一种抗肝坏死与纤维化的SiRNA表达模板
阅读：242发布：2023-01-16
专利汇可以提供一种抗肝坏死与纤维化的SiRNA表达模板专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种抗肝 坏死 与 纤维 化的siRNA表达模板。发明设计了一段阻断TBR介导转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)的 信号 转导途径的SiRNA表达模板，将模板插入到siRNA表达载体pRNAT－U6.1/Neo中，得到重组表达质粒pRNA－TBR I。通过 转染 3T3 成纤维细胞 ，MTT法筛选，及动物实验验证，重组表达质粒pRNA－TBR I能十分有效地阻断肝纤维化 进程 、改善肝脏功能，为开发 治疗 慢性 肝炎 和血吸虫肝硬化 疾病 的基因药物开辟了一条新途径。，下面是一种抗肝坏死与纤维化的SiRNA表达模板专利的具体信息内容。
技术领域
本发明涉及基因片段，具体涉及一种抗肝坏死与纤维化的siRNA表达模板。
背景技术
病毒性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝、日本血吸虫病等导致的慢性肝病是我国最常见 的疾病、多发病。慢性肝病(主要是慢性病毒性肝炎)的重要病理基础是肝纤维化。肝纤维 化的发生是机体对炎症的修复反应，如同瘢痕形成一样。肝穿标本分析表明轻型慢性肝 炎发生纤维化者有62.6％，中、重度者为100％；日本血吸虫病性肝纤维化是日本血吸虫 病的严重后果。其慢性肝病通过纤维化的发展走向肝硬化，乃至发生门脉高压，肝性脑 病甚至肝癌等严重并发症。如能阻断、减轻肝纤维化，就能在很大程度上改善肝病的预 后，因而成为肝病治疗的一个方向。
转化生长因子β(TGFβ)是肝纤维化形成过程中最重要的细胞因子之一，它通过自 分泌和旁分泌方式，对细胞的分裂增殖具有促进或抑制双重作用，是目前与肝纤维化相 关的肝脏贮脂细胞(又称肝星状细胞)重要的细胞调节因子。TGFβ的信号转导首先是通过 靶细胞膜上的特异性受体而介导的。其功能性受体主要为I型受体(TβR I)和II型受 体(TβR II)，TβR I为介导TGFβ促细胞外基质合成的信号通道，TβR II则与细胞增殖、 分化密切相关。因此，利用基因治疗抗肝纤维化的关键在于阻断TGFβ特异性受体介导 TGFβ的信号转导途径。
随着基因治疗技术的迅速发展，RNA干扰技术已显示出广阔前景，用RNAi干扰技 术制备治疗抗肝纤维化的基因药物是值得探索的重要课题。
转化生长因子β(TGFβ)是肝纤维化形成过程中最重要的细胞因子之一，它通过自 分泌和旁分泌方式，对细胞的分裂增殖具有促进或抑制双重作用，是目前与肝纤维化相 关的肝脏贮脂细胞(又称肝星状细胞)重要的细胞调节因子。TGFβ的信号转导首先是通过 靶细胞膜上的特异性受体而介导的。其功能性受体主要为I型受体(TβR I)和II型受 体(TβR II)，TβR I为介导TGFβ促细胞外基质合成的信号通道，TβR II则与细胞增殖、 分化密切相关。因此，利用基因治疗抗肝纤维化的关键在于阻断TGFβ特异性受体介导 TGFβ的信号转导途径。
随着基因治疗技术的迅速发展，RNA干扰技术已显示出广阔前景，用RNAi干扰技 术制备治疗抗肝纤维化的基因药物是值得探索的重要课题。
发明内容
本发明旨在采用siRNA技术阻断TGFβ I型受体介导TGFβ的信号转导途径，使肝 脏贮脂细胞和枯否细胞的激活受到抑制，从而十分有效地阻断肝纤维化进程，改善肝脏 功能，实现抗肝纤维化的治疗。
实现本发明目的的技术方案为：
设计一段阻断TBR介导转化生长因子β的信号转导途径的SiRNA表达模板，该模 板的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
下面结合附图进一步详述本发明：
实现本发明目的的技术方案为：
设计一段阻断TBR介导转化生长因子β的信号转导途径的SiRNA表达模板，该模 板的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
