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一种赤红球菌 发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用

阅读：517发布：2021-05-14

专利汇可以提供一种赤红球菌发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种赤红球菌(CGMCC NO.17012 Rhodococcus ruber.GD0704A)的特有发酵工艺及其不同剂型佐剂制备工艺及作为佐剂在动物疫苗中的用途，该红球菌株分离自养殖场，经单菌落克隆纯化，鉴定获得，本发明提供了该菌株灭活制品作为动物疫苗佐剂应用时特有的发酵工艺，并提供了含该菌株及其制品的不同剂型佐剂制备工艺。经动物实验证实，采用上述工艺制备的佐剂制品用于单价或多联多价动物疫苗时，特别是新城疫灭活疫苗，禽流感灭活疫苗，猪瘟活疫苗具有明确的非特异免疫增强作用，具体表现为动物疫苗诱导的抗体峰值水平显著提高，产生保护性抗体水平的时间提前，抗体维持期延长，增强动物疫苗的免疫效果。，下面是一种赤红球菌发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种赤红球菌，其特征在于，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCC NO.17012的赤红球菌(Rhodococcus ruber.GD0704A)。
2.根据权利要求1所述的一种赤红球菌的发酵方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于28℃-35℃透气或好氧培养4-6天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱，收获菌体，作为洗脱菌种备用；
2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积1％-5％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃透气或好氧培养18h-48h，作为一级种子液备用；
3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为二级种子液备用；
4)终点发酵：取步骤3)制备的二级种子液，按终点液体发酵培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤4)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨
0.1％-1％，尿素0.05％-0.1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-
1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水；或为获得更大发酵规模，采用具体步骤如下：
1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于28℃-35℃透气或好氧培养4-6天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱、收获菌体，作为洗脱菌种备用；
2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积1％-5％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃透气或好氧培养18h-48h，作为一级种子液备用；
3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为二级种子液备用；
4)三级种子液制备：取步骤3)制备的二级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为三级种子液备用；
5)终点发酵：取步骤4)制备的三级种子液，按终点液体发酵培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤5)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨
0.1％-1％，尿素0.05％-0.1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-
1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水。
3.权利要求2所述的赤红球菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中固体琼脂培养基所含营养物质的重量百分比是：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，酵母浸出粉
0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，葡萄糖或蔗糖或乳糖或果糖或甘露醇或甘油1％-5％，琼脂粉1％-2％；步骤2)-3)或所述步骤2)-
4)的液体培养基组分及重量百分比均为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，葡萄糖或蔗糖或乳糖或果糖或甘露醇或甘油1％-5％，余量为水。
4.权利要求1所述赤红球菌作为佐剂原料在制备动物疫苗中的用途，其特征在于，佐剂原料的制备方法为：赤红球菌按照权利要求2-3任一项所述发酵工艺发酵后的产物经灭活处理后，通过连续流离心机离心分离菌体沉淀物，经过纯化水洗涤，再次离心分离，收获菌体沉淀物，菌体沉淀物直接作为佐剂原料；或菌体沉淀物进一步制备成灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或裂解物或灭活赤红球菌衍生物再作为佐剂原料。
5.权利要求4所述赤红球菌作为佐剂原料在制备动物疫苗中的用途，其特征在于，佐剂原料进一步制备成不同剂型的佐剂成品，不同剂型佐剂成品的具体制备方法为：
1)水基型佐剂成品：以水溶液为基础的灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的混悬佐剂液，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，使得最终成品佐剂液中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL，该佐剂液经均质处理后，高压蒸汽灭菌，无菌灌装，检验合格后低温保存；对于含温敏性活性物水基型佐剂成品，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，经均质处理，高压蒸汽灭菌后备用；另取适量温敏性活性物，加入适量水溶液中，经微滤除菌处理后备用；将上述制备的液体按比例混合后进一步均质，无菌灌装，分装、低温保存，最终成品佐剂液中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL；
2)油基型佐剂成品：含有油剂成分的灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物乳液，为油包水(W/O)型佐剂液或水包油(O/W)型佐剂液或双相(W/O/W)型佐剂液或油混悬佐剂液，其中油包水(W/O)型佐剂液和水包油(O/W)型佐剂液具体制备方法为：
取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，补加适量水溶性表面活性剂及稳定剂，制备成佐剂水相并高压蒸汽灭菌后备用；另取适量油基，加入适量油溶性表面活性剂及稳定剂，制备成佐剂油相并高压蒸汽灭菌后备用；将水相和油相按比例混合，乳化机高速剪切乳化5min-
30min，制备成稳定的乳液，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；其中油包水型佐剂中水相含量为16％-40％，水包油型佐剂中水相含量为80％-95％；双相(W/O/W)型佐剂液具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量市售双相油佐剂中，经均质处理，高压蒸汽灭菌后，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；油混悬佐剂液具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量油相中，补加适量表面活性剂及稳定剂，经均质处理，高压蒸汽灭菌后，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；上述的佐剂乳液成品中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL；
3)缓释微粒型佐剂成品：以阳离子型或阴离子型或两性型或非离子型粒子或上述物质的复配型粒子为基础液，制备成含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的混悬液，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量含缓释胶团的水溶液中，最终的佐剂液成品中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL，该佐剂液经均质处理后，高压蒸汽灭菌，无菌灌装，分装，无菌检验合格后封箱低温保存。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，进一步的，水基型佐剂成品的制备方法优选为，取500g佐剂原料，加入10000mL含100mL Tween80，100mL Span80，10g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存；油包水型佐剂成品的制备方法优选为，选
500g佐剂原料，加入10000mL含5％Tween80的水溶液，溶解充分后制备成佐剂水相并高压蒸汽灭菌后备用，另取含6％Span80的矿物油20000mL，溶解充分后制备成佐剂油相并高压蒸汽灭菌后备用，将佐剂油相和佐剂水相充分混匀后，使用乳化机高速剪切乳化5min-30min，制备成稳定的油包水型乳液，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存；水包油型佐剂成品的制备方法优选为，选矿物油500mL，加入9500mL含500g佐剂原料，100mL Tween80，100mL Span80，10g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，使用乳化机对该混合液高速剪切乳化5min-30min，制备成稳定的水包油型乳液，高压灭菌后进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存；双相型佐剂成品的制备方法优选为，选
500g佐剂原料，100g卵磷脂，10000mL市售的兽用的水包油包水双相佐剂中，经纳米胶体磨均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存；油混悬型佐剂成品的制备方法优选为，选1000g佐剂原料，500g卵磷脂，
10000mL矿物油，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存；缓释微粒型佐剂成品的制备方法优选为，选500g佐剂原料，加入10000mL含50g双十八烷基二甲基季铵盐，100g氢化聚异丁烯，20g胆固醇的水溶液，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，疫苗终产品中佐剂活性物干物质含量为1μg/mL-100mg/mL；所述疫苗为减毒活疫苗或灭活疫苗或亚单位疫苗或活载体疫苗或基因重组疫苗。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述的动物用疫苗尤其为禽用疫苗或猪用疫苗；所述的禽用灭活疫苗为禽流感油乳剂灭活疫苗或新城疫油乳剂灭活疫苗或鸡传染性支气管炎油乳剂灭活疫苗或鸡传染性法氏囊油乳剂灭活疫苗或鸡减蛋综合征油乳剂灭活疫苗或鸡腺病毒油乳剂灭活疫苗或鸡病毒性关节炎油乳剂灭活疫苗或小鹅瘟灭活疫苗或鸭瘟灭活疫苗；其中所述的禽用基因工程疫苗为禽流感亚单位疫苗或鸡传染性法氏囊亚单位疫苗或鸡腺病毒亚单位疫苗或鸡减蛋综合征亚单位疫苗或鸡传染性贫血亚单位疫苗或鸡网状内皮增生病亚单位疫苗或禽白血病亚单位疫苗或上述抗原制备的多联或多价疫苗或疫苗组合物；猪用疫苗为猪用灭活疫苗或猪用基因工程疫苗或猪用活疫苗，其中所述的猪用灭活疫苗或猪用基因工程疫苗或猪用活疫苗为非洲猪瘟活疫苗或其灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪流感灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪瘟活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪圆环病毒灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪伪狂犬活疫苗或其灭活疫苗，或为猪细小病毒灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪口蹄疫灭活疫苗或其亚单位疫苗或其合成肽疫苗，或为猪传染性胃肠炎灭活疫苗或猪流行性腹泻灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗或其灭活疫苗或其亚单位疫苗，或上述抗原制备的多联或多价疫苗或疫苗组合物。
9.根据权利要求8所述的用途，所述的禽流感油乳剂灭活疫苗为H5亚型禽流感灭活疫苗或H7亚型禽流感灭活疫苗或H9亚型禽流感灭活疫苗或以禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗为基础的多联多价灭活疫苗组合物；所述的猪用疫苗，优选猪流感灭活疫苗或猪瘟活疫苗或猪瘟亚单位疫苗，其中所述的猪流感灭活疫苗为H1亚型猪流感灭活疫苗或H3亚型猪流感灭活疫苗或其疫苗组合物。
10.一种专用于发酵培养权利要求1所述赤红球菌的液体培养基，其特征在于，该液体发酵培养基的组分及重量比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，尿素0.05％-
0.1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐
0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水。

