发明领域

本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提 供包括一种有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列的一种组合物。本 发明还提供一种生产在有序的和重复的排列中的抗原或抗原决定簇的 方法。有序的和重复的抗原或抗原决定簇，在传染病治疗、过敏反应 治疗疫苗的生产中，以及作为一种预防或治疗癌和产生规定的自身特 异性抗体的药用疫苗(pharmaccine)是有用的。

相关技术

传染病预防疫苗的发展已经对人类的健康发挥了医学发明的最大 影响。据估计，全世界每年有三百万例死亡通过接种而被避免 (Hillemann，天然医学分册(Nature Medicine)4：507(1998))。最常 见的接种策略—使用减毒(也就是说，毒性较低)的病原体或密切相关 的生物体，最初由Edward Jenner在1796年作出证明，他通过给药一 种危险较低的牛痘病毒来接种抗天花。虽然许多活减毒病毒(例如麻 疹、腮腺炎、风疹、水痘、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒)和细 菌(例如抗肺结核的卡介苗(BCG))被成功地给药用于接种，但是存在发 展与毒性回复以及被“疫苗”生物体感染相关的严重并发症的危险， 特别是在无免疫应答的个体中。

现在利用重组DNA技术(也就是说，遗传工程)，通过产生缺失或 突变变体，能够进行减毒病毒的特异性设计。例如，已经证明给药一 种具有nef基因内部缺失的工程猴免疫缺陷病毒(SIV)，将保护短尾猿 抗致病性SIV菌株的继发性感染(Daniel等，科学(Science) 258：1938-1941(1992))。然而，在给药减毒SIV的动物中，获得性免 疫缺陷综合症(AIDS)一样症状的进展，提出了安全性忧虑(Babe等，科 学(Science)267：1820-1825(1995))。

作为备选的方法，减毒的病毒或细菌可以作为那些被认为太不安 全以致不能以减毒的形式给药的病原体的抗原编码基因的载体(例如， 人免疫缺陷病毒(HIV))。一旦抗原编码基因被投递给宿主，此抗原就 在原位合成。牛痘及相关的禽痘病毒已经在临床前及临床研究中被用 作各种基因的载体(例如，Shen等，科学(Science)252：440(1991))。 这种接种策略的一个不利之处是：它不能模拟病毒粒子的表面，因为 重组蛋白在宿主细胞的表面表达。此外，正如威胁生命的散布性牛痘 感染所证明的一样，在无免疫应答的个体中可能会发展并发症 (Redfield，新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)316：673((1998))。

第四种接种方法涉及病原体的分离成分的使用，这些成分或者从 体外培养的病原体纯化(例如，流感病毒凝集素或神经氨酸酶)，或者 在异源表达单个病毒蛋白之后纯化(例如，乙肝表面抗原)。例如，重 组的、突变的毒素(已解毒)用于接种，抗白喉、破伤风、霍乱和百日 咳毒素(Levine等，New generation vaccines，2nd edn.，Marcel Dekker，Inc.，New York)，并作为一种诱导抗HIV的中和抗体的手 段对HIV重组蛋白(gp120和全长的gp160)做了评价，结果令人失望 (Connor等，病毒学杂志(J.Virol.)72：1552(1998))。最近，用可 溶性寡聚gp160获得了有希望的结果，这种寡聚gp160能够诱导CTL 应答，并且引起具有中和活性的抗HIV-1分离物的抗体(Van Cortt等， 病毒学杂志(L.Virol.)71：4319(1997))。此外，在其中将已知的抗 原B-或T-细胞表位偶联到设计要通过刺激T-细胞辅助作用而增强此 表位的免疫原性的载体分子上的肽疫苗，也可使用。然而，这种方法 的一个重要问题是：总体上，它提供一个针对此蛋白的有限的免疫应 答。而且，必须为不同的MHC单倍型单独设计疫苗。这类疫苗的最严 重的忧虑是：保护性抗病毒抗体识别这些肽所不能模拟的复杂的三维 结构。

一种更新的接种策略是DNA疫苗的使用(Donnelly等，免疫学年 评(Ann.Rev.Immunol.)15：617(1997))，这种策略可以产生MHC- I限制性CTL应答(不使用活载体)。这种策略可通过将与相同病毒的 许多毒株有关的保守性内部蛋白的表位作为靶位，提供抗一种病毒之 不同毒株的更广泛的保护作用。因为所生产的蛋白具有哺乳动物的翻 译后修饰、构象和寡聚反应，所以它更可能与病毒感染所产生的野生 型蛋白相似或相同，而不是更可能与重组或化学修饰的蛋白相似或相 同。然而，这种差别可能成为应用细菌抗原的不利之处，因为非天然 的翻译后修饰可能导致免疫原性的降低。此外，病毒表面蛋白在缺少 基质蛋白的条件下不是高度有组织的。

除了传染病预防的应用之外，疫苗技术现在正被用来解决与过敏 反应相关的免疫问题。在过敏性个体中，IgE同种型的抗体在对特定 抗原(过敏原)的不当体液免疫应答中产生。利用过敏反应免疫疗法对 过敏反应进行治疗，必需每周给药持续地增大的剂量的特定过敏原长 达3-5年时间。可能是产生了在过敏原与肥大细胞上的IgE抗体反应 之前就在鼻或呼吸分泌液或在膜中截取过敏原的“封闭性”IgG抗体。 然而，在IgG滴度和症状减轻之间不存在恒定的关系。目前，这是一 种极其耗费时间和成本的方法，仅被考虑用于患有严重症状每年超过 一段被延长的时期的患者。

非常确定的是：单独给药纯化的蛋白通常不足以引起一个强的免 疫应答；分离的抗原通常必须与被称为佐剂的辅助物质一起给药。在 这些佐剂中，已给药的抗原避免了快速降解，而佐剂提供抗原的一个 低水平的膨胀-释放。

不同于分离的蛋白，病毒在缺乏任何佐剂的条件下无论有或没有 T-细胞辅助，都诱导迅速而有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel， 免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)15：235-270(1997))。虽然病毒通 常含有少数蛋白，但是它们能够触发比其分离成分强烈得多的免疫应 答。对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个至关紧要的因子，是 表面表位的重复性和有序性(Bachmann & Zinkernagel，今日免疫学 (Immunol.Today)17：553-558(1996))。许多病毒呈现准晶体表面， 此表面呈现一个有效交联B细胞上表位-特异性免疫球蛋白的表位的 规则排列。这种B细胞表面免疫球蛋白的交联，是一个直接诱导细胞 周期进展和IgM产生的强活化信号。进一步地，这些被激活的B细胞 能够活化辅助T细胞，这些活化的辅助T细胞然后又诱导B细胞中从 IgM到IgG抗体生产的转变，以及长寿的记忆B细胞——这是接种的 目标(Bachmann & Zinkernagel，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.) 15：235-270(1997))。病毒的结构甚至与自身免疫疾病中抗-抗体的产 生相联系，并作为对病原体天然应答的一部分(参见Fehr，T.，等，实 验医学杂志(J.Exp.Med.)185：1785-1992(1997))。因此，病毒颗 粒上组织在一个有序的和重复的排列中的抗原，具有高度免疫原性， 因为它们能直接活化B细胞。

除了强的B细胞应答之外，病毒颗粒还能诱导细胞毒性T细胞应 答的产生，这是免疫系统的另一个重要途径。这些细胞毒性T细胞对 于非细胞病变性病毒，例如HIV或乙型肝炎病毒的消除，以及肿瘤的 根除是特别重要的。细胞毒性T细胞不识别天然的抗原，而是识别它 们的与MHCI类分子结合的降解产物(Townsend & Bodmer，免疫学年 评(Ann.Rev.Immunol.)7：601-624(1989))。巨噬细胞和树突状细 胞能够摄取和加工外源的病毒颗粒(而不是它们的可溶性分离成分)， 并将所产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞，导致其活化和增殖 (Kovacsovics-Bankowski等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)90：4942-4946(1993)；Bachmann等，欧洲免疫学杂志(Eur. J.Immunol.)26：2595-2600(1996))。

病毒颗粒作为抗原，相对于其分离成分表现出两个优势：(1)因为 它们高度重复的表面结构，它们能够直接活化B细胞，产生高抗体滴 度和持久的B细胞记忆；和(2)是病毒颗粒而不是可溶性蛋白，能够诱 导细胞毒性T细胞应答，即使是病毒颗粒没有传染性而且缺乏佐剂。

数种新的疫苗策略使用病毒的固有的免疫原性。一些这样的方法 集中于病毒颗粒的特定性质；例如，参见Harding，C.V.和Song，R. (免疫学杂志(J.Immunology)153：4925(1994))，公开了一种由乳 胶珠子和抗原所组成的疫苗；Kovacscovics-Bankowski，M.，等，(美 国国家科学院院刊(Proc.Proc.Natl.Acad.Sci. USA)90：4942-4946(1993))，公开了一种由氧化铁珠子和抗原所组成 的疫苗；Kossovsky，N.，等的美国专利5,334,394号，公开了用抗原 包被的核心颗粒；美国专利5,871,747号，公开了表面携带一个或多 个共价结合于其上的蛋白的合成聚合物颗粒；和一个至少部分覆盖所 说颗粒的表面、具有一个非共价结合的包被的核心颗粒，以及至少一 个与所说的被包被的颗粒接触的生物活性物质。(例如，参见 WO/94/15585)。

然而，这些病毒模拟系统的一个不利之处是：它们不能再造在病 毒表面所发现的有序的抗原呈递。已经发现，以随机取向偶联到一个 表面上的抗原诱导CTL应答，而没有或仅有微弱的B-细胞应答。对于 一种有效的疫苗，免疫系统的两条途径都必须被强烈活化，正如上面 及Bachmann & zinkernagel，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.) 15：235(1997)所述。

在另一个实例中，重组病毒被用于抗原投递。已经发现，含有一 种被融合到衣壳蛋白的抗原的丝状噬菌体病毒，是高度免疫原性的(参 见Perham R.N.，等，欧洲微生物学会微生物学评论(FEMS Microbiol. Rev.)17：25-31(1995)；Willis等，基因(Gene)128：835-844 (1995))。然而，当融合蛋白以高水平表达时，此系统限制于非常小的 肽(5或6个氨基酸残基)(Iannolo等，分子生物学杂志(J.Mol. Biol.)248：835-844(1995))，或者限于大蛋白的低水平表达(de la Cruz等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 263：4318-4322(1998))。 对于小肽，到目前为止仅观察到CTL应答，而没有或仅有微弱的B-细 胞应答。

在又一个系统中，重组甲病毒被推荐作为一种抗原投递手段(参见 美国专利5,766,602号；5,792,462号；5,739,026号；5,789,245号 和5,814,482号)。到目前为止，所描述的重组病毒系统的问题，包括 异源蛋白在病毒表面低密度表达和/或成功而重复地为不同的用途创 造新而且不同的重组病毒的困难。

在一个进一步的发展中，病毒-样颗粒(VLP)，因为它们的结构性 质以及它们没有传染性的性质，正被用于疫苗生产领域。VLP是按对 称方式，用许多一种或多种类型的蛋白分子构建的超分子结构。它们 缺乏病毒基因组，因此没有传染性。VLP常可通过异源表达而大量生 产，并且容易纯化。

VLP的实例包括乙型肝炎病毒(Ulrich，等，病毒研究(Virus Res.) 50：141-182(1998))，麻疹病毒(Warnes，等，基因(Gene) 160：173-178(1995))，辛德比斯病毒、轮状病毒(美国专利5,071,651 和5,374,426号)，口蹄疫病毒(Twomey等，疫苗(Vaccine) 13：1603-1610，(1995))，诺沃克病毒(Jiang，X.，等，科学 (Science)250：1580-1583(1990)；Matusui，S.M.，等，临床研究杂志 (J.Clin.Invest.) 87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病 毒GAG蛋白(PCT专利申请号WO96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1， 乙肝病毒表面蛋白(WO92/11291)和人乳头瘤(WO98/15631)。在一些 实例中，可以利用重组DNA技术将异源蛋白融合到一种VLP蛋白上 (Kratz，P.A.，等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 96：19151920(1990))。

因此，在本领域中有开发与天然的病原体同样有效地促进强烈的 CTL和B细胞免疫应答的新的改进的疫苗的需要。

发明概括

本发明提供一种允许生产用所期望的抗原包被的颗粒的多用途的 新技术。本技术允许抗传染病的高效疫苗的创造，以及过敏反应和癌 症治疗疫苗的创造。

在第一个实施方案中，本发明提供一种包括(A)一种非天然的分子 支架和(B)一种抗原或抗原决定簇的新组合物。

非天然的分子支架包括(i)一种核心颗粒，选自(1)非天然起源的 核心颗粒(2)天然起源的核心颗粒；以及(ii)一种组织者，包括至少一 个第一结合位点，其中所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说 的核心颗粒上。

此抗原或抗原决定簇具有至少一个第二结合位点，选自(i)一种非 天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点；和(ii)一种 天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点。

本发明通过将第二结合位点经过至少一个非-肽键结合到第一结 合位点上提供一种有序的和重复的抗原排列。因此，抗原或抗原决定 簇及非天然的分子支架通过这种第一和第二结合位点之间的结合被集 合到一起，形成一种有序的和重复的抗原排列(assay)。

在另一个实施方案中，前面所提及的组合物的核心颗粒包括一种 病毒、病毒-样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式。备选 地，核心颗粒可以是一种合成聚合物或一种金属。

在一个特定的实施方案中，组织者可包括至少第一结合位点。第 一和第二结合位点是本发明的组合物的特别重要的元件。在本发明的 各种实施方案中，第一和/或第二结合位点可以是抗原和其抗体或抗体 片段；生物素和亲合素；链亲合素和生物素；受体及其配基；配基结 合蛋白及其配基；相互作用的亮氨酸拉链多肽；氨基及其化学反应基 团；羧基及其化学反应基团；巯基及其化学反应基团；或其组合。

在一个更加优选的实施方案中，本发明提供几乎任何所选择的抗 原与一种病毒、噬菌体、病毒-样颗粒或病毒衣壳颗粒之间的偶联。通 过将一种抗原组织成一种准晶体的“病毒-样”结构，本发明利用宿主 强烈的抗病毒免疫反应来产生一种抗所显示抗原的高度有效的免疫应 答，也就是说，接种。

在一个优选的实施方案中，核心颗粒可以选自：轮状病毒的重组 蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重 组蛋白、逆转录病毒的重组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花 叶病毒的重组蛋白、Flock House Virus的重组蛋白，以及人乳头瘤 病毒的重组蛋白。

在另一个优选的实施方案中，抗原可选自：(1)一种适于诱导抗癌 症细胞免疫应答的蛋白；(2)一种适于诱导抗传染病免疫应答的蛋白； (3)一种适于诱导抗过敏原免疫应答的蛋白；(4)一种适于在家畜中诱 导免疫应答的蛋白。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，第一结合位点和/或第二 结合位点包括一条相互作用的亮氨酸拉链多肽。在最优选的实施方案 中，第一结合位点和/或第二结合位点选自：(1)JUN亮氨酸拉链蛋白 结构域；和(2)FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。

在另一优选的实施方案中，该第一结合位点和/或第二结合位点选 自：(1)遗传工程赖氨酸残基和(2)遗传工程半胱氨酸残基，可化学 连接在一起的两个残基。

本发明的其它实施方案包括本发明的组合物的生产方法及一种使 用所说的组合物进行医学治疗的方法。

应该理解：以上的一般描述和以下的详细描述仅仅是示例性和解 释性的，并且意欲提供所要求保护的发明的进一步解释。

附图简述

图1.Western印迹，证明利用pCYTs∷E2JUN表达载体进行含有 E2-JUN融合蛋白的病毒颗粒的生产。

图2.Western印迹，证明自pTE5’2J∷E2JUN表达载体表达的含有 E2-JUN融合蛋白的病毒颗粒的生产。

图3.Western点印迹，证明细菌及真核表达的FOS-hgh抗原。

图4.HBcAg-JUN在大肠杆菌细胞中的表达。

图5.Western印迹，证明HBcAg-JUN在大肠杆菌裂解物中是可溶

的。

图6.HBcAg-JUN衣壳颗粒在蔗糖密度梯度上富集的SDS-PAGE分 析。

图7.hGH-FOS与HBcAg-JUN颗粒偶联的非还原SDS-PAGE分析。

优选实施方案的详述 1.定义

提供以下定义来阐明发明人认为是本发明的主题。

甲病毒：当在本文使用时，术语“甲病毒”是指包括在甲病毒属 (the genus Alphavirus)内的任何RNA病毒。该属成员的描述包括在 Strauss和Strauss，微生物评论(Micro.Rev.)，58：49-562(1994) 中，甲病毒的实例包括Aura virus(奥拉病毒)，Bebaru virus， Cabassou Virus，Chikungunya virus(基孔贡亚病毒)，Easter equine encephalomyelitis virus(东部马脑脊髓炎病毒)，Fort morgan Virus，Getah Virus(盖塔病毒)，Kyzylagach virus，Mayoaro virus， Middleburg Virus，Mucambo virus，Ndumu virus，Pixuna virus， Tonate virus，Triniti virus，Una virus(乌纳病毒)，Western equine encephalomyelitis virus(西部马脑脊髓炎病毒)，Whataroa virus， Sindibis Virus(SIN)(辛德比斯病毒)，Semliki virus(SFV)(塞姆利 基森林病毒)，Venezuelan equine encephalomyelitis Virus(VEE)(委内瑞拉马脑脊髓炎病毒)，Ross River virus。

