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用于治疗各种疾病的新JNK抑制剂分子

阅读：902发布：2020-07-27

专利汇可以提供用于治疗各种疾病的新JNK抑制剂分子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及新的JNK 抑制剂分子的用途及其在通过治疗处理人或动物体的方法中的用途。，下面是用于治疗各种疾病的新JNK抑制剂分子专利的具体信息内容。

权利要求

1.JNK抑制剂，所述JNK抑制剂选自由以下组成的组：
a)JNK抑制剂，其包含根据以下通式的抑制性(多)肽序列：
X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8(SEQ ID NO：1)，
其中X1是选自氨基酸R，P，Q和r的氨基酸，
其中X2是选自氨基酸R，P，G和r的氨基酸，
其中X3是选自氨基酸K，R，k和r的氨基酸，
其中X4是选自氨基酸P和K的氨基酸，
其中X5是选自氨基酸T，a，s，q，k的氨基酸或缺失，
其中X6是选自氨基酸T，D和A的氨基酸，
其中X7是选自氨基酸N，n，r和K的氨基酸；和
其中X8是选自F，f和w的氨基酸，和
其中以大写字母给出的氨基酸残基指示L-氨基酸，而以小写字母给出的氨基酸残基指示D氨基酸残基，
条件是：选自由X1，X2，X3，X5，X7和X8组成的组的氨基酸中的至少一个是D-氨基酸，和
b)JNK抑制剂，其包含与如a)中限定的SEQ ID NO：1共享至少80％的序列同一性的抑制性(多)肽序列，
条件是：关于SEQ ID NO：1，与SEQ ID NO：1共享序列同一性的所述抑制性(多)肽序列维持SEQ ID NO：1的位置4处的L-精氨酸(R)残基和SEQ ID NO：1位置8和10处的两个L-亮氨酸(L)残基，并且与SEQ ID NO：1共享至少80％序列同一性的所述序列中剩余的氨基酸中的至少一个是D-氨基酸，
所述JNK抑制剂应用于通过治疗处理人或动物体的方法中。
2.根据权利要求1所述应用的JNK抑制剂，其中选自由X3，X5，X7和X8组成的组的氨基酸中的至少一种是D-氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂包含与选自SEQ ID NOs：2-27中任一个的序列共享至少80％序列同一性的抑制性(多)肽序列。
4.根据在前权利要求任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述抑制性(多)肽序列选自SEQ ID NOs：2-27中任一个。
5.根据在前权利要求任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂包含SEQ ID NO：8或与SEQ ID NO：8共享至少80％序列同一性的抑制性(多)肽序列。
6.根据在前权利要求任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂包含转运序列。
7.根据权利要求6所述应用的JNK抑制剂，其中所述抑制性(多)肽序列和转运序列重叠。
8.根据权利要求6或7所述应用的JNK抑制剂，其中所述转运序列包含根据SEQ ID NOs：28-30中任一个的交替的D-和L-氨基酸的序列。
9.根据权利要求6-8任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述转运序列选自SEQ ID NOs：31-170中的任一个。
10.根据权利要求6-9任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述转运序列选自SEQ ID NOs：31-34，46，47和52-151中的任一个。
11.根据权利要求6-10任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述转运序列直接置于所述抑制性(多)肽序列的N-末端或直接置于所述抑制性(多)肽序列的C-末端。
12.根据权利要求6-11任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂包含
a)根据SEQ ID NOs：171-190中任一个的序列，或
b)与SEQ ID NOs：171-190中的至少一个共享至少50％序列同一性的序列，条件是：与SEQ ID NOs：171-190中任一个共享序列同一性的所述序列：
i)维持其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中的位置4上的L-精氨酸(R)残基，
ii)维持其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中的两个L-亮氨酸(L)，和
iii)在其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中的位置X1，X2，X3，X5，X7或X8处呈现至少一个D-氨基酸。
13.根据权利要求6-12任一项所述应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂包含
a)SEQ ID NO：172的序列或
b)与SEQ ID NO：172共享50％序列同一性的序列，条件是：与SEQ ID NO：172共享
50％序列同一性的所述序列
i)维持其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中位置4上的L-精氨酸(R)残基，
ii)维持其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中的两个L-亮氨酸(L)，和
iii)在其与SEQ ID NO：1相应的序列区段中的位置X1，X2，X3，X5，X7或X8处呈现至少一个D-氨基酸。
14.JNK抑制剂，所述JNK抑制剂包含：
a)包含选自由RPTTLNLF(SEQ ID NO：191)，KRPTTLNLF(SEQ ID NO：192)，RRPTTLNLF和/或RPKRPTTLNLF(SEQ ID NO：193)组成的序列组的序列的抑制性(多)肽，和
b)选自SEQ ID NOs：31-34和46-151的转运序列，
所述JNK抑制剂应用于通过治疗处理人或动物体的方法中。
15.JNK抑制剂，所述JNK抑制剂包含SEQ ID NO：194或195的序列，所述JNK抑制剂应用于通过治疗处理人或动物体的方法中。
16.根据权利要求1至61任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于通过治疗处理人体。
17.根据权利要求1至61任一项应用的JNK抑制剂，其中静脉内，肌肉内，皮下，皮内，经皮，肠内，口服，直肠，表面，经鼻，局部，鼻内，表皮，通过贴片递送，通过滴注，玻璃体内，结膜下和/或鼓室内施用所述JNK抑制剂。
18.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：炎性疾病，眼病，骨疾病，神经疾病，神经元疾病，神经变性疾病，皮肤疾病，免疫和/或自身免疫疾病，眼病，口疾病，代谢疾病，心血管疾病，增生性疾病，耳疾病，肠疾病，和/或呼吸系统疾病。
19.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：炎性疾病，急性炎症，慢性炎症，眼的炎症，口中的炎症，呼吸系统炎症，肺的炎症，皮肤炎症，心血管系统内炎症，脑的炎症，耳中的炎症，粘膜炎，口腔炎，种植体周围炎，视网膜炎，脉络膜炎，干燥性角结膜炎，炎症性肠疾病(IBD)，葡萄膜炎，前葡萄膜炎，中葡萄膜炎，后葡萄膜炎，牙周炎，COPD，哮喘，牙髓炎，类风湿性关节炎，骨关节炎，克罗恩病，银屑病关节炎，脉管炎，间质性膀胱炎；感染或受伤位点的急性炎症，脑膜炎，脑炎，肺炎，咽炎，扁桃体炎，耳炎，中耳炎，脉管炎，滑膜炎，肠炎，克罗恩病，溃疡性结肠炎和移植排斥。
20.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：耳疾病，内耳疾病，听力丧失，急性听力丧失，损伤的毛细胞静纤毛，毛细胞凋亡，噪音损伤，耳炎和中耳炎。
21.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：代谢病症，糖尿病，1型糖尿病，2型糖尿病，法布里病，戈谢病，体温过低，体温过高，缺氧，类脂组织细胞增多症，脂质沉积，异染性脑白质营养不良，黏多糖贮积症，尼曼皮克病，肥胖，和渥尔曼病。
22.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：亚历山大病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，卒中，共济失调毛细血管扩张症，切断或其它中断的轴突，轴突切开术，脑损伤，CMT(进行性神经性腓骨肌萎缩症)，皮质基底节变性，痴呆，神经系统疾病或病症，张力障碍，癫痫，法伯病，弗里德赖希共济失调(SCA)，神经节苷脂贮积病，吉兰-巴雷综合征，遗传性痉孪性截瘫，先天性巨结肠，人免疫缺陷病毒痴呆，亨廷顿病，脑梗死，缺血性卒中，克拉伯病，伦-格综合征，无脑回，多发性硬化，骨髓增生异常综合征，脊髓病，AIDS-相关神经变性疾病，2型神经纤维瘤病(NF-2)，neurolatyerism，神经元凋亡，神经元死亡，神经病性疼痛，神经病，化疗诱导的神经病，糖尿病诱导的神经病，NMDA-诱导的神经毒性，疼痛，帕金森病，帕金森综合征，皮克病，多神经病，进行性核上性麻痹，桑德霍夫病，脊柱裂，卒中，泰-萨克斯病，TBI(弥散性轴索损伤)，例如由炎性疼痛诱导的暗神经元的治疗，韦斯特综合征和脊髓性肌萎缩。
23.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：CNS的自身免疫疾病，自身炎性疾病，乳糜泻；舍格伦综合征和系统性红斑狼疮。
24.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：关节炎，椎间盘突出，进行性骨化性纤维发育不良(FOP)，骨关节炎，骨硬化病，骨质疏松症，糖尿病诱导的骨质疏松症，佩吉特病和类风湿性关节炎。
25.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：银屑病和红斑狼疮。
26.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：老年性黄斑变性(AMD)；血管样条纹症；前部缺血性视神经病变；前葡萄膜炎；白内障，特别是老年性白内障；中心渗出性脉络膜视网膜病变；中心浆液性脉络膜视网膜病变；睑板腺囊肿；无脉络膜；脉络膜炎；脉络膜硬化；结膜炎；睫状体炎；糖尿病性视网膜病变；干眼综合征；眼内炎；巩膜外层炎；眼感染；白点状眼底；脉络膜和视网膜环状萎缩；麦粒肿；眼睑的炎性疾病；脉络膜的炎性疾病；睫状体的炎性疾病；结膜的炎性疾病；角膜的炎性疾病；虹膜的炎性疾病；泪腺的炎性疾病；颧骨的炎性疾病；巩膜的炎性疾病；玻璃体的炎性疾病；葡萄膜的炎性疾病；视网膜的炎性疾病；中葡萄膜炎；虹膜炎；角膜炎；莱伯病；多灶性脉络膜炎；眼肌的肌炎；新生血管性黄斑病变(例如由高度近视，斜盘综合征，脉络膜骨瘤等引起)；NMDA诱导的视网膜毒性；非慢性或慢性炎性眼病；小口病；
视神经疾病；眼眶蜂窝织炎；全眼球炎；全葡萄膜炎；后囊混浊；后囊膜混浊(PCO)(白内障术后并发症)；后葡萄膜炎；增生性玻璃体视网膜病变；视网膜动脉闭塞；视网膜脱离，视网膜疾病；视网膜损伤；视网膜巨动脉瘤；视网膜色素上皮脱离；视网膜静脉闭塞；视网膜炎；
色素性视网膜炎；白点状视网膜炎；视网膜病，尤其是早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病变；巩膜炎；施塔加特病；发炎的眼创伤和/或眼创伤边缘的治疗；眼部手术或外伤后眼内炎症的治疗；葡萄膜炎；和卵黄状黄斑营养不良。
27.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：牙周炎，尤其慢性牙周炎；粘膜炎，口脱皮病，口腔扁平苔藓，寻常天疱疮，种植体周围炎，牙髓炎；口腔炎；和颞下颌关节病症。
28.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：癌症和肿瘤疾病，听神经瘤肺癌；急性淋巴细胞性白血病(L1，L2，L3)；
急性淋巴性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；腺癌；肛门癌；支气管癌；宫颈癌；宫颈癌；星形细胞瘤；基底细胞癌；具有Bcr-Abl转变的癌；膀胱癌；胚细胞瘤；骨癌；脑转移；
脑肿瘤；乳腺癌；伯基特淋巴瘤；类癌；宫颈癌；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；结肠癌；结肠癌；子宫体癌；颅咽管瘤；CUP综合征；病毒诱导的肿瘤；EBV-诱导的B细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；红白血病(M6)；食道癌；胆囊癌；胃肠癌；胃肠道间质肿瘤；胃肠道肿瘤；泌尿生殖器癌；青光眼；成胶质细胞瘤；神经胶质瘤；头/颈肿瘤；乙型肝炎-诱导的肿瘤；肝细胞癌；肝细胞瘤；疱疹病毒-诱导的肿瘤；霍奇金综合征；HTLV-1-诱导的淋巴瘤；HTLV-2-诱导的淋巴瘤；胰岛素瘤；肠癌；卡波西肉瘤；肾癌；肾癌；喉癌；白血病；眼睑肿瘤；肝癌；肝转移；肺癌；淋巴癌；淋巴瘤；恶性黑色素瘤；乳腺癌；套细胞淋巴瘤；成神经管细胞瘤；成巨核细胞白血病(M7)；黑色素瘤，尤其恶性黑色素瘤；脑膜瘤；间皮瘤；单核细胞白血病(MS)；多发性骨髓瘤；蕈样肉芽肿病；原始粒细胞性白血病(M1)；原始粒细胞性白血病(M2)；髓单核细胞白血病(M4)；神经鞘瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞癌；非小细胞肺癌；食管癌；食管癌；少突神经胶质瘤；卵巢癌；卵巢癌；胰腺癌；胰腺癌；乳头瘤病毒-诱导的癌；阴茎癌；垂体瘤；浆细胞瘤；早幼粒细胞性白血病(M3)；前列腺癌；
前列腺肿瘤；直肠肿瘤；直肠癌；肾细胞癌；视网膜母细胞瘤；肉瘤；施耐博格病；小细胞肺癌；小肠癌；小肠肿瘤；软组织肿瘤；脊柱瘤；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌；舌癌；未分化AML(MO)；尿道癌；子宫癌；阴道癌；希佩尔-林道病；外阴癌；肾母细胞瘤；和着色性干皮病。
29.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：高动脉压；动脉硬化；动脉硬化损伤；贝赫切特综合征；血管分叉；心脏肥大；心血管肥厚；心肌病，尤其化疗诱导的心肌病；脑缺血；冠心病；腹主动脉扩张；局灶性脑缺血；全脑缺血；心脏肥大；肾下动脉瘤高血压；缺血；心肌梗死，尤其急性心肌梗死；
心肌炎；再灌注；再狭窄；脉管炎；和韦格纳肉芽肿病。
30.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂用于冠状动脉旁路移植手术(CABG手术)；经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)；和/或支架治疗的补充。
31.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；哮喘；涉及呼吸系统的慢性疾病；慢性阻塞性肺病(COPD)；囊性纤维化；肺疾病；炎性肺疾病；肺炎；肺纤维化；等。
32.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：结肠炎，非典型性结肠炎，化学性结肠炎；胶原性结肠炎，远端结肠炎，改道性结肠炎；爆发性结肠炎，不确定性结肠炎，传染性结肠炎，缺血性结肠炎，淋巴细胞性结肠炎，显微镜下结肠炎，克罗恩病，胃肠炎，先天性巨结肠，炎性消化性疾病；炎性肠病(IBD)，克罗恩病，非慢性或慢性消化性疾病，非慢性或慢性炎性消化性疾病；局限性肠炎和溃疡性结肠炎。
33.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：细菌传染病，病毒传染病，病毒脑炎；病毒诱导的癌症和肿瘤，人免疫缺陷病毒痴呆，脑膜炎，脑膜脑炎，脑脊髓炎和扁桃体炎。
34.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗选自以下的疾病和/或病症：阿斯柯格综合征，对乙酰氨基酚肝毒性；奥尔德异常；斑秃；α-1-抗胰蛋白酶缺乏症；过敏反应；凋亡；凋亡性细胞死亡；非典型溶血尿毒综合征；嗜碱细胞减少；
嗜碱细胞增多；双相性精神障碍；烧伤；细胞剪切应激；白细胞异常色素减退综合征；化疗药物导致的DNA损伤；胆汁郁积；染色体11，部分单体性11q；染色体22，镶嵌性三体；慢性肉芽肿病；肝炎，比如慢性或爆发性肝炎；临床抑郁症；常见变异型低丙球蛋白血症；先天性C3不足；激活诱导的细胞死亡的CTL保护(AICD)；耳聋；抑郁和抑郁症(尤其预防细胞因子-诱导的疾病行为的背景下发生的抑郁症)，德乔治综合征；由有缺陷的凋亡引起的疾病；肝病；脊椎病；子宫疾病；由于暴露于DNA损伤剂和/或电离辐射以及所产生的细胞应激导致的疾病状态和症状；唐氏综合征；迪谢内肌营养不良；外胚层发育不良；子宫内膜异位；嗜酸粒细胞减少；嗜酸粒细胞增多；exocitoxic细胞死亡；胎儿酒精综合征；纤维化；
纤维变性疾病；纤维组织形成；自由基(导致细胞应激)；移植排斥；移植物抗宿主病；脱发；溶血性尿毒综合征；肝毒性；痛觉过敏，比如糖尿病诱导的痛觉过敏；体温过高；低血糖症；甲状腺机能减退；特发性嗜酸粒细胞增多综合征；IgA肾病；婴儿性连锁的丙种球蛋白血症；炎性疼痛；肾下动脉瘤；胰岛再生；胰岛移植；约伯综合征(高lgE)；懒惰白细胞综合征；白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症；脑白质营养不良；白细胞减少症；淋巴细胞性白细胞增多；淋巴细胞减少；淋巴球增多；重性抑郁；躁狂症；躁郁症；马方综合征；肥大细胞增多症；梅-赫异常；II型膜性增生性肾小球性肾炎；单核细胞减少症；单核细胞增多症；
髓过氧化物酶缺乏-良性；肌病；嗜中性白血球减少症；嗜中性白血球增多症；纳泽洛夫综合征；器官移植；氧化应激损伤；佩-休二氏异常；多囊性肾病；透析后综合征；放射综合征；放射治疗；肾病；肾衰竭；从激活诱导的细胞死亡拯救CTL；严重联合免疫缺陷病；移植排斥；移植；三体性；单相抑郁；UV-诱导的损伤；威-奥综合征和伤口愈合。
35.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗颞下颌关节病症。
36.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗粘膜炎。
37.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗口腔炎。
38.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗种植体周围炎。
39.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗口腔扁平苔藓。
40.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗寻常天疱疮。
41.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗牙周炎。
42.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗慢性牙周炎。
43.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗牙髓炎。
44.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗葡萄膜炎，尤其是前葡萄膜炎，中葡萄膜炎和/或后葡萄膜炎。
45.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗干眼综合征。
46.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂在冠状动脉旁路移植手术的情况下施用。
47.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂在经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)的情况下施用。
48.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂在支架放置的情况下施用。
49.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗急性心肌梗死。
50.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗动脉粥样硬化。
51.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗COPD。
52.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗哮喘。
53.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗类风湿性关节炎。
54.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗骨关节炎。
55.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗克罗恩病。
56.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗炎性肠病(IBD)。
57.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗银屑病。
58.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗糖尿病，尤其是1型糖尿病。
59.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗卒中。
60.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗帕金森病。
61.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗阿尔茨海默病。
62.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗系统性红斑狼疮。
63.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗脉管炎，尤其是韦格纳肉芽肿病。
64.根据权利要求1至17任一项应用的JNK抑制剂，其中所述方法用于治疗急性听力丧失。
65.根据在前权利要求中的任一项应用的JNK抑制剂，其中所述JNK抑制剂由SEQ ID NO：172的序列组成。
66.药物组合物，其包含如在权利要求1至15任一项中定义的JNK抑制剂和药学上可接受的载体。