说明书全文

一种赤红球菌发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物学与免疫学技术领域，具体涉及一种赤红球菌(保藏号为：CGMCC NO.17012 Rhodococcus ruber.GD0704A)的具体发酵方法以及其作为佐剂在动物疫苗制备中的应用。

背景技术

[0002] 近年来随着家畜、家禽养殖量的日益增多，动物疫病随之日益严重。特别是随着高致病性禽流感的爆发，动物用灭活疫苗特别是油乳剂灭活疫苗已经成为最重要的疫苗种类。目前动物用灭活疫苗虽然方法较为成熟，但是其极易受到灭活抗原质量品质的影响，特别是高质量油乳剂灭活疫苗目前只能通过高倍浓缩抗原来实现，以禽流感油乳剂灭活疫苗为例，高品质的禽流感油乳剂灭活疫苗，特别是多价的油乳剂灭活疫苗，存在生产资料消耗量大，工作人员容易过劳，能耗消耗严重，批次间差异大等问题，导致生产成本高昂并且严重制约产能，不能有效满足市场需求，并且不符合现代生物制品产业低碳环保的发展需要，更重要的是疫苗质量不稳定可能导致免疫失败，进而使疫病爆发，蔓延，因而需要配合高效的佐剂才能发挥疫苗良好的免疫效果。

[0003] 佐剂主要指非特异性免疫刺激剂，其与疫苗抗原配合使用后能增强动物机体对疫苗制品应答反应。目前常用的佐剂主要有：铝佐剂，矿物油佐剂，灭活的结核分枝杆菌(卡介苗)，聚肌胞等。目前佐剂普遍存在以下问题：(1)铝佐剂即氢氧化铝胶佐剂，是目前商品化的动物疫苗佐剂，其主要通过铝胶-抗原复合物形式在注射部位形成抗原池进而发挥缓释效应，该佐剂主要用于细菌性疫苗；(2)矿物油佐剂是油乳剂灭活疫苗主要组分，矿物油目前常用美孚或埃索等品牌矿物油，抗原与矿物油采用乳化方法制成油乳剂灭活疫苗，其免疫抗体维持久，但是抗体产生速度较慢，容易形成免疫空窗期；(3)灭活的结核分枝杆菌 (BCG)佐剂，采用减毒的卡介苗(BCG)经热灭活处理后制备的佐剂，是弗氏完全佐剂的主要组分，其常用于动物高免阳性血清的制备，但其易引发动物不良反应或局部肉芽肿病变等，因此国内外均禁止其用于商品疫苗；(4)聚肌胞即双链聚核苷酸(Poly I：C)为抗肿瘤药物，鉴于其在动物体内半衰期短，并且相对短效，其作为动物用灭活疫苗免疫佐剂局限性较大。

[0004] 目前常用动物疫苗主要有：(1)弱毒疫苗，是对微生物的自然强毒通过物理、化学方法处理和生物的连续继代，使其对原宿主动物丧失致病力或只引起轻微的亚临床反应，但仍保存良好的免疫原性的毒株或从自然界筛选的自然弱毒株制备的疫苗。弱毒活疫苗的优点是免疫效果好，免疫力坚强，免疫期长，其缺点是存在散毒和造成新疫源的问题；(2)灭活疫苗，又称死苗，是利用物理或化学的方法处理微生物，使其丧失感染性或毒性但保留良好免疫原性而制成的疫苗。灭活疫苗的优点是安全，不返祖，不返强，便于储存运输，对母源抗体的干扰作用不敏感，易制成联苗和多价苗，其缺点是不易产生局部粘膜免疫，引起细胞介导免疫能力较弱，用量大成本高，免疫途径必须注射，需免疫佐剂来增强免疫应答，刺激机体产生保护性抗体较慢，容易发生免疫空窗期；(3)代谢产物疫苗，是用细菌的代谢产物如毒素、酶等制成的疫苗，如破伤风毒素，白喉毒素或肉毒素等经福尔马林处理制备而成，类毒素是广泛应用的代谢产物疫苗； (4)亚单位疫苗，是用微生物经物理化学方法处理，去除其无效物质，提取其有效抗原部分，如细菌荚膜、鞭毛，病毒衣壳蛋白等制备而成，缺点是诱导免疫反应较差；(5)活载体疫苗，应用动物病毒弱毒或无毒株如痘苗病毒，疮疹病毒，腺病毒等作为载体，插入外源免疫抗原基因构建重组活病毒载体，转染病毒细胞而制备的疫苗；(6)基因缺失苗，应用基因操作，将病原细胞或病毒中与致病性有关物质的基因序列除去或失活，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持免疫原性，用这种无毒株或弱毒株作成的疫苗为基因缺失苗。

