性大观霉素(spec)基因的缺乏。将对两种转基因阳性并且对spec基因阴性的植物转移至温室中以进一步繁殖。使用抗玉米根虫的昆虫生物测定进行鉴定并筛选出阳性转殖项。杀虫转殖项的特征在于通过TAQMAN分析的拷贝数。选择转殖项
5307用于基于具有单拷贝的转基因进行进一步分析，通过ELISA鉴定良好的蛋白表达、以及当与用同一构建体制成的其他转殖项进行比较时的抗玉米根虫的更好的杀虫活性。
5307用于基于具有单拷贝的转基因进行进一步分析，通过ELISA鉴定良好的蛋白表达、以及当与用同一构建体制成的其他转殖项进行比较时的抗玉米根虫的更好的杀虫活性。
[0139] 将该T05307转殖项与近交玉米系NP2460回交，产生T1种群。将T1植物进行自花授粉从而产生T2代，并且重复这个过程从而产生T3代。使用T3植物的子代测试来鉴定纯合的(转化的)家族。将转殖项5307转化的 NP2460近交体与其他良种近交系进行杂交从而产生杂交体，这些杂交体被用于进一步的研究。
[0140] 实例2.通过TAQMAN PCR检测转殖项5307
[0141] TAQMAN分析基本如Ingham等描述的(Biotechniques(生物技术)，31：132-140，2001)来进行，将其通过引用结合在此。简言之，基本上根据生产者的说明(除了所有步骤在
1.2ml的96孔板中进行以外)使用 基因组DNA提取试剂盒(Gentra Systems，
Minneapolis，MN)将基因组DNA从转基因和非转基因玉米植物的叶子里分离出来。将干燥的DNA小粒再次悬浮在TE缓冲液(10Mm Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。
1.2ml的96孔板中进行以外)使用 基因组DNA提取试剂盒(Gentra Systems，
Minneapolis，MN)将基因组DNA从转基因和非转基因玉米植物的叶子里分离出来。将干燥的DNA小粒再次悬浮在TE缓冲液(10Mm Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。
[0142] TAQMAN PCR反应在96孔板中进行。对于内源性玉米基因对照，设计了对玉蜀黍醇脱氢酶(Adh)基因特异的引物和探针(Genbank登录号AF044295)。普通技术人员会认识到其他玉米基因可用作内源控制。可以将反应多路进行从而同时扩增FR8a与Adh或PMI与Adh。对于每个样品而言，通过将20μL提取的基因组DNA与35μL 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)合并而产生母体混合物(添加引物至各自的最终浓度为900nM、添加探针至各自的最终浓度为100nM，以及添加水至最终体积为70μL)。在96孔扩增板中将这个混合物分配成三个重复(每个20μL)并用光学透明的热封膜进行密封(Marsh Bio Products)。在ABIPrime 7700仪器中运行PCR，使用以下扩增参数：在50℃下2分钟以及在95℃下10分钟，之后在95℃下15秒35个循环以及60℃下1分钟。
[0143] TAQMAN分析的结果显示转殖项5307具有FR8a基因的一个拷贝以及PMI基因的一个拷贝。
[0144] 所使用的适合的引物/探针序列组合的实例是：
[0145] 引物名称引物序列SEO ID NO：
[0146] FR8a-正向5′-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3 SEQ ID NO：73
[0147] FR8a-反向5′-CGATCAGGTCCAGCACGG-3′SEQ ID NO：74
[0148] FR8a-探针5′-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3′SEQ ID NO：75
[0149] (5′标志物＝FAM，3′标志物＝TAMRA)
[0150] PMI-正向5′-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3′SEQ ID NO：76
[0151] PMI-反向5′-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3′SEQ ID NO：77
[0152] PMI-探针5′-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3′SEQ ID NO：78
[0153] (5′标记＝FAM，3′标记＝TAMRA)
[0154] ZmADH-267正向5′-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3′SEQ ID NO：79