说明书全文

用于治疗各种疾病的新JNK抑制剂分子

[0001] 本发明涉及酶抑制领域，尤其涉及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminalkinase，JNK)的(多)肽抑制剂。具体而言，本发明涉及在治疗各种疾病中应用这些JNK抑
制剂。

[0002] c-Jun氨基末端激酶(JNK)是有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶的应激激活组的成员。这些激酶与控制细胞生长和分化关联，和，更通常地，与细胞对环境刺激的应答关联。
JNK 信号传导通路相应环境应激和通过几类细胞表面受体的参与而被激活。这些受体可以
包括细胞因子受体，蛇根碱受体和受体酪氨酸激酶。在哺乳动物细胞中，JNK已经与生物
过程(比如致癌性转化和介导对环境应激适应的应答)相关联。JNK还已经与调解免疫
应答相关联，所述免疫应答包括免疫细胞的成熟和分化，以及引起由免疫系统鉴别为要破
坏的细胞中的程序性细胞死亡。该独特的性质使JNK信号转导成为对于开展药理学干预
有希望的靶。在一些神经病症中，JNK信号转导尤其与缺血性卒中(ischemic stroke)和
帕金森病相关联，并且与其它在下文进一步提到的疾病关联。此外，显示有丝分裂原活化
蛋白激酶(MAPK)p38α通过对抗JNK-c-Jun-通路负性调控细胞增殖。有丝分裂原活化蛋
白激酶(MAPK)p38α因此似乎在抑制正常和癌症细胞增殖中起作用并且，作为进一步的，
证明JNK参与到癌症疾病中(参见例如Hui等人，Nature Genetics，Vol 39，No.6，June
2007)。还显示，c-Jun N-末端激酶(JNK)参与到由脊神经结扎(SNL)产生的神经病性疼
痛(neuropathic pain)中，其中SNL诱导的缓慢和持久的JNK(尤其JNK1)活化，然而SNL
之后在脊髓小胶质细胞发现p38有丝分裂原活化蛋白激酶活化，其在21天降到接近基线水
平(Zhuang等人，The Journal of Neuroscience，March29，2006，26(13)：3551-3560))。在
2007年(Biochemica et Biophysica Acta，pp.1341-1348)，在综述中，Johnson等人讨论
了c-Jun激酶/应激活化通路，JNK信号转导参与到疾病中(比如参与到海马神经元的兴
奋性毒性中，肝缺血(liver ischemia)，再灌注，神经变性疾病，听力丧失(hearing loss)，耳聋(deafness)，神经管先天缺陷(neural tube birth defects)，癌症，慢性炎性疾病，肥胖(obesity)，糖尿病，尤其是胰岛素抗性糖尿病，并且提出可能需要具有高程度的特异性和没有毒性的选择性JNK抑制剂用于治疗各种疾病。

[0003] 因此，JNK信号转导通路的抑制或中断在与JNK信号转导强烈相关的病症的斗争方面是有希望的途径。然而，到目前为止，仅存在少数JNK信号转导通路的抑制剂。

[0004] 现有技术中已知的JNK信号转导通路的抑制剂包括例如上游激酶抑制剂(例如，CEP-1347)，JNK的小化学抑制剂(SP600125和AS601245)，其例如通过与蛋白激酶的
ATP-结合位点竞争直接影响激酶活性，和JNK及其底物间的相互作用的肽抑制剂(参见
例如Kuan等人，Current Drug Targets-CNS&Neurological Disorders，February2005，
vol.4，no.1，pp.63-67；WO 2007/031280；全部在此通过引用并入)。WO 2007/031280公开了小的可渗透融合肽，所述融合肽包含源自HIV-TAT蛋白的碱性运输序列的所谓TAT转运
序列和IB1的氨基酸抑制性序列。

[0005] WO 2007/031280尤其公开了两条特定序列，L-TAT-IB1(GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD，在本文中SEQ IDNO：196)和D-TAT-IB1(dqsrpvqpﬁnlttprkprpprrrqrrkkrg；在本文中SEQ ID NO：197)，后者为L-TAT-IB1的逆反(retro-inverso)序列。由于源自HIV
TAT的转运序列，这些融合肽被更有效地转运靶细胞，在其中它们仍然有效直到蛋白水解降解。

[0006] 因为不依赖ATP的JNK肽抑制剂通常是更特异的抑制剂，因此，如果谈到抑制JNK，它们往往是第一选择。然而，甚至在WO 2007/031280中公开的肽抑制剂不是对于所有目的都是最佳的。例如，仅由L氨基酸组成的化合物L-TAT-IB1(在本文中SEQ ID NO：196)，快
速地被蛋白水解降解。为了克服这个问题，WO 2007/031280的发明人还建议了包含D氨基
酸的D-TAT-IB1(在本文中SEQ ID NO：197)。为了更精确，D-TAT-IB1呈现L-TAT-IB1的逆
反序列。由立体化学的改变可以导致失去功能的事实使得D-氨基酸的掺入是困难的。可
以使用逆反途径以减少所述风险，因为与将一个或更多个D-氨基酸掺入原序列相比，ii)
而在相反的肽序列中仅使用i)D-氨基酸可以更可能获得对原肽可接受的构象模拟物。在
WO2007/031280的情况中，该途径仍然导致与L-TAT-IB1相比抑制能力的显著降低(参见图
4)。此外，逆反肽对蛋白水解消化非常稳定，结果是受控的消化，例如在时间敏感实验中，几乎是不可能的。

[0007] 已经在本领域中讨论，提议和成功测试了JNK抑制剂作为对于多种疾病状态的治疗。早已在1997年，Dickens等人描述了c-Jun氨基末端激酶抑制剂JIP-1并提议JIP-1
作为用于治疗例如慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukaemia)的治疗方案的候选
化合物，尤其，在Bcr-Abl引起前体B-细胞转变的情况下(Science；1997；277(5326)：
693-696)。

[0008] 在2001，Bonny和同事发表了：JNK的细胞渗透性肽抑制剂证实长期保护胰腺β-细胞免受IL-1β-诱导的凋亡的影响并且因此可以在糖尿病病程中的自身免疫破坏中
保护β-细胞(Diabetes，50，2001，p.77-82)。

[0009] Bonny等人(Reviews in Neurosciences，2005，p.57-67)还讨论了兴奋毒性，神经元细胞死亡，缺氧(hypoxia)，缺血(ischemia)，外伤性脑损伤，癫痫(epilepsy)，神经变性疾病，神经元和内耳感官听觉细胞的凋亡等情况下JNK抑制剂D-JNKI-1及其它JNK抑制
剂的抑制性作用。

[0010] 在WO 98/49188中，提议源自JIP-1的JNK信号转导抑制剂用于治疗神经变性疾病(比如帕金森病(Parkinson′s disease)或阿尔茨海默病(Alzheimer′s
disease))；卒中(stroke)和相关记忆丧失，自身免疫疾病(比如关节炎)；其它由炎症
表征的疾病；恶性肿瘤，比如白血病(leukemias)(例如慢性髓细胞性白血病(chronic
myelogenous leukemia)(CML)；对器官(比如肝和肾)的氧化性损伤；心脏疾病；和移植排
斥(transplant rejections)。

[0011] Borsello等人(Nat Med，2003，(9)，p.1180-1186)发表了：c-Jun-N-末端激酶的肽抑制剂保护免受兴奋毒性和脑缺血(cerebral ischemia)。

[0012] Assi等人已经发表：另一种特异JNK-抑制剂，SP600125，在急性小鼠结肠炎(acute murine colitis)中靶向肿瘤坏死因子-α产生和上皮细胞凋亡。作者得出结
论：抑制JNK在人炎性肠病(human inflammatory bowel disease)治疗中是有价值的
(Immunology；2006，118(1)：112-121)。

[0013] 在Kennedy等人(Cell Cycle，2003，2(3)，p.199-201)中，详细讨论了JNK信号转导在肿瘤发生中的作用。

[0014] Lee Yong Hee等人(J Biol Chem2003，278(5)，P.2896-2902)显示c-Jun N-末端激酶(JNK)介导胰岛素信号转导级联的反馈抑制并且提议抑制JNK信号转导是在糖尿病
患者中减少胰岛素抗性的良好治疗方法。

[0015] Milano等人(Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007；192(4)：H1828-H1835)发现：c-Jun NH2-末端激酶的肽抑制剂体内减少心肌缺血-再灌注损伤(myocardial
ischemia-reperfusion injury)和梗死面积。所述研究的作者使用肽抑制剂，D-JNKI-I，
包含胰岛-脑-1/JNK-相互作用蛋白-1的最小JNK-结合结构域的20个氨基酸的序列的
两结构域肽，所述两结构域肽连接于人免疫缺陷病毒TAT蛋白的介导细胞内迁移的10个氨
基酸的TAT序列。作者得出结论：由于所述抑制剂的存在导致的JNK活性和磷酸化的降低
在保护缺血(ischemia)和凋亡阶段的大鼠中的心脏功能方面是重要的。

[0016] 另外的组发表了：JNKs的小肽抑制剂通过抑制JNK-信号转导通路保护免受MPTP-诱导的黑质多巴胺能损伤(nigral dopaminergic injury)(Pan等人，Laboratory
investigation，2010，90，156-167)。作者得出结论：融合于TAT肽的包含小鼠JIP-1的残基153-163的肽提供通过抑制JNK-信号转导通路针对MPTP损伤的神经保护作用并且提供
对帕金森病(Parkinson′s disease)的治疗方法。

[0017] 对于听力损伤，Pirvola等人(The Journal of Neuroscience，2000，20(1)；43-50)描述了通过CEP-1347/KT7515(c-Jun-N-末端激酶活化的抑制剂)营救听力，听毛
细胞和神经元。作者大体建议在JNK信号转导级联中的治疗干预可以提供机会以治疗内
耳损伤。还例如在WO 03/103698中公开了通过施用JNK-抑制性肽的方法治疗听力丧失
(hearing loss)。

[0018] 尤其对于视网膜疾病和老年性黄斑变性，Roduit等人(凋亡，2008，13(3)，p.343-353)同样已经建议使用JNK-抑制作为治疗方法。依赖于JNK-抑制的类似考虑
也例如在WO 2010/113753中被公开，用于治疗老年性黄斑变性(age-related macular
degeneration)，糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema)，糖尿病性视网膜病变
(diabetic retinopathy)，中心渗出性脉络膜视网膜病变(central exudative chorio
retinopathy)，血管样条纹症(angioid streaks)，视网膜色素上皮脱离(retinal pigment epithelium detachment)，多灶性脉络膜炎(multifocal choroiditis)，新生血管性黄
斑病变(neovascular maculopathy)，早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)，
色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)，莱伯病(Leber′s disease)，视网膜动脉
闭塞(retinal artery occlusion)，视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusion)，中
心浆液性脉络膜视网膜病变(central serous chorio retinopathy)，视网膜巨动脉瘤
(retinal macroaneurysm)，视网膜脱离(retinal detachment)，增生性玻璃体视网膜
病变(proliferative vitreo retinopathy)，施塔加特病(Stargardt′s disease)，
脉络膜硬化(choroidal sclerosis)，无脉络膜(chorioderemia)，卵黄状黄斑营养不良
(vitelliform macular dystrophy)，小口病(Oguchi′s disease)，白点状眼底(fundus
albipunctatus)，白点状视网膜炎(retinitis punctata albescens)，和脉络膜视网膜环
状萎缩(gyrate atrophy of choroid and retina)。

[0019] Zoukhri等人(Journal of Neurochemistry，2006，96，126-135)鉴定了：c-Jun NH2-末端激酶介导白细胞介素-1β-诱导的泪腺分泌抑制。它们得出结论：JNK在IL-1β-介导的泪腺分泌抑制和随后的干眼中发挥关键作用。

[0020] 对于葡萄膜炎(uveitis)，Touchard等人(Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(9)；4683-4693)已经建议使用D-JNKI 1作为有效的治疗。

[0021] 对于IBD(炎性肠病(inflammatory bowel disease))，Roy等人(World JGastroenterol 2008，14(2)，200-202)已经强调JNK信号传导通路在其中的作用并且已经
提议使用肽JNK抑制剂用于治疗所述疾病状态。

[0022] Beckham 等人 (J Virol.2007 Jul；81(13)：6984-6992)显示：JNK 抑制剂D-JNKI-1在保护小鼠免受病毒脑炎(viral encephalitis)方面有效，并且因此建议JNK抑
制作为对于病毒脑炎(viral encephalitis)有希望的和新的治疗策略。

[0023] Palin等人(Psychopharmacology(Berl).2008 May；197(4)：629-635)使用同样的JNK抑制剂，D-JNKI-1，并且发现用D-JNKI-1(10ng/mouse)，而不是D-TAT预治疗，显著
抑制由核心TNFα诱导的疾病的所有三个标记体并且建议JNK抑制作为用于治疗在细胞因
子-诱导的疾病行为的背景下发生的重性抑郁症(major depressive disorder)。

[0024] 在WO 2010/151638中，提议通过JNK抑制的方式治疗神经变性疾病脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)。

[0025] 以上段落已经仅基于一些选择的出版物强调JNK抑制剂在治疗各种疾病中的有用性。因此，在本领域中存在对于用于治疗人(和动物)疾病的JNK抑制剂持续的需求。

[0026] 因此，通过本发明要解决的问题是提供进一步的JNK(肽)抑制剂。

[0027] 由发明人通过列于下文和附加的权利要求的主题解决本发明的目的。

[0028] 附图简述

[0029] 以下将给出附图简述。附图意在更详细说明本发明。然而，它们不意在以任何方式限制本发明的主题。

[0030] 图 1：通过体外 AlphaScreen 测定 (Ampliﬁed Luminescence ProximityHomogeneous-Screen Assay)研究的，根据本发明的一些JNK抑制剂的抑制效果的描述。

[0031] 图1A：通过SEQ ID NOs：193，2，3，5，6，和7抑制JNK1。

[0032] 图1B：通过SEQ ID NOs：193，2，3，5，6，和7抑制JNK2。

[0033] 图1C：通过SEQ ID NOs：193，2，3，5，6，和7抑制JNK3。

[0034] 图2：说明根据本发明的一些JNK抑制剂(SEQ ID NOs：193，2，3，5，6，和7)抑制效果的表。给出的是在nM范围内的IC50值，各自的平均值标准误差和进行的实验数量(n)。

[0035] 图3：根据本发明的一些JNK抑制剂的抑制效果的说明，所述抑制剂是JNK抑制性(多)肽序列和转运序列的融合蛋白。通过体外AlphaScreen测定(Ampliﬁed Luminescence Proximity Homogeneous-Screen Assay)的方法确定抑制效果。

[0036] 图3A：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，173，174，175，176，177，178，179，180，181和197抑制JNK1。

[0037] 图3B：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，173，174，175，176，177，178，179，180，181和197抑制JNK2。

[0038] 图3C：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，173，174，175，176，177，178，179，180，181和197抑制JNK3。

[0039] 图3D：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，182，183，184，185，186，187，188，189，190和197抑制JNK1。

[0040] 图3E：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，182，183，184，185，186，187，188，189，190和197抑制JNK2。

[0041] 图3F：通过SEQ ID NOs：194，195，172，200，46，182，183，184，185，186，187，188，189，190和197抑制JNK3。

[0042] 图4：说明根据本发明的一些JNK抑制剂的抑制效果的表，所述抑制剂是JNK抑制性(多)肽序列和转运序列的融合蛋白。给出的是在nM范围内的IC50值，各自的平均值
标准误差(SEM)和进行的实验数量(n)。

[0043] 图5：SEQ ID NOs：172，196和197的JNK抑制剂在50％人血清中的稳定性。SEQID NO：196的JNK抑制剂在6小时内完全降解为氨基酸残基(A)。SEQ ID NO：172的JNK
抑制剂仅14天后完全降解(B)。SEQ ID NO：197的JNK抑制剂稳定至少高达30天(B)。

[0044] 图6：显示使用具有如在SEQ ID NO：30中指示的D-氨基酸/L-氨基酸样式的源自TAT的转运构建体的内化实验。分析的转运序列与SEQ ID NOs：52-94加上SEQ ID NOs：
45，47，46，43和99(图6a)和SEQ ID NOs：100-147(图6b)相应。如可以看到的，具有共
有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)的所有转运蛋白比L-TAT转运蛋白(SEQ ID NO：43)显
示更高的内化能力。在96孔板中将Hela细胞与10mM的各个转运蛋白孵育24小时。随后
用酸性缓冲液(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH3.0)洗涤两次和用PBS洗涤两次。通过加入
RIPA裂解缓冲液破坏细胞。随后通过读每个提取物的荧光强度值(Fusion Alpha plate
reader；PerkinElmer)然后减去背景确定内化的肽的相对量。

[0045] 图7具有SEQ ID NO：172序列的JNK抑制剂阻断THP1-PMA-分化的巨噬细胞中LPS-诱导的细胞因子和趋化因子的释放。图7A：TNF释放(THP1pma 6h 3ng/ml LPS)；图
7B：TNFa释放(THP1pma 6h 10ng/ml LPS)；图7C：IL 6释放(THP1pma 6h 10ng/ml LPS)；
图7D：MCP1释放(THP1pma 6h 3ng/ml LPS)。