[0005] 利用微生物作为疫苗佐剂也是生物制药领域的关注热点之一。微生物在自身增殖或发酵培养过程中可产生大量不同性能的代谢产物，而代谢产物中生物活性物质能够作为疫苗佐剂发挥重要作用。现有技术中，有采用细菌或其产物作为佐剂的相关报导，在全菌用作佐剂方面：CN201410280086.8公开了灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的用途，其公开了灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中新的用途，灭活肺炎克雷伯菌菌液作为免疫成分，具有免疫增强剂作用，既可以诱导机体产生针对肺炎克雷伯菌的抗体使机体免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫调节活性提高机体对疫苗应答水平，产生更好的免疫保护；CN201710613785.3公开一种类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂在禽用油乳剂灭活疫苗中的应用，其公开了类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂在禽用油乳剂灭活疫苗中的应用，所述的类白喉棒状杆菌是指在形态及生物学特性方面与白喉棒杆菌类似的棒状杆菌，即除高致病性白喉棒状杆菌外的低致病或非致病性棒状杆菌，该发明提供的类白喉棒状杆菌活性佐剂具有高免疫刺激活性，可非特异性刺激T、B淋巴细胞免疫功能，促进多种细胞因子分泌，其添加到禽用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生； CN201610811285.6公开了一种灭活乳酸菌疫苗佐剂，其主要成分是灭活乳酸菌，可以通过将活的乳酸菌经过常规方法灭活制备，灭活乳酸菌可以作为人或动物各种疫苗的佐剂，用于增强疫苗免疫效果，具有广阔的应用前景；CN200580018170.1公开了作为佐剂的脑膜炎奈瑟氏菌IgtB LOS，其所述的奈瑟氏菌脂寡糖包括三糖外核，该三糖外核显示与树突细胞上的DC-SIGN受体的结合能力提高，其结果证实该发明的奈瑟氏菌脂寡糖提高了免疫活性，与毒性降低的类脂A部分结合的奈瑟氏菌脂寡糖的三糖外核可用作疫苗制剂中的佐剂；CN03824914.6公开了作为免疫调节物的全细菌细胞，发明内容涉及了红球菌属，戈登氏菌属，诺卡氏菌属，迪茨氏菌属，冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞用作免疫调节剂组合物，调节细胞免疫应答，其主要用途为通过调节细胞免疫途径，用于人类多种疫病及马乳头瘤等疫病的治疗或预防，用于疫苗佐剂用途时特指用于DNA疫苗；CN200610156653.4公开了红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备治疗皮肤损伤和疮疡的药物中的用途；
CN200510105533.7红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备抗人乳头瘤病毒药物的用途，以上2个发明均涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架的新用途，多年的临床应用表明红色诺卡氏菌细胞壁骨架具有很好的免疫效果和临床安全性，该方法制备的制品具备高度的生物安全性。上述微生物佐剂中，全菌细胞佐剂免疫刺激作用明显，但是生物安全性欠佳，临床效果有限，可能具有较强的副作用，如接种后可能引起持续高热，肝功能损伤，肉芽肿形成及对分支杆菌的变态反应等，而细胞壁骨架佐剂虽然生物安全性高，但是免疫有效性方面略显不足，且其临床上需多次给药，该方案不适用于动物疫苗佐剂应用。鉴于佐剂的免疫增强效力通常与生物安全性在一定程度上存在负相关，即佐剂免疫增强效果越强，注射动物后越可能或容易出现生物安全性问题，具体表现为蛋鸡减蛋，免疫的鸡、猪出栏推迟，动物疫苗注射局部肉芽肿浸润或皮下水肿等等问题。不同微生物在作为佐剂应用中差别较大，体现在作为佐剂的菌体的活性分子或产物结构明显差异、作用机理不完全相同、药理学和毒性特质差异等各个方面。

[0006] 国外关于红球菌的研究开展主要集中在二十世纪90年代，报道最多的是有关海藻糖二酯类体外抗肿瘤活性的研究，而目前国内研究者关注的焦点是某些类别的红球菌属的细菌对许多化合物有转化及降解作用，利用这一特性，可以用来生产生物表面活性剂及生物絮凝剂或用于生物去污。

[0007] 考虑到赤红球菌细胞壁富含肽聚糖、霉菌酸、海藻糖二酯类等物质，具有极强的免疫刺激性。大量的实验证明，赤红球菌细胞壁肽聚糖、霉菌酸、海藻糖二酯类等物质能加速机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬、消化及其趋化作用，并能促进吞噬细胞和肥大细胞等产生肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、干扰素等细胞因子，从而使T淋巴细胞增殖，激活机体产生免疫细胞应答，因而具有优异的免疫增强作用。

[0008] 赤红球菌免疫活性基础成分为疏水性的糖酯复合物，为霉菌酸结构，是公认的具有免疫增强效应的高分子物。相对的，分枝杆菌属的霉菌酸结构为80个碳原子，采用灭活的结核分枝杆菌(卡介苗)制备的完全弗氏佐剂为业界公认的使用最广泛，免疫刺激效果确实的佐剂，但是由于结核分枝杆菌霉菌酸分子量过大，其往往引起动物发生过度的免疫反应，动物易出现不良反应并且局部肉芽肿增生严重，鉴于其生物安全性存在隐患，因此国内外禁止将结核分枝杆菌用于商用动物疫苗；棒状杆菌属具有低分子量的霉菌酸结构，其也具备一定的免疫佐剂作用，如临床上采用胸腔内注射短小棒状杆菌治疗恶性胸腔积液，可明显控制病情，延长病人的存活时间，但是短小棒状杆菌生长周期长，厌氧发酵方法等限制了其作为动物疫苗专用佐剂方面的应用；而本发明所涉的赤红球菌的霉菌酸结构分子量适中，因而兼具高度安全性和有效性。

[0009] 但目前对于红球菌菌属或菌株作为动物疫苗佐剂的用途很少，作为佐剂的免疫活性效果不突出，疫苗种类针对性不强，大多数红球菌生长对营养和培养环境都有要求严格，氮源或碳源的不同，其产生的代谢产物及菌体细胞壁的物质组成和组织结构具有显著性差异，这种差异也影响到后续产品用途及性能。因此根据红球菌相关制品的功用，优化培养基及培养方法就尤显重要。

[0010] 综上所述，目前市场上缺乏高效、安全、经济的动物疫苗专用佐剂，开发新型疫苗佐剂是有效提高疫苗质量，解决畜禽养殖业病害问题的关键技术。

发明内容

[0011] 本发明目的之一是提供一种新的可用作动物疫苗佐剂的菌株，即赤红球菌，该菌株已于2018年12月 19日在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.17012，分类命名为赤红球菌Rhodococcus ruber，该菌株分离自养殖场废水，筛选细胞壁富含霉菌酸、海藻糖二酯类物质的菌种并分离纯化而得；本发明的目的之二是提供一种提高所述菌免疫活性的培养方法和培养条件，并将所述菌用于动物疫苗佐剂的用途；本发明的目的之三是提供一种专用于所述赤红球菌的专用培养基，该培养基有效提高免疫活性；本发明的目的之四是提供一种高度安全性，免疫效果好，专门针对禽和猪的含有优质佐剂的疫苗，将其用于免疫禽和猪。

[0012] 本发明解决了目前的疫苗佐剂存在的免疫增强效力欠佳，生物安全性低，针对性不强的技术问题，包括使用全细胞完整菌体佐剂出现的明显不良反应(表现为注射疫苗局部水肿，硬结，甚至溃烂)，常规的裂解物水溶液佐剂虽安全性好但是没有明显的提升疫苗抗体，以及现有技术中面临的诸多具体问题。

[0013] 本发明的技术方案如下：

[0014] 一种赤红球菌，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCC NO.17012的赤红球菌GD0704A(Rhodococcus ruber.GD0704A)。

[0015] 所述的一种赤红球菌的发酵方法，具体按照以下步骤进行：

[0016] 1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于28℃-35℃透气或好氧培养4-6天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱，收获菌体，作为洗脱菌种备用；

[0017] 2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积1％-5％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃透气或好氧培养18h-48h，作为一级种子液备用：

[0018] 3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速 100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为二级种子液备用；

[0019] 4)终点发酵：取步骤3)制备的二级种子液，按终点液体发酵培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤4)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，尿素0.05％-0.1％，酵母浸出粉 0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水；

[0020] 或为获得更大发酵规模，采用具体步骤如下：

[0021] 1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于28℃-35℃透气或好氧培养4-6天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱、收获菌体，作为洗脱菌种备用；

[0022] 2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积1％-5％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃透气或好氧培养18h-48h，作为一级种子液备用；

[0023] 3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为二级种子液备用；

[0024] 4)三级种子液制备：取步骤3)制备的二级种子液，按液体培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速 100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为三级种子液备用；

[0025] 5)终点发酵：取步骤4)制备的三级种子液，按终点液体发酵培养基体积5％-15％接种于发酵罐，转速100rpm-300rpm，28℃-35℃通气发酵18h-48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤5)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，尿素0.05％-0.1％，酵母浸出粉 0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水。

[0026] 所述步骤1)中固体琼脂培养基所含营养物质的重量百分比是：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨 0.1％-1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-
1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，葡萄糖或蔗糖或乳糖或果糖或甘露醇或甘油1％-5％，琼脂粉1％-2％；步骤2)-3)或所述步骤2)-4)的液体培养基组分及重量百分比均为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠
0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，葡萄糖或蔗糖或乳糖或果糖或甘露醇或甘油
1％-5％，余量为水。