抗原：当在本文使用时，术语“抗原”是一种能够被抗体结合的 分子。抗原还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞 免疫应答。抗原可具有一个或多个表位(B-和T-表位)。以上所提及的 特异性应答，意在说明，抗原将会以高度选择性的方式与其对应抗体 反应，而不会与其它抗原所激发的其它大量抗体反应。

抗原决定簇：当在本文使用时，术语“抗原决定簇”是指一种抗 原上能被B或T淋巴细胞特异识别的部分。B淋巴细胞通过产生抗体 对外源的抗原决定簇应答，而T淋巴细胞介导细胞免疫。因此，抗原 决定簇或表位是抗原上被各种抗体识别的或者是在MHC的背景下被T 细胞受体识别的那些部分。

结合：当在本文使用时，术语“结合”当它用于第一和第二结合 位点时，是用来指至少一个非-肽键。结合的实质可以是共价的、离子 的、疏水的、极性的、或者其任何组合。

结合位点，第一：当在本文使用时，术语“第一结合位点”是指 “组织者”的一种元件，它自身按随机的方式结合到核心颗粒上，定 位在抗原或抗原决定簇的第二结合位点可以结合到其上。第一结合位 点可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次 级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、维生素A、地高辛配基、金属 离子、苯甲基磺酰氟)，或其一种组合，或其一种化学反应基团。多个 第一结合位点以重复的构型存在于非天然的分子支架的表面。

结合位点，第二：当在本文使用时，术语“第二结合位点”是指 一种与抗原或抗原决定簇结合的元件，定位于非天然的分子支架表面 上的“组织者”的第一结合位点可以结合到其上。抗原或抗原决定簇 的第二结合位点可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合 成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、维生素A、地高 辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或其中一种组合，或其中一种化 学反应基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二结合位点。

核心颗粒：当在本文使用时，术语“核心颗粒”是指提供“组织 者”结合的基础、具有固有的重复性组织的刚性结构。核心颗粒当在 本文使用时，可以是合成过程的产物，或者是生物过程的产物。

顺式作用：当在本文使用时，“顺式作用”序列是指复制酶通过与 其结合从而催化RNA分子的RNA依赖性复制的核酸序列。这些复制事 件导致全长及部分RNA分子的复制，因而，甲病毒亚基因组启动子也 是“顺式作用”序列。顺式作用序列，可以定位在或接近于一个核酸 分子的5′端、3′端，或两端，以及定位在其内部。

融合：当在本文使用时，术语“融合”是指不同来源的氨基酸序 列，通过其编码核酸序列的符合阅读框的组合，在一条多肽链中的组 合。术语“融合”明确包括内部融合，也就是说，除了融合到它的一 个末端之外，不同起源的序列在一条多肽链内部的插入。

异源序列：当在本文使用时，术语“异源序列”是指存在于本发 明的载体中的另一个核苷酸序列。术语“异源序列”还指由本发明的 一种载体中所含有的一个异源DNA序列所编码的任何氨基酸或RNA序 列。异源核酸序列可以编码通常在其所存在的细胞类型表达的蛋白或 RNA分子，或者在其中通常不表达的分子(例如，辛德比斯病毒结构蛋 白)。

分离的：当在本文使用时，当术语“分离的”用来指一种分子时， 此术语是指被从其天然环境中移出的分子。例如，天然存在于活动物 中的多聚核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从天然状态的共存的物质 中分离出的相同的多聚核苷酸或多肽是“分离的”。进一步地，就本发 明而言，一种载体中所含有的重组DNA分子被认为是“分离的”。分离 的RNA分子包括DNA和RNA分子体内或体外的RNA复制产物。分离的 核酸分子进一步包括合成生产的分子。另外，重组宿主细胞中所含有 的载体分子也是分离的。因此，不是所有“分离的”分子都需要纯化。

免疫治疗剂：当在本文使用时，术语“免疫治疗剂”是一种治疗 疾病或紊乱的组合物。更明确地，此术语用来指一种过敏反应治疗方 法或一种癌症治疗方法。

个体：当在本文使用时，术语“个体”是指多细胞生物体，并且 包括植物和动物，更优选地是脊椎动物，甚至更优选地是哺乳动物， 最优选地是人。

低或不可检测的：当在本文使用时，术语“低或不可检测的”，当 它用来指基因表达水平时，是指显著低于该基因被最大诱导时所看到 的表达水平的表达水平(例如，至少低5倍)，或者是利用以下实施例 部分所用的方法不容易检测到的表达水平。

植物凝集素：当在本文使用时，不仅特别地从豆科植物的种子获 取，也从许多其它植物和动物来源获取，具有特定的单糖或寡糖的结 合位点的蛋白。实例包括在糖蛋白的研究中被广泛用作分析和制备试 剂的伴刀豆球蛋白A和麦芽凝集素。

天然起源：当在本文使用时，术语“天然起源”是指全部或其部 分不是合成的，而是在自然界中存在或产生的。

非天然的：当在本文使用时，此术语一般是指并不是来自于自然 界，更明确的，此术语是指来自于人工。

非天然起源：当在本文使用时，术语“非天然起源”一般是指合 成的而不是来自于自然界；更明确地，此术语是指来自于人工。

非天然的分子支架：当在本文使用时，术语“非天然的分子支架” 是指作用是用来提供第一结合位点的一种刚性的和重复的排列的利用 人工制造的任何产物。理想的而不是必要地，这些结合位点成几何级。 非天然的分子支架，其全部或者部分，可以是有机的或者无机的，并 可以是化学合成的或者是生物合成的。非天然的分子支架由以下组成 (a)一种核心颗粒，是天然起源的或者非天然起源的；及(b)一种组织 者，自身包括至少一个第一结合位点，并通过至少一个共价键结合到 一种核心颗粒上。在一个特别优选的实施方案中，非天然的分子支架 可以是病毒、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒、噬菌体、其中一种重组形 式或合成颗粒。

有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列：当在本文使用时，术语 “有序的(ordered)和重复的抗原或抗原决定簇排列”一般是指一种 以抗原或抗原决定簇关于支架的统一的空间排列为特征的、抗原或抗 原决定簇的重复模式。在本发明的一个实施方案中，重复模式可以是 几何模式。一种理想的有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列，将拥 有一种间距为5到15纳米的抗原或抗原决定簇的严格重复的类晶体秩 序。

组织者：当在本文使用时，术语“组织者”用来指一种以非随机 的方式结合到核心颗粒上的为创造一种有序的和重复的抗原排列提供 成核位点的元件。组织者是包括至少一个通过至少一个共价键结合到 一种核心颗粒上的第一结合位点的任何元件。组织者可以是蛋白、多 肽、肽、氨基酸(也就是说，一种蛋白、多肽或肽的一个残基)、糖、 多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧 光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或其一种组 合，或其一种化学反应基团。

允许温度：当在本文使用时，术语“允许温度”是指一种酶在此 温度下具有相对高水平的催化活性的温度。

纯化的：当在本文使用时，当术语“纯化的”用来指一种分子时， 它的意思是被纯化的分子的浓度相对于在其天然的环境中与其相关的 分子已被提高。天然相关的分子包括蛋白、核酸、脂和糖，但是一般 不包括水、缓冲液，以及被加入以维持正在纯化的分子的完整性或帮 助正在纯化的分子的纯化的试剂。例如，即使mRNA在寡脱氧胸苷酸 (oligo dT)层析期间被一种水性溶剂稀释了，如果天然相关的核酸和 其它生物分子不结合到柱子上，而是与所研究的mRNA分子分离，那么 mRNA分子就可以利用这种层析方法纯化。

受体：当在本文使用时，术语“受体”是指能与另一种被称为配 基的分子相互作用的蛋白或糖蛋白或其片段。配基可以属于任何种类 的生化或化学化合物。受体不必是膜结合蛋白。可溶性蛋白，例如， 麦芽糖结合蛋白或视黄醇结合蛋白也是受体。

残基：当在本文使用时，术语“残基”意在指多肽主链或侧链中 的一个特定的氨基酸。

温度敏感：当在本文使用时，术语“温度敏感”是指一种酶在一 个温度容易地催化一种反应，但在另一种温度缓慢地催化同样的反应 或根本不催化这种反应。温度敏感性酶的一个实例是由pCYTts载体所 编码的在低于34℃的温度有容易检测到的复制酶活性而在37℃具有 低的或不可检测的活性的复制酶蛋白。

转录：当在本文使用时，术语“转录”是RNA聚合酶催化从DNA 模板生产RNA分子。

重组宿主细胞：当在本文使用时，术语“重组宿主细胞”是指向 其中导入了本发明的一种或多种核酸分子的宿主细胞。

重组病毒：当在本文使用时，术语“重组病毒”是指一种利用人 工被遗传修饰过的病毒。此术语包括本领域中公知的任何病毒。更特 定地，术语是指通过人工被遗传修饰过的甲病毒，最特定地，此术语 是指被人工遗传修饰过的辛德比斯病毒。

限制性温度：当在本文使用时，术语“限制性温度”是指一种酶 在此温度具有低或不可检测的水平的催化活性的温度。“热”和“冷” 敏感的突变体都是公知的，因此，一种限制性温度可以低于或高于允 许温度。

RNA依赖性RNA复制事件：当在本文使用时，术语“RNA依赖的 RNA复制事件”是指使用一种RNA分子作为模板，导致一种RNA分子 形成的方法。

RNA依赖性RNA聚合酶：当在本文使用时，术语“RNA依赖性RNA 聚合酶”是指催化从一种RNA分子生产另一种RNA分子的聚合酶。此 术语在这里与术语复制酶”同义使用。

非翻译的RNA：当在本文使用时，术语“非翻译的RNA”是指一种 不编码开放阅读框，或编码开放阅读框或其部分、但却是按照一种不 会产生氨基酸序列的方式(例如，不存在启始密码子)的RNA序列或分 子。这些分子的实例是tRNA分子、rRNA分子，和核酶。

载体：当在本文使用时，术语“载体”是指一种用来将遗传物质 转移进宿主细胞的物质。载体可以包括DNA或RNA。

一(one，a或an)：当术语“一”被用于本公开时，它们的意思是 “至少一种/个”或“一种/个或多种/个”，除非另有说明。 2.有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列的组合物以及制备同样的组 合物的方法

所公开的发明提供包括一种有序的和重复的抗原或抗原决定簇的 组合物。进一步地，本发明方便地使实施者能够构建用于包括传染病 预防、过敏反应治疗及癌症治疗的各种治疗目的的、有序的和重复的 抗原或抗原决定簇排列。

本发明的组合物基本上包括两个元件：(1)一种非天然的分子支 架；及(2)具有至少一个能够通过至少一个非-肽键结合到所说的第一 结合位点上的所说的第二结合位点的抗原或抗原决定簇。

非天然的分子支架包括(a)一种核心颗粒，选自(1)一种非天然起 源的核心颗粒和(2)一种天然起源的核心颗粒；及(b)一种包括至少一 个第一结合位点的组织者，其中所说的组织者通过至少一个共价键连 接到所说的核心颗粒上。

抗原或抗原决定簇具有至少一个第二结合位点，选自(a)一种非天 然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的的结合位点；(b)一种天然 地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点。

本发明通过第二结合位点与第一结合位点之间经过至少一个非- 肽键的结合而规定一种有序的和重复的抗原排列。因此，抗原或抗原 决定簇和非天然的分子支架通过第一和第二结合位点间的结合而被集 合到一起，形成一种有序的和重复的抗原决定簇排列。

实施者可以特定地设计抗原或抗原决定簇及第二结合位点，从而 使所有结合到非天然的分子支架上的抗原或抗原决定簇的排列是相同 的。例如，可以将单个第二结合位点放置在抗原或抗原决定簇的羧基 端或氨基端，从而通过设计确保所有结合到非天然的分子支架上的抗 原或抗原决定簇分子按照均一的方式安排位置。因此，本发明提供一 种方便的、按规定的秩序和重复性将任何抗原或抗原决定簇放置于一 种非天然的分子支架的手段。

如同本领域的熟练人员会清楚的一样，本发明的特定实施方案涉 及重组核酸技术，例如克隆、聚合链式反应、DNA和RNA纯化，重组 蛋白在原核及真核生物细胞中表达等技术的使用。这些方法对于本领 域的熟练人员是公知的，可以方便地在已公开的实验室方法手册中找 到(例如，Sambrook，J.等编，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)2nd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等，当代 分子生物学操作(CURRENT PROTOCALS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)。组织培养细胞系的基本实验室技术 (Celis，J.ed.，细胞生物学(CELL BIOLOGY)，Academic Press，2nd edition(1998)及基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.“抗体： 实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)”，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，蛋白质纯化指导(Guide to Protein Purification)”，酶学方法(Meth.Enzymol.)，128， Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，“蛋白质纯化 原理与实践(Protein Purificaton Principles and Pratice)”，3rd editon，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有充分阐述， 所有这些均作为参考文献完整地并入本发明。 A.    非天然的分子支架的构建

在本发明的组合物的一种元件是一种包括一种核心颗粒和一种组 织者的非天然的分子支架。当在本文使用时，术语“非天然的分子支 架”是指任何作用是提供第一结合位点的一种刚性的重复的排列的、 人工生产的产物。更明确地，非天然的分子支架包括(a)一种核心颗粒， 选自(1)一种非天然起源的核心颗粒，及(2)一种天然起源的核心颗粒； 以及(b)一种包括至少一个第一结合位点的组织者，其中所说的组织者 通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上。

正如本领域的熟练人员所显而易见的，本发明的非天然分子支架 的核心颗粒不限定于任何特定形式。核心颗粒，可以是有机的或者非 有机的，并可以是化学合成的或通过生物过程合成的。

在一个实施方案中，一种非天然的核心颗粒可以是一种合成聚合 物、脂微胶粒或一种金属离子。这样的核心颗粒在本领域是公知的， 这为用它来构建本发明的新的非天然的分子支架提供了基础。举例来 说，在美国专利5,770,380号中描述了合成聚合物或金属核心颗粒， 此专利公开了连接到一种“抗体模拟物”的发明中的许多肽环上的一 种calixarene有机支架的使用，而美国专利5,334,394号描述了由许 多种包括金属、陶瓷在内的无机材料组成的用作病毒引诱物的纳米晶 体(nanocrystalline)颗粒。本实施方案中优选的金属包括铬、铷、铁、 锌、硒、镍、金、银及铂。本实施方案中优选的陶瓷材料包括二氧化 硅、二氧化钛、氧化铝、氧化铷及氧化锡。本实施方案的核心颗粒可 以用包括碳(钻石)在内的有机材料制造。优选的聚合物包括聚苯乙烯、 尼龙及硝基纤维素。对于这种纳米晶体颗粒，用氧化锡、二氧化钛或 碳(钻石)制造的颗粒是特别优选的。一种脂微胶粒可以利用本领域之 中任何公知的方法制备。例如微胶粒可以根据Baiselle和Millar的 方法制备(Baiselle，C.J.和Millar，D.B.，生物物理化学 (Biophys.Chem.)4：355-361(1975))或Corti等(Corti，M.， Degriorgio，V.，Sonnino，S.，Ghidoni R.，Masserini，M.和 Tettamanti，G.，脂肪化学物理学(Chem.Phys.Lipids) 38：197-214(1981))或Lopez等(Lopez，O de 1a Maza，A.，Coderch， L，Lopez-Iglesias，C.，Wehrli，E.和Parra，J.L.，欧洲生物化 学联合会快报(FEBS Lett.)426：314-318(1998))或Topchieva和 Karezin(Topchieva，I.，和Karazezin，K.，J.，胶体界面科学 (Colloid Interface Sci.)213：29-35(1999))或Norein等，(Morein， B.，Sundquist，B.，Hoglund，S.，Dalsgaard K.和Osterhaus，A.， 天然(Nature)308：457-60(1984))，这些文章在此作为参考文献并入 本发明。

核心颗粒还可以通过生物过程制备，可以是天然的或者非天然的。 举例来说，这种类型的实施方案可以包括一种包括一种病毒、病毒- 样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式的核心颗粒。在一 个更加特定的实施方案中，核心颗粒可以包括轮状病毒的重组蛋白、 诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、 逆转录病毒的重组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花叶病毒的 重组蛋白、Flock House Virus的重组蛋白及人乳头瘤病毒的重组蛋 白。