[0046] 图8SEQ ID NO：172的JNK抑制剂以比D-TAT-IB1(SEQ ID NO：197)，dTAT(SEQ ID NO：45)和SP600125更高的效力阻断THP1分化的巨噬细胞中LPS-诱导的IL6释放。加入LPS 6h(10ng/ml)。

[0047] 图9SEQ ID NO：172的JNK抑制剂以比D-TAT-IB1(SEQ ID NO：197)，dTAT(SEQ ID NO：45)和SP600125更高的效力阻断THP1分化的巨噬细胞中LPS-诱导的TNFα释放。加入LPS 6h(10ng/ml)。

[0048] 图10 SEQ ID NO：172的JNK 抑制剂以比 D-TAT-IB1(SEQ ID NO：197) 和L-TAT-IB1(SEQ ID NO：196)更高的效力阻断PMA分化的巨噬细胞中LPS-诱导的IL-6释
放。加入LPS6h。

[0049] 图11 SEQ ID NO：172的JNK 抑制剂以比 D-TAT-IB1(SEQ ID NO：197) 和L-TAT-IB1(SEQ ID NO：196)更高的效力阻断PMA分化的巨噬细胞中LPS-诱导的TNFα释
放。

[0050] 图12 SEQ ID NO：172的JNK抑制剂在3ng/ml阻断原代大鼠全血细胞中LPS-诱导的TNFα释放。给出的是对于对照，1μM SEQ ID NO：172，3μM SEQ ID NO：172，和10μM SEQ ID NO：172在不同水平的LPS(ng/ml)的结果。

[0051] 图13 SEQ ID NO：172的JNK抑制剂阻断由原代人T细胞应答PMA/离子霉素的IL2分泌。

[0052] 图14 SEQ ID NO：172的JNK抑制剂阻断由原代人T细胞应答CD3/CD28刺激的IL2分泌。使用的JNK抑制剂由其SEQ ID NO：172和197指示。

[0053] 图15通过SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的原代大鼠淋巴结纯化的T细胞中CD3/CD28-诱导的IL-2释放的剂量依赖的抑制。牺牲对照大鼠并收获淋巴结。进一步纯化T
细胞(使用磁性负筛选)并以200.000细胞/孔置于96孔板中。用抗大鼠CD3和抗大鼠
CD28抗体(2μg/mL)处理细胞。在CD3/CD28处理之前1h向培养物加入SEQ ID NO：172的
JNK抑制剂并且评估处理后24h上清中IL-2的释放。

[0054] 图16原代大鼠淋巴结纯化T细胞中CD3/CD28-诱导的IL-2释放的剂量依赖的抑制：一些JNK抑制剂，即SEQ ID NOs：172，197和SP600125的比较。

[0055] 图17用PMA+离子霉素刺激的大鼠全血中IL-2释放的剂量依赖的抑制。在用PMA+离子霉素刺激前1h以三个不同浓度，即1，3和10μM加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。
加入三个剂量的活化剂(25/500ng/mL，50/750ng/mL和50/1000ng/mL)4h。评估上清中IL-2
的释放。10μM的SEQ ID NO：172的JNK抑制剂确实在三个测试的活化剂浓度下有效减少
PMA-离子霉素-诱导的IL-2释放。

[0056] 图18人全血中JNK抑制和IL-6释放。用LPS(0.02ng/mL)全血刺激4小时之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：172
的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式降低LPS-诱导的IL-6释放。

[0057] 图19人全血中JNK抑制和IL-2释放。在用PMA+离子霉素(25/700ng/mL，50/800ng/ml和50/1000ng/mL)全血刺激4小时之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM
加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式
降低PMA+离子霉素-诱导的IL-2释放。

[0058] 图20人全血中JNK抑制和IFN-γ释放。在用PMA+离子霉素(25/700ng/mL，50/800ng/ml和50/1000ng/mL)全血刺激4小时之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM
加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：172的JN抑制剂的确以剂量依赖的方式
降低PMA+离子霉素-诱导的IFN-γ释放。

[0059] 图21人全血中JNK抑制和TNF-α释放。在用PMA+离子霉素(25/700ng/mL，50/800ng/ml和50/1000ng/mL)全血刺激4小时之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM
加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式
降低PMA+离子霉素-诱导的TNF-α释放。

[0060] 图22人全血中JNK抑制和TNF-α释放。在用PHA-L(5μg/mL)全血刺激3天之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：
172的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式降低PHA-L-诱导的TNF-α释放。

[0061] 图23人全血中JNK抑制和IL-2释放。在用PHA-L(5μg/mL)全血刺激3天之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ ID NO：172
的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式降低PHA-L-诱导的IL-2释放。

[0062] 图24人全血中JNK抑制和TNF-α释放。在用CD3+/-CD28抗体(2μg/mL)全血刺激3天之前1h，以三个不同浓度，即1，3和10μM加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。SEQ
ID NO：172的JNK抑制剂的确以剂量依赖的方式降低CD3/CD28-诱导的TNF-α释放。

[0063] 图25CFA(完全弗氏佐剂)诱导的足肿胀之后，SEQ ID NO：197(10μg/kg)和SEQID NO：172(10μg/kg)的JNK抑制剂的体内抗炎症性质的照片说明。在左后爪诱导足肿胀，右后爪未处理。

[0064] 图26在CFA(完全弗氏佐剂)诱导的足肿胀之后，SEQ ID NO：197(10μg/kg，n＝4)和SEQ ID NO：172(10μg/kg，n＝3)的JNK抑制剂的体内抗炎症性质的图片描述。指
示的是治疗后测量的左后爪周长。

[0065] 图27在CFA(完全弗氏佐剂)诱导的足肿胀之后，SEQ ID NO：197(10μg/kg)和SEQ ID NO：172(10μg/kg)的JNK抑制剂的体内抗炎症性质的图片描述。指示的是CFA诱
导的足肿胀之后一小时测量的体内细胞因子释放。

[0066] 图28在大白鼠中静脉内施用后，施用不同量的根据SEQ ID NO；172的JNK抑制剂的临床评估(内毒素诱导的葡萄膜炎模型)。从左至右：载体，0.015mg/kg(静脉注射)的
SEQ ID NO：172；0.18mg/kg(静脉注射)的SEQ ID NO：172；1.8mg/kg(静脉注射)的SEQ
ID NO：172，2mg/kg(静脉注射)的SEQ ID NO：197和20μg地塞米松(dexamethasone)(通
过结膜下注射于眼施用)。指示的是临床得分(平均值和SEM)。

[0067] 图29在14天的大鼠慢性建立的II型胶原性关节炎(chronic establised typeII collagen arthritis)(RTTC/SOL-1)中每日静脉内施用后SEQ ID NO：172的JNK抑制剂
的响应效果。显示的是从第0天到第14天的体重改变。从左至右：正常轨迹+载体(NaCl)，
疾病对照+载体(NaCl)，5mg/kg(静脉注射)的SEQ ID NO：172；1mg/kg(静脉注射)的SEQ
ID NO：172；0.1mg/kg(静脉注射)的SEQ ID NO：172，0.01mg/kg(静脉注射)的SEQ ID
NO：172，0.05mg/kg(静脉注射)的地塞米松(dexamethasone)。指示的是临床得分(平均
值和SEM)。n＝4/正常组，n＝8/治疗组；*p≤0.05对于疾病对照+载体(NaCl)的单向
ANOVA

[0068] 图30在14天的大鼠慢性建立的II型胶原性关节炎(RTTC/SOL-1)中，每日静脉内施用后SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的响应效果。显示的是随时间的踝直径。n＝4/正
常组，n＝8/治疗组；*p≤0.05对于疾病对照+载体(NaCl)的双向RMANOVA。

[0069] 图31在14天的大鼠慢性建立的II型胶原性关节炎(RTTC/SOL-1)中每日静脉内施用后SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的响应效果。说明的是关于炎症，血管翳，软骨损伤和骨吸收的踝组织病理学得分。治疗组中n＝8.*p≤0.05对于疾病对照+载体(NaCl)的
曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)。

[0070] 图32在14天的大鼠慢性建立的II型胶原性关节炎(RTTC/SOL-1)中每日静脉内施用后SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的响应效果。说明的是关于炎症，血管翳，软骨损伤和骨吸收的膝盖组织病理学得分。在治疗组中n＝8。*p≤0.05对于疾病对照+载体(NaCl)
的曼-惠特尼U检验。

[0071] 图33EIU诱导和在EIU诱导前的不同时间施用根据SEQ ID NO：172(1mg/kg静脉注射)的JNK抑制剂之后24小时通过狭缝灯的临床评分。从左至右：载体(0小时)；EIU
诱导前4周SEQ ID NO：172；EIU诱导前2周SEQ ID NO：172；EIU诱导前1周SEQ ID NO：
172；EIU诱导前48小时SEQ ID NO：172；EIU诱导前24小时SEQ ID NO：172；EIU诱导前
0小时SEQ ID NO：172；EIU诱导前0小时地塞米松(dexamethasone)(2mg/kg静脉注射)。
平均值±SEM。*p＜0.05相对于载体，**p＜0.01相对于载体。

[0072] 图34EIU诱导和在EIU诱导前的不同时间施用根据SEQ ID NO：172(1mg/kg静脉注射)JNK抑制剂之后24小时定量的每个切片的PMN细胞数量。从左至右：载体(0小时)；
EIU诱导前4周SEQ ID NO：172；EIU诱导前2周SEQ ID NO：172；EIU诱导前1周SEQ ID
NO：172；EIU诱导前48小时SEQ ID NO：172；EIU诱导前24小时SEQ ID NO：172；EIU诱
导前0小时SEQ ID NO：172；EIU诱导前0小时地塞米松(dexamethasone)(2mg/kg静脉注
射)。平均值±SEM。*p＜0.05相对于载体，**p＜0.01相对于载体。

[0073] 图35显示对于具有东莨菪碱诱导的干眼综合征(dry eye syndrome)的动物的计算的TBUT AUC平均值。显示的是对于用载体，3个不同浓度的序列SEQ ID NO：197的
完全-D-逆反JNK-抑制剂(多)肽，3个不同浓度的序列SEQ ID NO：172的JNK-抑制剂
(多)肽处理的动物的结果，和对于用环孢菌素处理的动物的结果。

[0074] 图36显示对于具有东莨菪碱诱导的干眼的动物(第7-21天)的计算的平均PRTTAUC。显示的是对于用载体，3个不同浓度的序列SEQ ID NO：197的完全-D-逆反JNK-抑
制剂(多)肽，3个不同浓度的序列SEQ ID NO：172的JNK-抑制剂(多)肽处理的动物的
结果，和对于用环孢菌素处理的动物的结果。

[0075] 图37显示对于具有东莨菪碱诱导的干眼综合征(dry eye syndrome)的动物的平均组织学角膜损伤得分(Cornea Lesion Scores)。显示的是对于用载体，3个不同浓度的
序列SEQ ID NO：197的完全-D-逆反JNK-抑制剂(多)肽，3个不同浓度的序列SEQ ID
NO：172的JNK-抑制剂(多)肽处理的动物的结果，和对于用环孢菌素处理的动物的结果。

[0076] JNK抑制剂

[0077] 第一个方面中，本发明涉及JNK抑制剂，其包含根据以下通式的抑制性(多)肽序列：

[0078] X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8(SEQ ID NO：1)，

[0079] 其中X1是选自氨基酸的氨基酸R，P，Q和r，

[0080] 其中X2是选自氨基酸的氨基酸R，P，G和r，

[0081] 其中X3是选自氨基酸的氨基酸K，R，k和r，

[0082] 其中X4是选自氨基酸的氨基酸P和K，

[0083] 其中X5是选自氨基酸的氨基酸T，a，s，q，k或缺失，

[0084] 其中X6是选自氨基酸的氨基酸T，D和A，

[0085] 其中X7是选自氨基酸的氨基酸N，n，r和K；和

[0086] 其中X8是选自F，f和w的氨基酸，

[0087] 条件是：选自由X1，X2，X3，X5，X7和X8组成的组的氨基酸中的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个或六个是D-氨基酸，优选条件是：选自由X3，X5，X7和X8组成的组的氨基酸中的至少一个，至少两个，至少三个或四个是D-氨基酸，

[0088] 所述JNK抑制剂应用于通过治疗处理人或动物体的方法中。

[0089] 根据本发明的JNK抑制剂的抑制性(多)肽序列包含L-氨基酸并且在大多数实施方案中包含D-氨基酸。除非另有具体说明，在本文中L-氨基酸残基以大写字母表示，而D
氨基酸残基以小写字母表示。甘氨酸可以以大写或小写字母表示(因为不存在D-或L-甘
氨酸)。在本文中公开的氨基酸序列总是从N-至C-末端(左至右)给出，除非另有具体
说明。给定的氨基酸序列可以是在C-和/或N-末端修饰或未修饰的，例如在C-末端乙酰
化和/或在N-末端用半胱胺酰胺化或修饰。为了清楚，此种在本文中公开的氨基酸序列的
C-和/或N-末端可能的但完全任选的修饰为了清楚未具体指出。

[0090] 本发明的JNK抑制剂是c-Jun N-末端激酶(JNK)的(多)肽抑制剂。所述抑制剂抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)的激酶活性，即阻止或减少JNK底物(比如c-Jun，ATF2
和/或Elk-1)的磷酸化程度。本领域技术人员将理解，如在本文中使用的术语“抑制剂”，不包含不可逆破坏c-Jun N-末端激酶(JNK)分子和/或激酶活性的化合物。此外，如在本
文中使用的术语“抑制JNK活性”，指抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)的激酶活性。

[0091] 此外，如在本文中使用的，JNK抑制剂包含氨基酸聚合物的至少一个功能单元，即(多)肽序列。此外，该至少一个氨基酸的功能聚合物提供对JNK活性的抑制。所述抑制性(多)肽序列的氨基酸单体通常通过肽键彼此连接，但所述肽键或侧链残基的(化学)修饰
可以是可容许的，只要抑制活性(JNK活性的抑制)不完全失去，即产生的化学实体仍然可
算作如在本文中功能限定的JNK抑制剂。术语“(多)肽”不应该理解为限制(多)肽单元
的长度。优选地，本发明的JNK抑制剂的抑制性(多)肽序列少于500，490，480，470，460，
450，440，430，420，410，400，390，380，370，360，350，340，330，320，310，300，290，280，270，
260，250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，95，90，85，
80，75，70，65，60，55，50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，
31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，或少于12个氨基酸长度。优选地，所述抑制性(多)肽序列不具有少于10个氨基酸残基，更优选不少于11氨基
酸残基。

[0092] 此外，本发明的“JNK抑制剂”抑制JNK活性，例如关于抑制人JNK介导的c-Jun底物(SEQ ID NO：198)的磷酸化，呈现IC 50值为：

[0093] a)关于人JNK1的抑制，少于3000nM，更优选少于2000nM，甚至更优选少于1000nM，甚至更优选少于500nM，甚至更优选少于250nM，甚至更优选少于200nM，甚至更优选少于150nM，最优选少于100nM，

[0094] b)关于人JNK2的抑制，少于3000nM，更优选少于2000nM，甚至更优选少于1000nM，甚至更优选少于500nM，甚至更优选少于250nM，甚至更优选少于200nM，甚至更优选少于150nM，最优选少于100nM，和/或

[0095] c)关于人JNK3的抑制，少于3000nM，更优选少于2000nM，甚至更优选少于1000nM，甚至更优选少于500nM，甚至更优选少于250nM，甚至更优选少于200nM，甚至更优选少于150nM，最优选少于100nM。

[0096] 对于一些应用，优选所述抑制剂抑制根据上文定义的人JNK2和/或人JNK3，但不抑制根据上文定义的JNK1。

[0097] 可以由本领域技术人员容易评估JNK活性是否被抑制或未被抑制。本领域中已知一些方法。一个实例是放射性激酶测定或非放射性激酶测定(例如Alpha screen测试；参
见例如Guenat等人J Biomol Screen，2006；11：第1015-1026页)。

[0098] 因此根据本发明的JNK抑制剂可以例如包含根据SEQ ID NOs：2至27中的任一个的抑制性(多)肽序列(参见表1)。

[0099]

[0100] 根据本发明的JNK抑制剂还可以是包含与选自SEQ ID NOs：1-27的序列，尤其与SEQ ID NO：8共享至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％序列同一性的抑制性(多)肽序列的JNK抑制剂(变体)，

[0101] 条件是：就各个选自SEQ ID NOs：1-27的序列而言，此种共享序列同一性的抑制性(多)肽序列

[0102] a)维持位置4上的L-精氨酸(R)残基，

[0103] b)维持在位置8和10(就SEQ ID NOs：25-27而言的位置7和9)处的两个L-亮氨酸(L)残基，

[0104] c)在与选自由SEQ ID NO：1的X1，X2，X3，X5，X7和X8和SEQ ID NOs：2-27中各个位置组成的组的氨基酸相应的各个位置呈现一个，两个，三个，四个，五个或六个D-氨基酸，更优选地，在与选自由SEQ ID NO：1的X1，X2，X3，X5，X7和X8和SEQ ID NOs：2-27中各个位置组成的组的氨基酸相应的各个位置呈现一个，两个，三个，四个D-氨基酸，和

[0105] d)仍然抑制JNK活性(即是如本文中定义的JNK抑制剂)。

[0106] 当然，在本文中公开的变体(尤其包含与选自SEQ ID NOs：1-27序列共享-在上文定义的范围内-一定程度的序列同一性的抑制性(多)肽序列的JNK抑制剂变体)，优选
与各自的参考序列共享少于100％序列同一性。