[0155] ZmADH-337反向5′-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3′SEQ ID NO：80
[0156] ZmADH-316探针5′-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3′SEQ ID NO：81
[0157] (5′标记＝TET，3′标记＝TAMRA)
[0158] PM1271、MIC5307a以及MIC5307b TAQMAN测定法被设计成一种转殖项特异性测定法，该特异性测定法涵盖该3′连接序列。
[0159] 所使用的适合的引物/探针序列组合的实例是：
[0160] 引物名称 引物序列SEQ ID NO：
[0161] PM1277-正向5′-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3′SEQ ID NO：82
[0162] PM1277-反向5′-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3′SEQ ID NO：83
[0163] PM1277-探针5′-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3′SEQ ID NO：84
[0164] (5′标记＝TET，3′标记＝TAMRA)
[0165] MIC5307a-正向5′-TGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACC-3′SEQ ID NO：82
[0166] MIC5307a-反向5′-TTTGCCAGTGGGCCCA-3′SEQ ID NO：83
[0167] MIC5307a-探针5′-ACAATATACCCTCTTCCCTGGGCCAGG-3′SEQ ID NO：84
[0168] (5′标记＝TET，3′标记＝TAMRA)
[0169] MIC5307b-正向5′-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3′SEQ ID NO：82
[0170] MIC5307b-反向5′-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3′SEQ ID NO：83
[0171] MIC5307b-探针5′-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3′SEQ ID NO：84
[0172] (5′标志物＝TET，3′标志物＝TAMRA)
[0173] 实例3.通过Southern印迹检测转殖项5307
[0174] 基本上用Thomas等的方法(Theor.Appl.Genet.86：173-180，1993)(通过引用结合在此)将用于Southern分析的基因组DNA从代表转殖项5307的回交6(BC6)代的10棵植物的汇集的叶组织中分离出来。用于DNA分离的所有植物用TAQMAN PCR(如实例2所描述的)单独地进行分析以确 认存在FR8a基因和PMI基因的单一拷贝。对于阴性分离子的控制，从代表转殖项5307的BC4代5个植物的汇集的叶组织中分离出DNA。使用TAQMAN PCR对这些阴性分离子植物单独地进行分析，并且这些测定对于FR8a基因以及PMI基因的存在是阴性的，但是如所期望的，对于内部对照(内源玉米Adh基因)测定是阳性的。
[0175] 使用常规的分子生物学技术进行Southern分析。用Smal和Pmel限制性酶对基因组DNA(7.5μg)进行双重消化，这些限制性酶在该转殖项5307T-DNA插入序列(来自质粒pSYN12274)中具有单个的识别位点(图1)。这个途径允许确定这些元件的拷贝数目，对应于用于每个Southern分析的特异探针，这些元件已经被结合进转殖项5307中。这导致在转殖项5307中存在一个杂交带/拷贝的元件。这导致在转殖项5307中对于每拷贝元件存在一个杂交带。在琼脂糖凝胶电泳以及碱性转移到 膜上之后，使用元件特异性全长PCR产生的探针来进行杂交。用于该Southern印迹中的全长探针包括SEQ ID NO：7中列出的核苷酸序列。这些探针使用RediprimeTM II系统(Amersham Biosciences，Cat.No.RPN 1633)通过随机引物法用32P进行标记。
[0176] 使用以下的高严谨杂交条件：将1-2百万cpm/ml加入到PerfectHyb(Sigma)中，该PerfectHyb添加有预热到65℃的100μg/ml的小牛胸腺DNA(Invitrogen)。在与上述相同的溶液中进行与杂交，在相同的温度下过夜或持续至少1小时。在65℃下杂交3小时，随后在65℃下在2X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20分钟，并且在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20分钟。