无论是天然的还是非天然，本发明的核心颗粒以包括通过至少一 个共价键结合到天然的或非天然的核心颗粒的组织者为特征。此组织 者是一种按照非随机方式结合到一种核心颗粒上的、为创造一种有序 的和重复的排列提供一个成核位点的元件。理想地但不是必要地，组 织者按几何秩序(geometric order)与核心颗粒结合。最低限度地， 组织者包括一个第一结合位点。

如前所述，组织者可以是任何包括至少一个通过至少一个共价键 结合到一种核心颗粒的第一结合位点的元件。组织者可以是蛋白、多 肽、肽、氨基酸(也就是说，一种蛋白、多肽或肽的一个残基)、糖、 多聚核苷酸、天然或合成聚合物，次级代谢产物或化合物(生物素、荧 光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或其一种组 合，或其一种化学反应基团。在一个更加特定的实施方案中，组织者 可以包括一个包括抗原，抗体或其抗体片段、生物素、亲合素、链亲 合素、受体、受体配基、配基、结合配基的蛋白、相互作用的亮氨酸 拉链多肽、氨基、与氨基反应的化学基团；羧基、与羧基反应的化学 基团、巯基、与巯基反应的化学基团，或其一种组合的第一结合位点。

在优选的实施方案中，非天然的分子支架的核心颗粒包括一种病 毒、噬菌体、病毒-样颗粒、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式。具有有 序的和重复的包被和/或核心蛋白结构的本领域中所公知的任何病毒 可以被选作本发明的非天然支架；合适的病毒的实例包括：辛德比斯 病毒及其它甲病毒；水泡性口炎病毒；弹状病毒-，(例如水泡性口炎病 毒)，细小核糖核酸病毒-，披膜病毒-，正粘病毒-，polyoma-，微细小 病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎 病毒、烟草花叶病毒、Flock House virus、人乳头瘤病毒、(例如， 参见Bachman，M.F.，和Zinkernagel，R.M，当代免疫学(Immunol. Today)17：553-558(1996)中的表1)。

在一个实施方案中，本发明利用一种病毒的遗传工程，创造一种 有序的和重复的病毒包膜蛋白与一种包括异源蛋白、肽、抗原决定簇 或所选的反应性氨基酸残基的组织者之间的融合。其它为本领域中人 员所公知的遗传操作可以包括在非天然支架的构建中；例如，可能期 望通过遗传突变来限制重组病毒的复制能力。选择用来与组织者(也就 是说，第一结合位点)蛋白融合的病毒蛋白应该具有一种有组织的重复 的结构，更优选地，在此病毒表面优化地具有5-15nm间距类晶体组构。 这种融合蛋白的创造将在此病毒表面产生多个有序的和重复的组织 者。因此，由此所产生的第一结合位点的、有序的和重复的组构将反 映此天然病毒蛋白的正常组构。

正如将要更加深入地进行讨论的一样，在本发明的一个优选实施 方案中，支架是一种重组甲病毒，更加明确地，是一种重组辛德比斯 病毒。甲病毒是一种在被感染细胞的细胞浆内完整地复制其基因组RNA 而且没有DNA中间体的正链RNA病毒(Strauss，J.和Strauss，E.，微 生物学评论(Microbiol.Rev.)58：491-562(1994))。数种甲病毒科成 员、辛德比斯病毒(Xiong，C.等，科学(Science) 243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)11：18-22(1993))，塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)(Liljestrm，P.，& Garoff，H.，生物技术 (Bio/Technology)9：1356-1361(1991))及其它病毒(Dayis，N.L.等， 病毒学(Virology)171：189-204(1989))，作为各种以病毒为基础的、 各种不同蛋白的表达载体(Lundsrom，K.，当代生物技术评论(Curr. Opin.Biotechnol.)8：578-582(1997)；Liljestrom K.，当代生物技 术评论(Curr.Opin.Biotechnol.)5：495-500(1994)及作为疫苗开发 的候选者已受到相当关注。最近，许多专利已经被颁布，针对甲病毒 用于异源蛋白表达和疫苗开发的用途(参见美国专利5,766,602号； 5,792,462号；5,739,026号；5,789,245号及5,814,482号)。本发 明的甲病毒支架的构建，可以利用重组DNA技术领域中公知的方法完 成，正如上述文章所描述的一样，在此作为参考文献将这些文章并入 本发明。

可以使用各种不同的重组宿主细胞来生产以病毒为基础的用于抗 原或抗原决定簇结合的核心颗粒。例如，公知甲病毒有广泛的宿主范 围；辛德比斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物及两栖动物细胞， 以及一些昆虫细胞(Clark，H.，国立癌症研究所杂志(J.Natl. Cancer Inst.)51：645(1973)；Leake，C.，普通病毒学杂志(J.Gen. Virol.)35：335(1997)；Stollar，V.，in囊膜病毒(THE TOGAVIRUS)， R.W.SCHLESINGER，ed.，Academic Press，(1980)，pp583-621)。因 此，许多重组宿主细胞可以用于本发明的实施。BHK、COS、Vero、HeLa 及CHO细胞特别适合异源蛋白的生产，因为(它们)具有按照与人细胞 相似的方式糖基化异源蛋白的潜力(Waston，E.等，糖生物学 (Glycobiology)4：227，(1994))，并且可被选择(Zang，M.等，生物技 术(Bio/Technology)13：389(1995))或遗传设计(Renner W.等，生物技 术生物工程(Biotech.Bioeng)4：476(1995)；Lee K.等生物技术生 物工程(Biotech.Bioeng.)50(1996))从而在无血清培养基和悬液中 培养。

将多聚核苷酸载体导入宿主细胞可以利用标准的实验室手册中所 描述的方法来实施(例如，参见Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室 手册(MOLECULAR CLONING：A LABRORORY MANNUAL)2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.(1998)，Chapter 9；及Ausubel，F.，等，当代分子生物学操作手 册，eds.，CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY，John H. Wiley & Sons，Inc(1997)，Chapter 16)，包括这些方法，例如电穿孔、 DEAE-右旋糖苷介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂-介导的转染、 转导、刮伤加载(scrape loading)、冲击导入(ballistic introduction)及感染。Felgner，P.等，在美国专利5,580,859号中 讨论了将外源DNA序列导入宿主细胞的方法。

包装的RNA序列也能用来感染宿主细胞。可通过将这些包装的RNA 序列加入培养基而将其导入宿主细胞。例如，在许多来源包括“辛德 比斯病毒表达系统”，Version C，(Invitrogen Catalog No.K750-1) 在内，描述了没有感染性的甲病毒颗粒的制备。

当哺乳动物细胞被用作生产以病毒为基础的核心颗粒的重组宿主 细胞时，这些细胞通常在组织培养中培养。培养细胞的方法在本领域 中是公知的(例如，参见Celis，J.，ed.，CELL BIOLOGY，Academic Press，2nd edition，(1998)；Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手 册(MOLECULAR CLONING：A LABRORORY MANNUAL.2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.(1998)，Chapter 9)；及Ausubel，F.，等，ed.s，当代分子生物学 操作手册，(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY，John H. Wiley & Sons，Inc(1997))；Freshney，R.，动物细胞培养(CULTURE OF ANIMAL CELLS)，Alan R.Liss，Inc.(1983))。

正如本领域的人员将会理解的一样，第一结合位点可以是任何合 适的、能够将所选的抗原或抗原决定簇特异性地结合到支架上的蛋白、 多肽、糖，多核苷酸肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢产物， 或其一种组合或其一部分。在一个实施方案中，结合位点是选自本领 域中所公知的物质的蛋白或肽。例如，第一结合位点可以选自：配基、 受体、植物凝集素、亲合素、链亲合素、生物素、表位，例如HA或 T7标记(T7 tag)、Myc、Max、免疫球蛋白结构域以及在本领域中所公 知的能够用作第一结合位点的其它任何氨基酸序列。

本领域中的人员可以进一步理解，利用本发明的另一个实施方案， 第一结合位点可继生于在构建与衣壳蛋白符合阅读框的融合中所使用 的组织者(例如，蛋白或多肽)。例如，一种蛋白可被用来与具有已知 按照特定方式被糖基化的氨基酸序列的包膜蛋白融合，然后，结果所 加上的糖部分(moiety)可以通过结合到作为抗原的第二结合位点的植 物凝集素上，从而在病毒支架的第一结合位点发挥作用。或者，组织 者序列可以在体内被生物素化，生物素部分可以作为本发明的第一结 合位点，或者组织者序列可以受到不同氨基酸残基的体外化学修饰， 这种修饰作为第一结合位点。

本发明的一个特定的实施方案使用辛德比斯病毒。辛德比斯病毒 RNA基因组被包装进包围着一个含有三种被称为E1、E2和E3的蛋白 的脂双层的衣壳蛋白中。这些所谓的包膜蛋白是糖蛋白，被糖基化的 部分在脂双层的外部，在这里，这些蛋白的复合物形成在电子显微照 片中可见的从病毒表面向外突出的“刺突”。在本发明的一个优选实施 方案中，第一结合位点选择是符合阅读框地与E2包膜蛋白融合的JUN 或FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。然而，本领域的所有人员都将清楚的 是，其它的包膜蛋白可以被用于将第一结合位点定位到本发明的支架 上的融合蛋白构建体。

在本发明的一个最优选的实施方案中，第一结合位点选择是符合 阅读框地与乙型肝炎病毒衣壳(核心)蛋白融合的JUN-FOS亮氨酸拉链 蛋白结构域。然而，对本领域的所有人员都将清楚的是，其它病毒衣 壳蛋白可被用于将第一结合位点定位到本发明的支架上的融合蛋白构 建体。

在本发明的另一个优选实施方案中，第一结合位点选择是符合阅 读框地与肝炎核心(衣壳)蛋白融合的赖氨酸或半胱氨酸残基。然而， 对本领域的所有人员都将清楚的是，其它病毒衣壳或病毒-样颗粒可被 用于将第一结合位点定位到本发明的支架上的融合蛋白构建体。

提供实施例1，说明使用Hahn等(美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad. Sci.USA)89：2679-2683(1992))的pTE5′2J载体构建 辛德比斯病毒E2包膜蛋白和JUN亮氨酸拉链蛋白结构域之间符合阅读 框的融合蛋白。用于第一结合位点的JUN氨基酸序列如 下：CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(第59号序 列(SEQ ID NO：59))。在这个实例中，抗原上预期的第二结合位点将是 FOS亮氨酸拉链蛋白结构域，而氨基酸序列将会是如下的序列： CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(第60号序列)。

这些序列从转录因子JUN和FOS衍生而来，每个在侧翼都具有在 两端含有一个半胱氨酸残基的短序列。已知这些序列彼此相互作用。 JUN-FOS二聚体的最初假定的结构设想了一个单体的疏水性侧链与另 一个单体相应的侧链以拉链的方式交错对插(Landschulz等，科学 (Science) 240：1759-1764(1998))。然而，这种假设证明是错误的， 已知这些蛋白形成α-螺旋卷曲螺旋(α-helix coiled coil)(O′Shea 等，科学(Science) 243：538-542(1989))；Cohen & Parry，生物化学 科学趋势(Trends Biochem.Sci.)11：245-248(1986))，因此，术语 “亮氨酸拉链”经常用来指这些蛋白结构域，更多地是因为历史原因 而不是结构原因。贯穿本发明之中地，术语“亮氨酸拉链”用于指以 上所描述的序列，以及与以上所描述的序列基本相似的序列。术语JUN 和FOS被用于分别的亮氨酸拉链结构域，而不是整个JUN和FOS蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供使用pCYTts表达系统(美国专利 申请，申请号60/79,562；申请日：1998年3月27日)生产辛德比斯 病毒E2-JUN支架。PCYTts表达系统提供了允许在真核细胞中进行基 因表达的严谨控制的新表达载体。本系统的DNA载体被转录，从而形 成RNA分子，然后此RNA分子又被一种温度敏感型复制酶复制从而形 成额外的RNA分子。复制所产生的RNA分子含有一个可以被翻译从而 产生感兴趣的蛋白或者编码一个或多个不被翻译的RNA分子的核苷酸 序列。因此，此表达系统可以进行重组辛德比斯病毒颗粒的生产。

实施例2提供了本发明的E2-JUN辛德比斯病毒(sinbis)非天然的 分子支架生产的细节。另外在实施例3中还提供了另一种使用实施例 1中所产生的pTE5′2JE2：JUN载体生产重组E2-JUN辛德比斯病毒支 架的方法。因此本发明提供了两种方法—pCYTts表达系统(实施例2) 和pTE5′2J载体系统(实施例3)—利用这些方法可以生产重组辛德比 斯病毒E2-JUN非天然的分子支架。在图1和图2中证明了在各系统中 所产生的病毒颗粒的分析。

如前所述，本发明包括一种以病毒为基础的、包括一种病毒、病 毒-样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式的核心颗粒。熟 练的技术人员具有生产这样的核心颗粒以及将其与组织者结合的知 识。通过提供其它实施例，本发明在此提供了作为核心颗粒的乙型肝 炎病毒-样颗粒及麻疹病毒衣壳颗粒的生产(实施例17到22)。在这样 的一个实施方案中，JUN亮氨酸拉链蛋白结构域或FOS亮氨酸拉链蛋 白结构域可被用作组织者，从而作为本发明的非天然的分子支架的第 一结合位点。

实施例23-29提供分别作为第一和第二结合位点的、携带与一个 反应性赖氨酸残基符合阅读框地融合的肽的乙型肝炎核心颗粒，和携 带遗传上融合的半胱氨酸残基的抗原的生产的细节。 B.    具有第二结合位点的抗原或抗原决定簇的构建

本发明的组合物的第二个元件是一种拥有至少一个能够通过至少 一个非-肽键结合到非天然的分子支架的第一结合位点的第二结合位 点的抗原或抗原决定簇。本发明提供了根据考虑所期望的治疗效果所 选择的抗原或抗原决定簇而变化的组合物。其它组合物通过变化为第 二结合位点所选择的分子来提供。

本发明的抗原可选自：(a)适于诱导抗癌细胞免疫应答的蛋白；(b) 适于诱导抗传染病免疫应答的蛋白；(c)适于诱导抗过敏原免疫应答的 蛋白，及(d)适于在家畜动物中诱导免疫应答的蛋白。

在本发明的一个特定的实施方案中，抗原或抗原决定簇是对传染 病预防有用的抗原或抗原决定簇。这样的治疗方法对于治疗大量影响 范围广泛的宿主，例如人、奶牛、羊、猪、狗、猫、其它物种哺乳动 物以及非-哺乳动物的传染病将会是有用的。可以治疗的疾病对本领域 中熟练人员是公知的，这些实例包括病毒性感染，例如HIV、流感、 疱疹、病毒性肝炎、Epstein Bar，脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、 水痘，等；或细菌性感染，例如肺炎、肺结核、梅毒，等；或寄生虫 性感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、trichomoniasis、阿米巴病， 等。因此，为本发明的组合物所选择的抗原或抗原决定簇对于医学领 域的人员将会是公知的；抗原或抗原决定簇的实例包括：HIV抗原 gp140和gp160；流感病毒抗原红细胞凝集素和神经胺酸酶；乙型肝炎 表面抗原、疟疾的环子孢子蛋白。

在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物是可以用于过敏反 应或癌症治疗的免疫治疗剂。

用于治疗过敏反应的组合物及方法的抗原或抗原决定簇的选择对 于医学领域中治疗这样的疾病的熟练人员是公知的；这种类型的抗原 或抗原决定簇的代表性实例包括：蜂毒磷脂酶A2、BetvI(桦木花粉 过敏原(birch pollen allergen))、5Dol m V(white-faced hornet venom a1lergen)、Der p I(House dust mite allergen)。

用于癌症治疗的组合物及方法的抗原及抗原决定簇的选择对于医 学领域中治疗这样的疾病的熟练人员是公知的；这种类型的抗原或抗 原决定簇的代表性实例包括：Her2(乳腺癌)、GD2(成神经细胞瘤)、 EGF-R(恶性成胶质细胞瘤)、CEA(甲状腺髓样癌)、CD52(白血病)。

在本发明的一个特别的实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：(a) HIV的一种重组蛋白，(b)流感病毒的一种重组蛋白，(c)丙型肝炎 病毒的一种重组蛋白，(d)弓形虫的一种重组蛋白，(e)恶性疟原虫 的一种重组蛋白，(f)间日疟原虫的一种重组蛋白，(g)卵形疟原虫的 一种重组蛋白，(h)三日疟原虫的一种重组蛋白，(i)乳腺癌细胞的 一种重组蛋白，(j)一种肾癌细胞的重组蛋白，(k)一种前列腺癌细胞 的重组蛋白，(l)皮肤癌细胞的一种重组蛋白，(m)脑癌细胞的一种 重组蛋白，(n)白血病细胞的一种重组蛋白，(o)一种重组的 profiling，(p)蜂螫(bee sting)过敏反应一种的重组蛋白，(q)坚 果过敏反应的一种重组蛋白，(r)食物过敏反应的一种重组蛋白、哮 喘的重组蛋白及衣原体的一种重组蛋白。