下面结合附图进一步详述本发明：
附图说明
图1SiRNA表达模板设计与作用示意图；
①.SiRNA表达模板设计示意图(以TBR I-3为例)
②.对照用six2模板设计示意图
③.SiRNA表达模板作用示意图(以TBR I-3为例)
图2pRNAT-U6.1/Neo质粒和靶序列模板酶切图谱；
①.退火后模板DNA ②.酶切后质粒 ③.酶切前质粒
图3阳性克隆测序结果；
图4正常组病理切片(放大倍数10×10×)
图5病理组切片(放大倍数10×10×)
图6治疗组病理切片(放大倍数10×10×)。
本发明分别设计了三段TGFβ I靶基因SiRNA表达模板以及一段与TGFβ I序列无关 的对照模板six2(见图1)，将SiRNA表达模板与对照模板分别插入到siRNA表达载体 pRNAT-U6.1/Neo(GenScript公司产品)中，得到重组表达质粒pRNA-TBR I-1、 pRNA-TBR I-2、pRNA-TBR I-3以及空白对照pRNA-six2。通过转染成纤维细胞(3T3 细胞)与MTT法筛选，筛选了效果最明显的一对模板，然后进行动物实验验证。
一、siRNA模板序列的设计
GeneScript公司提供了在线siRNA模板序列设计的软件，利用该软件可设计siRNA 模板序列，本研究设计了3对siRNA模板及一个空白对照(分别命名为TBR I-1、 TBR I-2、TBR I-3、six2；)供实验筛选，模板序列如下：
TBR1-1：
5′GATCCCG TTGATGCCTTCCTGTTGACTGTTCAAGAGA CAGTCAACAGGAAGGCATCAATTTTTTCCAAA 3′
3′ GGC AACTACGGAAGGACAACTGACAAGTTCTCT GTCAGTTGTCCTTCCGTAGTTAAAAAAGGTTTTCGA 5′
TBR1-2：
5′GATCCC ACAAACGGCCTATCTCGAGGATTCAAGAGA TCCTCGAGATAGGCCGTTTGTTTTTTTCCAAA 3′
3′ GG TGTTTGCCGGATAGAGCTCCTAAGTTCTCT AGGAGCTCTATCCGGCAAACAAAAAAAGGTTTTCGA 5′
TBR1-3：
5′GATCCCG TAAATCTCTGCCTCACGGAACTTCAAGAGA GTTCCGTGAGGCAGAGATTTATTTTTTCCAAA 3′
3′ GGC ATTTAGAGACGGAGTGCCTTGAAGTTCTCT CAAGGCACTCCGTCTCTAAATAAAAAAGGTTTTCGA 5′
Six2：
5′GATCC GGGTCTTACATAAGAGGACTTTAGTACT AGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTA 3′
3′ G CCCAGAATGTATTCTCCTGAAATCATGA TCAGGAGAATACATTCTGGAAAAATTCGA 5′
二、将合成的模板与酶切好的质粒连接，并转染DH5α感受态细菌
1.将siRNA表达质粒pRNAT-U6.1/Neo用EcoR I(Promega公司)、BamH I(Promega 公司)进行双酶切(37℃水浴箱切4小时，酶切体系见表1)，酶切产物进行厚琼脂糖凝胶 电泳(结果见图2)，用胶纯化试剂盒(Promega公司产品)纯化回收酶切后的线性质粒条带 (操作按说明书进行)，-20度冰箱保存备用。
表1pRNAT-U6.1/Neo质粒酶切体系
Buffer H(Promega公司) 2ul
EcoR I 1ul
BamH I 1ul
质粒pRNAT-U6.1/Neo 5ul
蒸馏水 11ul
总量 20ul
2.将合成的siRNA模板DNA于95℃水浴5分钟变性，然后自然冷却退火。
3.将步骤2处理后的DNA分别与酶切回收的质粒用T4连接酶(Promega公司产品) 16℃连接过夜，连接体系见表2。将连接后产物转化大肠杆菌DH5α感受态态细菌(晶美 公司产品)，铺Amp+LB细菌培养板(氨苄青霉素含量100μg/ml，下同)，37℃细菌培 养箱培养过夜。