[0107] 鉴于所述定义和为了清楚，在表1中强调了包含SEQ ID NOs：1-27(参见上文定义中的a)和b))的JNK抑制剂的变体中不可改变的残基。

[0108] 非同一的氨基酸优选为保守氨基酸置换的结果。

[0109] 如在本文中使用的保守氨基酸置换，可以包括具有基本上相似的物理化学性质的组内的氨基酸残基，以便所述组的成员之间的置换将保持分子的生物活性(参见例如
Grantham，R.(1974)，Science 185，862-864)。尤其，保守氨基酸置换优选为其中氨基酸源自相同类的氨基酸(例如碱性氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，具有脂肪族侧链的氨基酸，具有带正或负电荷侧链的氨基酸，侧链中具有芳香基团的氨基酸，其侧链可以进入氢桥的氨基酸(例如具有羟基功能的侧链，等)的置换。在目前的情况下，保守置换为例如用另
一个碱性氨基酸残基(Lys，Arg，His)置换一个碱性氨基酸残基(Lys，Arg，His)，用另一个脂肪族氨基酸残基置换一个脂肪族氨基酸残基(Gly，Ala，Val，Leu，Ile)，用另一个芳香氨基酸残基置换一个芳香氨基酸残基(Phe，Tyr，Trp)，用丝氨酸置换苏氨酸或用异亮氨酸置换亮氨酸。对于本领域技术人员，进一步的保守氨基酸交换将是已知的。异构体形式应该
优选为维持的，例如K优选置换为R或H，而k优选置换为r和h。

[0110] 在上文定义内，对于JNK抑制剂变体的进一步可能的置换是例如如果：

[0111] a)SEQ ID NO：1的X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7和/或X8或各个选自SEQ ID NOs：2-27的序列内的相应位置的一个，两个或更多个置换为A或a，

[0112] b)SEQ ID NO：1的X1或X8或各个选自SEQ ID NOs：2-27的序列内的相应位置缺失；

[0113] c)SEQ ID NO：1的X5或各个选自SEQ ID NOs：2-27的序列内的相应位置是E，Y，L，V，F或K；

[0114] d)SEQ ID NO：1的X5或各个选自SEQ ID NOs：2-27的序列内的相应位置是E，L，V，F或K；或

[0115] e)SEQ ID NO：1的X1，X2，X3或各个选自SEQ ID NOs：2-27的序列内的相应位置的一个，两个或三个是天然氨基酸。

[0116] 如在本文中使用的，术语″％序列同一性″，必须如以下理解：比对要比较的两条序列以给出序列间的最大相关性。这可以包括在一条或两条序列中插入″缺口″，以增强比对的程度。随后可以对每个被比较的序列的全长确定A％同一性(所谓的总体比对)(其
尤其适于具有相同或相似长度的序列)，或确定较短的、限定长度的序列的A％同一性(所
谓的局部比对)(这更适于不等长的序列)。在上文中，与查询氨基酸序列具有至少，例如，
95％的“序列同一性”的氨基酸序列，除了被研究(subject)氨基酸序列可以包括每100个
查询氨基酸序列的氨基酸中多达五个氨基酸的改变之外，被研究氨基酸序列的序列与查询
序列是相同的。换句话说，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸
序列，被研究序列中至多5％(100个中的5个)氨基酸残基可以用另一个氨基酸插入或替
代或缺失。为了确定序列同一性，将L-氨基酸置换为D-氨基酸(并且反之亦然)被认为
获得非同一的残基，即使其仅是相同氨基酸的D-(或L-异构体)。

[0117] 比较两条或更多条序列的同一性和同源性的方法在本领域中公知。可以例如通过使用数学算法确定两条序列同一到的百分数。优选的，但不限制的可以使用的数学算法实
例是Karlin等人(1993)，PNAS USA，90：5873-5877的算法。此种算法整合入BLAST程序家
族，例如BLAST或NBLAST程序(还参见Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215，403-410或
Altschul等人(1997)，Nucleic Acids Res，25：3389-3402)(通过万维网址ncbi.nlm.nih.gov NCBI的主页可访问)和FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A85，2444-2448.)。可以通过这些程序鉴定与其它序列同一到某种程度的序列。此外，在Wisconsin序列分析包，版本9.1中可用的程序
(Devereux等人，1984，Nucleic Acids Res.12，387-395.)，例如程序BESTFIT和GAP，可以用于确定两条多肽之间的％同一性和两条多肽序列之间的％同一性和％同源性。BESTFIT
使用(Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的″局部同源性″算法并且
发现两条序列之间相似性最好的单个区域。

[0118] 当然，只要未失去如本文中定义的抑制JNK活性的能力，根据本发明的JNK抑制剂可以包含-除了上文提及的抑制性(多)肽序列-另外的序列，结构域，标记(例如荧光或
放射性标记)，表位等。例如，根据本发明的JNK抑制剂还可以包含转运序列。如在本文中
使用的“转运序列”，是使得其连接的分子跨生物膜迁移的(多)肽序列。因此，根据本发明的包含转运序列的JNK抑制剂优选能够跨生物膜迁移。从而，本发明的此种JNK抑制剂可
以更容易地进入细胞，细胞亚区室和/或进入细胞核。

[0119] 所述转运序列可以例如(例如直接)在N-末端或(例如直接)在C-末端连接于JNK抑制剂的抑制性(多)肽序列。所述转运序列和抑制性(多)肽序列还可以分隔开，
例如可以由中间序列分开。还考虑所述转运序列可以完全位于JNK抑制剂分子的除抑制性
(多)肽序列外的别处，尤其是如果JNK抑制剂是更复杂的分子(例如包含一些结构域，是
多体(multimeric)缀合物等)。还考虑只要维持JNK抑制活性，转运序列和抑制性(多)
肽序列可以重叠。此种重叠的实例在下文进一步给出。

[0120] 用于与本发明的JNK抑制剂使用的转运序列可以选自，而不限于此，源自HIV TAT(HIV)的转运序列，例如天然蛋白，比如(例如TAT蛋白(例如如在美国专
利5,804,604和5,674,980描述的，这些参考文献中的每个通过引用并入本文)，HSV
VP22(单纯疱疹(Herpes simplex))(在例如WO97/05265；Elliott和O′Hare，Cell 88：
223-233(1997)中描述的)，非病毒蛋白(Jackson et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
10691-10695(1992)))，源自触角足(Antennapedia)，尤其源自果蝇触角足(Drosophila
antennapedia)(例如其触角足载体序列)的，FGF，乳铁蛋白，等的转运序列或源自碱性肽
的转运序列，所述肽为例如具有5至15个氨基酸长度，优选10至12氨基酸和包含至少
80％，更优选85％或甚至90％碱性氨基酸(比如例如精氨酸，赖氨酸和/或组氨酸)的肽，
或可以选自例如源自VP22，源自PTD-4蛋白或肽，源自RGD-K16，源自PEPT1/2或PEPT1/2蛋
白或肽，源自SynB3或SynB3蛋白或肽，源自PC抑制剂，源自P21衍生的蛋白或肽，或源自
JNKI蛋白或肽的富精氨酸肽序列(比如RRRRRRRRR(R9；SEQ ID NO：152)，RRRRRRRR(R8；SEQ ID NO：153)，RRRRRRR(R7；SEQ ID NO：154)，RRRRRR(R6，SEQ ID NO：155)，RRRRR(R5，SEQ ID NO：156)等。

[0121] 用于在本发明JNK抑制剂中使用的转运序列的实例尤其是(而不限于此)源自HIV-1TAT蛋白的碱性转运序列。优选地，HIV-1 TAT蛋白的碱性转运序列可以包括序列源
自人免疫缺陷病毒HIV-1 TAT蛋白(例如如在例如，美国专利5,804,604和5,674,980中描
述的，各自通过引用并入本文)。在这种情况下，全长HIV-1 TAT蛋白具有由HIV TAT基因
的两个外显子编码的86个氨基酸残基。TAT氨基酸1-72由外显子1编码，而氨基酸73-86
由外显子2编码。全长TAT蛋白由包含两个赖氨酸和六个精氨酸(氨基酸49-57)的碱性区
域和包含七个半胱氨酸残基(氨基酸22-37)的富半胱氨酸区域表征。碱性区域(即，氨基
酸49-57)被认为对于核定位是重要的。Ruben，S.等人，J.Virol.63：1-8(1989)；Hauber，J.等人，J.Virol.631181-1187(1989)。富半胱氨酸区域介导体外金属连接的二聚体的
形成(Frankel，A.D.等人，Science 240：70-73(1988)；Frankel，A.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：6297-6300(1988))并且对于其作为反式激活因子的活性是至关重要的
(Garcia，J.A.等人，EMBO J.7：3143(1988)；Sadaie，M.R.等人，J.Virol.63：1(1989))。
如在其它调控蛋白中，N-末端区域可以参与到保护免受胞内蛋白酶的作用中(Bachmair，
A.等人，Cell 56：1019-1032(1989))。用于本发明的JNK抑制剂的优选的TAT转运序列优
选由TAT碱性区域氨基酸序列(天然存在的TAT蛋白的氨基酸49-57)的存在；TAT富半胱
氨酸区域氨基酸序列(天然存在的TAT蛋白的氨基酸22-36)的缺失和编码TAT外显子2
的羧基末端结构域(天然存在的TAT蛋白的氨基酸73-86)的缺失表征。更优选地，本发明
的JNK抑制剂中的转运序列可以选自包含TAT残基48-57或49至57或其变体的氨基酸序
列。

[0122] 优选的，本发明的给定的JNK抑制剂中的转运序列还呈现D-氨基酸，例如以改善针对蛋白酶的稳定性。尤其优选的是呈现交替的D-和L-氨基酸的特定顺序的转运序列。
此种交替的D-和L-氨基酸顺序(基序)可以遵循-而不限于此-SEQ ID NOs：28-30中任
一个的样式：

[0123] dlLLLxdmLLLydn (SEQ ID NO：28)；

[0124] dLLLd(LLLd)a (SEQ ID NO：29)；和/或

[0125] dLLLdLLLd(SEQ ID NO：30)；

[0126] 其中：d 是D-氨基酸；

[0127] L 是L-氨基酸；

[0128] a 是0-3，优选0-2，更优选0，1，2或3，甚至更优选0，1，或2和最优选1；

[0129] l，m和n 彼此独立地是1或2，优选1；

[0130] x和y 彼此独立地是0，1或2，优选1。

[0131] 当合成转运序列时，所述D-和L-氨基酸(基序)的顺序成为有相关性的，即在氨基酸序列(即侧链残基的类型)保持不变时，各自的异构体改变。例如，源自HIV TAT的已
知的转运序列是RKKRRQRRR(SEQ ID NO：43)。在SEQ ID NO：30其中应用D-/L氨基酸顺序
将获得rKKRrQRRr(SEQ ID NO：46)。

[0132] 在一个特定的实施方案中，本发明的JNK抑制剂的转运序列可以包含根据rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)的至少一条序列，其中：

[0133] r 表示D-对映体精氨酸；

[0134] X 是任何L-氨基酸(包括甘氨酸)；

[0135] 并且其中各个X可以分别和独立地选为SEQ ID NO：31内的任何其它X。优选SEQID NO：31内的所述6XL-氨基酸中的至少4个是K或R。在另一个实施方案中，根据本发明
的JNK抑制剂包含转运序列rX1X2X3rX4XsX6r(SEQ ID NO：32)，其中X1是K，X2是K，X3是R和X4，X5，和X6是彼此独立选择的任何L-氨基酸(包括甘氨酸)。类似的，根据本发明的JNK
抑制剂转运序列可以包含序列rX1X2X3rX4XsX6r(SEQ ID NO：33)，其中X4是Q，X5是R，X6是R和X1，X2，和X3是彼此独立选择的任何L-氨基酸(包括甘氨酸)。发明的JNK抑制剂还可
以包含序列rX1X2X3rX4XsX6r(SEQ ID NO：34)，其中一个，两个，三个，四个，五个或六个X氨基酸残基选自由以下各项组成的组：X1是K，X2是K，X3是R，X4是Q，X5是R，X6是R，同时不选自以上组的剩余的X氨基酸残基可以是任何L-氨基酸(包括甘氨酸)并且彼此独立选择。
那么，X1是优选Y和/或X4是优选K或R。

[0136] 用于发明的JNK抑制剂分子的转运序列的实例可以选自(而不限于此)如在下文表2中给出的序列，(SEQ ID NOs：31-170)或选自任何其片段或变体或化学修饰的衍生物
(优选其保留跨生物膜迁移的功能)。

[0137]

[0138]

[0139]

[0140]

[0141]

[0142] 如上文提到的，转运序列还可以选自上文表2的序列的片段或变体(条件是：此种片段或变体优选保留提供跨生物膜迁移的功能)。在该特定的情况下，那些转运序列的变
体和/或片段优选包含与如在表2中限定的此种转运序列的全长序列共享至少10％，至少
20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少85％，优选至少90％，更优选至少95％和最优选至少99％序列同一性的肽序列。在该特定的情况下，如
在表2中限定的此种转运序列的“片段”，优选理解为其截短的序列，即与原序列的氨基酸序列相比在N-末端，在C-末端和/或在序列内截短的氨基酸序列。

[0143] 此外，如上文定义的转运序列的“变体”或其片段，优选理解为其中变体的氨基酸序列不同于在一个或更多突变体(比如一个或更多个置换的，(或，如果需要，插入的和/或缺失的)氨基酸)原转运序列或如本文中定义的其片段的序列。优选地，如上文定义的
此种转运序列的变体与相应的原序列相比具有相同的生物功能或特定活性，即提供转运，
例如入细胞或细胞核。在这种情况下，如上文定义的此种转运序列的变体可以例如包含约
1至50，1至20，更优选1至10和最优选1至5，4，3，2或1个氨基酸改变。如上文定义的
此种转运序列的变体可以优选包含保守氨基酸置换。保守氨基酸置换的概念是本领域已知
的并且已经在上文对JNK抑制性(多)肽序列列出并且因此应用于此。

[0144] 并入本发明的JNK抑制剂中的转运序列的长度可以不同。考虑了在一些实施方案中，根据本发明的JNK抑制剂的转运序列长度少于150，少于140，少于130，少于120，少于
110，少于100，少于90，少于80，少于70，少于60，少于50，少于40，少于30，少于20，和/或少于10个氨基酸。

[0145] 本领域技术人员可以容易地确定特定转运序列在根据本发明的JNK抑制剂的情况下是否仍然行使功能。例如，包含转运结构域的JNK抑制剂可以融合于在细胞中可以容
易被检测的标记(例如荧光蛋白比如GFP，放射性标记，酶，荧光团，表位等)。然后，将包含转运序列和所述标记的JNK抑制剂转染入细胞或加入培养上清，并且可以通过使用生物物
理和生物化学标准方法(例如流氏细胞术，(免疫)荧光显微镜等)监控细胞膜的透过。

[0146] 包含转运序列的根据本发明的JNK抑制剂的特定实例在表3中给出：

[0147]

[0148] 如上文提到的，在本发明的一个特定的实施方案中，转运序列和抑制性(多)肽序列可以重叠。换句话说，转运序列的N-末端可以与抑制性(多)肽序列的C-末端重叠或
转运序列的C-末端可以与抑制性(多)肽序列的N-末端重叠。后一实施方案是尤其优选
的。优选地，转运序列通过一个，两个或三个氨基酸残基与抑制性(多)肽序列重叠。在
此种情况下，给定的转运序列可以与SEQ ID NO：1或其相应的变体在位置1(X1)，位置1和
2(X1，X2)，位置1，2和3(X1，X2，X3)重叠。

[0149] SEQ ID NOs：174，175，178，179，180，181，182，183，184，188，189和190 是对于根据本发明的JNK抑制剂的好的实例，其中转运序列和抑制性(多)肽序列重叠，例如rKKRrQRRrRPTTLNLf(SEQ ID NO：174)是SEQ ID NO：46(下划线的)和SEQ ID NO：11(斜
体的)的重叠。

[0150] 当然根据本发明的JNK抑制剂还可以选自是根据SEQ ID NOs：171-190的JNK抑制剂中任一个的变体的JNK抑制剂。优选地，此种变体与SEQ ID NOs：171-190的序列，尤
其与SEQ ID NO：172共享至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性，

[0151] 条件是：就所述SEQ ID NOs：171-190的序列内的抑制性(多)肽序列而言(参见参考SEQ ID NO：1的抑制性(多)肽序列和SEQ ID NOs：2-27的特定实例))，此种共享序
列同一性的序列

[0152] a)维持抑制性(多)肽序列内位置4上的L-精氨酸(R)残基，

[0153] b)维持抑制性(多)肽序列内位置8和10(就SEQ ID NOs：25-27而言的位置7和9)处的两个L-亮氨酸(L)残基，

[0154] c)在对应于选自由SEQ ID NO：1的X1，X2，X3，X5，X7和或X8组成的组和SEQ ID NOs：2-27中的相应位置的氨基酸的相应位置呈现至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个或六个D-氨基酸，更优选在对应于选自由SEQ ID NO：1的X3，X5，X7和X8组成的组和SEQ ID NOs：2-27中的相应位置的氨基酸的位置呈现至少一个，至少两个，至少三个或四个D-氨基酸，和

[0155] d)仍然抑制JNK活性(即是如本文中定义的JNK抑制剂)。

[0156] 鉴于所述定义和为了清楚，在表3中下划线包含SEQ ID NOs：171-190的JNK抑制剂的变体(参见以上定义中的a)和b))中不可改变的残基。

[0157] 包含SEQ ID NOs：171-190的JNK抑制剂的变体中非同一的氨基酸优选为保守氨基酸置换的结果(参见上文)。当然，也考虑上文提到的进一步可能置换用于包含SEQ ID
NOs：171-190的JNK抑制剂的变体。同样地，本发明当然还考虑衍生自不在或不仅在抑制
性(多)肽序列中，而在转运序列中呈现变体残基的原序列的根据SEQ ID NOs：171-190的
JNK抑制剂中任一个的变体。对于转运序列的变体和片段，尤其参见上文各自公开的内容。