[0027] 所述赤红球菌作为佐剂原料在制备动物疫苗中的用途，所述佐剂原料的制备方法为：赤红球菌按照所述特定发酵方法发酵后的产物经灭活处理后，通过连续流离心机离心分离菌体沉淀物，经过纯化水洗涤，再次离心分离，收获菌体沉淀物，菌体沉淀物直接作为佐剂原料或菌体沉淀物进一步成菌体干粉后作为佐剂原料；或菌体沉淀物进一步制备成灭活的赤红球菌菌体颗粒，灭活赤红球菌系列裂解物或灭活赤红球菌系列衍生物再作为佐剂原料。

[0028] 进一步的，由佐剂原料进一步制备成不同剂型的佐剂成品，不同剂型佐剂成品的具体制备方法为：

[0029] 1)水基型佐剂成品：以水溶液为基础的灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的混悬佐剂液，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，使得最终成品佐剂液中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL，该佐剂液经均质处理后，高压蒸汽灭菌，无菌灌装，检验合格后低温保存；对于含温敏性活性物水基型佐剂成品，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，经均质处理，高压蒸汽灭菌后备用；另取适量温敏性活性物，加入适量水溶液中，经微滤除菌处理后备用；将上述制备的液体按比例混合后进一步均质，无菌灌装，分装、低温保存，最终成品佐剂液中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL；

[0030] 2)油基型佐剂成品：含有油剂成分的灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物乳液，为油包水(W/O)型佐剂液或水包油(O/W)型佐剂液或双相(W/O/W)型佐剂液或油混悬佐剂液，其中油包水 (W/O)型佐剂液和水包油(O/W)型佐剂液具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量水溶液中，补加适量水溶性表面活性剂及稳定剂，制备成佐剂水相并高压蒸汽灭菌后备用；另取适量油基，加入适量油溶性表面活性剂及稳定剂，制备成佐剂油相并高压蒸汽灭菌后备用；将水相和油相按比例混合，乳化机高速剪切乳化5min-30min，制备成稳定的乳液，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；其中油包水型佐剂中水相含量为16％-40％，水包油型佐剂中水相含量为80％-95％；双相(W/O/W)型佐剂液具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量市售双相油佐剂中，经均质处理，高压蒸汽灭菌后，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；油混悬佐剂液具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量油相中，补加适量表面活性剂及稳定剂，经均质处理，高压蒸汽灭菌后，无菌灌装，分装，检验合格后封箱低温保存；上述的佐剂乳液成品中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL；

[0031] 3)缓释微粒型佐剂成品：以阳离子型或阴离子型或两性型或非离子型粒子或上述物质的复配型粒子为基础液，制备成含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的混悬液，具体制备方法为：取适量佐剂原料，加入适量含缓释胶团的水溶液中，最终的佐剂液成品中含灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或其裂解物或其衍生物的干物质量为1mg/mL-200mg/mL，该佐剂液经均质处理后，高压蒸汽灭菌，无菌灌装，分装，无菌检验合格后封箱低温保存。

[0032] 进一步疫苗终产品中包含所述佐剂活性物干物质含量优选为1μg/mL～100mg/mL。

[0033] 本发明所述疫苗为减毒活疫苗或灭活疫苗或亚单位疫苗或活载体疫苗或基因重组疫苗。

[0034] 本发明所述的动物用疫苗尤其为禽用疫苗或猪用疫苗；所述的禽用灭活疫苗为禽流感油乳剂灭活疫苗或新城疫油乳剂灭活疫苗或鸡传染性支气管炎油乳剂灭活疫苗或鸡传染性法氏囊油乳剂灭活疫苗或鸡减蛋综合征油乳剂灭活疫苗或鸡腺病毒油乳剂灭活疫苗或鸡病毒性关节炎油乳剂灭活疫苗或小鹅瘟灭活疫苗或鸭瘟灭活疫苗；其中所述的禽用基因工程疫苗为禽流感亚单位疫苗或鸡传染性法氏囊亚单位疫苗或鸡腺病毒亚单位疫苗或鸡减蛋综合征亚单位疫苗或鸡传染性贫血亚单位疫苗或鸡网状内皮增生病亚单位疫苗或禽白血病亚单位疫苗或上述抗原制备的多联或多价疫苗或疫苗组合物；猪用疫苗为猪用灭活疫苗或猪用基因工程疫苗或猪用活疫苗，其中所述的猪用灭活疫苗或猪用基因工程疫苗或猪用活疫苗为非洲猪瘟活疫苗或其灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪流感灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪瘟活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪圆环病毒灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪伪狂犬活疫苗或其灭活疫苗，或为猪细小病毒灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪口蹄疫灭活疫苗或其亚单位疫苗或其合成肽疫苗，或为猪传染性胃肠炎灭活疫苗或猪流行性腹泻灭活疫苗或其亚单位疫苗，或为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗或其灭活疫苗或其亚单位疫苗，或上述抗原制备的多联或多价疫苗或疫苗组合物。

[0035] 进一步其中所述的禽流感油乳剂灭活疫苗为H5亚型禽流感灭活疫苗或H7亚型禽流感灭活疫苗或H9 亚型禽流感灭活疫苗或以禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗为基础的多联多价灭活疫苗组合物；所述的猪用疫苗，优选猪流感灭活疫苗或猪瘟活疫苗或猪瘟亚单位疫苗，其中所述的猪流感灭活疫苗为H1亚型猪流感灭活疫苗或H3亚型猪流感灭活疫苗或其疫苗组合物。

[0036] 本发明专用于发酵培养赤红球菌(CGMCC NO.17012)的液体培养基，该液体发酵培养基的组分及重量比为：胰蛋白胨0.1％-2％，大豆蛋白胨0.1％-1％，尿素0.05％-0.1％，酵母浸出粉0.1％-1％，NaCl 0.1％-1％，谷氨酸钠0.1％-1％，柠檬酸-柠檬酸盐0.1％-0.5％，甘露醇1％-5％，余量为水。

[0037] 本发明所述的灭活赤红球菌系列裂解物，其裂解方法选自下列方案的任一种或几种方案配合使用：1) 物理破碎物：超声波处理物，高压均质机处理物，珠磨机处理物；2)化学降解物：酸处理物，碱处理物，有机溶剂处理物，表面活性剂处理；3)生物酶降解物：溶菌酶处理物，溶壁酶处理物。

[0038] 本发明所述的灭活方法选自高温灭活，高温高压灭活，紫外线灭活，化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种。所述的化学试剂灭活，化学剂选自醛类灭活剂，优选甲醛。

[0039] 本发明的水基型佐剂制备中，所述的水溶液为纯水或生理盐水或含柠檬酸-柠檬酸盐的水溶液或含磷酸盐的水溶液或含卡波姆的水溶液或含壳聚糖的水溶液或含其它免疫刺激效应物成分的水溶液或上述制剂的复配水溶液。水基型佐剂中所述的含其它免疫刺激效应物成分的水溶液，为核酸型效应物或肽类效应物或多糖类效应物或蛋白类效应物或抗氧化剂或化合物类效应物或其它生物提取物。进一步的所述的核酸型效应物为Poly I：C或CpG-ODN或重组质粒；所述的肽类效应物为二肽或短肽，该二肽或短肽来源可为天然的生物提取物或人工合成品或基因工程表达物；所述的多糖类效应物可为植物提取物或细菌提取物或真菌提取物，其中所述的植物提取物可为黄芪多糖或牛膝多糖或商陆多糖或植物血凝素或甘草多糖或枸杞多糖或淫羊藿多糖，其中所述的细菌提取物为细菌脂多糖，其中所述的真菌提取物可为酵母多糖或香菇多糖或灵芝多糖或茯苓多糖；所述的蛋白类效应物可为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白或卵清蛋白或上述蛋白的偶联载体，也可为刀豆素或细胞因子，其中所述的细胞因子为基因表达的IL-2或IL-6或IL-8或IL-10或 IL-12或IL-18或集落刺激因子或胸腺肽；所述的抗氧化剂为维生素A油或其衍生物，或为维生素E油或其衍生物，或为虾青素油或其衍生物，或为油酸或BHQ或TBHQ等；所述的化合物类效应物可为含咪唑基团化合物或合成去污剂，其中所述的含咪唑基团化合物可为左旋咪唑或甲硝唑或西咪替丁或法莫替丁，其中所述的合成去污剂可为Triton X-100或SDS或Tween 20或Tween80；所述的其他生物提取物，可为皂甙类化合物，其中所述的皂甙类化合物为人参皂甙或皂树皂甙或绞股蓝皂甙或大豆皂甙或无患子皂甙。