表2连接反应体系
T4Buffer(Promega公司) 1.5ul
质粒pRNAT-U6.1/Neo(己酶切并
3ul
纯化)
siRNA模板DNA 9ul
T4连接酶 1.5ul
总量 15ul
三、挑阳性克隆进行测序鉴定，以确定siRNA模板是否已正确插入质粒
挑取Amp+LB细菌培养板上阳性菌落接种10mlAmp+LB液体细菌培养基，37℃摇床、 230(转/分钟)扩增过夜，质粒提取试剂盒(QIAGEN公司产品)抽提质粒，送大连宝 生物公司测序。测序结果见图3。
四、体外细胞筛选实验
每对模板选择一个经测序证实已经正确插入载体的克隆，分别大量扩增选择的克隆 并用质粒提取试剂盒抽提质粒，再用乙醇进行无菌处理(加入95％乙醇于-80℃固定3 小时；16000rpm离心30分钟，去上清，再用70％乙醇重悬后于-80℃冷冻2小时去盐； 16000rpm离心30分钟，适量无菌去离子水溶解沉淀)后，采用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司)脂质体介导转染3T3细胞，经G418(Geneticin，氨基糖苷类抗生素， Promega公司产品)筛选：起初200μg/ml，两天后换液加至400μg/ml，再过两天换液加到 800μg/ml，维持800μg/ml至空白对照组细胞全部死亡后改为300μg/ml。筛选后建立的稳 定细胞株，分别命名为TBR I-1-3T3细胞、TBR I-2-3T3细胞、TBR I-3-3T3细胞、six2-3T3 细胞。分别消化收集稳定细胞株细胞，以1×105个/ml的密度种96孔平底细胞培养板， 48小时后加MTT(四唑盐，5mg/ml)20μl，继续5％CO2细胞培养箱培养4小时，去孔 内培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)充分溶解孔内形成的甲瓒颗粒，酶标仪 570nm波长检测各孔OD值，统计软件SPSS 10.0分析结果(见表3)。
表3pRNA-TBR I稳定细胞株生长对比实验结果 稳定细胞株 实验孔OD值 ( x±s) six2-3T3细胞对照 ( x±s) TBR I-1-3T3细胞 TBR I-2-3T3细胞 TBR I-3-3T3细胞 1.803±0.211 1.911±0.207 1.611±0.126** 1.956±0.141
**该组P＜0.05，效果显著，进行动物试验进一步验证。
五、动物实验：
取体重150～200g雌性SD大鼠15只(购自中南大学湘雅附二院动物实验中心)， 标准饲料，自由饮水，随机分成3组：正常组、病理组、RNAi治疗组各5只。用60％CCl4 的橄榄油溶液0.3ml/(100g大鼠体重)皮下注射SD大鼠(正常组用等体积生理盐水代替， 每周2次、共6周)制备肝纤维化模型。治疗组在造模6周后按5ug/(20g大鼠体重)的剂 量皮下注射RNAi载体，病理组及正常给予等体积生理盐水，各组实验动物在最后一次 给药后2天处死，取肝组织作组织学及病理检查(结果见表4、图4～图6)。
表4pRNA-TBR I-3动物试验病理切片结果 项目 分组 切片数 肝细胞坏死 肝细胞变性 肝细胞脂变 淋巴细胞浸 润 肝细胞桥状 坏死 正常组 病理组 治疗组 5 5 5 - ++ - - ++ - ± +++ + - ++ - - ++ -
由表4病理切片结果结合图4～图6说明：
经pRNA-TBR I-3治疗后，大鼠肝细胞脂肪变明显减少；坏死、变性肝细胞消失； 没有进一步向肝纤维化发展(无肝细胞桥状坏死)。说明pRNA-TBR I-3能明显改善肝细 胞坏死，阻止肝纤维化发生。
<110>苏先狮
<120>一种抗肝坏死与纤维化的SiRNA表达模板
<160>1
<210>1
<211>69
<212>DNA
<213>SiRNA表达模板
<220>
<400>1