一旦选定本组合物的抗原或抗原决定簇，在准备要构建与本发明 非天然的分子支架结合的、有组织的重复的排列时，可以给此分子加 上至少一个第二结合位点。什么将会构成一个适合的第二结合位点的 知识对于本领域的熟练人员将会是公知的。第二结合位点的代表性实 例包括，但是不限制于：抗原、抗体或其抗体片段、生物素、亲合素、 链亲合素、受体、受体的配基、配基、配基结合蛋白、相互作用的亮 氨酸拉链多肽、氨基、与氨基反应的化学基团、羧基、与羧基反应的 化学基团、巯基、与巯基反应的化学基团，或其一种组合。

第一和第二结合位点之间的结合将利用所选择的各个分子的特征 来确定，但是，将会包括至少一个非肽-键。决定于第一和第二结合位 点之间的组合，结合的实质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的， 或其组合。

在本发明的一个实施方案中，第二结合位点可以是FOS亮氨酸拉 链蛋白结构域或JUN亮氨酸拉链蛋白结构域。

在最具体的实施方案中，所选的该第二结合位点是FOS亮氨酸拉 链蛋白结构域，FOS亮氨酸拉链蛋白结构域与本发明的非天然的分子 支架的JUN亮氨酸拉链蛋白结构域特异性地结合。JUN和FOS亮氨酸 拉链蛋白结构域之间的结合提供了一个在此支架表面形成有组织的重 复的抗原或抗原决定簇排列的基础。FOS亮氨酸拉链蛋白结构域可以 符合阅读框地与所选的抗原或抗原决定簇在氨基端、羧基端融合，或 者如果希望的话定位于蛋白质内部。

出于示范意图，提供数个FOS融合构建体。人生长激素(实施例 4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA)(实施例9)、卵清蛋白(实施例10)和HIV gp140(实施例12)。

为了简化FOS融合蛋白构建体的生成，公开了数种载体为抗原或 抗原决定簇的设计和构建提供选择的载体(参见实施例6)。载体 pAV1-4是为FOS融合蛋白在E.coli中表达而设计的；载体pAV5和 pAV6是为FOS融合蛋白在真核细胞中表达而设计的。这些载体的性质 简述如下：

1.pAV1：此载体是为将FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli 周质间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的Stu I /Not I位点。

2.pVA2：此载体是为将FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli 周质间隙而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的Not I /EcoRV位点(或Not I/HindIII)。

3.pAV3：此载体是在E.coli中细胞质生产FOS位于C-末端的融 合蛋白而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的EcoRV /Not I位点。

4.pAV4：此载体是在E.coli中细胞质产生FOS位于N-末端的融 合蛋白而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的Not I /EcoRV位点(或Not I/HindIII)。基于蛋白质被合成即通过蛋白质水 解除去N-末端的甲硫氨酸残基(Hirel等，美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad Sci.USA)86：8247-8251(1989)).

5.pAV5：此载体是为FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生产而设 计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以通过将其连接到此载体的EcoR47III /Not I位点而插入编码hGH信号序列及FOS结构域的序列之间。或者， 一种含有其自身信号序列的基因，可以通过连接到Stu I/Not I位点 而融合到FOS编码序列。

6.pAY6：此载体是为N一末端具有FOS的融合蛋白的真核生产而设 计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的Not I/Stu I(或Not  I/HindIII)位点。

正如本领域的熟练人员将会理解的，一种FOS-抗原或抗原决定簇 融合蛋白的构建可以包括便于重组蛋白生产的特定遗传元件的加入。 实施例4为特定的E.coli转录调控元件的加入提供指导，实施例7 为真核信号序列的加入提供指导。其它遗传元件可根据实施者的特定 需要而加以选择。

还可见本发明包括FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白在细菌 (实施例5)或真核细胞(实施例8)中的生产。选择在何种细胞类型中表 达此融合蛋白是熟练技术人员知识之内的事情，取决于这些因子，例 如翻译后修饰在此组合物的设计中是否是一项重要的考虑。

正如先前提到的，本发明公开各种通过使用pAY载体构建FOS-抗 原或FOS-抗原决定簇融合蛋白的各种方法。除了能进行原核和真核表 达之外，这些载体允许实施者选择-和C-末端加入到FOS亮氨酸拉链 结构域的抗原。提供了特定实施例，其中将-和C-末端FOS融合进行 到PLA(实施例9)及卵清蛋白(实施例10)上。实施例11说明PLA和卵 清蛋白融合蛋白的纯化。

在一个最特定的实施方案中，本发明描述一种由HIV基因组所编 码的抗原或抗原决定簇。更特别的，此HIV抗原是gp140。正如实施 例11-15中所提供的一样，可以创造HIV gp140，具有FOS亮氨酸拉 链结构域和为结合本发明的非天然的分子支架所合成和纯化的融合蛋 白。正如本领域的熟练人员将会知道的，其它HIV抗原或抗原决定簇 可被用于本发明的组合物的创造。

在本发明的一个最特定的实施方案中，所选择的第二结合位点是 一个半胱氨酸残基，此半胱氨酸残基特异性地结合本发明的非天然的 分子支架的赖氨酸残基。赖氨酸残基(Lys)与半胱氨酸(Cys)的化 学结合提供了一个在支架的表面形成有组织的重复的抗原或抗原决定 簇排列的基础。半胱氨酸残基可以符合读框地改造到所选抗原或抗原 决定簇，在氨基端、羧基端的或者如果期望的话位于此蛋白的内部。 例如，提供PLA和HIVgp140用于连接到赖氨酸残基第一结合位点的半 胱氨酸残基。

C.甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒的制备

本发明提供有序的和重复的抗原排列的新组合物和构建方法。正 如本领域的熟练人员将会知道的一样，有序的和重复的抗原排列的组 装条件在很大程度上取决于非天然支架的第一结合位点的特定选择及 抗原或抗原决定簇的第二结合位点的特定选择。因此，在此组合物设 计中实施者的选择(也就是说，第一及第二结合位点、抗原及非天然支 架的选择)将会决定甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒(有序的和重复的抗原 排列及所结合非天然的分子支架)组装的特定条件。与甲疫苗 (AlphaVaccine)颗粒组装有关的信息正好属于实施者的工作知识之 内，而且存在许多参考资料帮助实施者(例如，参见Sambrook，J.，等， 编著的分子克隆：实验室手册第2版(MOLECULAR CLONING：A LABRORORY MANNUAL.2nd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；及Ausubel，F.，等，当代 分子生物学操作手册(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY)， John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Celis，J.编著，细胞生物学 (CELL BIOLOGY)，Academic Press，2nd edition(1998)；及Harlow， E.和Lane，D.“抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)”，Cold Spring Harbor，N.Y.)(1988))，所有这些文献在此 作为参考文献并入本发明。

在一个特定实施方案中，分别将JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白结构 域用于本发明的第一和第二结合位点。在AlphaVaccine(甲疫苗)的制 备中，抗原必须在促进有序的和重复的抗原排列到非天然支架之上的 条件下生产和纯化。在这个特别的JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白结构域实 施方案中，FOS-抗原或FOS-抗原决定簇应该用还原剂(例如二硫苏糖 醇(DTT))进行处理从而减少或消除二硫键形成的发生率(实施例15)。

对于JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白结构域实施方案的非天然支架(也 就是说，重组辛德比斯病毒)的制备，重组E2-JUN病毒颗粒应该浓缩、 中和并用还原剂处理(实施例16)。

在这个JUN/FOS实施方案中有序的和重复的抗原排列的组装，是 在存在redox shuffle的存在下完成的。E2-JUN病毒颗粒与240倍摩 尔过量的FOS-抗原或FOS-抗原决定簇在4℃结合10小时。随后， AlphaVaccine(甲疫苗)颗粒通过层析方法浓缩及纯化(实施例16)。

在另一个实施方案中，非天然的分子支架偶联到抗原或抗原决定 簇上可以通过化学交联来完成。在一个最优选的实施方案中，化学试 剂是异双功能交联试剂，例如ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺 酯(Tanimori等，药物药效学杂志(J.Phar.Dyn.)4：812(1981)； Fujiwara等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)45：195(1981))， 此酯含有(1)与氨基反应的琥珀酰亚胺基团和(2)与SH基团反应的马 来酰亚胺基团。第一结合位点的一种异源蛋白或多肽可以加工成含有 一个或多个作为此异双功能交联试剂的琥珀酰亚胺部分的反应部分的 赖氨酸残基。一旦被化学偶联到非天然的分子支架的第一结合位点上， 此异双功能交联试剂的马来酰亚胺基团将可与抗原或抗原决定簇上半 胱氨酸残基的SH基团反应。在这个实例中，抗原或抗原决定簇制备可 能需要将半胱氨酸加工到被选为第二结合位点的蛋白或多肽中，从而 使其可以与结合到非天然的分子支架第一结合位点的交联试剂上自由 的马来酰亚胺功能反应。

C.组合物、疫苗及其给药，与治疗的方法

在一个实施方案中，本发明提供在广泛的物种，特别是哺乳动物 例如人、猴、奶牛、狗、马、猪等当中预防传染病的疫苗。可以设计 疫苗来治疗病毒性感染，例如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、Epstein Bar、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌性传染病，例 如肺炎、肺结核、梅毒等；或寄生虫性感染，例如疟疾、锥虫病、利 什曼病、滴虫病、阿米巴病等。

在另一个实施方案中，本发明提供在广泛的物种，特别是哺乳动 物例如人、猴、奶牛、狗、马、猪等当中预防癌症的疫苗。可以设计 疫苗来治疗所有类型癌症：淋巴溜、细胞癌、肉瘤、黑色素瘤等。

在本发明的又一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗过敏 反应的疫苗的设计。IgE同种型的抗体是过敏反应中的重要成分。肥 大细胞在其表面结合IgE抗体，而且一旦特异性抗原结合到结合在肥 大细胞表面的IgE抗体，就释放组织胺和其它的过敏反应介质。因此， 抑制IgE抗体的生产，是一个有希望的抗过敏反应的靶。通过获得一 种期望的T辅助细胞应答，这应该是可能的。T辅助细胞应答可以分 成1型(TH1)和2型(TH2)辅助细胞应答(Ramagnani，当代免疫学 (Immunol.Today)18：263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素-γ及其 它触发B细胞产生IgG1-3抗体的细胞因子。相反地，TH2细胞所分泌 的一种至关重要的细胞因子是IL-4，此细胞因子驱使B细胞产生IgG4 及IgE抗体。在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展是相互排斥的， 因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，触发强烈TH1应 答的抗原同时抑制TH2细胞应答的发展，以及IgE抗体的产生。有趣 地，事实上所有的病毒在宿主中诱导TH1应答而不能触发IgE抗体的 产生(Coutelie等，实验医学杂志(J.Exp.Med.) 165：64-69(1987))。此同种型模式并不仅仅限定于活病毒，在灭活的 或重组病毒颗粒上也被观察到(Lo-Man等，欧洲免疫学杂志(Eur.J. Immunol.)28：1401-1407(1998))。因此，通过使用本发明的方法(例 如，AlphaVaccine Technology(甲疫苗技术))，可用各种过敏原点缀 病毒颗粒并用于免疫。因为所产生的过敏原的“病毒结构：将会引起 一个TH1应答，将会产生“保护性”IgG1-3抗体，而引起过敏反应的 IgE抗体的产生将会被避免。因为过敏原是以被不同组的辅助T细胞 识别的病毒颗粒而不是以过敏原自身被呈递的，所以在即使定居有已 经存在的对此过敏原特异的TH2细胞的过敏性个体中也可能诱导过敏 原特异性IgG1-3抗体。高浓度IgG抗体的存在，可以避免过敏原结合 到结合着肥大细胞的IgE上，从而抑制组织胺的释放。因此，IgG抗 体的存在可以保护(肌体)抗IgE介导的过敏反应。引起过敏反应的典 型物质包括：草、豚草、桦(birch)或高山雪松花粉(mountain cedar pollen)、屋尘(house dust)、螨(mites)、动物毛发皮屑(animal danders)、霉菌(mold)、昆虫毒素(insect venom)或药物(例如青霉 素)。因此，给个体用过敏原修饰的病毒颗粒免疫不仅在过敏反应发病 之前，而且在发病之后，都应该是有益的。

正如本领域的具有普通技能的人员将会理解的一样，当给个体给 药本发明的组合物时，它们可以是一种含有盐、缓冲液、佐剂或其它 改善组合物之效能的物质的组合物。在包括REMIGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCE(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.， (1980))在内的许多来源中，提供了适用于制备药用组合物的材料的 实例。

本发明的组合物，如果其给药能够被接受药物的个体耐受，那么 就说其是“药理上接受的”。进一步地，本发明的组合物将按一个“治 疗有效的量”给药(也就是说，一个产生所期望的生理效应的量)。

本发明的组合物可用本领域公知的各种方法给药，但是通常将会 通过注射、灌输、吸入、口服或其它适合的物理方法给药。此外，此 组合物还可以通过肌肉内、静脉内或皮下注射给药。给药的组合物的 成分包括无菌的水溶液(例如生理盐水)、非水溶液以及悬浮液。非水 性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可以 注射的有机酯例如油酸乙酯。载体或密闭包装可用来提高皮肤通透性 及增强抗原吸收。

除疫苗技术之外，本发明的其它实施方案描述癌症和过敏反应的 医学治疗。

在此所引用的全部专利及公开明确地作为参考文献并入本发明。

            实施例

用于以下实验的酶或试剂包括：从New England Biolabs获得的 T4DNA连接酶；从QIAGEN获得的Taq DNA聚合酶、QIAprep Spin Plamid Kit试剂盒，QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒、QiaExIIGel Extraction Kit试剂盒、QIAquick PCR Purification Kit试剂盒；从Pharmacia 获得的QuickPrep Micro mRNA Purification Kit试剂盒；从Gibco BRL 获得的Superscript One-step RT-PCR Kit试剂盒、胎牛血清(FCS)、 胰化蛋白胨及酵母提取物；从Microsynth(Switzerland)获得的寡聚 核苷酸；从Boehringer Mannheim、New England Biolabs或MBI Fermentas获得的限制性内切酶；从Boehringer Mannheim获得的Pwo 聚合酶及dNTPs。从Cell culture technologies(Glattbrugg， Switzerland)获得HP-1培养基。所有的标准化学品从 Fluka-Sigma-Aldrich获得，而所有的细胞培养材料从TPP获得。

DNA操作使用标准的技术实施。根据生产商的使用说明使用 QIAprep Spin Plamid Kit试剂盒用2ml细菌培养或使用QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒用50ml培养物制备了DNA。为了进行限制性 内切酶消化，在生产商推荐的条件(缓冲液和温度)下，将DNA与适当 的限制性内切酶以每毫克DNA 5-10单位(U)酶的浓度温育了至少2小 时。如果反应条件对所有的酶都合适，则同时进行多于一个酶的消化， 否则进行顺序消化。为进一步操作而分离的DNA片段在0.7-1.5％琼脂 糖凝胶上利用电泳分离，从凝胶上切除并根据生产商所提供的使用说 明利用QiaExII Gel Extration Kit试剂盒纯化。为了DNA片段的连 接，将100到200pg已纯化的载体DNA与三倍摩尔过量的插入片段在 生产商所提供的缓冲液(总体积10-20μl)中存在1U T4 DNA连接酶的 条件下，在16℃温育过夜。等份(0.1-0.5μl)连接反应液被用于 E.coli XL 1-Blue(Stratagene)的转化。转化使用一个Gene Pulser (BioRAD)和0.1cm Gene Pulser Cuvettes(BioRAD)在200Ω，25μF， 1.7kV条件下通过电穿孔完成。电穿孔之后，将此细胞在1ml S.O.B. 培养基(Miller，1972)中摇动温育1小时。

                  实施例1：

            JUN两亲性螺旋结构域在E2中的插入

在载体pTE5′2J(Hanh等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)89：2679-2683(1992))中，在结构蛋白E2编码序列 的密码子71(Gln)和密码子74(Thr)之间引进了MluI及BstEII限制 性内切酶切位点，产生载体pET5′2IBM。这些限制性内切酶切位点的 引进是使用以下寡聚核苷酸通过PCR(聚合酶链式反应)完成的：

Oligo 1：

E2insBstEII/BssHII：

5′-ggggACGCGTGCAGCAggtaaccaccgTTAAAGAAGGCACC-3′(SEQ ID

NO：1)