[0040] 水基型佐剂成品的制备方法优选，取500g佐剂原料，加入10000mL含100mL Tween80，100mL Span80，10g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。对于所述的含温敏性活性物的水基型佐剂成品，其制备方法优选，取500g佐剂原料，加入
5000mL含100mL Tween80，100mL Span80，10g柠檬酸 -柠檬酸钠的水溶液中，配制成含活性物10％的混悬液，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌备用；取含温敏性活性物的水溶液，优选含终浓度10％的poly I：C或1％胸腺肽的水溶液，过滤除菌处理备用；将上述制备的两种水溶液1∶1混合即为含温敏性活性物的水基型佐剂，进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0041] 本发明的油基型佐剂制备中，其油脂可为烃类矿物油或天然油脂或人工合成油脂或嵌段聚醚化合物，其中所述的烃类矿物油可为Marcol 52或Marcol 82或Primol 352；其中所述的天然油脂可为大豆油或橄榄油或棕榈油或维生素E油或维生素A油或羊毛脂；其中所述的人工合成油脂可为氢化大豆油或氢化蓖麻油或氢化羊毛脂或氢化棕榈油或氢化聚异丁烯或氢化聚葵烯或肉豆蔻异丙酯或棕榈酸异辛酯；其中所述的嵌段聚醚化合物可为Pluronic L31或Pluronic L61或Pluronic L81或Pluronic L101或Pluronic L121。

[0042] 油包水型佐剂成品的制备方法优选为，取500g佐剂原料，加入10000mL含5％Tween80的水溶液，溶解充分后制备成佐剂水相并高压蒸汽灭菌后备用，另取含6％Span80的矿物油20000mL，溶解充分后制备成佐剂油相并高压蒸汽灭菌后备用；将佐剂油相和佐剂水相充分混匀后，使用乳化机高速剪切乳化 5min-30min，制备成稳定的油包水型乳液，进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0043] 水包油型佐剂成品的制备方法优选为，取矿物油500mL，加入9500mL含500g佐剂原料，100mL Tween80，100mL Span80，10g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，使用乳化机对该混合液高速剪切乳化 5min-30min，制备成稳定的水包油型乳液，高压灭菌后进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0044] 双相型佐剂成品的制备方法优选为，取500g佐剂原料，100g卵磷脂，10000mL市售的兽用的水包油包水双相佐剂中，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0045] 油混悬型佐剂成品的制备方法优选，取1000g佐剂原料，500g卵磷脂，10000mL矿物油，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装，分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0046] 本发明所述的缓释微粒型佐剂，其可为矿物盐佐剂或壳聚糖佐剂或海藻酸盐佐剂或蜂胶型佐剂或食用增稠剂型佐剂或聚丙烯酸-聚丙烯酸酰胺衍生物或葡聚糖衍生物或表面活性剂或上述物质的复配型粒子，其中所述的矿物盐可为铝胶型或锌胶型或铁胶型；其中所述的食用增稠剂型佐剂可为明胶或卡拉胶或结冷胶或琼脂胶或普鲁兰多糖；其中所述的聚丙烯酸-聚丙烯酸酰胺衍生物可为聚丙烯酸盐或聚N-异丙基丙烯酰胺及其衍生物；其中所述的葡聚糖衍生物可为低分子量葡聚糖或中分子量葡聚糖或高分子量葡聚糖；其中所述的表面活性剂可为胺盐型阳离子表面活性剂或季铵盐型阳离子表面活性剂或磺酸型阴离子表面活性剂或硫酸型阴离子表面活性剂或脂肪醇醚硫酸钠阴离子表面活性剂或脂肪醇醚羧酸钠阴离子表面活性剂或脂肪醇醚磷酸钠阴离子表面活性剂或甜菜碱型两性离子表面活性剂或咪唑啉型两性离子表面活性剂或聚氧乙烯型非离子表面活性剂或多元醇型非离子表面活性剂。

[0047] 缓释微粒型佐剂成品的制备方法优选为，选500g佐剂原料，加入10000mL含50g双十八烷基二甲基季铵盐，100g氢化聚异丁烯，20g胆固醇的水溶液，经纳米胶体磨进行均质处理后，常规高压蒸汽灭菌后，进行无菌灌装、分装，随机取样进行无菌检验，合格后封箱低温保存。

[0048] 技术效果：

[0049] 1、本发明克服了现有技术中各缺陷，提供了一种高生物活性、无生物毒性的赤红球菌作为佐剂的在禽疫苗和猪疫苗中的新用途，尤其是在新城疫，禽流感，猪瘟疫苗中的用途，该佐剂具有高度针对性，配合动物疫苗抗原，能够制备高效动物疫苗，特别对于灭活疫苗，其高效诱导机体非特异免疫反应，表现出不同寻常的体液免疫调节效应，可以高水平诱导动物的抗体水平，安全性好。发明人所筛选的赤红球菌 (CGMCC NO.17012)好氧培养；抗酸；营养要求不苛刻；产类胡萝卜素，不同发酵条件下，菌体颜色可呈红色、深红或浅红色；革兰氏染色为强阳性，染色固着力强不易脱色；发酵周期短；生产方法简单等诸多优势。现有技术中目前还没有利用灭活所述赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒或裂解物或其衍生物制备成不同剂型佐剂制品作为新城疫，禽流感，猪瘟等动物疫苗佐剂的构思，属于发明人首次提出并相应证实。

[0050] 2、实验结果证明，本发明通过采用不同赤红球菌菌株，不同发酵方法，不同培养基，不同佐剂制品，相比于常规方法制备的赤红球菌，其活性物含量发生明显改变，免疫效力更加突出，特别是非特异性提升体液免疫方面效果突出，可非特异性刺激T、B淋巴细胞免疫功能，促进多种细胞因子分泌，表现出持久的且更高水平的抗体，且有效抗体产生时间明显提前，抗体峰值维持期明显延长，而常规方法制备的赤红球菌试验组则提升效果不明显，抗体水平提高不显著。这可能主要是由于赤红球菌(CGMCC NO.17012) 在特定情形下发酵培养，获得更多能够发挥免疫作用的，分子量适中或更理想的霉菌酸结构，其以最小的免疫剂量引发适当的免疫促进作用，在保证有效的非特异性免疫刺激作用的同时，引起动物不良反应特别是注射局部肉芽肿反应非常轻微，因而其作为佐剂具有高度的生物安全性。

[0051] 3、发明人在研究中意外发现，所述赤红球菌(CGMCC NO.17012)在不同碳源或不同氮源组合的培养基中其佐剂效用明显不同，在培养基中使用甘露醇作为碳源同时添加尿素作为氮源、并按特定用量配比时，所发酵培养出来的赤红球菌才可用作动物疫苗佐剂并发挥高效的体液免疫调节效果，而采用常规培养基或其它组合配比时，虽然所述赤红球菌表现出高生长特性，但所得培养物并不能有效提高动物灭活疫苗抗体水平，并且免疫效果不稳定。