gatcccgtaa atctctgcct cacggaactt caagagagtt ccgtgaggca gagatttatt 60
ttttccaaa 69
①.SiRNA表达模板设计示意图(以TBR I-3为例)
②.对照用six2模板设计示意图
③.SiRNA表达模板作用示意图(以TBR I-3为例)
图2pRNAT-U6.1/Neo质粒和靶序列模板酶切图谱；
①.退火后模板DNA ②.酶切后质粒 ③.酶切前质粒
图3阳性克隆测序结果；
图4正常组病理切片(放大倍数10×10×)
图5病理组切片(放大倍数10×10×)
图6治疗组病理切片(放大倍数10×10×)。
本发明分别设计了三段TGFβ I靶基因SiRNA表达模板以及一段与TGFβ I序列无关 的对照模板six2(见图1)，将SiRNA表达模板与对照模板分别插入到siRNA表达载体 pRNAT-U6.1/Neo(GenScript公司产品)中，得到重组表达质粒pRNA-TBR I-1、 pRNA-TBR I-2、pRNA-TBR I-3以及空白对照pRNA-six2。通过转染成纤维细胞(3T3 细胞)与MTT法筛选，筛选了效果最明显的一对模板，然后进行动物实验验证。
一、siRNA模板序列的设计
GeneScript公司提供了在线siRNA模板序列设计的软件，利用该软件可设计siRNA 模板序列，本研究设计了3对siRNA模板及一个空白对照(分别命名为TBR I-1、 TBR I-2、TBR I-3、six2；)供实验筛选，模板序列如下：
TBR1-1：
5′GATCCCG TTGATGCCTTCCTGTTGACTGTTCAAGAGA CAGTCAACAGGAAGGCATCAATTTTTTCCAAA 3′
3′ GGC AACTACGGAAGGACAACTGACAAGTTCTCT GTCAGTTGTCCTTCCGTAGTTAAAAAAGGTTTTCGA 5′
TBR1-2：
5′GATCCC ACAAACGGCCTATCTCGAGGATTCAAGAGA TCCTCGAGATAGGCCGTTTGTTTTTTTCCAAA 3′
3′ GG TGTTTGCCGGATAGAGCTCCTAAGTTCTCT AGGAGCTCTATCCGGCAAACAAAAAAAGGTTTTCGA 5′
TBR1-3：
5′GATCCCG TAAATCTCTGCCTCACGGAACTTCAAGAGA GTTCCGTGAGGCAGAGATTTATTTTTTCCAAA 3′
3′ GGC ATTTAGAGACGGAGTGCCTTGAAGTTCTCT CAAGGCACTCCGTCTCTAAATAAAAAAGGTTTTCGA 5′
Six2：
5′GATCC GGGTCTTACATAAGAGGACTTTAGTACT AGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTA 3′
3′ G CCCAGAATGTATTCTCCTGAAATCATGA TCAGGAGAATACATTCTGGAAAAATTCGA 5′
二、将合成的模板与酶切好的质粒连接，并转染DH5α感受态细菌
1.将siRNA表达质粒pRNAT-U6.1/Neo用EcoR I(Promega公司)、BamH I(Promega 公司)进行双酶切(37℃水浴箱切4小时，酶切体系见表1)，酶切产物进行厚琼脂糖凝胶 电泳(结果见图2)，用胶纯化试剂盒(Promega公司产品)纯化回收酶切后的线性质粒条带 (操作按说明书进行)，-20度冰箱保存备用。
表1pRNAT-U6.1/Neo质粒酶切体系
Buffer H(Promega公司) 2ul
EcoR I 1ul
BamH I 1ul
质粒pRNAT-U6.1/Neo 5ul
蒸馏水 11ul
总量 20ul
2.将合成的siRNA模板DNA于95℃水浴5分钟变性，然后自然冷却退火。
3.将步骤2处理后的DNA分别与酶切回收的质粒用T4连接酶(Promega公司产品) 16℃连接过夜，连接体系见表2。将连接后产物转化大肠杆菌DH5α感受态态细菌(晶美 公司产品)，铺Amp+LB细菌培养板(氨苄青霉素含量100μg/ml，下同)，37℃细菌培 养箱培养过夜。