[0177] 在每个Southern印迹中包含了三个对照样品：(1)来自阴性(非转化的)分离子的DNA，用于鉴定任何内源性的可能与元件特异的探针交叉杂交的玉蜀黍序列；(2)来自阴性分离子的DNA，在该分离子中引入了一定量的Smal-Pmel消化的pSYN12274(该消化的量与基于探针长度的一个拷贝数相等)，以证明本实验在检测在玉蜀黍基因组之内的单个基因拷贝中的敏感性；以及(3)Smal-Pmel消化的pSYN12274质粒，它等于基于探针长度的一个拷贝数，以作为杂交的一个阳性对照并且证明本实验的敏感性。
[0178] 这些杂交数据提供了证实的证据以支持TAQMAN PCR分析，即转殖项5307包含单拷贝的FR8a和PMI基因，以及该5307转殖项不包含pSYN12274 中存在的任何载体主链序列。如对于FR8a和PMI探针两者所期望的，该Smal-Pmel消化导致了具有正确大小的单个杂交带，证明每个基因的单个拷贝存在于该5307转殖项中。此外，对于主链探针，杂交的缺乏证明在转化过程期间没有任何pSYN12274载体主链序列被整合到转殖项5307中。实例4.T-DNA插入片段测序
[0179] 存在于转殖项5307中的整个转基因DNA插入片段的核苷酸序列被确定用来证明该插入片段的总完整性、功能性元件的连续性以及用来检测任何单独的碱基对改变。从由BC5代得到的DNA进行PCR扩增转殖项5307插入片段(作为两个单独的重叠片段)。使用与位于该转殖项5307插入片段侧翼的植物基因组序列同源的一种多核苷酸引物以及与该FR8a基因同源的一个多核苷酸引物来扩增每一片段。为了产生5′片段，将与该5′侧翼序列同源的第一多核苷酸引物(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：15)，与同该插入的DNA该FR8a基因同源的第二核苷酸引物(SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：41)、泛素启动子(SEQ ID NO：42至SEQ ID NO：53)或PMI基因(SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：60)相结合。为了产生3′片段，将与该3′侧翼序列同源的第一多核苷酸引物(SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72)与同该FR8a基因内的该插入的DNA同源的第二核苷酸引物(SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：17)、泛素启动子(SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：26)或PMI基因(SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：32)相结合。
[0180] 使用扩展高保真PCR系统(Roche，Cat.No.1732650)以及以下的扩增参数来进行PCR扩增：在94℃下1个循环2分钟，随后在94℃下15秒在55-65℃下30秒10个循环，以及在68℃下5分钟，随后94℃下15秒在55-65℃下30秒20个循环，并且在72℃下5分钟+5秒/循环，随后在72℃下7分钟1个循环。
[0181] 使用SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：41从该PCR扩增得到的扩增子包括该5′连接序列(SEQ ID NO：1)。使用SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：72从该PCR扩增得到的扩增子包括该3′连接序列(SEQ ID NO：2)。将每个测序片段单独地克隆到 -XL-TOPO载体(Invitrogen，Cat.No.K4700-20)中并且对于每个片段用三个分开的克隆进行鉴定和测序。使用ABI 1.1或Big Dye 3.1dGTP(对于GC丰富的模板)化学法使用ABI3730XL分 析仪进行
测序。使用来自华盛顿大学(University of Washington)的Phred、Phrap和Consed包进行序列分析，并且该序列分析是在每10,000个碱基中少于1个的误差率下进行的(E wing and Green，1998)。通过结合来自6个单独的克隆的序列数据(每个测序片段3个)以产生该转殖项5307插入片段的共有序列从而确定最终的共有序列。为了进一步确认该转殖项5307插入片段与该pSYN12274质粒之间任何单独的碱基对差异，对于其中在初始共有序列中看到的碱基对差异的任何区域特异的小(约300-500bp)PCR产物，使用上述相同的方法进行扩增。