[0158] 如之前提到的，根据本发明的JNK抑制剂的转运序列和JNK抑制性(多)-肽序列需要不必需直接彼此连接。它们还可以例如通过中间(多)肽序列间隔开。优选的分开抑
制性(多)肽序列及其它(功能)序列(比如转运序列)的中间序列由长度少于10个氨
基酸的短肽序列(如六聚体，五聚体，四聚体，三肽或甚至仅二肽或单个氨基酸残基)构成。
尤其优选的中间序列是一个，两个或更多个拷贝的二-脯氨酸，二-甘氨酸，二-精氨酸和
/或二-赖氨酸，或者全部仅以L-氨基酸的形式，或仅以D-氨基酸的形式，或具有混合的
D-和L-氨基酸。当然，也可以使用其它已知的肽间隔序列。

[0159] 尤其优选的根据本发明的JNK抑制剂包含SEQ ID NO：8(或与SEQ ID NO：8以上文进一步限定的范围和限制共享序列同一性的序列)和转运序列。所述转运序列优选选
自如本文中定义的SEQ ID Nos：31-170的任一个或其变体，甚至更优选选自SEQ ID NOs：
31-34和46-151中的任一个。根据本发明的JNK抑制剂的一个尤其优选的实施方案是包含
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：46(或以上文进一步限定的范围和限制共享其各自的序列同一
性的序列)的JNK抑制剂。优选的实例是包含SEQ ID NO：172的序列或在如本文中定义的
转运序列和/或抑制性(多)肽序列中不同的其各自的变体JNK抑制剂。

[0160] 在一个进一步的方面，本发明涉及JNK抑制剂，所述JNK抑制剂包含

[0161] a)抑制性(多)肽，其包含源自由RPTTLNLF(SEQ ID NO：191)，KRPTTLNLF(SEQ ID NO：192)，RRPTTLNLF和/或RPKRPTTLNLF(SEQ ID NO：193)组成的组的序列的序列，和

[0162] b)转运序列，优选选自表2中公开的转运序列或其变体/片段的转运序列，甚至更优选选自SEQ ID NOs：31-34和46-151或其各自的变体或片段的转运序列。

[0163] 所述转运序列和所述抑制性(多)肽序列可以重叠。对于本发明的所述实施方案的优选的转运序列尤其是SEQ ID NO：46的转运序列，优选连接(例如直接)于抑制性
(多)肽序列的N-末端。

[0164] 本发明的JNK抑制剂还可以是包含序列GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD(SEQ IDNO：194)，或序列GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD(SEQ ID NO：195)或由序列GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD(SEQ ID NO：194)，或序列GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD(SEQ ID NO：195)组成的JNK抑制剂。

[0165] 在一个进一步的方面，本发明涉及包含选自由rKKRrQRr(SEQ ID NO：148)，rKKRrQRrK(SEQ ID NO：149)，和/或rKKRrQRrR(SEQ ID NO：150)组成的序列组的转运序列的(多)肽。

[0166] 如在本文中使用的，包含某序列或某SEQ ID NO：通常暗示例如在JNK抑制剂分子中存在所述序列的(至少)一个拷贝。例如，一条抑制性(多)肽序列将通常满足获得足
够的活性的抑制。然而，发明人当然考虑了还可以使用各个序列的两个或更多个拷贝(例
如不同或相同类型的抑制性(多)肽序列的两个或更多个拷贝和/或不同或相同类型的转
运序列的两个或更多个拷贝)，只要产生的分子抑制JNK活性的总体能力不被废除(即各个
分子仍然是如本文中定义的JNK抑制剂)。

[0167] 可以由本领域公知的方法，例如由使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略通过固相肽合成的化学合成(即通过脱保护和Fmoc-氨基酸偶联循环的连续循环)获得
或生产发明的JNK抑制剂。提供此种肽合成的商业服务由很多公司提供，，例如公司
PolyPeptide(Straβbourg，France)。

[0168] 根据本发明使用的JNK抑制剂可以任选地被进一步修饰，尤其在抑制性的(多肽)序列的氨基酸残基处。可能的修饰可以例如选自由以下组成的组：

[0169] (i)放射性标记，即放射性磷酸化或用硫，氢，碳，氮，等放射性标记；

[0170] (ii)有色染料(例如洋地黄毒苷(digoxygenin)，等)；

[0171] (iii)荧光基团(例如荧光素，等)；

[0172] (iv)化学发光基团；

[0173] (v)用于固定在固相上的基团(例如His-标签，生物素，strep-标签，flag-标签，抗体，表位，等)；

[0174] (vi)聚乙二醇化，

[0175] (vii)糖基化，

[0176] (viii)hesylation，

[0177] (ix)蛋白酶切割位点(例如用于JNK抑制剂的可控释放)

[0178] (x)肽骨架修饰(例如(ΨCH2-NH)键)

[0179] (xi)氨基酸侧链残基的保护，

[0180] (xii)N-和/或C-末端的保护(例如N-末端酰胺化或C-末端乙酰化)

[0181] (xiii)在(i)至(xii)下提到的要素的两个或更多个要素的组合。

[0182] 尤其优选的是选自(i)至(xi)的修饰和在(i)至(xi)下提到的要素的两个或更多个要素的组合。在此种情况下，在一个进一步的方面，本发明涉及如在本文中公开的用选自(i)至(xi)的修饰修饰的或用在(i)至(xi)下提到的要素的两个或更多个要素的组合
修饰的JNK抑制剂，和包含此种修饰的JNK抑制剂的药物组合物(参见下文)。

[0183] 药物组合物

[0184] 如根据本发明定义的JNK抑制剂可以配制于药物组合物中，所述药物组合物可以用于预防或治疗任何如本文中定义的疾病。典型地，根据本发明使用的此种药物组合物包
括如本文中定义的活性组分JNK抑制剂，尤其如本文中定义的包含根据SEQ ID NO：1的抑
制性(多)肽序列或由根据SEQ ID NO：1的抑制性(多)肽序列组成的JNK抑制剂。优选
地，活性化合物是包含以下各项或由以下各项组成的JNK抑制剂：根据SEQ ID NOs：2-27中任一个；或，如果连接转运序列，根据SEQ ID NOs：171-190中任一个的抑制性(多)肽序
列。

[0185] 此外，本发明的发明人发现，如本文中定义的JNK-抑制剂，尤其如果融合于转运序列；呈现特别好的进入参与到本发明的疾病中的细胞摄取率。因此，要施用于受试者的药物组合物中JNK-抑制剂的量，可以(而不限于此)具有非常低的剂量。因此，所述剂量可
以远低于对本领域中已知的肽药物(比如DTS-108)的剂量，(Florence Meyer-Losic等人，
Clin Cancer Res.，2008，2145-53)。这具有一些积极的方面，例如潜在的副反应的减少和成本的降低。

[0186] 优选地，所述剂量(每kg体重)在以下范围内：多达约10mmol/kg，优选地多达约1mmol/kg，更优选多达约100μmol/kg，甚至更优选多达约10μmol/kg，甚至更优选多达约
1μmol/kg，甚至更优选多达约100nmol/kg，最优选地多达约50nmol/kg。

[0187] 因此，所述剂量范围可以优选从约1pmol/kg至约1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0,1mmol/kg，从约10pmol/kg至约0,01mmol/kg，从约50pmol/kg至约1μmol/kg，从
约100pmol/kg至约500nmol/kg，从约200pmol/kg至约300nmol/kg，从约300pmol/kg至
约100nmol/kg，从约500pmol/kg至约50nmol/kg，从约750pmol/kg至约30nmol/kg，从约
250pmol/kg至约5nmol/kg，从约1nmol/kg至约10nmol/kg，或所述值的任意两个的组合。

[0188] 在本文中，当使用上文的药物组合物时，治疗的处方，例如剂量等方面的决定典型地在全科医生及其它医生的责任范围内，并且典型地考虑要治疗的疾病，个体患者的病状，递送的部位，施用方法和从业人员已知的其它因素。以上提到的技术和方案的实例可在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第16版，Osol，A.(编辑)，1980中找到。因此，对于根据本发明使用的药物组合物的组分，″安全和有效量″意为足以显著诱导如本文中
定义的与JNK信号转导强烈相关的疾病或病症的积极改变的这些组分中的每个或全部的
量。然而，同时，″安全和有效量″足够小以避免严重的副作用，也就是说允许利益和风险之间合理的关系。这些范围的确定典型地位于合理的医学判断的范围内。此种组分的″安
全和有效量″将随要治疗的特定疾病，并且也随要治疗的患者的年龄和身体条件，疾病的
严重度，治疗的持续时间，伴随治疗、使用的特定药学上可接受的载体性质，和类似因素，在随行医生的知识和经验内而不同。可以根据本发明使用根据本发明的药物组合物，用于人
和也用于兽医的医学目的。

[0189] 除了JNK抑制剂中的一种或更多种之外，根据本发明使用的药物组合物还可以包含，(相容的)药学上可接受的载体，赋形剂，缓冲剂，稳定剂或本领域技术人员公知的其它物质。

[0190] 在本文中，措辞″(相容的)药学上可接受的载体″优选包括组合物的液体或非液体基础。术语″相容的″意为如本文使用的药物组合物的成分能够与如上文定义的药学
活性组分并且与另一个组分以这样的方式混合，以致于在普通使用条件下没有发生将显著
降低组合物的药学有效性的相互作用。当然药学上可接受的载体必须具有充分高的纯度和
充分低的毒性，以使它们适于施用于要被治疗的人。

[0191] 如果以液体形式提供如本文使用的药物组合物，则所述药学上可接受的载体将典型地包含一种或更多种(相容的)药学可接受液体载体。所述组合物可以包含(相容的)
药学可接受液体载体，例如无热源水；等渗盐水或缓冲(含水)溶液(例如磷酸盐，柠檬酸
盐等缓冲溶液，植物油(比如，例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油和源自可可属的油)；多元醇，比如，例如，聚丙二醇，甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；藻酸，等。尤其是对于如本文使用的药物组合物的注射，可以使用缓冲液，优选含水缓冲液。

[0192] 如果以固体形式提供如本文使用的药物组合物，则所述药学上可接受的载体将典型地包含一种或多种(相容的)药学可接受固体载体。所述组合物可以包含(相容的)
药学可接受固体载体，例如也可以使用适于施用于人的一种或多种相容的固体或液体填充
物或稀释剂或包封化合物。此种(相容的)药学可接受固体载体的一些实例是例如糖，比
如，例如，乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，比如，例如，羧甲基纤维素钠，乙基纤维素，乙酸纤维素；粉末的黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固体助流剂，比如，例如，硬脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙，等。

[0193] (相容的)药学上可接受的载体或其它物质的确切种类可以取决于给药途径。(相容的)药学上可接受的载体的选择可以因此原则上通过根据本发明使用的药物组合物施
用的方式来确定。可以例如，全身施用根据本发明使用的药物组合物。给药途径包括，例如，肠胃外途径(例如通过注射)，比如静脉内，肌肉内，皮下，皮内，或经皮途径给药等，肠内途径，比如口服，或直肠途径等，表面途径，比如经鼻，或鼻内途径等，或其它途径，比如表皮途径或贴片递送。还考虑的(尤其对于眼相关疾病)是滴注，玻璃体内，和结膜下施用。同样
地，例如如果治疗耳相关疾病，施用可以在鼓室内发生。

[0194] 要使用的药物组合物的合适的量可以通过使用动物模型的常规实验确定。此种模型包括(不意味着任何限制)兔，绵羊，小鼠，大鼠，狗和非人灵长类模型。优选的用于注射的单位剂量形式包括无菌水溶液，生理盐水或其混合物。应该将此种溶液的pH调节至约
7.4。用于注射的合适的载体包括水凝胶，用于控制或延缓释放的装置，聚乳酸和胶原基质。
用于表面应用的合适的药学上可接受的载体包括适于在乳液，乳霜，凝胶等中使用的那些。
如果化合物要由口服施用，片剂，胶囊等是优选的单位剂量形式。用于制备可以用于口服施用的单位剂量形式的药学上可接受的载体是本领域公知的。其选择将依赖于次要的考虑因
素，比如味道，成本和可储存性，其对本发明的目的不是至关重要的，并且本领域技术人员可以容易地完成。

[0195] 用于口服施用的药物组合物可以是片剂，胶囊，粉末或液体形式。片剂可以包括如上文定义的固体载体，比如明胶，和任选的辅剂。用于口服施用的液体药物组合物通常可以包括如上文定义的液体载体，比如水，石油，动物或植物油，矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液，葡萄糖或其它糖溶液或二醇类比如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。

[0196] 对于静脉内，皮肤或皮下注射，或在患处注射，活性成分将为肠外可接受的水溶液形式，所述水溶液无热原并具有合适的pH，等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如，等渗载体比如氯化钠注射液，林格注射液，乳酸盐林格注射液制备合适的溶液。按需要可以包括防腐剂，稳定剂，缓冲剂，抗氧化剂和/或其它添加剂。不论其是否是多肽，肽，或核酸分子，要给予个体的其它根据本发明的药用化合物优选以″预防有效量”或“治疗有效量”施用(根据具体情况而定)，这足以对个体显示出益处。施用的实际量，和施用
的速率和时程，将依赖于被治疗的疾病的性质和严重度。

[0197] 治疗如本文中定义的疾病典型地包括施用如上文定义的药物组合物。本发明的JNK抑制剂将调节受试者中JNK活性。术语“调节”尤其包括抑制任何上文中的疾病中
c-jun，ATF2或NFAT4的磷酸化，例如，通过使用至少一种包含以下各项或由以下各项组成
的JNK抑制剂：根据SEQ ID NOs：2至27的序列中任一个的抑制性(多)肽序列，可能包
含另外的转运序列，作为细胞中天然c-jun，ATF2和NFAT4结合位点的竞争性抑制剂。术语
“调节”还包括抑制由c-jun，ATF2，或NFAT4及其相关伴侣构成(但不限于此)的转录因子
异源和同源复合体，比如例如由c-jun，AFT2和c-fos构成的AP-1复合体。

[0198] 用上文公开的药物组合物治疗受试者可以典型地通过向受试者施用(体内)(“治疗有效”)量的所述药物组合物完成，其中所述受试者可以是例如人受试者或动物。所述动物优选为非人哺乳动物，例如，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，牛，马或猪。术语“治疗有效”意为药物组合物的活性组分为足够量的以缓解如在本文中讨论的疾病和病症。

[0199] 疾病和病症

[0200] 本发明的主旨是在用于通过治疗处理人或动物体，尤其处理人体的方法中使用上文公开的JNK抑制剂和药物组合物。如上文提到的JNK信号转导参与到大量的多种疾病状
态和病症中，并且对于这些疾病中的很多，已经提议抑制所述信号转导并成功测试。本发明的发明人发现在本文中公开的JNK抑制剂是有效的JNK抑制剂并且因此等同地适于治疗如
在本领域中公开的疾病。

[0201] 如在本文中使用的，通过治疗处理人或动物体，指个体受试者的任何类型的治疗处理。其包括例如预防疾病或症状的发生(预防)，即典型地疾病在患者中表现出之前。术
语还包括“仅仅”治疗给定疾病的症状，即治疗将通过减少疾病相关的症状缓解发病机制，而不是必需消除疾病和症状的深层原因。当然，消除疾病的深层原因也被该术语包括。该
术语还包括推迟或甚至终止个体疾病的进程。

[0202] 在一个实施方案中，可以在可预见的疾病开始之前，例如在计划的手术干预或计划的暴露于紧张刺激之前，例如预防地施用根据本发明的JNK抑制剂。手术干预可以例
如承担各个伤口或相邻组织的炎症的风险(例如眼部手术治疗后的干眼综合征(dry eye
syndrome)，牙移植治疗后的种植体周围炎(peri-implantitis)，移植(transplantation)
后的移植排斥，等)。暴露于紧张刺激(如辐射)可能导致受影响的组织和细胞的凋亡。在
此种情况下，可以例如事先施用根据本发明的JNK抑制剂至少一次直至约4周。可以例如
事先施用JNK抑制剂至少24小时，至少48小时，至少1周，至少2周或4周。

[0203] 要用如在本文中公开的JNK抑制剂治疗的疾病和病症可以是急性的或慢性的。

[0204] 由于JNK信号转导参与到非常多样的病理学状况中，本发明的JNK抑制剂可以例如用于治疗各种器官的疾病，比如眼病，骨疾病，神经疾病，神经元疾病，神经变性疾病，皮肤疾病，免疫和/或自身免疫疾病，眼病，口疾病，炎性疾病，代谢疾病，心血管疾病，增生性疾病(尤其癌症和肿瘤)，耳疾病，肠疾病，呼吸系统疾病(例如肺疾病)，感染性疾病，和各种其它疾病。

[0205] 本发明的JNK抑制剂可以用于例如治疗炎性疾病，包括例如急性炎症以及慢性炎症。本发明的JNK抑制剂可以用于治疗任何类型的组织炎症，例如眼的炎症，口炎症，呼吸系统(尤其包括肺)炎症，皮肤炎症，心血管系统内炎症，脑的炎症，耳中的炎症，等。对于此种延性疾病状态，一些非限制性实例是粘膜炎(mucositis)，口腔炎(stomatitis)，种植体周围炎(peri-implantitis)，视网膜炎(retinitis)，脉络膜炎(chorioiditis)，干燥
性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)，免疫性肠疾病(IBD)，葡萄膜炎(uveitis)
(例如前葡萄膜炎(anterior uveitis)，中葡萄膜炎(intermediate uveitis)，后葡萄
膜炎(posterior uveitis))，牙周炎(periodontitis)，COPD，哮喘(asthma)，牙髓炎
(pulpitis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，
克罗恩病(Crohn′s disease)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，脉管炎
(vasculitis)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)；感染或伤口位点的急性炎症，脑膜炎(meningitis)，脑炎(encephalitis)，肺炎(pneumonia)，咽炎(pharyngitis)，扁桃体炎(tonsillitis)，耳炎(otitis)(包括中耳炎(otitis media))，脉管炎(vasculitis)，
滑膜炎(synovitis)，肠炎(enteritis)，克罗恩病(Crohn′s disease)，溃疡性结肠炎
(ulcerative colitis)，移植排斥(graft rejection)等。