[0052] 4、动物疫苗中添加本发明的佐剂成品，安全性好，动物免疫后对生长、生产性能无明显影响，疫苗注射部位无明显残留及肉芽肿病变；其添加到动物疫苗中，如减毒活疫苗，灭活疫苗和基因工程疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生；佐剂菌本身对人和动物无毒力，不会引起研究人员和生产人员的意外感染，降低了研究和生产过程中生物质泄露可能造成的环境污染问题；佐剂生产后处理简单，制备的不同剂型的制品可用于不同类型的疫苗；佐剂成品稳定性高，可常温条件下长久保存，且储运方便，减少因冷链保存及冷链运输不当导致的产品稳定性问题。附图说明

[0053] 图1：赤红球菌在不同的碳源及氮源中的OD660值和脂含量的比较

[0054] 图2：赤红球菌在不同的碳源及氮源中佐剂活性的影响

[0055] 图3：成品佐剂与全细胞粗品及裂解物免疫活性比对

[0056] 图4：鸡新城疫、禽流感(H9亚型)抗体结果统计

[0057] 图5：猪瘟疫苗血清抗体水平(注：OD值≥0.40为阳性)

[0058] 图6：H5亚型禽流感(Re-6+Re-8株)二价油乳剂对比试验体测定结果具体实施方式

[0059] 实施例1：

[0060] 一种赤红球菌的发酵方法，具体按照以下步骤进行：

[0061] 1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于30℃透气或好氧培养4天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱、收获菌体，作为洗脱菌种备用；

[0062] 2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积2％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速200rpm，30℃透气或好氧培养48h，作为一级种子液备用；

[0063] 3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积10％接种于发酵罐，转速200rpm， 30℃通气发酵36h，作为二级种子液备用；

[0064] 4)终点发酵：取步骤3)制备的二级种子液，按终点液体发酵培养基体积10％接种于发酵罐，转速200rpm，30℃通气发酵48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤4)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，尿素0.05％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸- 柠檬酸盐0.25％，甘露醇2％，余量为水。

[0065] 实施例2：

[0066] 一种赤红球菌的发酵方法，具体按照以下步骤进行：

[0067] 1)洗脱菌种制备：将所述赤红球菌接种于固体琼脂培养基方瓶内，于30℃透气或好氧培养4天，待方瓶中菌体呈现浅黄或橙黄或浅红或深红色后，用适量生理盐水无菌洗脱、收获菌体，作为洗脱菌种备用；所述步骤1)中固体琼脂培养基所含营养物质的重量百分比为：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，甘油2％，琼脂粉1.5％；

[0068] 2)一级种子液制备：取步骤1)制备的洗脱菌种液，按液体培养基体积2％接种摇瓶培养，经恒温摇床连续振荡培养，转速200rpm，30℃透气或好氧培养48h，作为一级种子液备用；

[0069] 3)二级种子液制备：取步骤2)制备的一级种子液，按液体培养基体积10％接种于发酵罐，转速200rpm， 30℃通气发酵36h，作为二级种子液备用；步骤2)和3)所述的液体培养基组分及重量百分比均为：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，甘油2％，余量为水。

[0070] 4)终点发酵：取步骤3)制备的二级种子液，按终点液体发酵培养基体积10％接种于发酵罐，转速200rpm， 30℃通气发酵48h，作为终点发酵液；其中，所述步骤4)中终点液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，尿素0.05％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸- 柠檬酸盐0.25％，甘露醇2％，余量为水。

[0071] 实施例3：

[0072] 一种专用于发酵培养本申请所述赤红球菌的液体培养基，该液体发酵培养基的组分及重量百分比为：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨1％，尿素0.1％，酵母浸出粉1％，NaCl 1％，谷氨酸钠1％，柠檬酸-柠檬酸盐 0.5％，甘露醇5％，余量为水。

[0073] 效果实验

[0074] 实验一.不同发酵方法对比试验

[0075] 以鸡新城疫灭活疫苗添加不同发酵方法制备的佐剂，进行免疫活性效果比对。试验设计如下：

[0076] 1.不同发酵方法

[0077] 本发酵方法重点进行终点发酵培养基组方的筛选而获得高菌量高免疫活性的菌体，其基本流程为：

[0078] 1)固体琼脂培养基：所含营养物质的重量百分比为胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％， NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，甘油
2％，琼脂粉1.5％。

[0079] 2)一级种子液、二级种子液培养基：所含营养物质的重量百分比为胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，甘油2％，余量为水。

[0080] 3)终点发酵培养基：所含营养物质的重量百分比为胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％， NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，与发酵方法组区别为终点培养基是否添加0.05％尿素，以及5％葡萄糖、甘油或甘露醇为碳源的不同选用(其它发酵方法组的设置见表1中左栏)，余量可为水。

[0081] 发酵后的产物经灭活处理后，通过高速离心机离心分离菌体沉淀物，经过纯化水洗涤，再次离心分离，收获菌体沉淀物，菌体沉淀物为佐剂原料，或菌体沉淀物进一步制备成灭活的赤红球菌菌体干粉或菌体颗粒、灭活赤红球菌系列裂解物或灭活赤红球菌系列衍生物。

[0082] 2.疫苗制备及动物试验

[0083] 具体按照以下过程进行：佐剂制备，疫苗抗原相的制备，疫苗的制备，油乳剂灭活疫苗物理性状检测，油乳剂灭活疫苗安全性试验，油乳剂灭活疫苗效力性试验。

[0084] (1)佐剂制备：具体见表1

[0085] BASE(基础培养组分)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％。

[0086] GLUC+BASE(葡萄糖+基础培养组分)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％， NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％葡萄糖。

[0087] GLUC+BASE+UREA(葡萄糖+基础培养组分+尿素)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，0.05％尿素，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％葡萄糖。

[0088] GLYC+BASE(甘油+基础培养组分)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％甘油。

[0089] GLYC+BASE+UREA(甘油+基础培养组分+尿素)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，0.05％尿素，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％甘油。

[0090] MAN+BASE(甘露醇+基础培养组分)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％， NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％甘露醇。

[0091] MAN+BASE+UREA：(甘露醇+基础培养组分+尿素)：胰蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，0.05％尿素，酵母浸出粉0.5％，NaCl 0.5％，谷氨酸钠0.5％，柠檬酸-柠檬酸盐0.25％，5％甘露醇。

[0092] 表1：不同终点发酵培养基获得的佐剂原料制备的佐剂成品

[0093]

[0094]

[0095] (2)疫苗抗原相的制备

[0096] 取93.5体积份的新城疫灭活抗原液，加入5体积份灭菌的吐温80(TWEEN80)，对照组添加1.5体积份生理盐水，试验组则分别添加1.5体积份对应的试验佐剂组后，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后得到抗原水相，制备对应抗原相。

[0097] (3)疫苗的制备：

[0098] ①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含 6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原相加入过程中保持5000rpm 低速搅拌，待抗原完全加入油相后，调节乳化机转速为
16000rpm高速乳化4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0099] ②试验组疫苗制备：取上述制备的各试验组抗原相100mL，分别进行乳化，过程为将抗原相缓慢加入 200mL灭菌油相(含6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm高速剪切乳化 4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0100] (4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测

[0101] 取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

[0102] A.每组疫苗各取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

[0103] B.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。

[0104] C.每组各取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000rpm离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。

[0105] D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5mL为合格。

[0106] 上述制备疫苗物理性状均符合2015版兽药典要求。

[0107] (5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的各组疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫5只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。

[0108] 检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。

[0109] (6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，于免疫后2～7周采血分离血清检测新城疫抗体，比较各不同佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。