对于该转殖项5307插入片段中所有推定的碱基对差异，直接PCR产物测序在所讨论的所有碱基对处导致单一的清楚的峰，这表明这些差异可能存在于该转殖项5307插入片段中。采用ClustalW程序结合下列参数进行比对：记分矩阵(scoring matrix)blosum55、空位开放罚分(gap opening penalty)15、空位延伸罚分(gap extension penalty)6.66(Thompson et al，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680)。
测序。使用来自华盛顿大学(University of Washington)的Phred、Phrap和Consed包进行序列分析，并且该序列分析是在每10,000个碱基中少于1个的误差率下进行的(E wing and Green，1998)。通过结合来自6个单独的克隆的序列数据(每个测序片段3个)以产生该转殖项5307插入片段的共有序列从而确定最终的共有序列。为了进一步确认该转殖项5307插入片段与该pSYN12274质粒之间任何单独的碱基对差异，对于其中在初始共有序列中看到的碱基对差异的任何区域特异的小(约300-500bp)PCR产物，使用上述相同的方法进行扩增。
对于该转殖项5307插入片段中所有推定的碱基对差异，直接PCR产物测序在所讨论的所有碱基对处导致单一的清楚的峰，这表明这些差异可能存在于该转殖项5307插入片段中。采用ClustalW程序结合下列参数进行比对：记分矩阵(scoring matrix)blosum55、空位开放罚分(gap opening penalty)15、空位延伸罚分(gap extension penalty)6.66(Thompson et al，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680)。
[0182] 该转殖项5307T-DNA插入片段的共同序列数据证明，该插入片段的总完整性以及该插入片段中功能性的元件的连续性已经如pSYN12274中所预期的那样被保持了。
[0183] 实例5.侧翼DNA序列的分析
[0184] 使用OmniPlexTM技术(基本上如Kamberov等人(Proceedings of SPIE，Tools for Molecular Analysis and High-Throughput Screening，4626：1-12，2002)中所述，该文件通过引用结合在此)得到位于被插入到转殖项5307的玉米基因组中的同源DNA侧翼的玉米基因组DNA序列。
[0185] 5’和3′侧翼序列和连接序列用标准PCR过程来证实。使用SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：14中所列出的第一多核苷酸引物与SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：41中所列出的第二多核苷酸引物相结合来证实该5′侧翼以及连接序列。使用SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72中所列出的第一多核苷酸引物与SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：32中所列出的第二多核苷酸引物相结合来证实该3′侧翼以及连接序列。普通技术人员应认识到其他引物序列也可用于证实该侧翼序列和连接序列。
[0186] 被发现转殖项5307插入片段的右侧边缘(5′侧翼序列)上是示于SEQ ID NO：5中的玉米基因组序列侧翼，并且其左侧边缘(3′侧翼序列)上是示于 SEQ ID NO：6中的玉米基因组序列侧翼。该5′连接序列列出在SEQ ID NO：1中。该3′连接序列列出在SEQ ID NO：2中。pSYN12274载体插入的整合位点被包括在SEQ ID NO：103或它的反向互补物SEQ ID NO：110之内，这取决于所使用的核酸的方向。
[0187] 实例6.通过ELISA检测转殖项5307蛋白
[0188] 为了表征转殖项5307植物中FR8a(活性杀虫要素)以及磷酸甘露糖异构酶(PMI)(选择性标记)蛋白的表达范围，在数个植物组织中通过ELISA确定了FR8a蛋白和PMI的浓度。在转殖项5307中对于转基因而言这些杂交体是半合子的，而对于这些转基因而言该近交体是纯合的。