[0206] 如在本文中公开的JNK抑制剂可以例如用于治疗耳部疾病(尤其内耳疾病)，听力丧失(hearing loss)(尤其急性听力丧失(acute hearing loss))，受损的毛细胞纤毛，
毛细胞凋亡，噪音损伤(noise trauma)，耳炎(otitis)，中耳炎(otitis media)等的方法。
听力丧失(hearing loss)和相关毛细胞凋亡是从细胞的紧张状况导致的疾病的非限制性
实例，其中JNK抑制可以调节应激应答和例如阻断凋亡。

[0207] 本发明的JNK抑制剂还可以用于治疗代谢病症，例如用于治疗糖尿病(类型1或类型2，尤其类型1)，法布里病(Fabry disease)，戈谢病(Gaucher disease)，体温过
低(hypothermia)，体温过高(hyperthermia)缺氧(hypoxia)，含类脂组织细胞增多症
(lipid histiocytosis)，脂质沉积(lipidoses)，异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)，黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis)，尼曼皮克病(Niemann Pick
disease)，肥胖(obesity)，和渥尔曼病(Wohnan′s disease)。体温过低(hypothermia)，体温过高(hyperthermia)和缺氧(hypoxia)也是对于细胞的紧张状况的非限制性实例，其
中JNK抑制可以调节应激应答和例如阻断凋亡。

[0208] 同样地，本发明的JNK抑制剂可以分别用于治疗神经的，神经元的和/或神经变性疾病。此种疾病的实例是例如亚历山大病(Alexander disease)，阿尔茨海默
病(Alzheimer′s disease)，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)
(ALS)，卒中(apoplexy)，共济失调毛细血管扩张症(Ataxia Telangiectasia)，切断或其
它中断的轴突(cut or otherwise disrupted axons)，轴突切开术(axotomy)，脑损伤
(brain lesions)，CMT(进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth))，皮质基底
节变性(corticobasal degeneration)，痴呆(dementia)，神经系统的疾病或病症，张力
障碍(dystonia)，癫痫(epilepsy)，法伯病(Farber′s disease)，弗里德赖希共济失调
(Friedreich ataxia)(SCA)，神经节苷脂贮积病(gangliosidoses)，吉兰-巴雷综合征
(Guillain-Barr6syndrome)，遗传性痉孪性截瘫(hereditary spastic paraplegia)，先天性巨结肠(Hirschsprung′s disease)，人免疫缺陷病毒痴呆(human immunodeﬁcienty
virus dementia)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，脑梗死(infarct of the brain)，缺血性卒中(ischemic stroke)，克拉伯病(Krabbe disease)，伦-格综合征(Lennox
Gastaut Syndrome)，无脑回(lissencephaly)，多发性硬化(multiple sclerosis)，骨髓
增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)，脊髓病(myelopathy)，AIDS-相关神经
变性疾病，2型神经纤维瘤病(neuroﬁbromatosis type 2)(NF-2)，neurolatyerism，神经元凋亡，神经元死亡，神经病性疼痛(neuropathic pain)，神经病(neuropathy)，化疗诱导的神经病，糖尿病诱导的神经病，NMDA-诱导的神经毒性，疼痛，帕金森病(Parkinson′s disease)，帕金森综合征(parkinsonism)，皮克病(Pick′s Disease)，多神经病
(polyneuropathy)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)，桑德霍夫病
(Sandhoff disease)，脊柱裂(spina biﬁda)，卒中(stroke)，泰-萨克斯病(Tay Sachs)，TBI(弥散性轴索损伤(diffuse axonal injury))，例如由炎性疼痛(inflammatory pain)
诱导的暗神经元的治疗，韦斯特综合征(West Syndrome)，脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)等。

[0209] 关于自身免疫病症，本发明的JNK抑制剂肽可以例如用于治疗CNS的自身免疫疾病，自身炎性疾病，乳糜泻(Celiac disease)；舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)等的方法中。

[0210] 对于可以用本发明的JNK抑制剂治疗的骨疾病的实例是例如关节炎(arthritis)，椎间盘突出(disc herniation)，进行性骨化性纤维发育不良
(ﬁbrodysplasia ossiﬁcans progressiva)(FOP)，骨关节炎(osteoarthritis)，骨硬化病(osteopetrosis)，骨质疏松症(osteoporosis)，尤其糖尿病诱导的骨质疏松症，佩吉特病(Paget′s Disease)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)等。

[0211] 对于可以用本发明的JNK抑制剂治疗的皮肤疾病的实例是例如银屑病(psoriasis)和红斑狼疮(lupus erythematosus)。

[0212] 可以用本发明的JNK抑制剂治疗的眼病包括例如老年性黄斑变性(age-relatedmacular degeneration)(AMD)；血管样条纹症(angioid streaks)；前部缺血性视神
经病变(anterior ischemic optic neuropathy)；前葡萄膜炎(anterior uveitis)；
白内障(cataract)，尤其老年性白内障；中心渗出性脉络膜视网膜病变(central
exudative chorio retinopathy)；中心浆液性脉络膜视网膜病变(central serous
chorio retinopathy)；睑板腺囊肿(chalazion)；无脉络膜(chorioderemia)；脉络膜
炎(chorioiditis)；脉络膜硬化(脉络膜al sclerosis)；结膜炎(conjunctivitis)；睫
状体炎(cyclitis)；糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)；干眼综合征(dry
eye syndrome)；眼内炎(endophthalmitis)；巩膜外层炎(episcleritis)；眼感染(eye
infection)；白点状眼底(fundus albipunctatus)；脉络膜视网膜环状萎缩(gyrate
atrophy of choroid and retina)；麦粒肿(hordeolum)；眼睑炎性疾病；脉络膜炎性疾
病；睫状体炎性疾病；结膜炎性疾病；角膜炎性疾病；虹膜炎性疾病；泪腺炎性疾病；颧骨炎性疾病；巩膜炎性疾病；玻璃体炎性疾病；葡萄膜炎性疾病；视网膜炎性疾病；中葡萄膜炎(intermediate uveitis)；虹膜炎(irititis)；角膜炎(keratitis)；莱伯病(Leber′s disease)；多灶性脉络膜炎(multifocal choroiditis)；眼肌肌炎(myositis of the
eye muscle)；新生血管性黄斑病变(neovascular maculopathy)(例如由高度近视(high
myopia)，斜盘综合征(tilted disc syndrome)，脉络膜骨瘤(choroidal osteoma)等引起
的)；NMDA诱导的视网膜毒性(NMDA induced retinotoxicity)；非慢性或慢性炎性眼病；
小口病(Oguchi′s disease)；视神经疾病；眼眶蜂窝织炎(orbital phlegmon)；全眼球炎(panophtalmitis)；全葡萄膜炎(panuveitis)；后囊混浊(post caspule opaciﬁcation)；
后囊膜混浊(posterior capsule opaciﬁcation)(PCO)(白内障术后并发症(cataract
after-surgery complication))；后葡萄膜炎(posterior uveitis)；增生性玻璃体视
网膜病变(proliferative vitreo retinopathy)；视网膜动脉闭塞(retinal artery
occlusion)；视网膜脱离(retinal detachment)，视网膜疾病；视网膜损伤(retinal
injuries)；视网膜巨动脉瘤(retinal macroaneurysm)；视网膜色素上皮脱离(retinal
pigment epithelium detachment)；视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusion)；视网膜
炎(retinitis)；色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)；白点状视网膜炎(retinitis
punctata albescens)；视网膜病(retinopathy)，尤其早产儿视网膜病(retinopathy
of prematurity)和糖尿病性视网膜病变(diabetic视网膜病(retinopathy))；巩膜炎
(scleritis)；施塔加特病(Stargardt′s disease)；发炎的眼创伤和/或眼创伤边缘
的治疗；眼部手术或外伤后眼内炎症的治疗；葡萄膜炎(uveitis)；卵黄状黄斑营养不良
(vitelliform macular dystrophy)；等。

[0213] 可以用在本文中公开的JNK抑制剂治疗的典型的口疾病是牙周炎(periodontitis)，尤其慢性牙周炎(chronic periodontitis)；粘膜炎(mucositis)，口
脱皮病(oral desquamative disorder)，口腔扁平苔藓(oral liquen planus)，寻常天疱
疮(pemphigus vulgaris)，牙髓炎(pulpitis)；口腔炎(stomatitis)；颞下颌关节病症
(temporomandibular joint disorder)，种植体周围炎(peri-implantitis)等。

[0214] 同样地，本发明的JNK抑制剂可以(如先前已经对于其它JNK抑制剂建议的)用于治疗增生性疾病如癌症和肿瘤疾病，比如听神经神经鞘瘤(acusticus neurinoma)肺
癌(lung carcinomas)；急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)(L1，L2，
L3)；急性淋巴性白血病(acute lymphoid leukaemia)(ALL)；急性骨髓性白血病(acute
myelogenous leukemia)(AML)；腺癌(adenocarcinomas)；肛门癌(anal carcinoma)；
支气管癌(bronchial carcinoma)；宫颈癌(cervix carcinoma)；宫颈癌(cervical
cancer)；星形细胞瘤(astrocytoma)；基底细胞癌(basalioma)；具有Bcr-Abl转变的
癌症；膀胱癌(bladder cancer)；胚细胞瘤(blastomas)；骨癌(bone cancer)；脑转移
(brain metastases)；脑肿瘤(brain tumours)；乳腺癌(breast cancer)；伯基特淋巴
瘤(Burkitt′s lymphoma)；类癌(carcinoids)；宫颈癌(cervical cancer)；慢性淋
巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia)(CLL)；慢性骨髓性白血病(chronic
myeloid leukaemia)(CML)；结肠癌(colon cancer)；结肠癌(colon carcinoma)；子宫
体癌(corpus carcinoma)；颅咽管瘤(craniopharyngeomas)；CUP综合征；病毒诱导的肿
瘤；EBV-诱导的B细胞淋巴瘤；子宫内膜癌(endometrium carcinoma)；红白血病(erytho
leukemia)(M6)；食道癌(esophagus cancer)；胆囊癌(gallbladder cancer)；胃肠癌
(gastro intestinal cancer)；胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors)；
胃肠道肿瘤(gastrointestinal tumours)；泌尿生殖器癌(genitourinary cancer)；青
光眼(glaucoma)；成胶质细胞瘤(glioblastoma)；神经胶质瘤(gliomas)；头/颈肿瘤
(head/neck tumours)；乙型肝炎-诱导的肿瘤；肝细胞癌(hepatocell carcinomas)；肝
细胞瘤(hepatomas)；疱疹病毒-诱导的肿瘤；霍奇金综合征(Hodgkin′s syndrome)；
HTLV-1-诱导的淋巴瘤(lymphomas)；HTLV-2-诱导的淋巴瘤(lymphomas)；胰岛素瘤
(insulinomas)；肠癌(intestinal cancer)；卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)；肾
癌(kidney cancer)；肾癌(kidney carcinomas)；喉癌(laryngeal cancer)；白血病
(leukemia)；眼睑肿瘤(lid tumour)；肝癌(liver cancer)；肝转移(liver metastases)；
肺癌(lung cancer)；淋巴癌(lymphoid cancer)；淋巴瘤(lymphomas)；恶性黑色素瘤
(malignant melanomas)；乳腺癌(mammary carcinomas)；套细胞淋巴瘤(mantle cell
lymphoma)；成神经管细胞瘤(medulloblastoma)；成巨核细胞白血病(megakaryoblastic
leukemia)(M7)；黑色素瘤(melanoma)，尤其恶性黑色素瘤(malignant melanoma)；脑膜
瘤(meningioma)；间皮瘤(mesothelioma)；单核细胞白血病(monocytic leukemia)(MS)；
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)；蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)；原始粒细胞性
白血病(myeloblastic leukemia)(M1)；原始粒细胞性白血病(myeloblastic leukemia)
(M2)；髓单核细胞白血病(myelomonocytic leukemia)(M4)；神经鞘瘤(neurinoma)；非霍
奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphomas)；非小细胞癌(non-small cell carcinoma)；
非小细胞肺癌(non-small cell carcinoma of the lung)；食管癌(oesophageal
cancer)；食管癌(oesophageal cancer)；少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)；卵巢
癌(ovarian cancer)；卵巢癌(ovarian carcinoma)；胰腺癌(pancreatic cancer)；胰
腺癌(pancreatic carcinoma)；乳头瘤病毒-诱导的癌；阴茎癌(penis cancer)；垂体瘤
(pituitary tumour)；浆细胞瘤(plasmocytoma)；早幼粒细胞性白血病(promyelocytic
leukemia)(M3)；前列腺癌(prostate cancer)；前列腺肿瘤(prostate tumours)；直肠肿
瘤(rectal tumours)；直肠癌(rectum carcinoma)；肾细胞癌(renal-cell carcinoma)；
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；肉瘤(sarcomas)；施耐博格病(Schneeberger′s
disease)；小细胞肺癌(small cell lung carcinomas)；小肠癌(small intestine
cancer)；小肠肿瘤(small intestine tumours)；软组织瘤(soft tissue tumours)；脊柱瘤(spinalioma)；鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；胃癌(stomach cancer)；睾丸癌(testicular cancer)；喉癌(throat cancer)；胸腺癌(thymoma)；甲状腺癌(thyroid
cancer)；甲状腺癌(thyroid carcinoma)；舌癌(tongue cancer)；未分化的AML(MO)；
尿道癌(urethral cancer)；子宫癌(uterine cancer)；阴道癌(vaginal cancer)；希
佩尔-林道病(Von Hippel Lindau disease)；外阴癌(vulval cancer)；肾母细胞瘤
(Wilms′Tumor)；着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)；等。

[0215] 因为JNK信号转导还参与到很多心血管疾病和病症中，过去已经建议在此种疾病的治疗中使用JNK抑制剂。因此本发明的抑制剂可以用于，例如治疗心血管疾病
比如高动脉压(arterial hypertension)；动脉硬化(arteriosclerosis)；动脉硬化
损伤(arteriosclerotic lesions)；贝赫切特综合征(Behcet′s syndrome)；血管分
叉(bifurcations of blood vessels)；心脏肥大(cardiac hypertrophy)；心血管肥
厚(cardiavascular hypertrophy)；心肌病(cardiomyopathies))，尤其化疗诱导的心
肌病；脑缺血(cerebral ischemia)；冠心病(coronary heart disease)；腹主动脉扩张
(dilatation of the abdominal aorta)；局灶性脑缺血(focal cerebral ischemia)；
全脑缺血(global cerebral ischemia)；心脏肥大(heart hypertrophy)；肾下动脉瘤高
血压(infrarenal aneurism hypertension)；缺血(ischemia)；心肌梗死(myocardial
infarct)，尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction)；心肌炎(myocarditis)；
再灌注(reperfusion)；再狭窄(restenosis)；脉管炎(vasculitis)；韦格纳肉芽肿病
(Wegener′s granulomatosis)；等。

[0216] 在心血管疾病的情况下，本发明的JNK抑制剂还可以用于冠状动脉旁路移植手术(CABG surgery)；经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)；和/或支架治疗的补充，例如以预防或治疗由所述(手术)治疗导致的内膜增生(intimal hyperplasia)。

[0217] 用本发明的JNK抑制剂可以有效治疗的呼吸系统疾病和尤其肺疾病是例如急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)(ARDS)；哮喘(asthma)；涉及呼吸系统的慢性疾病；慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)；
囊性纤维化(cystic ﬁbrosis)；炎性肺疾病；肺炎(pneumonia)；肺纤维化(pulmonary
ﬁbrosis)；等。

[0218] 如现有技术中的抑制剂，本发明的抑制剂还可以用于治疗肠道疾病，例如结肠炎(colitis)(例如非典型性结肠炎(atypical colitis)，化学性结肠炎(chemical
colitis)；胶原性结肠炎(collagenous colitis)，远端结肠炎(distal colitis)，改
道性结肠炎(diversion colitis)；爆发性结肠炎(fulminant colitis)，不确定性结
肠炎(indeterminate colitis)，传染性结肠炎(infectious colitis)，缺血性结肠炎
(ischemic colitis)，淋巴细胞性结肠炎(lymphocytic colitis)，或显微镜下结肠炎
(microscopic colitis)，克罗恩病(Crohn′s disease)，胃肠炎(gastroenteritis)，先天性巨结肠(Hirschsprung′s disease)，炎性消化性疾病；炎性肠病(inflammatory bowel disease)(IBD)，克罗恩病(Morbus Crohn)，非慢性或慢性消化性疾病，非慢性或慢性炎性消化性疾病；局限性肠炎(regional enteritis))；溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)
等。

[0219] 本发明的JNK抑制剂还可以用作对于治疗由例如细菌或病毒感染导致的感染性疾病的治疗剂。如在本文中公开的JNK抑制剂可以例如预防或缓解由所述感染引起的炎性
反应。此种疾病状态的实例(其不被认为是限制的)是病毒脑炎(viral encephalitis)；
病毒诱导的癌症(例如如上文提到的)，人免疫缺陷病毒痴呆(human immunodeﬁciency
dementia)，脑膜炎(meningitis)，脑膜脑炎(meningoencephalitis)，脑脊髓炎
(encephalomyelitis)，扁桃体炎(tonsillitis)，等。