Oligo 2：

E2insMluIStuI：

5′-cggtggttaccTGCTGCACGCGTTGCTTAAGCGACATGTAGCGG-3′(SEQ

ID NO：2)

Oligo 3：

E2insStuI：5′-CCATGAGGCCTACGATACCC-3′(SEQ ID NO：3)

Oligo 4：

E2insBssHII：5′-GGCACTCACGGCGCGCTTIACAGGC-3′(SEQID NO：4)

为了PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng模板 DNA在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装 置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接 加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完成：95℃2分钟；5 个95℃(45秒)、53℃(60秒)、72℃(80秒)循环；及25个95℃(45 秒)、57℃(60秒)、72℃(80秒)循环。

分析了这两个PCR片段，并利用琼脂糖电泳纯化。使用寡聚核苷 酸3和4(oligo3和4)进行这两个PCR片段的装配PCR(Assembly PCR) 扩增从而获得最终的构建体。

为了装配PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与2ng 已纯化的PCR片段在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都 使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始 PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完 成：95℃2分钟；5个95℃(45秒)、57℃(60秒)、72℃(90秒)循环； 及25个95℃(45秒)、59℃(60秒)、72℃(90秒)循环。

最终的PCR产物使用Qia Spin PCR柱(Qiagen)纯化，并用BssH II及StuI限制性核酸内切酶各10单位在一种合适的缓冲液中在37 ℃消化12小时。DNA片段进行凝胶纯化，并连接到已用BssHII及Stu I消化和凝胶纯化的pTE5′2J载体上(Hanh等，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：2679-2683)。首先利用BstEII 及MluI限制性分析，此后又通过PCR产物的DNA序列测定，分析了 PCR产物的正确插入。

使用如下寡聚核苷酸从载体pJuFo(Crameri和Suter，基因 (Gene)137：69(1993))PCR-扩增编码JUN两亲性螺旋结构域的DNA序列：

Oligo 5：

JUNBstEII：

5′-CCTTCTTTAAcggtggttaccTGCTGGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′

(SEQ ID NO：5)

Oligo 6：

MluIJUN：5′-AAGCATGCTGCacgcgtgTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGC-3′

(SEQ ID NO：6)

为了这个PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng 已经纯化的DNA模板在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都 使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始 PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完 成：95℃2分钟；5个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循环； 及25个95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。

最终的PCR产物进行凝胶纯化，并连接到已用EcoRV消化和凝胶 纯化的pBluecsript(KS-)上。通过使用MluI和BstEII切割从所产生 的载体中分离了JUN序列，用QiaExII纯化，并将其连接到载体pTE5 ′2JBM上(先前用相同的限制性内切酶切割)，从而获得载体pTE5′ 2J：E2JUN。

                      实施例2

使用pCYTts系统生产含有E2-JUN的病毒颗粒

使用pTE5′2J：E2JUN作为模板和寡聚核苷酸XgalStruct (ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC)和StructBsp1201(tcgaat GGGCCCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG)PCR-扩增此结构蛋白。为了这个PCR， 使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和5ng已纯化的DNA模板在100 μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的 反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装置 (Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接加 入(起点是95℃)。温度循环如下：95℃3分钟，随后是5个95℃(30 秒)、54℃(35秒)、72℃(270秒)循环；随后又是25个95℃(30秒)、 63℃(35秒)、72℃(270秒)循环。PCR产物经凝胶纯化，并使用限制 性内切酶Xbal I/Bsp1201消化，连接到以前已用相同的酶切割过的载 体pCYTts上(美国专利申请，申请号60/079,562；1998年3月27 日提交)。    

20μg pCYTtsE2：JUN与30单位ScaI在一种合适的缓冲液中在 37℃温育至少4小时。利用酚/氯仿抽提终止反应，随后利用异丙醇沉 淀线性DNA。利用琼脂糖电泳检查了限制性酶切反应。为了转染，将 5.4μg线性化pCYTtsE2：JUN与0.6μg线性pSV2Neo在30μl H2O中 混合，并加入30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES， 280mM NaCl，1.5mM Na2PO4，pH7.05)之后，涡旋溶液5秒钟，随 后在室温温育25秒钟。立即将此溶液加入2ml含有2％FCS的HP-1 培养基(2％FCS培养基)中。使用含有DNA的培养基替换6-孔板中80％ 铺满的BHK21细胞培养的培养基。在CO2培养箱中在37℃温育5小时 之后，除去含有DNA的培养基并用2ml内含15％甘油的2％FCS培养 基替换。在30秒的温育期之后除去含有甘油的培养基，使用5ml含 有10％FCS的HP-1培养基漂洗而洗涤细胞。最后，加入含有2ml含 有10％FCS的新鲜的HP-1培养基。

选择被稳定转染的细胞，并在37℃在CO2培养箱中在选择培养基 (补充了G418的HP-1培养基)中培养。当此混合细胞群生长到铺满时， 将此培养物分入2个平皿，随后在37℃培养12小时。将一平皿细胞 转移到30℃从而诱导病毒颗粒的表达；另一平皿细胞在37℃保存。

病毒颗粒的表达利用Western印迹测定(图1)。用培养基(0.5ml) 进行甲醇/氯仿沉淀，沉淀物在SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上样 缓冲液中重新悬浮。样品在95℃加热5分钟，然后上样到15％丙烯酰 胺凝胶上。在SDS-PAGE之后，如Bass和Yang，在Creighton，T.E. 编著的蛋白质功能：一种实用方法(Protein Function：A Practical Approch，2nd edn.，)，IRL Press，Oxford(1997)，29-55页所述， 将蛋白转移到Protan硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell，Germany) 上。用1％牛血清白蛋白的TBS溶液(10x TBS/升：87.7g NaCl，66.1g Trima hydrochloride(Sigma)和9.7g Tris base(Sigma)pH7.4) 在室温封闭1小时，此后与抗-El/E2抗体(多克隆抗体)温育1小时。 印迹斑点用TBS-T(含有0.05％Tween20的TBS)洗涤3次10分钟，并 与碱性磷酸酶-抗-兔IgG偶联物(0.1μg/ml，Amersham Life Science，England)温育1小时。用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗 涤2次10分钟之后，使用碱性磷酸酶检测试剂和50μl NBT(内含7.7％ 氮蓝四唑(Sigma)的70％二甲基甲酰胺)及37μl X-Phosphate溶液(内 含5％5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)进行显色反应。

病毒颗粒的产生在图1说明。Western印迹模式说明，与野生型 E2(栏2)比较，E2-JUN(栏1)在SDS-PAGE上迁移到更高的分子量处， 而BHK21宿主细胞系没有显示出任何背景。

                        实施例3：

使用pTE5′2JE2：JUN载体生产含有E2-JUN的病毒颗粒

无RNase载体(1.0μg)利用PvuI消化使其线性化。此后，使用 一种SP6体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP，Invitrogen， Invitrogen BV，NV Leek，Netherlands)进行体外转录。所产生的5 ′-加帽的mRNA在还原性琼脂糖凝胶上进行分析。

根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统， Invitrogen BV，Netherlands)，将体外转录的mRNA(5μg)电穿孔导 入BHK21细胞(ATCC：CCL10)。在37℃温育10小时之后，使用不合有 FCS的HP-1培养基替换含有FCS的培养基，此后又在37℃温育10小 时。收获悬液，并完全按照实施例2中所述，利用Western印迹分析 法分析病毒颗粒的产生。

所获结果与图2所示的用pCYTtsE2：JUN获得的结果相同。

                  实施例4

人生长激素(hGH)与FOS亮氨酸拉链结构域(OmpA信号序列)的融

                      合

利用PCR从原始质粒(ATCC31389)扩增没有人源前导序列的hGH 基因。具有内部XbaI位点的寡聚核苷酸7(Oligo7)是为在hGH基因的 5′末端退火而设计的，而具有内部EcoRI位点的寡聚核苷酸 9(Oligo9)在hGH基因的3′末端引发。为了这个PCR反应，使用每一 种寡聚核苷酸各100pmol和5ng已纯化的模板DNA在75μl含有4 单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物 中进行反应。

PCR循环按如下方式进行：30循环，退火温度是60℃而延伸时间 是37℃1分钟。

经凝胶纯化和分离的PCR产物被用作第二次PCR反应的模板，从 而引进ompA信号序列及Shine-Dalgarno序列。为了这个PCR反应， 使用寡聚核苷酸8和9(oligo8和9)各100pmol和1ng模板PCR产 物在75μl反应混合液中进行反应(4单位Taq或Pwo聚合酶，o.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)。最初5个循环的退火温度55℃，延伸时间是 72℃60秒；使用65℃的退火温度和72℃60秒的延伸时间进行另25 个循环。

Oligo7：

gggtctagattcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatgctccgcgcccatcgtctgcaccagct

ggcctttgacacc(SEQ ID NO：7)

Oligo8：

gggtctagaaggaggtaaaaaacgatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctac

cgtagcgcaggccttcccaaccattcccttatcc(SEQ ID NO：8)

Oligo9：

cccgaattcctagaagccacagctgccctcc(SEQID NO：9)

所产生的重组hGH基因经过Xba I/EcoR I被亚克隆到 pBluescript上。利用DNA测序证明了两条链的正确序列。

使用下列寡聚核苷酸从载体pJuFo(Crameri & Suter基因(Gene) 137：69(1993))PCR-扩增了编码FOS两亲性螺旋结构域的DNA序列：  omp-FOS：  5′-ccTGCGGTGGTCTGACCGACACCC-3′(SEQ ID NO：10)  FOS-hgh：  5-ccgcggaagagccaccGCAACCACCGTGTGCCGCCAGGATG-3′(SEQ ID  NO：11)

为了这个PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和5ng 模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs 和1.5mM MgSO4)中进行反应。温度循环如下：95℃2分钟；此后是5 个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循环；此后是25个95℃ (45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。

PCR产物被纯化和分离，并被克隆到用Stu I消化的 pBluecript-ompA-hGH中。然后将杂合基因克隆到pKK223-3质粒上 (Pharmacia)。

                  实施例5：

            FOS-hGH的细菌表达

pkk223-3中的omp-FOS-hGH使用JM101作为E.coli宿主菌，在 可诱导的IPTG-依赖性启动子的控制之下表达。表达在摇瓶中进行。 细胞在OD600为0.5时用1mM IPTG诱导。表达在37℃持续10小时。 通过在10℃3600rpm离心10分钟而收获细胞。冰冻(-20℃或液氮) 细胞沉淀物并贮存16小时。然后在4℃使此沉淀物解冻，并在10ml 含有600mM蔗糖的10mM Tris-HCl，pH7.4中重新悬浮。在4℃搅 拌15分钟之后，细胞周质蛋白通过渗透压休克程序将蛋白释放。加入 冷却(4℃)的去离子H2O，然后在4℃搅拌30分钟。将污泥稀释，重新 悬浮，并加入溶菌酶从而降解细菌的细胞壁。通过在4℃ 11000g离 心20分钟将细胞和细胞周质球芽分离。利用含有还原性和非还原性 SDS-PAGE及斑点印迹(Dot Bolt)分离了含有FOS-hGH上清。使用一种 抗-hGH抗体(Sigma)作为第一抗体及碱性磷酸酶(AP)-抗-小鼠抗体偶 联物作为第二抗体，如实施例8中所述进行斑点杂交。

全长的、被正确加工的FOS-hGH在还原性及非还原性条件下可以 检测到。由于FOS两亲性螺旋中所存在的自由的半胱氨酸，FOS-hGH 的一部分结合到其它没有被鉴定的蛋白上。然而，超过50％的表达的 FOS-hGH以其天然的单体构象存在(图3)。

将使用已纯化的FOS-hGH，进行使用含有JUN的病毒颗粒的最初 的添加实验(doping experiment)。

                  实施例6：

          表达FOS融合蛋白的pAV载体系列的构建

构建一种多用途的载体系统从而允许在E.coli中进行-或C-末 端FOS融合蛋白的细胞质生产或分泌，或者在真核细胞中进行-或C- 末端FOS融合蛋白的生产。为在E.coli中生产FOS融合蛋白而设计的 载体pAV1-pAV4，包括以下所列的DNA盒，其含有按不同次序排列的 下列遗传元件：(a)一个从E.coliompA基因衍生而来的强的核糖体结 合位点和5′不翻译区(aggaggtaaaaaacg)(第13号序列)；(b)一个编 码E.coli外膜蛋白OmpA的信号肽的序列(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) (第14号序列)的序列；(c)一个编码两侧具有两个甘氨酸残基和一个 半胱氨酸残基的FOS二聚化结构域的序列 (CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15号序 列)；及(d)一个编码一种连接感兴趣蛋白与FOS二聚化结构域的短肽 接头(AAASGG(第16号序列)或GGSAAA(第17号序列))的区域。有关的 编码区域以大写字母列出。限制性内切酶酶切位点的排列使得具有或 不具有信号信号序列的FOS融合蛋白的构建容易。将此盒式组件克隆 到在强tac启动子控制下表达此融合蛋白的表达载体 pKK223-3(Pharmacia)中的EcoR I/HindIII限制性位点处。 pAV1

此载体是为将FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli细胞周 质间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的StuI /NotI位点处。     EcoRI                                   31/11     gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT

                            M   K   K   T   A   I   A   I   A   V   A   L   A     6/21                    StuI                NotI     GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC tgg gtg ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGT     G   F   A   T   V   A   Q   A    (goi)      A   A   A   S   G   G   C   G   G     121/41                                  151/51     CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA     L   T   D   T   L   Q   A   E   T   D   Q   V   E   D   E   K   S   A   L   Q     181/61                                  211/71     ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC     T   E   I   A   N   L   L   K   E   K   E   K   L   E   F   I   L   A   A   H     241/51      HindIII     GGT GGT TGC taa gct t    (SEQ ID NO：18)     G   G   C   *   A        (SEQ ID NO：19)     pAV2

此载体是为将FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli细胞周质 间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI /EcoRV(或NotI/HindIII)位点处。     EcoRI                                   31/11     gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT

                            M   K   K   T   A   I   A   I   A   V   A   L   A     61/21                    StuI           91/31     GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC     G   F   A   T   V   A   Q   A   C   G   G   L   T   D   T   L   Q   A   E   T     121/41                                  151/51     GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA     D   Q   V   E   D   E   K   S   A   L   Q   T   E   I   A   N   L   L   K   E     181/61                                  211/71                      NotI     AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCT     K   E   K   L   E   F   I   L   A   A   H   G   G   C   G   G   S   A   A   A     241/81      EcoRV   HindIII     ggg tgt ggg gat atc aag ctt     (SEQ ID NO：20)       (goi)                         (SEQ ID NO：21) pAV3

此载体是为在E.coli细胞质生产FOS位于C-末端的融合蛋白而设 计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的EcoRV/NotI位点处。   EcoRI                   EcoRV               NotI   gaa ttc agg agg taa aaa gat atc ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGT

                                (goi)     A   A   A   S   G   G   C   G   G   61/21                                   91/31   CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA   L   T   D   T   L   Q   A   E   T   D   Q   V   E   D   E   K   S   A   L   Q   121/41                                  151/51   ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC   T   E   I   A   N   L   L   K   E   K   E   K   L   E   F   I   L   A   A   H   181/61       HindIII   GGT GGT TGC taa gct t      (SEQ ID NO：22)   G   G   C   *              (SEQ ID NO：23)   pAV4

此载体是为在E.coli细胞质生产FOS位于N-末端的融合蛋白而设 计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI/EcoRV(或 NotI/HindIII)位点处。一旦蛋白质被合成即通过蛋白质水解去除甲硫 氨酸残基(Hirel等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)86：8247-8251(1989))。   EcoRI                                   31/11   caa ttc agg agg taa aaa acg ATG GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA   E   F   R   R   *   K   T   M   A   C   G   G   L   T   D   T   L   Q   A   E   61/21                                   91/31   ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA   T   D   Q   V   E   D   E   K   S   A   L   Q   T   E   I   A   N   L   L   K   121/41                                  151/51                          NotI   GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC   E   K   E   K   L   E   F   I   L   A   A   H   G   G   C   G   G   S   A   A   181/61         EcoRV    HindIII   GCT ggg tgt ggg gat atc aag ctt   (SEQ ID NO：24)   A     (goi)                       (SEQ ID NO：25)

载体pAV5和pAV6，是为FOS融合蛋白的真核生产而设计的，包 括按不同次序排列的下列遗传元件：(a)一个编码人生长激素的前导肽 的区域(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)(第26号序列)；(b)一个编码 两侧具有两个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基的FOS二聚化结构域的序 列(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15号序 列)；及(c)一个编码一个连接感兴趣蛋白与FOS二聚化结构域的短肽 接头(AAASGG(第16号序列)或GGSAAA(第17号序列))的区域。有关的 编码区域以大写字母列出。限制性切割位点的排列使得FOS融合基因 的构建容易。此盒式组件被克隆到表达载体pMPSVEH的EcoRI/HindIII 限制性位点中(Artelt，等，基因(Gene)68：1998))。 pAV5