[0189] 通过使用或者咖啡研磨器、掺和器、GrindomixTM研磨器(Brinkmann Instruments；Westbury，NY，USA)、带有研棒的研钵或碾磨机、或这些装置的一种组合之一进行处理将整个植物以及单独的部分(除了花粉以外)磨成细粉末。所有处理都是在干冰亦或液氮的存在下进行的。将样品良好地混合以确保均匀。保留整个植物组织样品或代表性的子样品用于分析，这允许足够的样品尺寸用来归档保存保留的植物组织样品。确定每个样品的百分比干重并且将处理过的样品存储在约-80℃下直至冷冻干燥。
[0190] 提取新鲜的组织(除了花粉和青贮饲料之外)以及全植物样品。对于每个被分析的样品，将1.0g等分部分的粉末化的新鲜材料称重加入15ml的聚丙烯管中，悬浮在3ml的提取缓冲剂[50mM CAPS、0.1M NaCl、2mMEDTA、1mM二硫苏糖醇、1mM 4-(1-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、1mM亮抑酶肽、pH 10]中，并且使用一台 均质器(Tomtek；Hamden，CT，USA)进行提取。在4℃下在10,000x g下离心15分钟之后，使用上清液通过ELISA进行FR8a和PMI分TM析。在用碘乙酰胺进行处理(如Hill和Straka(1988)所描述的)之后，使用BCA 蛋白测定试剂(Pierce；Rockford，IL，USA)对提取物中的总蛋白进行定量。
[0191] 通过将花粉1∶30(w/v)悬浮在提取缓冲剂中来制备花粉提取物。在冰上30分钟之后，通过在约15,000psi下3次通过French高压细胞破碎仪来破碎这些花粉悬浮液，随后在4℃下在14,000x g下离心5分钟。如下所述通过ELISA在这些上清液上进行Cry3A055和PMI分析。如上所述对总蛋白进行定量。
[0192] 通过将青贮饲料1∶25(w/v)悬浮在2X提取缓冲剂中来制备青贮饲料提取物。在冰上30分钟之后，使用一台Brinkmann Polytron均质器(Brinkmann；Westbury，NY，USA)来提取青贮饲料悬浮液。在4℃下在10,000x g下离心15分钟之后，使用上清液通过ELISA进行FR8a和PMI分析。如上所述对总蛋白进行定量。
[0193] FR8a定量
[0194] 使用免疫亲和纯化的单克隆抗-mCry3A抗体以及免疫亲和纯化的多克隆抗-CrylAb抗体通过ELISA(Tijssen，1985)针对FR8a定量分析如上所述制备的提取物。基于位于标准曲线的线性部分上的纯参考蛋白的最低浓度估计双夹心ELISA的定量的下限、在无背景干扰下可以被分析的对照提取物的最大体积、以及该等分部分代表的相应的该样品的重量。
[0195] 在从所有转殖项5307得到的植物组织中检测到可定量水平的FR8a蛋白。在大多数情况下，这些结果被表示为5个重复组织样品的平均值。对照样品水平在所有组织的定量限度之下。
[0196] 贯穿所有生长阶段，在叶、根、以及花粉中所测量的平均FR8a水平的范围对应地为从约18-29μg/g湿重(77-113μg/g干重)，约1.8-4.1μg/g湿重(22-41μg/g干重)以及约＜LOD-0.15μg/g湿重(＜LOD-0.15μg/g干重)，[检测限(LOD)＝0.08μg/g湿重，0.08μg/g干重]。
[0197] 在各时间点处对于每种组织在近交和杂交基因型中的FR8a的水平总体上是类似的。
[0198] PMI定量
[0199] 使用对于PMI具有亲和性的蛋白A纯化的多克隆兔抗体和免疫亲和纯化的多克隆山羊抗体通过ELISA(Tjissen，1985)对于PMI来定量分析如上所述制备的提取物。基于位于该标准曲线的线性部分上的纯参考蛋白的最低浓度估计双夹心ELISA的定量的下限、在无背景干扰下可以被分析的对照提取物的最大体积、以及该等分部分代表的相应的该样品的重量。
[0200] 在从被分析的转殖项5307得到的植物组织的大多数中检测到PMI蛋白。在大多数情况下，这些结果被表示为5个重复组织样品的平均值。对于所有阶段和组织，对照样品水平在定量限度之下。
[0201] 贯穿所有植物生长阶段，在叶、根、以及花粉中所测量的平均PMI水平范围对应地为从约0.4至约0.6μg/g湿重(1.5-2.3μg/g干重)，约0.1-0.2μg/g湿重(0.9-1.5μg/g干重)以及约16.7-30.6μg/g湿重(17.1-31.1μg/g干重)，[检测限(LOD)＝0.08μg/g湿重(鲜重fresh wt.)，0.08μg/g干重]。
[0202] 在各时间点处对于每种组织在近交和杂交基因型中PMI的水平总体上是类似的。
[0203] 实例7.转殖项5307的大田效果
[0204] 西方玉米根虫和北方玉米根虫