[0220] 存在很多其它的本发明的JNK抑制剂可以用于治疗的疾病，疾病状态和病症，例如阿斯柯格综合征(Aarskog syndrome)，对乙酰氨基酚的肝毒性(acetaminophen
hepatotoxicity))；奥尔德异常(Alder-Reilly anomaly)；斑秃(alopecia areata)；
α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(α-1-antitrypsin deﬁciency)；过敏反应(anaphylaxis)；
凋亡；细胞凋亡；非典型溶血尿毒综合征(atypical hemolytic uremic syndrome)；
嗜碱细胞减少(basopenia)；嗜碱细胞增多(basophilia)；双相性精神障碍(bipolar
disorder)；烧伤(burns)；细胞剪切应激；白细胞异常色素减退综合征(Chedial-Higashi syndrome)；化疗药物导致的DNA损伤；胆汁郁积(cholestasis)；染色体11，部分单体
性(Partial Monosomy)11q；染色体22，镶嵌型三体(trisomy Mosaic)；慢性肉芽肿
病(chronic granulomatous disease)；肝炎(hepatitis)，比如慢性或爆发性肝炎；
临床抑郁症(clinical depression)；常见变异型低丙球蛋白血症(common variable
hypogammaglobulinemia)；先天性C3不足(congenital C3deﬁciency)；来自激活诱导的
细胞死亡的CTL保护(AICD)；耳聋(deafness)；抑郁症(depression and depressive
disorder)(尤其预防细胞因子-诱导的疾病行为的情况下发展的抑郁症)，德乔治综合
征(DiGeorge′s syndrome)；由有缺陷的凋亡引起的疾病；肝病；脊椎病；子宫疾病；由
于暴露于DNA损伤剂和/或电离辐射以及所产生的细胞应激导致的疾病状态和症状；唐氏
综合征(Down Syndrome)；迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)；外胚层
发育不良(ectodermal dysplasias)；子宫内膜异位(endometriosis)；嗜酸粒细胞减少
(eosinopenia)；嗜酸粒细胞增多(eosinophilia)；exocitoxic细胞死亡；胎儿酒精综合
征(fetal alcohol syndrome)；纤维化(ﬁbrosis)；纤维变性疾病(ﬁbrotic disease)；纤维组织形成(formation of ﬁbrous tissue)；自由基(leading to cellular stress)；移植排斥(graft rejection)；移植物抗宿主病(graft versus host disease)；脱发(hair
loss)；溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome)；肝毒性(hepatotoxicity)；
痛觉过敏(hyperalgesia)，比如糖尿病诱导的痛觉过敏；体温过高(hyperthermia)；低
血糖症(hypoglycemia)；甲状腺机能减退(hypothyroidism)；特发性嗜酸粒细胞增多
综合征(idiopathic hypereosinophilic syndrome)；IgA肾病 (IgA nephropathy)；
婴儿性连锁的丙种球蛋白血症(infantile sex-linked agammaglobulinemia)；炎性
疼痛(inflammatory pain)；肾下动脉瘤(infrarenal aneyrism)；胰岛再生(islet
regeneration)；胰岛移植(islet transplantation)；约伯综合征(Job′s syndrome)
(高lgE)；懒惰白细胞综合征(lazy leukocyte syndrome)；白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢
酶缺乏症(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deﬁciency)；脑白质营养不
良(leukodystrophy)；白细胞减少症(leukopenia)；淋巴细胞性白细胞增多(lymphocytic leukocytosis)；淋巴细胞减少(lymphocytopenia)；淋巴球增多(lymphocytosis)；重
性抑郁(major depression)；躁狂症(mania)；躁郁症(maniac depression)；马方综
合征(Marfan syndrome)；肥大细胞增多症(mastocytosis)；梅-赫异常(May Hegglin
Anomaly)；II型膜性增生性肾小球性肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis
Type II)；单核细胞减少症(monocytopenia)；单核细胞增多症(monocytosis)；髓过氧
化物酶缺乏-良性(myeloperoxidase deﬁciency-benign)；肌病(myopathies)；嗜中性
白血球减少症(neutropenia)；嗜中性白血球增多症(neutrophilia)；纳泽洛夫综合征
(Nezelofs syndrome)；器官移植；氧化应激损伤(oxidative stress injuries)；佩-休
二氏异常(Pelger-Huet anomaly)；多囊性肾病(polycystic kidney disease)；透析后
综合征(post-dialysis syndrome)；放射综合征(radiation syndromes)；放射治疗；
肾病；肾衰竭(renal failure)；从激活诱导的细胞死亡拯救CTL；严重联合免疫缺陷病
(severe combined immunodeﬁciency disease)；移植排斥(transplant rejection)；移植(transplantation)；三体性(trisomy)；单相抑郁(unipolar depression)；UV-诱导的损
伤；威-奥综合征(Wiskott Aldrich syndrome)；伤口愈合(wound healing)；等。

[0221] 本发明的发明人考虑颞下颌关节病症(temporomandibular joint disorder)，粘膜炎(mucositis)，口腔炎(stomatitis)，口腔扁平苔藓(oral liquen planus)
(脱皮病 (desquamative disorder))，寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)(脱皮
病(desquamative disorder))，牙周炎(periodontitis)，慢性牙周炎 (chronic
periodontitis)，牙髓炎(pulpitis)，种植体周围炎(peri-implantitis)，葡萄膜炎
(uveitis)(前葡萄膜炎(anterior uveitis)，中葡萄膜炎(intermediate uveitis)，
后葡萄膜炎(posterior uveitis))，干燥性角结膜炎(kerato conjunctivitis sicca)
(干眼综合征(dry eye syndrome))，冠状动脉旁路移植手术(CABG surgery)，急性心肌
梗死(acute myocardial infarction)，预防经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的内膜
增生(intimal hyperplasia)，预防支架放置之后的内膜增生(intimal hyperplasia)，
动脉粥样硬化(atherosclerosis)，COPD，哮喘(asthma)，类风湿性关节炎(rheumatoid
arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，克罗恩病(Crohn′s disease)，炎性肠病
(inﬁammatory bowel disease)(IBD)，银屑病(psoriasis)，糖尿病，卒中(stroke)，帕
金森病(Parkinson′s disease)，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)，系统性红斑
狼疮(systemic lupus erythematosus)，和脉管炎(vasculitis)，尤其韦格纳肉芽肿病
(Wegener′s granulomatosis)，用本发明的JNK抑制剂治疗是尤其有用的。

[0222] 本领域技术人员将容易了解，上文提到的疾病状态和病症可以属于多于一种上文提到的疾病类型。例如，支气管癌(bronchial carcinoma)当然不仅是增生性疾病，还将放在呼吸系统疾病(包括肺疾病)的组中。因此，上文提及的个别疾病的分类不被认为是限
制或总结，而仅被认为是典型的性质。其不排除在一种类型中列举的个别疾病状态事实上
也是应用本发明的JNK抑制剂在另一种类型的疾病状态中作为治疗剂的合适的实例。本领
域技术人员将能够容易将不同疾病状态和病症分配到匹配的分类中。

[0223] 最后，如上文提到的，本发明考虑使用如本文中定义的JNK抑制剂用于治疗各种疾病状态和病症。本发明不考虑使用如本文中定义的JNK抑制剂免疫非人的动物，例如用
于产生单克隆抗体。在本文中此种方法不被认为是通过治疗处理动物体的方法。

[0224] 在本文中引用的所有参考文献在此通过引用并入。实施例

[0225] 在下文中，提供说明本发明的不同实施方案和方面的特定实施例。然而，本发明不应该限于由在本文中描述的特定实施方案限定的范围。的确，对于本领域技术人员来讲，从之前的描述，附图和下文的实施例，除了在本文中描述的那些之外，本发明的不同修饰将成为容易显而易见的。所有此种修饰落在附加的权利要求的范围内。

[0226] 实施例1：JNK抑制剂SEQ ID NO：172的合成

[0227] 作为说明性实施例，SEQ ID NO：172的JNK抑制剂的合成在下文列出。本领域技术人员将知晓所述合成还可以用于和容易地适应于合成任何其它根据本发明的JNK抑制剂。

[0228] 使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略通过固相肽合成制造SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。肽和树脂之间的接头是Rink酰胺接头(p-[Fmoc-2，3-二甲氧基苄基]-苯氧基乙
酸)。通过连续的Fmoc脱保护和Fmoc-氨基酸偶联循环合成肽。合成的最后，通过三氟乙
酸(TFA)直接切开完成的肽以获得粗制的C-末端酰胺，其随后通过预备的反相HPLC纯化。
将纯化的级分汇集入同类的批次，通过离子交换层析处理其以获得其醋酸盐。随后冻干肽。

[0229] 1.1肽的固相合成

[0230] 除特别声明，制造在空气过滤的环境在室温(22℃±7℃)发生。合成的规模为在树脂上0.7mmoles起始氨基酸，得到预期产量为约1g的纯化肽。在装备有玻璃烧结的盘
(fritted disk)的30-50mL反应器以机械搅拌和/或氮气鼓泡手动进行合成。

[0231] 1.2树脂的制备

[0232] 首先用二氯甲烷/二甲基甲酰胺/二异丙基乙胺在氮条件下洗涤p-甲苯羟酰胺树脂(MBHA-树脂)。随后在PyBOB(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷六氟磷酸酯)/
二异丙基-乙胺/1-羟基苯并三唑中将洗涤的树脂偶联于Rink酰胺接头(p-[Fmox-2，4-二
甲氧基苄基]-苯氧基乙酸)以获得Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂。

[0233] 1.3氨基酸的偶联

[0234] 使用以下循环将氨基酸偶联于树脂：

[0235] 通过在35％(v/v)哌啶/二甲基甲酰胺中，随后在二甲基甲酰胺中洗涤其将Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂脱保护。脱保护反应大约用时16分钟。将被保护的Fmoc氨基
酸(例如，二甲基甲酰胺/二氯甲烷(50/50)中的2eq的氨基酸和HOBt(1-羟基苯并三唑)
加于树脂，然后加入2eq的偶联剂二异丙基碳化二亚胺(DIC)。依赖于加入的各个氨基酸，
偶联反应耗时1小时到过夜。基于0.5mL/100mg的肽-树脂计算体积并在各个循环之后调
整。偶联之后，用DMF洗涤树脂3次。伯胺上的茚三酮试验(或Kaiser测试1)和仲胺上
的chloranyl测试2测试偶联的完成。在一些情况下，chloranyl测试可以作为安全对照与
茚三酮试验关联。一旦偶联测试指示反应未完成，以在二甲基甲酰胺/二氯甲烷和二异丙
基乙胺中的较低过量(0.5-1eq)的氨基酸，PYBOP，HOBT重复偶联。测量树脂的功能性并通
常依赖于树脂的初始载量为0.6-0.2meq/g。在偶联上最后一个氨基酸之后，仍然将肽-树
脂脱保护并随后用DCM洗涤5次，然后在烘箱中30℃真空干燥。干燥肽-树脂之后，固相
合成的产量计算为与从树脂的初始载量计算的理论重量增加相比，肽树脂的重量增加的比
率。产量可以接近100％。

[0236] 1.4切割和脱保护

[0237] 在三氟乙酸/1，2-乙硫醇/苯硫基甲烷/水/苯酚(88/2.2/4.4/4.4/7v/v)的混合物(也被称为TFA/K 试剂)中从树脂室温切割肽4小时。反应体积为1mL/100mg的肽树
脂。在向试剂加入树脂的过程中，调节混合物的温度以保持在30℃以下。

[0238] 1.5从树脂提取肽：

[0239] 通过从多孔盘(fritted disc)过滤从树脂提取肽。在旋转蒸发器(rotavapor)上浓缩到其体积的1/3后，通过冷的t-丁基甲基醚沉淀肽并过滤。随后在30℃真空干燥粗
制肽。

[0240] 1.6预备的HPLC纯化：

[0241] 随后通过反相HPLC纯化粗制肽到纯度≥95％。在旋转蒸发器(rotavaporator)上浓缩纯化的级分并冻干。

[0242] 1.7离子交换层析

[0243] 将纯化的序列SEQ ID NO：172的肽的浓缩的冻干得汇集物溶解于水并在Dowex醋酸，50-100目树脂上用离子交换层析。

[0244] 对于合成所需要的起始试剂是：

[0245]

[0246] 可以以类似的方式制备本发明的其它JNK抑制剂。

[0247] 实施例2：选自的根据本发明的JNK抑制剂的抑制效果

[0248] 下文中将列出标准的操作工序，所述工序描述怎样测量根据本发明的JNK抑制剂的抑制效果。所述方法允许以非放射性的标准化的测定体外测量候选化合物减少通过JNK
的c-Jun特异的底物的磷酸化的能力。此外，将说明怎样确定选择的化合物对JNK的抑制
效果(IC50)和Ki。所述方法适于验证候选化合物是否抑制或不抑制JNK活性。并且本领
域技术人员当然将理解怎样改变下文的方法用于其特定的目的和需求。

[0249] 2.1材料

[0250] AlphaScreen试剂和平板：

[0251] -His-JNK1(编号14-327，Upstate，10μg于100μl中：浓度：2.2μM)5nM终浓度

[0252] -His-JNK2(编号14-329，Upstate，10μg于100μl中：浓度：2μM)5nM终浓度

[0253] -His-JNK3(编号14-501，Upstate，10μg于100μl中：浓度：1.88μM)5nM终浓度

[0254] -抗-磷酸化-cJun(编号06-828，Upstate，批次DAM1503356，浓度：44.5μM)10nM终浓度

[0255] -生物素-cJun(29-67)：

[0256] 序列：生物素-SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG(SEQ ID NO：198)，批次100509(mw4382.11，P99.28％)溶于H2O，浓度：10mM)30nM终浓度

[0257] -ATP(编号AS001A，Invitrogen，批次50860B，浓度100mM))5μM终浓度

[0258] -SAD珠子(编号6760617M，PerkinElmer，批次540-460-A，浓度5mg/ml)20μg/ml终浓度

[0259] -AprotA珠子(编号6760617M，PerkinElmer，批次540-460-A，浓度 5mg/ml)20μg/ml终浓度

[0260] -Optiplate 384孔白色平板(编号6007299，PerkinElmer，批次654280/2008)

[0261] -用于肽稀释的96孔板(编号82.1581，Sarstedt)

[0262] -TopSeals-A(编号6005185，Perkin Elmer，批次65673)

[0263] -生物发光能量转移读数

[0264] -在Fusion Alpha平板读数器(Perkin Elmer)上对生物发光能量转移读数。

[0265] 移液器：

[0266] -用电动EDP3移液器20-300(编号17007243；Rainin)将酶-抗体混合物(Enzme-Antibody mix)，底物-ATP混合物(Subtrate-ATP mix)和珠子装入平板。

[0267] -使用 Ultra多通道8X20(编号21040；Gilson)将抑制性化合物装入平板。

[0268] 缓冲液和溶液

[0269] -激酶缓冲液：20mM Tris-碱pH7.4，10mM MgCl2，1mM DTT，100μM Na3VO4，0.01％ Tween，(1％ DMSO)

[0270] -终止缓冲液：20mM Tris-碱pH7.4，200mM NaCl，80mM EDTA-K(pH de8，以KOH替代NaOH)，0.3％BSA

[0271] -JNK稀释激酶缓冲液：50mM Tris-碱pH7.4，150mM NaCl，0.1mMEGTA，0.03％Brij-35，270mM蔗糖，0.1％β巯基乙醇。

[0272] 2.2方法

[0273] 为了评估肽的抑制效果，进行标准的AlphaScreen测定(参见例如Guenat等人JBiomol Screen，2006；11：第1015-1026页)。制备不同组分并随后根据指示混合。密封平板并以如下方式孵育：

[0274] 5μl JNK+抗体

[0275] 5μl TP激酶+/-抑制剂预孵育30分钟

[0276] 5μl 生物素-cJun+ATP24℃孵育60分钟

[0277] 10μl 珠子SAD+A protA黑暗中24℃孵育60分钟

[0278] 为了避免污染，用移液器在孔的不同角加入混合物。将各个混合物加入平板后，轻拍平板(保持一侧固定并让相反侧轻拍桌子)以让混合物沉下孔壁。

[0279] 在Fusion Alpha平板读数器(Perkin Elmer)上对生物发光能量转移读数。

[0280] 对于JNK的各个同型物，应该至少在3个独立实验中一式三份测试所有化合物。要测试的化合物的可能浓度是0，0.03nM，0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，
1μM，3μM，10μM，30μM，和100μM。对照是或者没有JNK或者没有底物(c-Jun)的样品。

[0281] 混合物制备

[0282] JNK1，JNK2和JNK35nM

[0283] 生物素-cJun 30nM

[0284] ATP 5μM；抗磷酸化-cJun(S63)10nM

[0285] Bille SAD/AprotA 20μg/ml

[0286] 抗体[终浓度]＝10nM(抗磷酸化cJun(S63))

[0287] 检测部分：[混合物]X5(5μl于25μl的最终体积中)

[0288] [储液]＝44.5μM(编号06-828，Upstate，批次DAM1503356)

[0289] 10nM→50nM于激酶缓冲液中

[0290] JNK1，JNK2和JNK3[终浓度]＝5nM

[0291] 反应部分：[混合物]X3(5μl于15μl的最终体积中)

[0292] [储液]＝对于JNK1(编号14-327，Upstate，批次D7KN022CU)2.2μM

[0293] 对于JNK2(编号14-329，Upstate，批次33221CU)2.0μM

[0294] 对于JNK3(编号14-501，Upstate，批次D7CN041CU)1.88μM

[0295] 5nM →15nM于抗体缓冲液中

[0296] 抑制剂：

[0297] 反应部分：[混合物]X3(5μl于15μl的最终体积中)

[0298] [储液]＝10mM

[0299] 100 μM →300 μM于激酶缓冲液中

[0300] 30 μM →90 μM于激酶缓冲液中

[0301] 10 μM →30 μM于激酶缓冲液中

[0302] ...