[0110] 实验一的结果：

[0111] 图1：赤红球菌在不同的碳源及氮源中的OD660值和脂含量的比较

[0112] 图1结果表明：不同氮源、碳源发酵的赤红球菌，对于细菌生长和细菌脂含量具有显著影响。

[0113] 图2：赤红球菌在不同的碳源及氮源中佐剂活性的影响

[0114] 图2结果表明：鸡新城疫灭活疫苗添加不同发酵方法制备的佐剂效果对比试验中，本发明优选佐剂组疫苗比其他发酵方法制备的佐剂组均表现出更高抗体水平。

[0115] 结论：实验一结果可以看出，特定发酵方法制备的佐剂能显著增强鸡新城疫灭活疫苗抗体水平。

[0116] 实验二.成品佐剂与全细胞粗品及裂解物免疫活性的对比

[0117] 以鸡新城疫灭活疫苗添加成品佐剂与全细胞粗品及裂解物，进行免疫活性效果比对，具体过程如下：

[0118] (1)佐剂制备：具体见表2

[0119] 表2：不同类型佐剂成品的制备

[0120]

[0121] (2)疫苗抗原相的制备

[0122] 取93.5体积份的新城疫灭活抗原液，加入5体积份灭菌的吐温80(TWEEN80)，对照组添加1.5体积份生理盐水，试验组则分别添加1.5体积份对应的试验佐剂后，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后得到抗原水相，制备对应抗原相。

[0123] (3)疫苗的制备：

[0124] ①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含 6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原相加入过程中保持5000rpm 低速搅拌，待抗原完全加入油相后，调节乳化机转速为
16000rpm高速乳化4min，乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0125] ②试验组疫苗制备：取上述制备的各试验组抗原相100mL，分别进行乳化，过程为将抗原相缓慢加入 200mL灭菌油相(含6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm高速剪切乳化 4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0126] (4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测

[0127] 取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

[0128] A.每组疫苗各取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

[0129] B.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。

[0130] C.每组各取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000rpm离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。

[0131] D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5mL为合格。

[0132] 上述制备疫苗物理性状均符合2015版兽药典要求。

[0133] (5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的各组疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫5只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。表3为安全性对比结果。

[0134] 检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。

[0135] (6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后3周，采血分离血清检测新城疫抗体，比较各不同佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。

[0136] 表3.成品佐剂与全细胞粗品及裂解物制备疫苗安全性对比统计表

[0137]

[0138] 注：+++为注射部位肿胀，解剖可见严重的肉芽肿增生，甚至明显黄褐色结节；++为注射部位解剖可见眼观肉芽肿病变，大量炎性渗出物，呈条索状；+为注射部位有轻微炎性渗出物，±为可疑，-为无反应，**动物试验过程中意外死亡。

[0139] 图3：成品佐剂与全细胞粗品及裂解物免疫活性比对

[0140] 图3结果表明：鸡新城疫灭活疫苗添加成品佐剂，全细胞粗品及裂解物的佐剂效果对比试验中，免疫后3周，本发明优选佐剂组疫苗抗体水平略高于全细胞粗品组抗体水平，显著优于裂解物试验组和疫苗对照组；佐剂生物安全性评估发现，在试验观察期内，上述安检试验及全部组别效检试验，动物眼观健康状况均正常，但是对效检试验动物全部扑杀后，剖检观察疫苗注射部位残留情况时发现，全细胞粗品动物普遍存在较为严重的肉芽肿增生，甚至形成明显黄褐色结节；而成品佐剂组与裂解物试验组和疫苗对照组残留水平相当，眼观病变不明显。

[0141] 结论：本实验可以看出，本发明成品佐剂组能显著增强鸡新城疫灭活疫苗抗体水平，并且具有高度的生物安全性。

[0142] 实验三.与市售佐剂对比试验

[0143] 以鸡新城疫，禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗添加不同类型佐剂效果比对研究为例，其他对比佐剂按相应说明书添加，考虑技术外的因素，在此不明确其他对比佐剂的商品名称。实验过程如下：

[0144] (1)水基型佐剂成品的制备

[0145] 取5g前述实验一中“MAN+BASE+UREA”组发酵制备的佐剂原料，加入100mL含1mL Tween80，1mL Span80，0.1g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，纳米胶体磨进行均质处理后，121℃高压蒸汽灭菌20min， 4℃备用。

[0146] (2)疫苗抗原相的制备

[0147] 取93.5体积份新城疫+H9亚型禽流感灭活抗原混合液，加入5体积份灭菌的吐温80(TWEEN80)，对照组添加1.5体积份生理盐水，本申请试验组添加1.5体积份试验佐剂组后，其他佐剂试验组按照使用说明进行添加，保证抗原相100体积份的总量，再振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后得到抗原水相，制备对应抗原相。

[0148] (3)疫苗的制备：

[0149] ①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含 6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原相加入过程中保持5000rpm 低速搅拌，待抗原完全加入油相后，调节乳化机转速为
16000rpm高速乳化4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0150] ②佐剂组疫苗制备：取上述制备的各佐剂试验组抗原相100mL，分别进行乳化，过程为将抗原相缓慢加入200mL灭菌油相(含6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm高速剪切乳化4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0151] (4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测

[0152] 取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

[0153] A.每组疫苗各取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

[0154] B.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。

[0155] C.每组各取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。

[0156] D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5mL为合格。

[0157] 上述制备疫苗物理性状均符合2015版兽药典要求。

[0158] (5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的各组疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫5只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。

[0159] 检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。

[0160] (6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，每组疫苗免疫 10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后3周，采血分离血清检测禽流感(H9)和新城疫抗体，比较各不同佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。

[0161] 图4：鸡新城疫、禽流感(H9亚型)抗体结果统计

[0162] 图4结果表明：鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗添加不同类型佐剂效果对比试验中，免疫后3周，本发明佐剂组疫苗比其他佐剂组均表现出更高抗体水平。

[0163] 结论：本实验可以看出，本申请的佐剂能显著增强鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗抗体水平。可更高水平且更快更持久地诱导免疫反应。优于市售的其他佐剂制品。

[0164] 实验四.水包油型佐剂在猪瘟活疫苗(传代细胞源)中的应用试验

[0165] 以猪瘟活疫苗为例，进行水包油型佐剂稀释液与常规厂家配备稀释液的效果的比对研究，过程如下：

[0166] (1)水包油型佐剂疫苗稀释液的制备

[0167] 矿物油5mL，5g前述实验一中“MAN+BASE+UREA”组发酵制备的佐剂原料干粉，1mL Tween80， 1mL Span80，93mL注射水，纳米胶体磨均质处理后，制备成稳定的水包油型乳液，121℃高压灭菌20min 后4℃保存备用，作为稀释液。

[0168] (2)试验分组：具体见表4

[0169] 表4：不同稀释液的配制及使用方法

[0170]

[0171] 水包油型佐剂稀释液与常规厂家配备稀释液的效果的比对结果见图5。

[0172] 图5：猪瘟疫苗血清抗体水平(注：OD值≥0.40为阳性)

[0173] 图5结果表明：使用水包油型佐剂作为疫苗稀释液与厂家配备的稀释液比对，猪瘟抗体于免疫后21 天开始拉开差距，并在后续的观察期内始终保持明显的抗体优势。

[0174] 结论：经过动物实验证明，使用水包油型佐剂作为疫苗稀释液可以显著提高猪瘟疫苗抗体水平；证明该水包油佐剂可以作为猪瘟活疫苗的专用稀释液。

[0175] 实验五.缓释微粒型佐剂在鸭疫疫苗中的应用试验

[0176] 以鸭疫油乳剂灭活疫苗与添加本发明的缓释微粒型佐剂疫苗进行效果比对研究为例。过程如下：

[0177] (1)缓释微粒型佐剂的制备

[0178] 5g前述实验一中“MAN+BASE+UREA”组发酵制备的佐剂原料，加入100mL含0.5g双十八烷基二甲基季铵盐，1g氢化聚异丁烯，0.2g胆固醇的水溶液，经纳米胶体磨进行均质处理后，121℃高压蒸汽灭菌20min后，4℃保存备用。