[0205] 在美国12个地点针对抗西方玉米根虫以及北方玉米根虫的效果来测试转殖项5307植物。在加入或不加入杀虫性种子处理 下对转殖项5307进行测试。对照组包括用两种不同比率的 和一种未处理的检验来处理的种子。这些处理包括在中心
(以随机化完全区块方式进行设计)处间隔30″的2个17.5-20英尺行的4个重复。随机地选出
10个植物/每个处理并且使用0-3尺度针对效果进行评估，其中0＝无采食损害(可以给出的最低等级)；1＝一个节点(根的圆周)，或完整的节点的等效物，在该茎的约2英寸内被吃掉(在第7节点上的土壤线)；2＝被吃掉两个完整的节点；3＝被吃掉3个或更多的节点(可以给出的最高等级)。在完全被吃的节点之间中的损害被记录为节点损失的百分比，即1.50＝
11/2个节点被吃掉，0.25＝一个节点的1/4被吃掉。
(以随机化完全区块方式进行设计)处间隔30″的2个17.5-20英尺行的4个重复。随机地选出
10个植物/每个处理并且使用0-3尺度针对效果进行评估，其中0＝无采食损害(可以给出的最低等级)；1＝一个节点(根的圆周)，或完整的节点的等效物，在该茎的约2英寸内被吃掉(在第7节点上的土壤线)；2＝被吃掉两个完整的节点；3＝被吃掉3个或更多的节点(可以给出的最高等级)。在完全被吃的节点之间中的损害被记录为节点损失的百分比，即1.50＝
11/2个节点被吃掉，0.25＝一个节点的1/4被吃掉。
[0206] 转殖项5307效果与用于陇中的商业的颗粒状的杀虫剂标准品进行比较。该实验设计是如上所述。表2中的结果证明转殖项5307的效果在保护植物免受玉米根虫采食损害方面比得上商业的标准品。
[0207] 表2.转殖项5307与用于陇中的商业杀虫剂的效果的比较。
[0208]
[0209] 墨西哥玉米根虫
[0210] 在德克萨斯的两个地点针对对墨西哥玉米根虫的抗性来评估转殖项5307植物。实验设计基本上与上述相同。
[0211] 清楚的速率响应是明显的。示于表3中的结果证明转殖项5307的效果在保护植物免受墨西哥玉米根虫采食损害方面比得上商业的标准品。
[0212] 表3.转殖项5307的效果与用于陇中的抗墨西哥玉米根虫的商业的杀虫剂进行比较
[0213]
[0214] 在本说明书中提到的所有公开文件以及专利申请对于本发明相关领域的普通技术人员的技术水平是指示性的。所有公开文献和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开文献或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。
[0215] 虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和举例的方式在一定详细程度上描述了以上发明，显然的是在本发明的范围内可以进行某些改变和变更。实例8.在玉蜀黍中用于靶向整合的转殖项5307插入位点的用途
[0216] 在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中披露的转殖项5307侧翼序列被用来检索玉米基因组数据库。与两个侧翼序列相同的匹配被发现于染色体5的BAC克隆ZMMBBc0077H14上(NCBI登录号AC202955)。更具体地说，该转殖项5307插入片段位于5′标记(在此称为公开的分子标记umcl475(SEQ ID No：104))与3′标记(在此称为公开的分子标记uazl90(SEQ ID No：107))之间。使用这个信息，可以确定的是被插入到转殖项5307中的该异源DNA替换了玉米基因组DNA的38个核苷酸，它位于5′侧翼序列(缺失的序列的上游)与3′侧翼序列(缺失的序列的下游)之间。用于鉴定分子标记uazl90有用的引物被列出为SEQ ID NO：108和109。用于鉴定分子标记umcl475有用的引物被列出为SEQ ID NO：105和106。为了精细绘制插入位点的目的，进一步开发了多种标记。这些标记被命名为SMl108C、SM0584B、SM0377D以及SM0501D。用于检测这些标记有用的引物和探针如下：SMl108C(SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：93)、SM0584B(SEQ ID NO：94至SEQ ID：96)、SM0377D(SEQ ID NO：97至SEQ ID NO：99)、以及SM0501D(SEQ ID NO：100至SEQ ID NO：102)。
[0217] 转殖项5307的转基因在大田条件下经过几代的一致农艺学性能说明这些在转殖项5307插入位点周围的被鉴定的区域为其他感兴趣的转基因基因的靶向整合提供了良好的基因组位置。这种靶向整合克服了所谓的“位置效应”的问题、以及当转基因整合进入宿主时在基因组中产生突变的风险。这种靶整合的其他的优点包括但不限于，减少在获得转基因植物(该植物展示所希望水平的转基因表达而不同样展示由该转基因的不经意的插入至宿主基因组中的重要的位置导致的异常)之前必须筛选和测试大量数目的转化转殖项。另外，这种靶向整合允许堆叠转基因使得具有两种基因的良种植物系的育种更有效。