此载体是为FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生产而设计的。感 兴趣的基因(g.o.i)可以通过将其连接到此载体的Eco47III/NotI位 点而被插入编码hGH信号序列和FOS结构域的序列之间。或者，一个 含有其自身信号序列的基因可以通过将其连接到StuI/NotI位点而 与FOS编码序列融合。 EcoRI   StuI                            31/11

gaa ttc agg cct ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC

                M   A   T   G   S   R   T   S   L   L   L   A   F   G   L   L

61/21                           Eco47III            NotI

TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC

C   L   P   W   L   Q   E   G   S   A     (goi)     A   A   A   S   G   G   C

121/41                                  151/51

GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG

G   G   L   T   D   T   L   Q   A   E   T   D   Q   V   E   D   E   K   S   A

181/61                                  211/71

CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG

L   Q   T   E   I   A   N   L   L   K   E   K   E   K   L   E   F   I   L   A

241/81                HindIII

GCA CAC GGT GGT TGC taa gct t    (SEQ ID NO：27)

A   H   G   G   C   *             (SEQ ID NO：28) pAV6

此载体是为FOS位于N-末端的融合蛋白的真核生产而设计的。感 兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI/StuI(NotI/HindIII) 位点。   EcoRI                                   31/11   gaa ttc ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG

      M   A   T   G   S   R   T   S   L   L   L   A   F   G   L   L   C   L   61/21                   Eco47III    91/31   CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC   F   W   L   Q   E   G   S   A   C   G   G   L   T   D   T   L   Q   A   E   T   221/41                                  151/51   GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA   D   Q   V   E   D   E   K   S   A   L   Q   T   E   I   A   N   L   L   K   E   181/61                                  211/71                      NotI   AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCT   K   E   K   L   E   F   I   L   A   A   H   G   G   C   G   G   S   A   A   A   241/81      StuI    HindIII   ggg tgt ggg agg cct aag ctt      (SEQ ID NO：29)   (goi)                          (SEQ ID NO：30) 表达载体pAV1-pAV6的构建 合成了以下寡聚核苷酸用于表达载体pAV1-pAV6的构建：   FOS-FOR1：   CCTGGGTGGGGGCGGCCGCTTCTGGTGGTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ   ID NO：31)；   FOS-FOR2：   GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATCGGGTGTGGGGCGGCC   (SEQ ID NO：32)；   FOS-FOR3：   GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATGGCTTGCGGTGGTCTGACC   (SEQ ID NO：33)；   FOS-FOR4：   GCTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ ID NO：34)；   FOS-REV1：   CCACCAAGCTTAGCAACCACCGTGTGC(SEQ ID NO：35)；   FOS-REV2：   CCACCAAGCTTGATATCCCCACACCCAGCGGCCGCAGAACCACCGC   AACCACCG(SEQID NO：36)；   FOS-REV3：   CCACCAAGCTTAGGCCTCCCACACCCAGCGGC(SEQ ID NO：37)；   OmpA-FOR1：   GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATG(SEQ ID NO：38)；   hGH-FOR1：   GGTGGGAATTCAGGCCTATGGCTACAGGCTCC(SEQ ID NO：39)；和   hGH-FOR2：   GGTGGGAATTCATGGCTACAGGCTCCC(SEQ ID NO：40)

为了载体pAV2的构建，使用引物对OmpA-FOR1/FOS-REV2从载体 pKK223-3的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码OmpA 信号序列和FOS结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化并连接 到载体pKK223-3的相同位点上(Pharmacia)。

为了载体pAV1的构建，使用引物对FOS-FOR1/FOS-REV1从载体 pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码FOS 的区域。PCR产物用HindIII消化并连接到用StuI/HindIII消化过的载 体pAV2。

为了载体pAV3的构建，使用引物对FOS-FOR2/FOS-REV1从载体 pAV1扩增了编码FOS结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化 并连接到载体pKK223-3的相同位点上(Pharmacia)。

为了载体pAV4的构建，使用引物对FOS-FOR3/FOS-REV2从载体 pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码FOS 结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化并连接到载体pKK223-3 的相同位点上(Pharmacia)。

为了载体pAV5的构建，使用引物对hGH-FOR1/hGHREV1从载体 pSINrep5中的hGH-FOS-hGH融合基因(参见实施例7)扩增了编码hGH 信号序列的区域。PCR产物用EcoRI/NotI消化并连接到载体pAV1 的相同位点上。此后，通过EcoRI/HindIII消化，分离所产生的编码 hGH信号序列和FOS结构域的盒式组件，并将其克隆到用相同的酶消 化过的载体pMPSVEH上(Artelt等，基因(Gene)68：213-219(1998))。

为了载体pAV6的构建，使用引物对FOS-FOR4/FOSREV3从载体 pAV2扩增了编码FOS的区域。PCR产物用HindIII消化，并被克隆到用 Eco47III/HindIII切割过的载体pAV5上。此后，使用引物对 hGH-FOR2/FOSREV3从所产生的载体上再次扩增编码hGH信号序列和 FOS结构域的完整盒式组件，用EcoRI/HindIII消化并将其连接到用相 同的酶消化过的载体pMPSVEH上(Artelt等，基因 (Gene)68：213-219(1998))。

                实施例7：

            具有人(hGH)信号序列的FOS-hGH的构建

为了FOS-hGH融合蛋白的真核表达，利用Xba I/Bsp120 I消化从 pBluescript∷OmpA-FOS-hGH(参见实施例4)分离了OmpA-FOS-hGH融 合基因，并将其克隆到用相同的酶消化过的载体pSINrep5 (Invitrogen)上。使用重叠的寡聚核苷酸 Sig-hGH-FOR(GGGTCTAGAATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTT TGGCCTGCTCTG)(第41号序列)和Sig-hGH-REV(CGCAGGCCTCGGCACT GCCCTCTTGAAGCCAGGGCAGGCAGAGCAGGCCAAAAGCCAG)(第42号序列)，通 过PCR合成了hGH信号序列(反应混合物：每种引物各50pmol，dATP、 dGTP、dTTP、dCTP各200μM，2.5单位Taq DNA聚合酶(Qiagen)， 50μl总反应体积，在生产商所提供的的缓冲液中；扩增：92℃30秒、 55℃30秒、72℃30秒，30个循环)。PCR产物使用QiaEx II Kit试剂盒 进行纯化，用Stu I/Xba I进行消化，并连接到用同样的酶切割过的 载体pSINrep∷OmpA-FOS-hGH上。

                实施例8：

              FOS-hGH的真核表达

通过利用ScaI限制性消化，使无RNase的载体(1.0μ g)(pSINrep∷OmpA-FOS-hGH)及1.0μg DHEB(Bredenbeek等，病毒 学杂志(J.Virol.)67：6439-6446(1993))线性化。此后，使用SP6 体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP，InvitroGen，Invitrogen BV，NV Leek，Netherlands)进行体外转录。所产生的5′-加帽的mRNA在还 原性琼脂糖凝胶上进行分析。

根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统， Invitrogen BV，Netherlands)将体外转录的mRNA 5μg电穿孔导入 BHK21细胞(ATCC：CCL10)中。在37℃温育10小时之后，用不含有FCS 的HP-1培养基替换含有FCS的培养基，随后又在37℃温育10小时。 收获上清，并利用斑点印迹(dot-Blot)分析了FOS-hGH的生产。

在硝酸纤维素膜上点培养基(2.5μl)并在室温干燥10分钟。用 1％牛血清白蛋白(Sigma)的TBS(10×TBS每毫升：87.7g NaCl，66.1 g Trizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma)，pH 7.4)溶液在室温封闭此膜1小时，此后在10ml TBS-T(含有0.05％ Tween20的TBS)中与2μg兔抗-人hGH抗体温育1小时。用TBS-T洗 涤此印迹斑点3次10分钟，并与用TBS-T 1∶5000稀释的偶联了抗- 兔IgG的碱性磷酸酶(Jackson Laboratories，Inc.)温育1小时。在 用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后，如实施例2 中所述，利用AP染色使印迹显色。结果表示在图3中。

                实施例9：

       FOS-PLA(N-和C-末端)的构建

通过编码一种蜂毒磷脂酶A2(PLA)的、催化活性被灭活的突变体的 化学基因合成，构建下列基因(Frster等，过敏反应临床免疫学杂志 (J.Allergy Clin.Immunol.)95：1229-1235(1995))。   1/1                                     31/11   ATC ATC TAC CCA GGT ACT CTG TGG TGT GGT CAC GGC AAC AAA TCT TCT GGT CCG AAC GAA   I   I   Y   P   G   T   L   W   C   G   H   G   N   K   S   S   G   P   N   E   61/21                                   91/31   CTC GGC CGC TTT AAA CAC ACC GAC GCA TGC TGT CGC ACC CAG GAC ATG TGT CCG GAC GTC   L   G   R   F   K   H   T   D   A   C   C   R   T   Q   D   M   C   P   D   V   121/41                                 151/51   ATG TCT GCT GGT GAA TCT AAA CAC GGG TTA ACT AAC ACC GCT TCT CAC ACG CGT CTC AGC   M   S   A   G   E   S   K   H   G   L   T   N   T   A   S   H   T   R   L   S   181/61                                  211/71   TGC GAC TGC GAC GAC AAA TTC TAC GAC TGC CTT AAG AAC TCC GCC GAT ACC ATC TCT TCT   C   D   C   D   D   K   F   Y   D   C   L   K   N   S   A   D   T   I   S   S   241/81                                  271/91   TAC TTC GTT GGT AAA ATG TAT TTC AAC CTG ATC GAT ACC AAA TGT TAC AAA CTG GAA CAC   Y   F   V   G   K   M   Y   F   N   L   I   D   T   K   C   Y   K   L   E   H   301/101                                 331/111   CCG GTA ACC GGC TGC GGC GAA CGT ACC GAA GGT CGC TGC CTG CAC TAC ACC GTT GAC AAA   P   V   T   G   C   G   E   R   T   E   G   R   C    L  H   Y   T   V   D   K   361/121                                 391/131   TCT AAA CCG AAA GTT TAC CAG TGG TTC GAC CTG CGC AAA TAC        (SEQ ID NO：43)   S   K   P   K   V   Y   Q   W   F   D   L   R   K   Y          (SEQ ID NO：44)

为了PLA与FOS二聚化结构域的N-末端的融合，使用寡聚核苷酸 PLA-FOR1(CCATCATCTACCCAGGTAC)(第45号序列)和 PLA-REV1(CCCACACCCAGCGGCCGCGTATTTGCGCAGGTCG)(第46号序列)扩 增了该区域。这个PCR产物用Not I进行切割，并被连接到先前已经 用限制性内切酶Stu I/Not I切割过的载体pAV1上。为了PLA与FOS 二聚化结构域的C-末端的融合，使用寡聚核苷酸 PLA-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTATCATCTACCCAGGTAC)(第47号序列) 和PLA-REV2(TTAGTATTTGCGCAGGTCG)(第47号序列)扩增了该区域。这 个PCR产物用Not I切割并连接到先前已经用限制性内切酶Not I /EcoRV切割过的载体pAV2上。

                           实施例10：

FOS-卵清蛋白融合基因(N-末端和C-末端)的构建

为了卵清蛋白编码序列的克隆，根据生产商的使用说明，使用 QuickPrepTM Micro mRNA Purifieation Kit试剂盒(Pharmacia)用鸡 输卵管组织制备mRNA。使用SuperScriptTM One-step RT-PCR Kit试 剂盒(Gibco BRL)，使用引物Ova-FOR1(CCGGCTCCATCGGTGCAG)(第49 号序列)和Ova-REV1(ACCACCAGAAGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCC)(第 50号序列)合成一个编码卵清蛋白的成熟部分的cDNA(对应于该mRNA 的68-1222位核苷酸(McReynold等，科学(Nature) 273：723-728(1978))。这个PCR产物用Not I消化，并被克隆到用Stu I/Not I消化过的载体pAV1上，以表达FOS二聚化结构域在C-末端 的融合蛋白。为了FOS二聚化结构域在N-末端的融合蛋白的生产，使 用引物Ova-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTGGCTCCATCGGTGCAG)(第51号 序列)和Ova-REV2(TTAAGGGGAAACACATCTGCC)(第52号序列)，从已构 建的载体(pAV1∷Ova)扩增了卵清蛋白编码区。PCR产物用Not I消化， 并被克隆到用Not I/EcoR V消化过的载体pAV2上。所克隆的片段利 用DNA序列分析验证。

                  实施例11：

FOS-PLA和FOS-卵清蛋白融合蛋白的生产和纯化

为了在细胞周质产生FOS融合蛋白，用载体pAV3∷PLA、pAV4∷ PLA、pAV3∷Ova或pAV4∷Ova转化了一种合适的E.coli菌株。培养 物在37℃，在存在氨苄青霉素的丰富培养基中温育和摇动。在光密度 (550nm)为1时，加入1mM IPTG并继续温育5小时。通过离心收获细 胞，重新悬浮在一种含有DNase、RNase和溶菌酶的合适的缓冲液(例 如，Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl)中，并使细胞通过弗氏压碎器 (Fench pressure cell)从而将细胞破碎。离心(Sovall RC-5C，SS34 转头，15000rpm，10分钟，4℃)之后，在4℃将沉淀物重新悬浮于 25ml包函体洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，23％蔗糖，0.5％Triton X-100，1mM EDTA，pH8.0)中，并如上所述再次离心。重复进行此 过程直到离心以后的上清基本澄明。在室温将包函体溶解于20ml溶 解缓冲液(5.5M盐酸胍，25mM Tris-HCl，pH7.5)中，并离心、此 后使上清通过无菌滤膜(0.45μm)从而去除不溶物质。蛋白溶液在存 在10mM和100mM DTT的条件下在4℃保存至少10小时，对10体积 的5.5M盐酸胍，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH6(溶液)透析3 次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽；胱氨 酸/半胱氨酸)的条件下，将此溶液对5升2M尿素，4mM EDTA，O.1M NH4Cl，20mM硼酸钠(pH8.3)(溶液)透析2次。然后对重折叠的蛋白 进行离子交换层析。将此蛋白贮存于一种合适的缓冲液中，pH大于7 并存在2-10mM DTT，从而使位于FOS侧翼的半胱氨酸残基处于还原 形式。在此蛋白和甲病毒颗粒偶联之前，将此蛋白溶液通过Sephadex G-25凝胶过滤柱，从而除去DTT。

                 实施例12：

           gp140-FOS的构建

使用下列寡核苷酸，通过PCR从含有全长gp160基因的原始质粒 pAbT4671(ATCC 40829)扩增了不含有内部蛋白酶切割位点的gp140基 因(Swiss-Prot：P03375)：   HIV-1：   5′-ACTAGTCTAGAatgagagtgaaggagaaatatc-3′(SEQ ID NO：53)；   HIV-end：   5′-TAGCATGCTAGCACCGAAtttatctaattccaataattcttg-3′(SEQ ID NO：54)；   HIV-Cleav：   5′-gtagcacccaccaaggcaaagCTGAAAGCTACCCAGCTCGAGAAACTGgca-3′   (SEQ ID NO：55)；和   HIV-Cleav2：   5′-caaagctcctattcccactgcCAGTTICTCGAGCTGGGTAGCTTICAG-3′(SEQ ID   NO：56).

为了PCR I，使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-Cleav2各100pmol 和5ng模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶，0.1 mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方式进行： 30个循环，退火温度是60℃，延伸时间72℃2分钟。

为了PCRII，使用寡聚核苷酸HIV-end和HIV-Cleav各100pmol 和5ng模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶，0.1 mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方式进行： 30个循环，退火温度是60℃，延伸时间72℃50秒。

两个PCR产物都进行纯化、分离，并用于装配PCR反应。为了这 个装配PCR反应，使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-end各100pmol和 每一个PCR片段各2ng在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合 酶，0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方 式进行：30个循环，退火温度是60℃，延伸时间72℃2.5分钟。装配 PCR产物用Xba I和Nhe I消化。此FOS两亲性螺旋符合阅读框地融合 到gp-140的C-末端。

使用下列寡聚核苷酸，从载体pJuFo(Crameri & Suter基因 (Gene)137：69(1993))PCR-扩增了编码FOS两亲性螺旋结构域的DNA 序列：   FOS-HIV：   5′-ttcggtgctagcggtggcTGCGGTGGTCTGACCGAC-3′(SEQID NO：57)；和   FOS-Apa：   5′-gatgctgggcccttaaccGCAACCACCGTGTGCCGCC-3′(SEQID NO：58).

