口蹄疫A型灭活疫苗
阅读：450发布：2020-05-12
专利汇可以提供口蹄疫A型灭活疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 口 蹄 疫 A型灭活 疫苗 ，由A型口蹄疫病毒 抗原 和佐剂以抗原：佐剂＝1:1比例经：毒种、增殖病毒的程序、病毒灭活的程序、菌检、疫苗配制程序和疫苗检验步骤制备而成。本 发明 的安全性达国际同类产品先进 水 平；对A型口蹄疫的平均免疫效 力 为7.27PD50/头份，超过了国际上战略应急疫苗的标准。因此，是高效的口蹄疫A型灭活疫苗，具有广阔的应用前景。免疫接种剂量缩减到了每头 牛 2ml，从而在不影响疫苗免疫效力的前提下，大大降低了疫苗的副反应，也降低了用于防疫的人力、物力和财力。，下面是口蹄疫A型灭活疫苗专利的具体信息内容。
1.1.一种口蹄疫A型灭活疫苗，其特征在于由A型口蹄疫病毒抗原和佐剂按下述含量配制而成：
抗原，由已灭活的A型口蹄疫病毒抗原AF/72占疫苗总量的50％；
佐剂：为蒙太得206—Montanide ISA 206佐剂，佐剂占疫苗总量的50％；
疫苗配制的比例为，抗原:佐剂＝1:1；
上述含量原料按照下述工艺方法和顺序制备而成：
a、毒种
牛源A型口蹄疫病毒AF/72株细胞毒；
b、增殖病毒的程序
b.1制苗材料的制备：
制苗材料为BHK-21单层细胞，培养按一般组织培养方法进行；
b.2病毒的增殖：用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法增殖制苗用A型病毒抗原，转瓶机转速为10～12r/h，收获病毒液，在-15℃下冻结保存；
c.病毒灭活的程序
c.1过滤：将冻结的A型制苗病毒液融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用
7.5％NaHCO3调PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素；
c.2灭活：向已过滤的A型病毒液中加入BEI二乙烯亚胺使其浓度达到2mmol/L，在
37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检；
c.3安检：取2～4日龄乳鼠，颈背部皮下接种灭活病毒液，每只0.2mL，另取对照乳鼠，不接种；接种后，将乳鼠与母鼠一起饲养，连续观察7d，不出现口蹄疫症状和死亡；
c.4菌检：
d、疫苗配制程序
疫苗乳化，先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内，将灭活的病毒液按比例真空负压进料到油佐剂相中，循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后，乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗；
e、疫苗检验
e.1物理性状检查；
e.2无菌检验；
e.3安全检验；
e.4效力检验。
口蹄疫A型灭活疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。口蹄疫的暴发将严重影响到一个国家的经济发展、国际贸易、社会稳定和国际声誉。1997年我国台湾暴发口蹄疫，导致养猪业及相关产业倒闭，70万人失业，总经济损失达80亿美元。2001年，口蹄疫首先在英国暴发，造成直接损失达几亿英镑，但外贸和相关产业的间接损失多达90亿英镑，当年经济增长率下调1.5个百分点。Blackwell(1984)曾引用一个经济分析报告称：如果畜牧业十分发达的美国发生口蹄疫，当年的直接损失和间接损失将分别是40亿和400亿美元。鉴于口蹄疫不仅会造成巨大经济损失和社会影响，而且会影响一个国家在国际上的声誉和形象，素有“政治经济病”之称，被联合国粮农组织(FAO)、世界动物卫生组织(OIE)和我国政府列为A类和一类动物传染病之首，并列入重大跨国动物疫病全球消灭行动计划，这充分显示了国内外对口蹄疫的关注程度。目前，世界口蹄疫流行的总格局是，发达国家继续享受无口蹄疫地位，发展中国家仍未摆脱口蹄疫的危害。根据2004年世界口蹄疫地理分布情况，我们的邻国几乎都有口蹄疫流行，疫情非常严重，血清型十分复杂。与我国接壤的东南亚、南亚和中亚数国，常年流行O、A和亚洲1型口蹄疫。因此，可以看出，我国被置身于口蹄疫重疫区的重重包围之中，可谓“危机四伏、四面楚歌”。我国口蹄疫流行历史已久，解放后，先后经历过几次大流行，从流行病毒的血清型看，主要是O型、A型和Asia-I型。目前，除O型外，局部地区还有亚洲1型口蹄疫流行。至于A型口蹄疫，是由北部国家传入我国，并于20世纪70年代中期以前在我国大部分地区流行。