表2连接反应体系
T4Buffer(Promega公司) 1.5ul
质粒pRNAT-U6.1/Neo(己酶切并
3ul
纯化)
siRNA模板DNA 9ul
T4连接酶 1.5ul
总量 15ul
三、挑阳性克隆进行测序鉴定，以确定siRNA模板是否已正确插入质粒
挑取Amp+LB细菌培养板上阳性菌落接种10mlAmp+LB液体细菌培养基，37℃摇床、 230(转/分钟)扩增过夜，质粒提取试剂盒(QIAGEN公司产品)抽提质粒，送大连宝 生物公司测序。测序结果见图3。
四、体外细胞筛选实验
每对模板选择一个经测序证实已经正确插入载体的克隆，分别大量扩增选择的克隆 并用质粒提取试剂盒抽提质粒，再用乙醇进行无菌处理(加入95％乙醇于-80℃固定3 小时；16000rpm离心30分钟，去上清，再用70％乙醇重悬后于-80℃冷冻2小时去盐； 16000rpm离心30分钟，适量无菌去离子水溶解沉淀)后，采用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司)脂质体介导转染3T3细胞，经G418(Geneticin，氨基糖苷类抗生素， Promega公司产品)筛选：起初200μg/ml，两天后换液加至400μg/ml，再过两天换液加到 800μg/ml，维持800μg/ml至空白对照组细胞全部死亡后改为300μg/ml。筛选后建立的稳 定细胞株，分别命名为TBR I-1-3T3细胞、TBR I-2-3T3细胞、TBR I-3-3T3细胞、six2-3T3 细胞。分别消化收集稳定细胞株细胞，以1×105个/ml的密度种96孔平底细胞培养板， 48小时后加MTT(四唑盐，5mg/ml)20μl，继续5％CO2细胞培养箱培养4小时，去孔 内培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)充分溶解孔内形成的甲瓒颗粒，酶标仪 570nm波长检测各孔OD值，统计软件SPSS 10.0分析结果(见表3)。
表3pRNA-TBR I稳定细胞株生长对比实验结果 稳定细胞株 实验孔OD值 ( x±s) six2-3T3细胞对照 ( x±s) TBR I-1-3T3细胞 TBR I-2-3T3细胞 TBR I-3-3T3细胞 1.803±0.211 1.911±0.207 1.611±0.126** 1.956±0.141
**该组P＜0.05，效果显著，进行动物试验进一步验证。
五、动物实验：
取体重150～200g雌性SD大鼠15只(购自中南大学湘雅附二院动物实验中心)， 标准饲料，自由饮水，随机分成3组：正常组、病理组、RNAi治疗组各5只。用60％CCl4 的橄榄油溶液0.3ml/(100g大鼠体重)皮下注射SD大鼠(正常组用等体积生理盐水代替， 每周2次、共6周)制备肝纤维化模型。治疗组在造模6周后按5ug/(20g大鼠体重)的剂 量皮下注射RNAi载体，病理组及正常给予等体积生理盐水，各组实验动物在最后一次 给药后2天处死，取肝组织作组织学及病理检查(结果见表4、图4～图6)。
表4pRNA-TBR I-3动物试验病理切片结果 项目 分组 切片数 肝细胞坏死 肝细胞变性 肝细胞脂变 淋巴细胞浸 润 肝细胞桥状 坏死 正常组 病理组 治疗组 5 5 5 - ++ - - ++ - ± +++ + - ++ - - ++ -
由表4病理切片结果结合图4～图6说明：
经pRNA-TBR I-3治疗后，大鼠肝细胞脂肪变明显减少；坏死、变性肝细胞消失； 没有进一步向肝纤维化发展(无肝细胞桥状坏死)。说明pRNA-TBR I-3能明显改善肝细 胞坏死，阻止肝纤维化发生。
<110>苏先狮
<120>一种抗肝坏死与纤维化的SiRNA表达模板
<160>1
<210>1
<211>69
<212>DNA
<213>SiRNA表达模板
<220>
<400>1
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