为了这个PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng 模板DNA在75μl反应混合物(4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs 和1.5mM MgSO4)中进行反应。温度循环以如下方式完成：95℃2分钟； 随后是5个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)的循环；随后又 是25个95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。所获得的PCR 片段用NheI和Bsp120L消化。

GP140-FOS的最终表达载体在将2个PCR片段连接到pSinRep5的 3片段连接反应中获得。所产生的载体pSinRep5-GP140-FOS通过限制 性分析和DNA测序进行评价。

GP140-FOS还经过XbaI和Bsp120L而被克隆到pCYTts中，从而 获得一个稳定的可以诱导的GP140-FOS表达细胞系。

                   实施例13：

     使用pSinRep5-GP140FOS表达GP140FOS

通过限制性内切酶消化，使无RNA酶(RNase-free)的载体(1.0 μg)(pSinRep5-GP140-FOS)和1.0μg DHEB(Bredenbreek等，病毒学 杂志(J.Virol.)67：6439-6446(1993))线性化。此后，使用一种SP6 体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP，InvitroGen，Invitrogen BV， NV Leek，Netherlands)进行体外转录。所产生的5′-加帽的mRNA在 还原性琼脂糖凝胶上分析。

根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统， Invitrogen BV，Netherlands)，将所转录的mRNA(5μg)电穿孔导入 BHK21细胞系(ATCC：CCL10)。37℃温育10小时之后，用不含有FCS 的HP-1培养基交换含有FCS的培养基，此后又在37℃温育10小时。 收获上清，并完全按照实施例2中所述，利用Western印迹分析可溶 性GP140-FOS的生产。

                 实施例14：

     使用pCYTts-GP140FOS表达GP140FOS

利用限制性内切酶消化使pCYT-GP140-FOS线性化。利用酚/氯仿 抽提终止此反应，此后用异丙醇沉淀线性DNA。利用琼脂糖凝胶电泳 评价限制性内切酶消化。为了转染，将5.4μg的线性pCYTtsGP140-FOS 与0.6μg线性pSV2Neo混合于30μlH2O中，并加入30μlCaCl2 溶液。在加入60μ1磷酸缓冲液(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)之后，振摇此溶液30秒，然后在室温温育25秒。 立即将此溶液加入2ml含有2％FCS(2％FCS)的HP-1培养基中。然后 用含有DNA的培养基替换80％铺满的BHK21细胞培养(6-孔板)的培养 基。在CO2培养箱中在37℃温育5小时后，去除含有DNA的培养基， 并用2ml内含15％甘油的2％FCS培养基替换。在30秒的温育期4 之后，去除含有甘油的培养基，通过用5ml含有10％FCS的HP-1培 养基漂洗而洗涤细胞。最后，加入2ml含有10％FCS的新鲜HP-1培 养基。

选择稳定转染的细胞，并在CO2培养箱中，在选择培养基(补充G418 的HP-1培养基)中在37℃培养。当混合的细胞群培养到铺满时，将细 胞分到两个平皿中，然后在37℃培养12小时。将一平皿细胞转移到 30℃，从而诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一平皿细胞在37℃保存。

利用Western印迹测定了可溶性GP140-FOS的表达。培养基(0.5 ml)用甲醇/氯仿沉淀，并将此沉淀物重新悬浮于SDS-PAGE上样缓冲液 中。将样品95℃加热5分钟，然后上样到15％丙烯酰胺凝胶上。SDS-PAGE 之后，如Bass和Yang在Creighton，T.E.，eds.蛋白质功能：一种实 用方法(Protein Function：A Practical Approch，2nd edn.，)，IRL Press，Oxford(1997)，29-55页所述，将蛋白转移到Protan硝酸纤 维膜(Schleicher & Schuell，Germany)上。用含有1％牛血清白蛋白 (Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升：87.7g NaCl，66.1g Trizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma)，pH7.4)室温封 闭1小时，随后与抗-GP140或GP160抗体温育1小时。印迹斑点用 TBS-T(含有0.05％Tween20的TBS)洗涤3次10分钟，并与碱性磷酸 酶抗-小鼠/兔/猴/人IgG偶联物温育1小时。用TBS-T洗涤2次10 分钟和TBS洗涤2次10分钟之后，使用碱性磷酸酶检测试剂和50μl NBT(内含7.7％氮蓝四唑(Sigma)的70％二甲基甲酰胺)及37μl X-Phosphate溶液(内含5％5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺) 进行显色反应。

                  实施例15：

          GPl40FOS的生产及纯化

将一种抗-gp120抗体共价偶联到一种用NHS/EDC活化的右旋糖苷 上，并装到层析柱中。将含有GP140FOS的上清装载到层析柱上，充分 洗涤之后，用0.1M HCl洗脱GP140FOS。在收集期间，使用1M Tris pH7.2直接在收集试管中中和洗脱物。

纯化期间可能存在二硫键形成，因此所收集的样品用内含10mM DTT的10mM Tris pH7.5在25℃处理2小时。

随后对10mM Mes；80mM NaCl pH6.0透析从而去除DTT。最后， 如实施例16中所述，将GP140-FOS与在E2中含有JUN亮氨酸拉链的 甲病毒颗粒混合。

                实施例16：

          甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒的制备

根据生产商所提供的操作程序，使用分子量截留值为100kD的 Millipore Ultra Centrifugal Filter Devices浓缩病毒颗粒(参见 实施例2和3)。或者，病毒颗粒可如辛德比斯病毒表达系统 (Invitrogen，Sam Diego，California)的使用手册所述，利用蔗糖梯 度离心来浓缩。将病毒悬浮液的pH调整到pH7.5，在存在2-10mM DTT 的条件下将病毒颗粒温育数小时。用一种合适的缓冲液在Sephacryl S-300柱(Pharmacia)(病毒颗粒用空体积洗脱)上从污染蛋白纯化出 病毒颗粒。

在存在一种redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽； 胱氨酸/半胱氨酸)的条件下，在一种适当的缓冲液(pH7.5-8.5)中将 所纯化的病毒颗粒与至少240倍摩尔过量的FOS-抗原融合蛋白在4℃ 温育至少10小时。在使用分子量截留值为100kD的Millipore Ultra Centrifugal Filter Devices浓缩此颗粒之后，将此混合物通过 Sephacryl S-300过滤柱(Pharmacia)。病毒颗粒用空水体积(void volume)洗脱。

                实施例17：

  JUN两亲性螺旋与HBcAg(1-144)的氨基端的融合

JUN螺旋被融合到HBcAg第1到144位氨基酸序列的氨基末端 (JUN-HBcAg构建体)。为了JUN-HBcAg DNA序列的构建，通过PCR扩 增了编码JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物EcoR I-JUN(s) 和JUN-SacII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。EcoR I-JUN(s)引物 引进了一个EcoR I位点和此后一个启始ATG密码子。JUN-SacII(as) 引物引进了一个编码氨基酸序列GAAGS的接头。使用引物JUN-HBcAg(s 和HBcAg(1-144)Hind(as)，从pEco63质粒(从ATCC No.31518获得) 扩增了HBcAg(1-144)序列。JUN-HBcAg(s)含有一个对应于编码JUN螺 旋和此后一个编码GAAGS接头的序列和HBcAg序列5′末端的序列的3 ′末端。HBcAg(1-144)Hind(as)在HBcAg基因的114位密码子之后引 进一个终止密码子和一个HindIII位点。为了这个PCR反应，使用每一 种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2个单位 Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。 对于这两个反应，温度循环都以如下方式进行：94℃2分钟；及30个 94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。 引物序列：   EcoRI-JUN(s)：   (5′-CCGGAATTCATGTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ ID   NO：61)；   JUN-SacII(as)：   (5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ   ID NO：62)；   JUN-HBcAg(s)：   (5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG-3′)   (SEQ ID NO：63)；   HBcAg(1-144)Hind(as)：   (5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQ   ID NO：64).

使用引物EcoR I-JUN(s)和HbcAg(1-144)Hind(as)通过PCR进行 这两个PCR片段的融合。使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与100ng 纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和 2mM MgSO4的反应混合物中进行反应。PCR循环条件是：94℃2分钟； 及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。最终的PCR 产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，纯化，并在一种合适的缓冲液中 用EcoR I和HindIII限制性内切酶消化16小时。将已消化的DNA片段 连接到用EcoR I/HindIII-消化过的pKK载体上，从而产生 pKK-JUN-HBcAg表达载体。利用EeoR I/HindIII限制性分析及利用插入 物的DNA序列测定，分析了这个PCR产物的插入。

                    实施例18：

  JUN两亲性螺旋与HBcAg(1-144)的羧基末端的融合

JUN螺旋被融合到HBcAg氨基酸序列第1到144位的羧基末端 (HBcAg-JUN构建体)。为了HBcAg-JUN DNA序列的构建，通过PCR分 别扩增了编码JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物SacII-JUN (s)和JUN-HindIII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。SacII-JUN(s) 引物引进了一个编码氨基酸LAAG的接头。此序列还含有一个SacII位 点。JUN-HindIII(as)引进了一个终止密码子(TAA)及随后一个HindIII 位点。使用引物EcoR I-HBcAg(s)和HBcAg(1-144)-JUN(as)，从pEco63 质粒扩增了HBcAg(1-144)DNA序列。EcoR I-HBcAg(s)在HBcAg编码 序列的启始ATG之前引进一EcoR I位点。HBcAg(1-144)-JUN(as)引进 一个编码肽接头(LAAG)的序列，这个序列还含有一个SacII位点。为 了这个PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板 DNA在50μl含有2个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。温度循环都以如下方式进行：94℃2分钟； 及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。 引物序列：   SacII-JUN(s)：   (5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ ID   NO：65)；   JUN-HindIII(as)：   (5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ   ID NO：66)；   EcoRI-HBcAg(s)：   (5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO：67)；   和   HBcAg-JUN(as)：   (5′-CCGACCACCGCAACCCGCGGCTAGCGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)   (SEQ ID NO：68).

使用引物EcoR I-HBcAg(s)和JUN-HindIII(as)通过PCR进行这 两个PCR片段的融合。使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与100ng 纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和 2mM MgSO4的反应混合物中进行。PCR循环条件是：94℃1分钟；及 35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。最终的PCR 产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，并在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII限制性内切酶消化16小时。凝胶纯化此DNA，并连接到经 EcoR I/HindIII-消化过的pKK载体上，从而产生pKK-HBcAg-JUN表达 载体。利用EcoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA测序分析 这个PCR产物的插入。

                 实施例19：

     JUN两亲性螺旋插入HBcAg(1-144)的c/el表位

已知HBcAg的c/el表位(第72-78位残基)是定位于乙型肝炎病毒 衣壳表面的尖端区域。此蛋白这一区域的一部分(第76-82残基)在遗 传上被JUN螺旋替换，从而提供一个抗原结合位点(HBcAg-JUNIns构 建体)。HBcAg-JUNIns DNA序列通过PCR产生：通过PCR分别扩增JUN 螺旋和两个编码HBcAg片段(第1到75位氨基酸残基和第83到144 位氨基酸残基)的序列。使用引物BamH I-JUN(s)和JUN-SacII(as)从 pJuFo质粒扩增了JUN序列。BamH I-JUN(s)引进一个编码又含有一个 BamH I位点的肽序列的接头序列。JUN-SacII(as)引进一个编码肽接头 GAAGS及其后一个与JUN编码序列的3′末端互补的序列。使用引物 EcoR I HBcAg(s)和HBcAg75-JVN(as)，从pEco63质粒扩增了 HBcAg(1-75)DNA序列。EcoR I HBcAg(s)引进了一个EcoR I位点，和 此后一个对应于HBcAg序列的5′末端的序列。HBcAg75-JUN(as)引进 了一个编码HBcAg第75位氨基酸之后的肽GSGGG的接头，及此后一个 与JUN螺旋编码序列的5′末端互补的序列。使用引物JUN-HBcAg83(s) 和引物HBcAg(1-144)Hind(as)扩增了HBcAg(83-144)片段。 JUN-HBcAg83(s)含有一个对应于JUN-编码序列的3′末端和此后一个 编码多肽GAAGS的接头的序列和一个对应于HBcAg(83-144)编码序列 的5′端的序列。HBcAg(1-144)Hind(as)引进了一个终止密码子和一 个位于HBcAg基因的第144位密码子之后的HindIII位点。为了这个PCR 反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl 反应混合液(2单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4)中进行 反应。温度循环都以如下方式进行：94℃2分钟；及35个94℃(1分 钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。 引物序列：   BamHI-JUN(s)：   (5′-CTAATGGATCCGGTGGGGGCTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGCTCGAG-3′)   (SEQ ID NO：69)；   JUN-SacII(as)：   (5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3)(SEQ   ID NO：70)；   EcoRIHBcAg(s)：   (5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO：71)；   HBcAg75-JUN(as)：   (5′-CCGACCACCGCAGCCCCCACCGGATCCATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3′)   (SEQ ID NO：72)；   JUN-HBcAg83(s)：   (5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3′)   (SEQ ID NO：73)；和   HBcAg(1-144)Hind(as)：   (5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQ   ID NO：74).

这三个PCR片段的融合如下进行。首先，使用引物EcoR I HBcAg(s) 和JUN-SacII(as)通过PCR将编码HBcAg1-75的片段与编码JUN的序 列融合。第二，使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAgHindIII(as)通过PCR 将所获得的产物与HBcAg(83-144)片段融合。为了PCR融合，使用每 一种寡聚核苷酸各100pmol和100ng纯化的PCR片段在50μl含有 2个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进 行反应。同样的PCR条件被用于产生个别片段。最终的PCR产物在一 种适合的缓冲液中用EcoR I/HindIII限制性内切酶消化16小时。将此 DNA片段连接到已用EcoR I/HindIII消化的pKK载体上，产生 pKK-HBcAg-JUNIns载体。利用EcoR I/HindIII限制性分析以及利用插 入物的DNA序列测定，分析了这个PCR产物的插入。

                  实施例20：

JUN两亲性螺旋与麻疹病毒核衣壳(N)蛋白的羧基端的融合

JUN螺旋被融合到截短的、包括第1到473位氨基酸残基的麻疹病 毒N蛋白片段的羧基端(N473-JUN构建体)。为了编码N473-JUN的DNA 序列的构建，通过PCR分别扩增了编码JUN螺旋的序列和编码 N473-JUN的序列。使用引物SacII-JUN(s)和JUN-HindIII(as)从 pJuFo质粒扩增了JUN序列。SacII-JUN(s)引物引进了一个编码肽接 头LAAG的序列。此序列还含有一个SacII位点。JUN-HindIII(as)反 义引物引进了一个终止密码子(TAA)及此后一个HindIII位点。使用引 物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as)，从含有完整的麻疹病毒N蛋白 编码序列(从M.Billeter，Zurich处获取)的pSC-N质粒扩增了 N(1-473)序列。EcoR I-N(mea)(s)在N编码序列的启始ATG之前引进 一个EcoR I位点。N(mea)-JUN(as)与N(1-473)编码序列的3′末端互 补，此后是一个与肽接头(LAAG)的编码序列互补的序列。为了这个PCR 反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl 含有2个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液 中进行反应。温度循环以如下方式进行：94℃2分钟；及35个94℃(1 分钟)、55℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。 引物序列： SacII-JUN(s)： (5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ ID NO：75)；   JUN-HindIII(as)：   (5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ   ID NO：76)；   EcoRI-Nmea(s)：   (5′-CCGGAATTCATGGCCACACTTTTAAGGAGC-3′)(SEQ ID NO：77)；和   Nmea-JUN(as)：   (5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ ID   NO：78)

使用引物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as)通过进一步PCR使这 两个PCR片段的融合。为了这个PCR融合，使用每一种寡聚核苷酸各 100pmol与100ng所纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚 合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行。进行如下的 温度循环：95℃2分钟；及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃ (2分钟)的循环。PCR产物在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII 限制性内切酶消化16小时。凝胶纯化此DNA片段，并连接到用EcoR I/HindIII-消化过的pKK载体上，产生pKK-N473-JUN质粒。利用EcoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA序列测定，分析了PCR产物 的插入。

                 实施例21：

        HBcAg-JUN的表达及部分纯化

用pKK-HBcAg-JUN转化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml细菌 过夜培养物接种100ml含有100μg/ml培养基氨苄青霉素的LB培养 基。此培养物在37℃培养4小时，直至600nm光密度达到约0.8。通 过加入最终浓度1mM的IPTG，诱导HBcAg-JUN的合成。诱导之后， 细菌进一步在37℃摇16小时。通过5000xg离心10分钟，收获细 菌。将沉淀物在-20℃冰冻。解冻此沉淀物，并用补充了200μg/ml溶 菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2PO4， pH 7.0，30mM NaCl，0.25％ Tween-20，10mM EDTA，10mM DTT) 重新悬浮。细胞在室温温育30分钟，并用弗氏压碎器(Fench pressure cell)破碎细胞。向裂解物中加入最终浓度为0.2％的Triton X-100， 并将裂解物在冰上温育30分钟，偶尔摇动。图4表示一旦用IPTG诱 导时，HBcAg-JUN蛋白在E.coli中的表达。带有pKK-HBcAg-JUN表 达质粒或一种对照质粒的E.coli，被用于HBcAg-JUN表达的IPTG诱 导。在加入IPTG之前，从携带pKK-HBcAg-JUN质粒(第3栏)的细菌培 养物及从携带对照质粒(第1栏)的细菌培养物中取出一份样品。加入 IPTG后16小时，从携带pKK-HBcAg-JUN质粒(第4栏)的培养物及对 照培养物(第2栏)取样。利用SDS-PAGE及随后的考马斯亮蓝染色 (Coomassie staining)来监测蛋白的表达。