[0003] 疫苗接种是防止疫病暴发和避免造成巨大损失的主要措施、关键环节和最后防线。在有口蹄疫流行的国家每年都要进行有计划的免疫预防接种；无口蹄疫流行或已消灭了口蹄疫的国家在疫苗库中也储备了一定数量的战备疫苗；受口蹄疫威胁国家除进行严格的进口检疫外，对边境地区亦进行定期的疫苗预防接种。口蹄疫病毒属小RNA病毒科，病毒基因组具有小RNA病毒准种的特性，压力选择导致病毒在毒力和抗原性方面极易变异。根据交叉保护试验已确定了O、A、C、Asia-I、SAT I、SAT II、SATIII等7个血清型，型间无交叉保护，型内不同毒株之间的遗传变异可导致抗原差异。因此，各国流行的血清型及毒株存在着较大差异，均纷纷研制适合于自己国家的疫苗，以预防和控制这一世界性重大动物疫病的流行。国际上曾研究应用和正在研制的口蹄疫疫苗综括起来有弱毒疫苗、灭活疫苗和新型疫苗三大类。从口蹄疫疫苗的整个研究和应用情况看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已经被世界上许多国家摈弃。新型疫苗虽然取得一些非常有前途的结果，但在免疫效力和经济上目前尚不存在与常规疫苗竞争的能力。在新型疫苗进入实际应用前，还需对此类疫苗的免疫机制和分子生物学特性作更深入地研究。常规灭活疫苗仍然是当前世界口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。在灭活疫苗的研制方面，国际上具有代表性的疫苗生产工艺是：“筛选优异的制苗毒株，用转瓶单层传代细胞培养法或悬浮培养法生产制苗用口蹄疫病毒抗原；用乙酰基乙烯亚胺(AE1)或二乙烯亚胺(BE1)对病毒进行灭活；利用油佐剂乳化配制疫苗。”我国已研制成功并用于实际防疫的灭活疫苗有：牛口蹄疫O型灭活疫苗、猪口蹄疫O型灭活疫苗、猪口蹄疫O型灭活疫苗(II)[即猪口蹄疫O型高效灭活疫苗]等。鉴于我国目前还没有商品化的安全、高效的A型口蹄疫灭活疫苗，研制开发A型口蹄疫灭活疫苗则显得极为迫切，对于预防外来口蹄疫病毒的侵入具有重要战略储备意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种预防A型口蹄疫的高效、安全、可靠的灭活疫苗，用于A型口蹄疫的免疫预防。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现其发明目的：
[0006] 一种口蹄疫A型灭活疫苗，其特征在于由A型口蹄疫病毒抗原和佐剂按下述含量配制而成：
[0007] 抗原，由已灭活的A型口蹄疫病毒抗原AF/72占疫苗总量的50％；
[0008] 佐剂：为蒙太得206—MontanideISA206佐剂，佐剂占疫苗总量的50％；
[0009] 疫苗配制的比例为，抗原:佐剂＝1:1；
[0010] 上述含量原料按照下述工艺方法和顺序制备而成：
[0011] a、毒种
[0012] 牛源A型口蹄疫病毒AF/72株细胞毒；
[0013] b、增殖病毒的程序
[0014] b.1制苗材料的制备：
[0015] 制苗材料为BHK-21单层细胞，培养按一般组织培养方法进行；
[0016] b.2病毒的增殖：用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法增殖制苗用A型病毒抗原，转瓶机转速为10～12r/h，收获病毒液，在-15℃下冻结保存；
[0017] c.病毒灭活的程序
[0019] c.2灭活：向已过滤的A型病毒液中加入BEI二乙烯亚胺使其浓度达到2mmol/L，在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检；