[0218] 使用以上披露的传授内容，普通技术人员能够使用本领域已知的方法来将转基因靶向到与转殖项5307中相同的插入位点或靶向到紧密接近于5307中的插入位点的一个位点。一种这样的方法披露于美国专利申请公开号20060253918中，其全部内容通过引用结合在此。简言之，位于插入位点5′侧翼的高达20Kb的基因组序列(SEQ ID NO：5)和位于插入位点3′侧翼的高达20Kb的基因组序列(SEQ ID NO：6)也被用来使其位于旨在通过同源重组插入染色体5上的基因组位置中的一个或多个感兴趣的基因的侧翼。这些序列可进一步被安排有T-DNA边缘重复侧翼，如左侧边缘(LB)及右侧边缘(RB)的重复序列以及其他加强序列以增强T-DNA的递送效率。一个或多个感兴趣的基因能像在转殖项5307插入位点处完全一样地放置或能被放置在转殖项5307插入位点周围的20Kb区域之内的任何位置，以赋予一致水平的转基因表达而不对该植物造成有害的影响。包含一个或多个感兴趣的基因及侧翼序列的DNA载体能通过本领域技术人员已知的几个方法之一(包括但不限于土壤杆菌属介导的转化)被递送至植物细胞中。将DNA载体插入至转殖项5307靶位点能通过几种方法之一(包括但不限于共表达或重组增强基因的上调或内源重组抑制基因的下调)而被进一步加强。此外，本领域中已知在基因组中分裂特异的序列能被用于增加同源重组的频率，因此插入至转殖项5307插入位点及其侧翼区域能通过自然或设计的序列特异的内切核酸酶的表达而加强以分裂这些序列。
[0219] 这种技术的一个实例被证明于Shukla等人(Nature vo1.459，21May2009)中。基于在该目标植物内使用同源序列，为了将异源序列靶向特异的基因座，这种方法使用了锌指核酸酶。本领域的普通技术人员可以将该转殖项5307插入片段用于5′标记(在此命名为公开的分子标记umcl475(SEQ ID No：104))与3′标记(在此命名为公开的分子标记uazl90(SEQ ID No：107))之间从而产生用于靶向插入的基因座。
[0220] 实例9.转殖项5307插入位点及侧翼序列用于稳定基因表达的用途
[0221] 当在玉蜀黍和其他农作物的其他基因组位置中作为转基因被插入时，位于转殖项5307插入位点侧翼的基因组序列也可被用来稳定其他的一个或多个或感兴趣的基因的表达。具体而言，位于插入位点5′侧翼的高达20Kb的基因组序列(SEQ ID NO：5)和位于插入位点3′侧翼的高达20Kb的基因组序列(SEQ ID NO：6)也被使其位于旨在插入植物基因组的一个或多个感兴趣的基因的侧翼。这些序列可进一步安排有T-DNA边缘重复侧翼，如左侧边缘(LB)及右侧边缘(RB)的重复序列以及其他的加强序列以增强T-DNA的递送效率。一个或多个感兴趣的基因能像在转殖项5307插入位点处完全一样地放置或能被放置在转殖项5307插入位点周围的20Kb区域之内的任何位置，以赋予一致水平的转基因表达。包含一个或多个感兴趣的基因以及转殖项5307插入位点侧翼序列的DNA载体能通过本领域技术人员已知的几个方法中的一种方法(包含但不限于原生质体转化、基因枪轰击以及土壤杆菌属介导的转化)被递送至植物细胞中。被递送的DNA能够被随机整合至植物基因组中或也能作为独立分离的遗传单位(例如人工染色体或微型染色体)的一部分出现。包含一个或多个感兴趣的基因的DNA载体及转殖项5307插入位点侧翼序列也能被递送至植物细胞中。因此，通过用位于基因组序列侧翼的转殖项5307插入位点围绕一个或多个感兴趣的基因，这类基因的表达在转基因宿主植物(例如双子叶植物或单子叶植物，像玉米)中得到稳定。
[0222] 保藏
[0223] 申请人已经在2008年10月15日将以上披露的转殖项5307的玉米种子，根据布达佩斯条约，保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，ATCC登记号为PTA-9561。 此保藏将在该保藏机构保存30年，或在最后一次要求之后的5年，或本专利的有效期内，以更长的为准，且此时期内如果必须将被替换。诸位申请人对从ATCC获得所保藏的物质没有限制；然而，诸位申请人无权免除法律在转移生物材料或其在商业上的运输方面所施加的任何限制。
[0224] 在本说明书中所引用的所有公开文献和已公开的专利文件均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开文献或专利文件被确切地并单独地指明通过引用而结合。
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