然后，为了除去不溶性的细胞碎片，将裂解物在12,000xg离心 30分钟。使用一种抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841，购买自Accurate Chemical and Scientific Corp，Westbury，NY，USA)进行Wesatern 印迹来分析上清和沉淀物，表明显著量的HBcAg-JUN是可溶性的(图 5)。简单地说，表达HBcAg-JUN的E.coli细胞及对照细胞的裂解物 在14,000xg离心30分钟。上清(＝可溶性部分)和沉淀物(不溶性部 分)被分离，并用SDS上样缓冲液稀释到相同体积。利用SDS-PAGE， 随后使用抗-HBcAg单克隆抗体YVS1841进行Western印迹来分析这些 样品。第1栏：可溶性部分；第1和2栏：不溶性部分，对照细胞； 第3栏：可溶性部分，表达HBcAg-JUN的细胞；第4栏：不溶性部分， 表达HBcAg-JUN的细胞。

使用包括用3ml 15％蔗糖溶液、随后又用4ml细菌裂解物覆盖 的4ml 65％蔗糖溶液的蔗糖分级梯度对澄明的细菌裂解物进行分级梯 度离心。样品在4℃用100,000xg离心3小时。离心之后，从顶部 收集了1ml的部分，并用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染色分析(图 6)。第1栏：离心前的总细菌裂解物；第1和2栏：梯度顶部的第1 部分和第2部分；第4到7栏：第5到8部分(15％蔗糖)。HBcAg-JUN 蛋白利用考马斯亮蓝染色检测。

HBcAg-JUN蛋白在15％和65％蔗糖之间的界面处富集，说明已经形 成了衣壳颗粒。大多数的细菌蛋白保留在梯度的无蔗糖的上层中，因 此HBcAg-JUN蛋白的分级梯度离心导致这些颗粒的富集和部分纯化。

                实施例22：

          hGH对HBcAg-JUN的共价偶联

为了证明蛋白对HBcAg-JUN颗粒的结合，我们选择在其羧基端融 合剂FOS螺旋的人生长激素(hGH-FOS)作为模型蛋白(hGH-FOS)将 HBcAg-JUN颗粒与部分纯化的hGH-FOS混合并在4℃下温育4小时让 蛋白结合。然后，该混合物对300倍体积的透析缓冲液(150mMNaCl， 10mMTris-HCl溶液，pH8.0)透析过夜以除去在HBcAg-JUN溶液和 hGH-FOS溶液中存在的DTT并从而让蛋白通过二硫键的建立而共价偶 联。作为对照，HBcAg-JUN和hGH-FOS溶液也对透析缓冲液透析。通 过还原条件下的SDS-PAGE分析来自所有三个透析的蛋白溶液的样 品。在抗-hGH免疫印迹(图))中检测hGH-FOS对HBcAg-JUN的偶 联。结合到HBcAg-JUN的hGH-FOS应该迁移的表观分子量约53KDa， 而未结合的hGH-FOS迁移的表观分子量为31KDa。在无(栏3)和有还 原剂(栏2)的存在下通过SDS-PAGE分析透析液并通过考马斯染色 检测。作为对照，也将未与衣壳颗粒混合的hGH-FOS负载到存在还原 剂的凝胶(栏1)上。

在存在HBcAg-JUN衣壳蛋白下观察到hGH-FOS迁移到约53KDa 的分子量，提示发生了hGH-FOS与HBcAg-JUN的有效结合。

                  实施例23

将一个含有一个赖氨酸残基的肽插入HBcAg(1-149)的c/el表位

HBcAg的c/el表位(第72到88位残基)位于乙型肝炎病毒衣壳 (HBcAg)表面的尖端区域。这个区域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80) 在遗传上被肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys构建体)替换。所引 进的赖氨酸残基在其侧链中含有一个可用于HBcAg颗粒与任何含有自 由半胱氨酸基团之间化学交联的反应性氨基。

HBcAg-Lys DNA序列通过PCR产生：通过PCR分别扩增编码HBcAg 片段的两个片段(第1到78位和第81到149位氨基酸残基)。这些PCR 所使用的引物也引进了一个编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序 列。使用引物EcoR I HBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)从pEco63质粒中扩 增了HBcAg(1到78)片段。使用引物Lys-HBcAg(s)和 HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63扩增了HBcAg(81到149)片段。引物 Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在这两个PCR产物的末端引进了互补 的DNA序列，(这就)允许这两个PCR产物在随后的一个装配PCR中的 融合。使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBCAg(1-149)Hind(as)扩增这些 已装配的片段。

为了这些PCR反应，使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng 模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反应，温度循环以如下方式进 行：94℃2分钟；及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟) 的循环。 引物序列：   EcoRIHBcAg(s)：   (5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3)(SEQ ID NO：79)；   Lys-HBcAg(as)：   (5’-CCTAGAGCCACCTITGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAG   GTAGC-3’)(SEQ ID NO：80)；   Lys-HBcAg(s)：   (5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT   GTC-3’)(SEQ ID NO：81)；   HBcAg(1-149)Hind(as)：   (5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ   ID NO：82).

为了通过PCR融合这两个PCR片段，使用引物EcoR I HBcAg(s)和 HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng两个纯化的PCR片段在50μl含有2 个单位Pwo聚合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行 反应。PCR循环的条件是：94℃2分钟；及30个94℃(1分钟)、50℃ (1分钟)、72℃(2分钟)的循环。装配PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳 分析，并纯化，在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII限制性内切 酶消化19小时。将已消化的DNA片段连接到已用EcoR I/HindIII消 化过的pKK载体上，从而产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。利用EcoR I /HindIII限制性分析及插入物的DNA序列测定分析这个PCR产物在此载 体中的插入。

                实施例24：

          HBcAg-Lys的表达及部分纯化

用pKK-HBcAg-Lys转化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml细菌 过夜培养物接种100ml含有100μg/ml培养基氨苄青霉素的LB培养 基。此培养物在37℃培养4小时，直至600nm的光密度达到约0.8。 通过加入最终浓度1mM的IPTG，诱导HBcAG-JUN的合成。诱导之后， 细菌进一步在37℃摇16小时。5000xg离心15分钟，收获细菌。将 沉淀物在-20℃冰冻。解冻此沉淀物，并用补充了200μg/ml溶菌酶 和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2PO4，pH 7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA，10mM DTT)重新 悬浮。细胞在室温下温育30分钟，并用弗氏压碎器(Fench pressure cell)破碎细胞。向裂解物中加入最终浓度为0.2％的Triton X-100， 并将裂解物在冰上温育30分钟，偶尔摇动。带有pKK-HBcAg-Lys表达 质粒或一种对照质粒的E.coli，被用于HBcAg-Lys表达的IPTG诱导。 在加入IPTG之前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养物及从携带 对照质粒的细菌培养物中取出一份样品。加入IPTG后16小时，再次 从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的培养物及携带对照质粒的培养物取样。 利用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染色来监测蛋白的表达。

然后，为了除去不溶性的细胞碎片，将裂解物在12,000xg离心 30分钟。使用一种抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841，购买自Accurate Chemical and Scientific Corp.，Westbury，NY，USA)进行Wesatern 印迹，来分析上清和沉淀物，表明有显著量的HBcAg-Lys是可溶性的。 简单地说，表达HBcAg-Lys的E.coli细胞及对照细胞的裂解物在 14,000xg离心30分钟。上清(＝可溶性部分)和沉淀物(不溶性部分) 被分离，并用SDS上样缓冲液稀释到相等体积。利用SDS-PAGE，随后 使用抗-HBcAg单克隆抗体YVS1841进行Western印迹来分析这些样 品。

使用一种由4ml 65％蔗糖溶液，覆盖有3ml 15％蔗糖溶液、随后 又覆盖有4ml细菌裂解物组成的蔗糖分级梯度，对澄明的细菌裂解物 进行分级梯度离心。样品在4℃100,000xg离心3小时。离心之后， 从顶部收集了各1ml的部分，并用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染 色分析。HBcAg-Lys蛋白利用考马斯亮蓝染色检测。

HBcAg-Lys蛋白在15％和65％蔗糖之间的界面处富集，说明已经形 成了衣壳颗粒。大多数的细菌蛋白保留在梯度无蔗糖的上层中，因此， HBcAg-Lys蛋白分级梯度离心导致这些颗粒的富集和部分纯化。

                      实施例25：

      使用异双功能交联剂SPDP将FLAG肽化学偶联到

                    HBcAg-Lys上

为了引起一个抗FLAG肽的免疫应答，将合成的、在其氨基端具有 一个半胱氨酸残基的FLAG肽(氨基酸序列为CGGDYKDDDDK)化学偶联到 已纯化的HBcAg-Lys颗粒上。在室温下将600μl HBcAg-Lys颗粒的 95％纯溶液与异双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸 酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)(SPDP)(0.5 mM)温育30分钟。反应完成之后，将此混合物对1升50mM磷酸缓冲液 (pH7.2)和150mM NaCl(溶液)透析过夜，从而去除游离的SPDP。在 存在10mM EDTA的条件下，将500μl已经衍生化的HBcAg-Lys衣壳 颗粒(2mg/ml)与0.1mM FLAG肽(含有一个氨基端半胱氨酸)混合， 从而避免金属催化巯基的氧化。通过由于一旦与此肽的自由半胱氨酸 反应，吡啶-2-硫酮从SPDP释放所引起的溶液的光密度在343nm处的 增加来监测此反应。衍生化的赖氨酸残基与此肽的反应在约30分钟后 完成。

将FLAG修饰的颗粒注射给小鼠。

                实施例26

          pMPSV-gp140cys的构建

使用引物寡聚核苷酸gp140CysEcoR I和SalIgp140通过PCR，从 pCytTSgp140FOS扩增gp140基因。为了这些PCR反应，使用每一种寡 聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚 合酶，0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这 两个反应，温度循环以如下方式进行：94℃2分钟；及30个94℃(0.5 分钟)、55℃(1分钟)、72℃(2分钟)的循环。

使用QiaExII试剂盒纯化PCR产物，用Sal I和EcoR I消化，并将 其连接到已用同样的酶消化过的载体pMPSVHE上。 寡聚核苷酸序列： Gp140CysEcoRI： 5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ ID NO：83)； SalIgp140 5’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO：84).

                实施例27

          pMPSVgpl40Cys的表达

利用限制性消化使pMPSVgp140Cys(20μg)线性化。反应用酚/氯 仿抽提终止，随后用异丙醇沉淀已线性化的DNA。利用琼脂糖凝胶电 泳评价了限制性内切酶消化。为了转染，将5.4μg的线性化 pMPSVgp140-Cys与0.6μg线性pSV2Neo在30μl H2O中混合，并加 入30μlCaCl2溶液。在加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)之后，振动此溶液5秒，然后在室 温温育25秒。立即将此溶液加入2ml含有2％FCS(2％FCS)的HP-1 培养基中。然后用含有DNA的培养基替换一种80％铺满的BHK21细胞 培养(6-孔板)的培养基。在CO2培养箱中37℃温育5小时后，去除含 有DNA的培养基，并用2ml内含15％甘油的2％FCS培养基替换。在30 秒温育期之后，去除含有甘油的培养基，用5ml含有10％FCS的HP-1 培养基漂洗来洗涤细胞。最后，加入2ml含有10％FCS的新鲜HP-1 培养基。

选择稳定转染的细胞，并在CO2培养箱中、在选择性培养基(补充 G418的HP-1培养基)上37℃培养。当混合的细胞群培养到铺满时，将 细胞分到两个平皿中，然后在37℃培养12小时。将一个细胞平皿转 移到30℃，诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一个细胞平皿在37℃保 存。

利用Western印迹分析测定了可溶性GP140-Cys的表达。培养基 (0.5ml)用甲醇/氯仿沉淀，并将此沉淀物重新悬浮于SDS-PAGE样品 缓冲液中。样品在95℃加热5分钟，然后上样到15％丙烯酰胺凝胶上。 SDS-PAGE之后，如Bass和Yang在Creighton，T.E.，编著的蛋白质 功能：一种实用方法，第2版(Protein Function：A Practical Approch， 2nd edn.，)，IRL Press，Oxford(1997)，29-55页所述，将蛋白转移 到Protan硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell，Germany)上。用含有 1％牛血清白蛋白(Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升：87.7g NaCl，66.1g Trizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma)，pH7.4) 室温封闭1小时，随后与抗-GP140或GP160抗体温育1小时。印迹斑 点用TBS-T(含有0.05％Tween20的TBS)洗涤3次10分钟，并与碱 性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人IgG偶联物温育1小时。用TBS-T洗涤2 次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后，使用碱性磷酸酶检测试剂和 50μl NBT(内含7.7％氮蓝四唑(Sigma)的70％二甲基甲酰胺)及37μl X-Phosphate溶液(内含5％5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺) 进行显色反应。

                      实施例28：

                  gp140Cys的纯化

将一种抗-gp120抗体共价偶联到一种NHS/EDC活化的右旋糖苷 上，并装到层析柱中。含有GP140Cys的上清被加载到层析柱上，在充 分洗涤之后，用0.1M HCl洗脱GP140Cys。在收集期间，用在收集管 中的1MTris pH7.2直接中和该洗脱液。

在纯化期间可能形成二硫键，因此，在25℃用内含10mM DTT的 10mM Tris pH7.5(溶液)处理所收集的样品2小时。

随后对10mM Mes；80mM NaCl pH6.0透析，从而除去DTT。最 后如实施例16所述，将GP140Cys和在E2中含有JUN残基的甲病毒颗 粒混合。

                  实施例29

              PLA2-Cys的构建

使用寡聚核苷酸EcoR I PLA和PLA-Cys-hind通过PCR，从 pAV3PLAfOS扩增PLA2基因。为了这些PCR反应，使用每一种寡聚核 苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚合酶， 0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反 应，温度循环以如下方式进行：94℃2分钟；及30个94℃(0.5分钟)、 55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)的循环。

使用QiaExII试剂盒纯化PCR产物，用EcoRI/HindIII消化，并将 其连接到已用同样的酶消化过的载体pAV3上。 寡聚核苷酸序列 Oligos EcoRIPLA： 5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO：85) PLACys-hind： 5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3’(SEQ ID NO：86).

                        实施例30

                PLA-cys的表达及纯化

为了在细胞周质生产Cys标记的蛋白，用载体pAY3∷PLA和 pPLA-Cys转化E.coli XL-1 Blue菌株。培养物在37℃，在存在氨 苄青霉素的丰富培养基中摇动温育。在光密度(550nm)，加入1mM IPTG，再温育5小时。通过离心收获细胞，重新悬浮在一种含有DNase、 RNase和溶菌酶的合适的缓冲液(例如，Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl) 中，并使细胞通过弗氏压碎器(Fench pressure cell)从而将细胞破碎。 离心(Sovall RC-5C，SS34转头，15000rpm，10分钟，4℃)之后，在 4℃将沉淀物重新悬浮于25ml包函体洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，23％ 蔗糖，0.5％Triton X-100，1mM EDTA，pH8.0)中，并如上所述再次 离心。重复进行此过程直到离心后的上清基本澄明。在室温下将包函 体溶解于20ml溶解缓冲液(5.5M盐酸胍，25mM Tris-HCl，pH7.5) 中，并离心，随后使上清通过无菌滤膜(0.45μm)从而去除不溶物质。 蛋白溶液在存在10mMEDTA和100mM DTT的条件下4℃保持至少10小 时，对10倍体积5.5M盐酸胍，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 6(溶液)透析3次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷 胱甘肽；胱氨酸/半胱氨酸)的条件下，将此溶液对5升2M尿素，4mM EDTA，0.1M NH4Cl，20mM硼酸钠(pH8.3)(溶液)透析2次。然后对 重折叠的蛋白进行离子交换层析。将此蛋白贮存于一种适当的、pH大 于7、并存在2-10mM DTT的缓冲液中，从而使半胱氨酸残基处于还 原型。在将此蛋白与甲病毒颗粒偶联之前，将此蛋白溶液通过 Sephadex G-25凝胶过滤柱，从而除去DTT。

                  发明背景