[0020] c.3安检：取2～4日龄乳鼠，颈背部皮下接种灭活病毒液，每只0.2mL，另取对照乳鼠，不接种；接种后，将乳鼠与母鼠一起饲养，连续观察7d，不出现口蹄疫症状和死亡；
[0021] c.4菌检：
[0022] d、疫苗配制程序
[0024] e、疫苗检验
[0025] e.1物理性状检查；
[0026] e.2无菌检验
[0027] e.3安全检验；
[0028] e.4效力检验。
[0029] 我国是畜牧业大国，畜牧业产值已占农业总产值的1/3以上。据统计，到2004年底全国主要家畜存栏数，猪4.82亿头、牛1.38亿头、羊3.66亿只，分别比上年增长3.4％、2.3％、7.6％。国家已经把发展畜牧业提高到了调整农业产业结构和增加农民收入、解决“三农问题”和建设社会主义新农村的战略地位。口蹄疫是最重要的世界性动物疫病之一，被称为畜牧业的“头号杀手”，每年因该病造成的经济损失达数百亿元。此外，还涉及食品安全和公共卫生。我国口蹄疫流行流行历史已久，疫情比较复杂，严重制约着畜牧业的健康、持续发展，极大影响着动物及其产品的国际贸易。而与我国接壤的许多国家，常年流行O、A和亚洲1型口蹄疫，疫情非常严重。为了应对我国口蹄疫突发事件，也为了提供拒邻国口蹄疫于国门之外的战略技术储备，我们在科技部组织的国家“十五”科技攻关“防治口蹄疫科技攻关”项目的资助下，研制成功了口蹄疫A型灭活疫苗。
[0030] 该疫苗系将牛源A型口蹄疫病毒株的细胞适应毒，接种BHK-21细胞，收获细胞培养物，经二乙烯亚胺(BEI)灭活，加油佐剂混合乳化制成，用于A型口蹄疫的免疫预防，对口蹄疫易感动物安全。一次接种有效免疫期6个月；2～8℃下疫苗保存期12个月；免疫剂量为每头牛2mL。按国际通用标准PD50法进行效力检验，6批疫苗(040327、040415、040510、041005、041214、050113)疫苗免疫牛，抗口蹄疫A型同源强毒攻击的免疫效力分别为7.22、
6.50、8.10、6.50、7.22、8.10PD50/头份，平均7.27PD50/头份，而对照牛则均2/2四蹄发病。
表明，本疫苗免疫效力大于国际上战略应急疫苗的免疫效力(6个PD50/头份)，是一种高效的口蹄疫A型灭活疫苗。
6.50、8.10、6.50、7.22、8.10PD50/头份，平均7.27PD50/头份，而对照牛则均2/2四蹄发病。
表明，本疫苗免疫效力大于国际上战略应急疫苗的免疫效力(6个PD50/头份)，是一种高效的口蹄疫A型灭活疫苗。
[0031] 与国内外现有口蹄疫灭活疫苗相比，该疫苗具有以下特点：
[0032] 1)本疫苗制苗毒种是经先进的口蹄疫病毒毒株库技术筛选确定的，不仅免疫原性好、抗原谱广、遗传性能稳定、对实验动物和制苗材料具有良好适应性，而且是近年来口蹄疫流行代表毒株。以其作为制苗毒株，对实际防疫更具针对性。
[0033] 2)疫苗制造采用BHK-21细胞浓缩培养法繁殖病毒抗原、二乙烯亚胺(BEI)灭活和双相油佐剂乳化技术。同时，将口蹄疫病毒抗原浓缩、保存、稀释技术应用于疫苗制造，完善和优化了疫苗生产工艺。为保证产品质量、规范毒种管理，建立了制苗和攻毒用毒种及制苗细胞种子批，制订了与国际标准接轨的疫苗质量标准。
[0034] 3)该疫苗的安全性达国际同类产品先进水平；对A型口蹄疫的平均免疫效力为7.27PD50/头份，超过了国际上战略应急疫苗的标准(6个PD50/头份)。因此，是高效的口蹄疫A型灭活疫苗，具有广阔的应用前景。
[0035] 4)免疫接种剂量缩减到了每头牛2mL，从而在不影响疫苗免疫效力的前提下，大大降低了疫苗的副反应，也降低了用于防疫的人力、物力和财力。
具体实施方式
[0036] 实施例1
[0037] 一种口蹄疫A型灭活疫苗，由已灭活的A型口蹄疫病毒抗原AF/72(占疫苗总量的50％)与佐剂(法国SEPPIC公司生产的Montanide ISA206佐剂(蒙太得206)，经高压灭菌而成，占疫苗总量的50％)共同配制而成，通过下述工艺方法和顺序实现。