[0179] (3)试验分组及疫苗制备：具体见表5

[0180] 表5：实验分组及具体制备方法

[0181]

[0182]

[0183] 上述实验组每组10只麻鸭雏鸭，其中1、2组于3日龄腿部肌肉注射相应疫苗，每只0.3mL，3组空白对照组不免疫，上述全部鸭子于免疫后3周进行攻毒，腿部肌肉注射强毒1mL(2×108CFU)，每天观察死亡情况并剖检检验，观察14天扑杀所有存活动物，并进行剖检检验。判定以动物死亡情况为依据，在试验过程中出现死亡的动物及时剖检，观察内脏病变是否出现心包炎、肝周炎、气囊炎等特征性病变，并做病原分离以确定是否为攻毒强毒致死。
鸭疫油乳剂灭活疫苗攻毒保护试验结果具体见表6。

[0184] 表6鸭疫油乳剂灭活疫苗攻毒保护试验结果

[0185]

[0186] 表6结果表明：添加佐剂的鸭疫油乳剂灭活疫苗攻毒保护率为100％，而未添加佐剂的对照组油苗保护率为80％，佐剂组免疫效果优于未添加佐剂的对照组，空白对照组于攻毒后48小时内全部死亡，死亡率为100％，试验结果成立。

[0187] 结论：经过动物实验证明，添加佐剂的鸭疫油乳剂灭活疫苗与未添加佐剂对照组疫苗有显著的差异；证明佐剂可以用于鸭疫油乳剂灭活疫苗的制备。

[0188] 实验六.水基型佐剂在禽流感油乳剂灭活疫苗中的应用试验

[0189] 以H5亚型禽流感(Re-6+Re-8)二价油乳剂灭活疫苗添加水基型佐剂效果比对研究为例。过程如下：

[0190] (1)水基型佐剂成品的制备

[0191] 取5g前述实验一中“MAN+BASE+UREA”组发酵制备的佐剂原料，加入100mL含1mL Tween80， 1mL Span80，0.1g柠檬酸-柠檬酸钠的水溶液中，纳米胶体磨进行均质处理后，121℃高压蒸汽灭菌20min， 4℃备用。

[0192] (2)抗原相的制备：

[0193] ①无佐剂对照组抗原水相：取93.5体积份灭活的含H5亚型禽流感Re-6株和Re-8株混合抗原，无菌条件下添加1.5体积份灭菌生理盐水，再加入5体积份灭菌的TWEEN80，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原相。

[0194] ②佐剂组抗原相：取93.5体积份灭活的含H5亚型禽流感Re-6株和Re-8株混合抗原，无菌条件下添加1.5体积份水基型佐剂成品，再加入5体积份灭菌的TWEEN80，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后，即为佐剂组抗原相。

[0195] (3)乳化制备疫苗：

[0196] ①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原相加入过程中保持5000rpm 低速搅拌，待抗原完全加入油相后，调节乳化机转速为
16000rpm高速乳化4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0197] ②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含6％SPAN80 和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm高速剪切乳化4min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0198] (4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测

[0199] 取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

[0200] A.每组疫苗各取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

[0201] B.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。

[0202] C.每组各取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。

[0203] D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5mL为合格。

[0204] 上述制备疫苗物理性状均符合2015版兽药典要求。

[0205] (5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫21日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫5只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。

[0206] 检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。

[0207] (6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后2周起，每周采血分离血清检测Re-6和Re-8的HI抗体，连续检测3周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异，结果见图6。

[0208] 图6：H5亚型禽流感(Re-6+Re-8株)二价油乳剂对比试验体测定结果[0209] 图6结果表明：H5亚型禽流感(Re-6+Re-8株)二价油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后3周、4周，佐剂组疫苗比对照组疫苗均表现出更高抗体水平。本实验可以看出，佐剂能显著增强H5亚型禽流感 (Re-6+Re-8株)疫苗抗体水平。

[0210] 结论：经过本动物实验证明，添加佐剂的H5亚型禽流感(Re-6+Re-8株)二价油乳剂灭活疫苗与未添加佐剂对照组疫苗的有显著的差异；证明佐剂可以用于H5亚型禽流感(Re-6+Re-8株)二价油乳剂灭活疫苗的制备。

[0211] 实验七.水包油型佐剂在猪圆环病毒2型亚单位疫苗制备中的应用试验[0212] 以猪圆环病毒2型亚单位疫苗为例，进行水包油型佐剂效果比对研究，过程如下：

[0213] (1)水包油型佐剂的制备

[0214] 矿物油5mL，5g前述实验一中“MAN+BASE+UREA”组发酵制备的佐剂原料干粉，1mL Tween80， 1mL Span80，93mL注射水，使用纳米胶体磨均质处理后，制备成稳定的水包油型乳液，121℃高压灭菌 20min后4℃保存备用。

[0215] (2)抗原相的制备：

[0216] ①无佐剂亚单位对照组抗原相：取86体积份猪圆环病毒2型亚单位抗原，无菌条件下添加9体积份灭菌生理盐水，再加入5体积份灭菌的TWEEN80，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原相。

[0217] ②佐剂组亚单位抗原相：取86体积份猪圆环病毒2型亚单位抗原，无菌条件下添加9体积份水包油佐剂，再加入5体积份灭菌的TWEEN80，振荡或搅拌至TWEEN80完全溶解后，即为佐剂组抗原相。

[0218] (3)乳化制备疫苗：

[0219] ①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含 6％SPAN80和1％硬脂酸铝)，使用1KA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原相加入过程中保持5000rpm 低速搅拌，待抗原完全加入油相后，调节乳化机转速为
16000rpm高速乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0220] ②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原相100mL，缓慢加入200mL灭菌油相(含6％SPAN80 和1％硬脂酸铝)，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

[0221] (4)油乳剂疫苗物理性状检测

[0222] 取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

[0223] A.每组疫苗各取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

[0224] B.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。

[0225] C.每组各取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。

[0226] D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5mL为合格。

[0227] 上述制备疫苗物理性状均符合2015版兽药典要求。

[0228] (5)亚单位油乳剂疫苗安全性试验：采用上述制备的3种疫苗分别免疫10只昆明小鼠，每只腹腔接种0.5mL，另设5只同日龄小鼠作为空白对照。上述小鼠免疫后观察14天，每日检查健康状况。

[0229] 检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。

[0230] (6)亚单位油乳剂疫苗效力性试验：将上述制备的2种油乳剂疫苗分别免疫10只昆明小鼠，另设5 只同日龄小鼠做空白对照。于免疫后21天起，每隔10天对所有小鼠进行尾静脉采血并分离血清，将血清保存于-20℃，于第4次采血结束时统一进行PCV2抗体检测。检测采用PCV2.Cap特异性IgG抗体检测试剂盒，具体操作按照说明进行。

[0231] 水包油型佐剂在猪圆环病毒2型亚单位疫苗制备中的应用试验结果见表7。

[0232] 表7首次免疫后各组小鼠的PCV2抗体水平(OD 450nm)

[0233]

[0234] 表7结果表明：使用佐剂的PCV2亚单位油乳剂疫苗组在整个免疫试验期间，PCV2.Cap特异性IgG 抗体检测结果均显著高于无佐剂的对照疫苗组，而空白对照组检测结果均呈阴性反应，故试验结果成立。

[0235] 结论：添加佐剂的PCV2亚单位油乳剂疫苗免疫效果显著优于无佐剂的亚单位疫苗，证明佐剂可以用于猪PCV2亚单位油乳剂疫苗的制备。

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