[0038] 1毒种：AF/72，系1972年分离的A型口蹄疫牛源舌皮毒，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室鉴定、保存和供应。将该毒种1:10000倍稀释后，接种无口蹄疫A型血清抗体的黄牛，于48h内4蹄出现典型口蹄疫水泡病变，对牛的半数感染量-8.00(ID50/0.1mL)为10 ；将牛舌皮毒种1:10稀释后接种2～3日龄乳鼠，于48小时内出现明显的麻痹症状并最终死亡，盲传至第3代时，发病死亡时间为21～23小时，对乳鼠的半-7.67
数致死量(LD50/0.2mL)为10 ；用该毒种适应BHK-21细胞，第8代毒培养时间为12小时，-7.67
对细胞的半数感染量(TCID50/mL)为10 ；经核苷酸序列分析，该毒种与周边国家及我国
20世纪50～60年代牛源A型口蹄疫分离毒株的同源性在91％以上，在遗传学分类上属相同的基因亚型；通过细胞中和试验分析，该毒种与我国其它A型口蹄疫分离毒株抗原关系密切(对其它A型病毒的r值为0.78～1.00，平均0.88)。
数致死量(LD50/0.2mL)为10 ；用该毒种适应BHK-21细胞，第8代毒培养时间为12小时，-7.67
对细胞的半数感染量(TCID50/mL)为10 ；经核苷酸序列分析，该毒种与周边国家及我国
20世纪50～60年代牛源A型口蹄疫分离毒株的同源性在91％以上，在遗传学分类上属相同的基因亚型；通过细胞中和试验分析，该毒种与我国其它A型口蹄疫分离毒株抗原关系密切(对其它A型病毒的r值为0.78～1.00，平均0.88)。
[0039] 2增殖病毒的程序
[0040] 2.1制苗材料的制备：制苗材料为BHK-21单层细胞，细胞种子由中国兽医药品监察所提供。细胞制备所用犊牛血清，经检查应无口蹄疫病毒抗体，每批血清均应过滤除菌、无菌检验。培养细胞用营养液的配制及BHK-21细胞的培养按一般组织培养方法进行。
[0041] 2.2病毒的增殖：用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法(薛景山，[21]ZL专利号93114885.5)增殖制苗用A型病毒抗原，但转瓶机转速为10～12r/h。在培养过程中镜检转瓶细胞CPE，当达到90％时即可收获病毒液，在-15℃下冻结保存。抽样测定，TCID50均-7.0应不低于10 。
[0042] 3病毒灭活的程序
[0043] 3.1过滤：将冻结的A型制苗病毒液融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用7.5％NaHCO3调PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素。
[0044] 3.2灭活：向已过滤的A型病毒液中加入BEI使其浓度达到2mmol/L，在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2％。抽样，并置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检。
[0045] 3.3安检：取2～4日龄乳鼠4只，颈背部皮下接种灭活病毒液，每只0.2mL。另取对照乳鼠2只，不接种。接种后，将乳鼠与母鼠一起饲养，连续观察7d，均应不出现口蹄疫症状和死亡。
[0046] 3.4菌检：按《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。
[0047] 4疫苗配制程序：疫苗配制比例为，抗原:佐剂＝1:1；疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA206(法国SEPPIC公司产品蒙太得206)；疫苗乳化用抗原为灭活彻底、菌检合格的A型口蹄疫病毒抗原。乳化时，先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内，搅拌过程中，将灭活的病毒液按比例缓慢真空负压进料到油佐剂相中。投料后，循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后，通过均质机，乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗。
[0048] 5疫苗检验
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