[0303] 0.03nM → 0.09nM于激酶缓冲液中

[0304] 和0nM → 激酶缓冲液

[0305] 在96孔板中进行两个系列的10倍系列稀释，一个从300μM至0nM，第二个从90μM至0.03nM。用8通道的多通道移液器(multipipette)(编号F14401，Gilson，8X20)
在384平板中加入肽。

[0306] ATP[终浓度]＝5μM

[0307] 反应部分：[混合物]X3(5μl于15μl的终体积中)

[0308] [储液]＝100mM(编号AS001A，Invitrogen，批次50860B)

[0309] 5μM→15μM于激酶缓冲液中

[0310] 生物素c-Jun[终浓度]＝30nM

[0311] 反应部分：[混合物]X3(5μl于15μl的终体积中)

[0312] [储液]＝10mM

[0313] 30nM→30nM于ATP缓冲液中

[0314] 珠子SAD/A ProtA[终浓度]＝20μg/ml(光灵敏的)

[0315] 检测部分：[混合物]X2.5(10μl于25μl的终体积中)

[0316] [储液]＝5mg/ml→20μg/ml 50μg/ml于终止缓冲液中

[0317] 在暗室(绿光)或在黑暗中混合。

[0318] IC50曲线的分析：

[0319] 通过GraphPad Prism4 软件用以下方程式进行分析：S形剂量应答(Sigmoidaldose-response)(无限制).

[0320] Y＝底+(顶-底)/(1+10^((LogEC50-X)))

[0321] 使用Grugg′s测试避免极端值数据。

[0322] IC50的比较：

[0323] 通过GraphPad Prism4软件用以下测试进行分析：单向ANOVA测试，随后用Tukey′s多重比较测试。P＜0.05被认为显著。

[0324] 在报告AlphaScreen标准化测定中确定对于JNK的ATP的Km和生物素-cJun特异肽的Km。

[0325] Ki和IC50之间的数学关系(Ki＝IC50/(1+([底物]/底物的Km))可以用于计算Ki值。

[0326] 实施例3：内化实验和分析

[0327] 3.1用于摄取实验的材料和方法

[0328] a)细胞系：

[0329] 用于此实验的细胞系是HL-60(编号CCL-240，ATCC，批次116523)

[0330] b)培养基和平板

[0331] RPMI(编号21875-091，Invitrogen，批次8296)或DMEM(编号41965，Invitrogen，批次13481)在2008年05月05日补充以：

[0332] 10％ FBS(编号A64906-0098，PAA，批次A15-151)：在2008年04月04日在56℃，30分钟去补体

[0333] 1nM丙酮酸钠(编号S8636，Sigma，批次56K2386)

[0334] 青霉素(100单位/ml)/链霉素(100μg/ml)(编号P4333，Sigma，批次106K2321)

[0335] PBS 10X(编号70011，Invitrogen，批次8277)：用无菌水稀释到1X

[0336] 胰蛋白酶-0.05％ EDTA(编号L-11660，PAA，批次L66007-1194)

[0337] 6孔培养板(编号140675，Nunc，批次102613)

[0338] 24孔培养板(编号142475，Nunc，批次095849)

[0339] 96孔培养板(编号167008，Nunc，批次083310)

[0340] 用于蛋白配量的96孔板(编号82.1581，Sarstedt)

[0341] 用于荧光测量的96孔板(编号6005279，Perkin Elmer)

[0342] c)溶液

[0343] 聚-D-赖氨酸包被液(Sigma P9011批次095K5104)：稀释在PBS 1x中，终浓度25μg/ml

[0344] 酸性洗涤缓冲液：0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH3.0

[0345] Ripa细胞裂解缓冲液：10mM NaH2PO4pH7.2，150mM NaCl，1％Triton X-100，1mM EDTA pH8.0，200μM Na3VO2，0.1％SDS，1X蛋白酶抑制剂混合物(编号11873580001，Roche，批次13732700)

[0346] d)显微镜和荧光平板读数器

[0347] 使用倒置显微镜(Axiovert 40 CFL；Zeiss；20X)观察和计数细胞。

[0348] 用Fusion Alpha平板读数器(Perkin Elmer)用对荧光读数。

[0349] e)方法

[0350] 在悬浮细胞上研究标记FITC的肽内化。将细胞以1x106细胞/ml的浓度铺于聚-DL-赖氨酸包被的培养盘中。然后在37℃，5％CO2和100％相对湿度孵育24h，之后加
入已知浓度的肽。加入肽之后，在37℃，5％CO2和100％相对湿度孵育细胞30分钟，1，6或
24h。然后用酸性缓冲液(甘氨酸0.2M，NaCl 0.15M，pH3.0)洗涤细胞两次以移除细胞表
面吸附的肽(参见Kameyama等人，(2007)，Biopolymers，88，98-107)。使用酸性缓冲液是因为富含碱性氨基酸的肽强烈吸附在细胞表面，其常常导致过高估计内化的肽。因此使用
酸性缓冲液洗涤细胞以移除细胞表面吸附的肽。在确定。在确定Fab/细胞-浸润肽缀合
物的细胞摄取中进行酸洗涤，随后用PBS洗涤两次。通过加入RIPA细胞裂解缓冲液破坏细
胞。然后通过减除背景后的荧光和蛋白含量标准化确定内化的肽的相对量。

[0351] 步骤是这样的：1.细胞培养

[0352] 2.酸性洗涤和细胞提取

[0353] 3.用荧光平板读数器分析肽内化

[0354] f)细胞培养和肽处理

[0355] 用3ml的聚-D-Lys(Sigma P9011；25μg/ml于PBS中)包被6孔培养板，24孔板用600μl包被并且96孔板用125μl包被并在37℃，CO2 5％和100％相对湿度孵育4h。

[0356] 4小时之后，对于6，24或96孔板，分别用3.5ml PBS，700μl或150μlPBS洗涤平板两次。

[0357] 对于悬浮细胞，在2.4ml培养基(RPMI)中以1′000′000细胞/ml的铺板密度将细胞铺于皿中。孵育后，在37℃，5％ CO2和100％相对湿度孵育平板24小时，之后加入
肽。粘着细胞应该为在处理当天为90-95％的密度并铺板于DMEM。

[0358]

[0359] 用所需浓度的FITC标记的肽(H2O中10mM浓度的储液)处理细胞.

[0360] 加入肽之后，在37℃，CO2 5％和100％相对湿度孵育细胞0至24小时(例如30分钟，1，6或24小时)。

[0361] 酸性洗涤和细胞提取：

[0362] 将细胞提取物置于冰上冷却。

[0363] 悬浮细胞(或贴附培养盘不是很好的细胞)：

[0364] 将细胞转入《15ml的Falcon管》。为了回收最多的细胞，用1ml PBS洗涤培养盘。

[0365] 最大2400rpm 2分钟收获细胞。

[0366] 在1ml冷的PBS中悬起细胞。

[0367] 将细胞转移至包被的“微量离心管”(用1ml聚D-Lys包被4小时和用1ml PBS洗涤两次)。

[0368] 用1ml冷的酸性洗涤缓冲液洗涤三次并在最大2400rpm离心2分钟。谨防细胞在“微量离心管”中散布。

[0369] 用1ml冷的PBS洗涤两次以中和。

[0370] 加入50μl细胞裂解RIPA缓冲液.

[0371] 在冰上搅拌孵育30分钟-1h。

[0372] 粘着细胞：

[0373] 用3ml，1ml或200μl(分别对于6，24或96孔板)冷的酸性洗涤缓冲液洗涤三次。谨防细胞从培养盘分离。

[0374] 用1ml冷的PBS(分别对于6，24或96孔板)洗涤两次以中和。

[0375] 加入50μl细胞裂解RIPA缓冲液。

[0376] 在冰上搅拌孵育30分钟-1h。

[0377] 用冷的刮子刮下细胞。将24和96孔板直接在4000rpm 4°离心15min以移除细胞碎片。随后将上清(对于24或96孔板分别100或50ml)直接转移入暗96孔板中。通
过荧光平板读数器(Fusion Alpha，Perkin Elmer)对平板读值。

[0378] 将细胞裂解物转移入包被的“微量离心管”(用1ml聚D-Lys包被4小时并用1mlPBS洗涤两次)中。

[0379] 随后在10000g 4℃离心裂解的细胞30分钟以除去细胞碎片。

[0380] 移除上清并将其储存-80℃在包被的“微量离心管”(用1ml聚D-Lys包被4小时并用1ml PBS洗涤两次)中。

[0381] 用荧光平板读数器分析肽内化：

[0382] 按照制造商的使用说明，通过标准BCA测定(试剂盒N°23225，Pierce)确定各个蛋白提取物的含量。

[0383] 在荧光平板读数器(Fusion Alpha，Perkin Elmer)对10μl各个样品读值，减去背景和通过蛋白浓度的标准化之后确定各个样品的相对荧光。

[0384] 3.2摄取实验

[0385] 如上文使用SEQ ID NOs：52-96，43，和45-47的序列转运肽描述的进行FITC-标记的源自TAT的转运构建体进入HL-60细胞系细胞的时间依赖性的内化(摄取)。这些序
列在下文表4中列出。

[0386]

[0387]

[0388]

[0389] 在上表中，D氨基酸由在各个氨基酸残基之前的小“d”表示(例如dR＝D-Arg)。

[0390] 对于一些序列，由于技术原因，在第一种方法中合成不幸失败。这些序列在图6中简写为1，2，3，4，5，6，7，8，43，52，53，54，55，56，57，85，86，87，88，89，和90。然而，剩余的序列用于内化实验。

[0391] 结果显示在图6中。

[0392] 如在图6中可以看到的，孵育24小时后，具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)的所有转运蛋白显示比L-TAT转运蛋白(SEQ ID NO：43)更高的内化能力。将Hela细胞在96孔板中用10mM r3-L-TAT-衍生的转运蛋白孵育24小时。随后将细胞用酸性缓冲液
(0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH3.0)洗涤两次并用PBS洗涤两次。通过加入RIPA细胞裂解缓
冲液破碎细胞。随后对各个提取物读荧光强度(Fusion Alpha平板读数器；PerkinElmer)
然后减去背景确定内化的肽的相对量。

[0393] 如在图6中可以看到的，一个位置似乎对于最高转运活性和对于改善的转运活性动力学至关重要：位置2(对应于SEQ ID NO：142的肽N°91)中的Y。

[0394] 该实验的结论如下：

[0395] 24小时孵育后，具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)的所有转运蛋白(对于可能序列的选择参见表2)显示比L-TAT转运蛋白(SEQ ID NO：43)更高的内化能力(图
6)。那些结果完全验证了共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)。

[0396] 一个位置对于最高转运活性至关重要和(图6)：位置2(对应于SEQ ID NO：142的序列91)中的Y。

[0397] 因此，尤其当序列呈现9个氨基酸残基并具有共有序列rXXXrXXXr(SEQ ID NO：31)时，如在表4中显示的此种TAT衍生的序列是优选的，其在位置2呈现Y。

[0398] 实施例4：测量细胞因子和趋化因子释放

[0399] 下文中将列出描述如何测量配体诱导的从人细胞(血液，WBC，PBMC，纯化的原发淋巴细胞，细胞系，...)的分泌后一些人细胞因子的释放量的过程。

[0400] 使用的技术是夹心ELISA，其允许测量两层抗体(即捕获和检测抗体)间抗原的量。要被测量的抗原必须包含能够结合于抗体的至少两个抗原位点，因为在夹心至少两种
抗体作用。单克隆或多克隆抗体可用作夹心ELISA系统中的捕获和检测抗体。单克隆抗体
识别单个表位，其允许很好地检测和定量抗原中小的不同。多克隆抗体经常用作捕获抗体
以拉下尽可能多的抗原。夹心ELISA的优势是在分析之前不必须纯化样品，并且测定可以
非常灵敏(比直接或间接灵敏达2至5倍)。

[0401] 所述方法可以用于确定本发明的JNK抑制剂的体外/细胞培养效果。在非毒性剂量，化合物效果由与未处理样品相比细胞因子水平的增加(光密度(450nm处吸光度)的改
变)表示并由ELISA监控。结果以ng/ml表示。

[0402] 4.1材料

[0403] 96孔板：

[0404] 用于收集上清(编号82.1581，Sarstedt)

[0405] 用于ELISA(F96maxisorp，编号442404，Nunc)

[0406] TopSeal-A：96孔微孔板封条(编号600585，PerkinElmer).

[0407] ELISA试剂

[0408] 包被缓冲液ELISA：0.1M碳酸钠pH9.5( ＝7.13g NaHCO3(编号 71627，Fluka)+1.59g Na2CO3(编号71345，Fluka)溶于1升H2O，用浓缩的NaOH将pH调至9.5)

[0409] 洗涤缓冲液ELISA：PBS 1X+0.01％吐温20。制备1升PBS 1X(PBS10X：编号70011，GIBCO)并缓慢加入100ul吐温20(编号P1379，Sigma)同时用磁力搅拌器混合)

[0410] 测定稀释液：PBS 1X+10％FBS(编号A15-151，PAA，在56℃，30分钟去补体).

[0411] DAKO TMB(编号S1599，DAKO)：商业化底物溶液

[0412] 终止液：1M H3PO4(→对于200ml＝177ml H2O+23ml H3PO4 85％(编号345245，Aldrich).

[0413] ELISA试剂盒(用于20个板的试剂)

[0414] IFN-γ：人IFN-γELISA组，BD OptEIATM(编号555142，DB).

[0415] IL-1β：人IL-1βELISA组II，BD OptEIATM(编号557953，BD)

[0416] IL-10：人IL-10ELISA组II，BD OptEIATM(编号555157，DB).

[0417] IL-12：人IL-12(p70)ELISA组，BD OptEIATM(编号555183，DB).

[0418] IL-15：人IL-15ELISA组，BD OptEIATM(编号559268，DB).

[0419] IL-2：人IL-2ELISA组，BD OptEIATM(编号555190，DB).

[0420] IL-4：人IL-4ELISA组，BD OptEIATM(编号555194，DB).

[0421] IL-5：人IL-5ELISA组，BD OptEIATM(编号555202，DB).

[0422] IL-6：人IL-6ELISA组I，BD OptEIATM(编号555220，DB).

[0423] IL-8：人IL-8ELISA组，BD OptEIATM(编号555244，DB).

[0424] MCP-1：人MCP-1ELISA组，BD OptEIATM(编号555179，BD)

[0425] TNF-α：试剂盒人TNF ELISA组，BD OptEIATM(编号555212，DB).

[0426] 吸光度读值：在Fusion Alpha平板读数器(Perkin Ehner)上对吸光度读值。

[0427] 重复移液器，数字移液器或多通道移液器。

[0428] 4.2方法

[0429] 样品的制备

[0430] 样品是来自培养的人细胞(典型地，全血，WBC，PBMC，纯化的WBC亚型，癌症细胞系)的培养基上清。通过离心(400g5分钟4℃)移除任何颗粒材料并立即测定或在-20℃储存样品。避免重复的冻融循环。

[0431] 使用前一小时，在冰上解冻样品并将它们离心。在步骤11，将样品在测定稀释液直接稀释于平板(首先加入测定稀释液，随后加入样品并上下吸液)：

[0432] 标准物的制备

[0433] 在室温将冻干的标准物加温后，小心地打开小瓶以避免物质的损失。用建议体积的去离子水复原冻干的标准物以获得储液标准物。在进行稀释之前让标准物平衡至少
15分钟。温和地蜗旋混合。复原后，立即以50μl每小瓶在聚丙乙烯小瓶钟等分储液并
在-20℃冷冻达6个月。如果需要，在等分/冷冻前，在2-8℃储存达8小时。不要将复原
的标准物置于室温。

[0434] 在使用前，立即使用在试剂稀释液中的2-倍系列稀释制备十点标准曲线。建议4000pg/ml的高标准物。

[0435] 检测剂混合物的制备

[0436] 生物素/SAv试剂的一步孵育。加入所需体积的检测抗体以测定稀释液。使用前15分钟内，加入所需量的酶试剂，良好蜗旋或混合。对于建议的稀释度，参见组特定的说明/分析证书(lot-speciﬁc Instruction/analysis Certiﬁcate)。使用后弃去任何残留的
工作检测剂。

[0437] 用捕获抗体包被

[0438] 1.以稀释于包被缓冲液中的100μL每孔捕获抗体包被PVC微量滴定板孔。对于建议的抗体包被稀释度，参见组特定的说明/分析证书。

[0439] 2.用粘性塑料覆盖平板并4℃孵育过夜。

[0440] 3.移除包被液并用150μl洗涤缓冲液加满孔洗涤平板。

[0441] 4.通过在水池上轻弹平板将溶液或洗涤液移除。

[0442] 5.为了总共三次洗涤，重复该过程两次。

[0443] 6.最后一次洗涤之后，通过在纸巾上轻拍移除任何残留的洗涤缓冲液。

[0444] 封闭

[0445] 7.通过每孔加入100μl试剂稀释液封闭包被的孔中残留的蛋白-结合位点。

[0446] 8.用粘性塑料覆盖平板并室温孵育1h。

[0447] 9.在孵育过程中，开始制备标准物。

[0448] 加入样品

[0449] 10.如在步骤3中用150μl洗涤缓冲液进行一次洗涤。此时，平板准备好用于加入样品。

[0450] 11.将50μl在测定稀释液中适当稀释的样品加入每孔。为了精确的定量结果，总是比较针对标准曲线的信号的未知样品的信号。必须用每种细胞因子进行标准物(一式三
份)和空白以确保精确性。

[0451] 12.用粘性塑料覆盖平板并孵育室温孵育2h。

[0452] 用检测抗体和二抗孵育

[0453] 13.如步骤3用150μl洗涤缓冲液洗涤平板四次。

[0454] 14.将50μl检测剂混合物(在测定稀释液中的检测抗体+第二链亲和素-HR抗体)以建议的稀释度加入每孔(参见组特定的说明/分析证书).

[0455] 15.用粘性塑料覆盖平板并室温光保护下孵育1h。

[0456] 16.如步骤3用150μl洗涤缓冲液洗涤平板六次。

[0457] 17.将50μl DAKO TMB溶液加入每孔，不密封室温暗处孵育15-20分钟。

[0458] 18.将50μl终止液加入每孔。温和地轻拍平板以保证完全混合。

[0459] 19.在平板混合器上以500rpm混合平板5分钟。

[0460] 20.在450nm对光密度读值.(程序：在Fusion Alpha平板读数器上的细胞因子_ELISA)。

[0461] 数据分析

[0462] 将对于各个标准对照和各个样品的一式三份的读值平均。减去平均零标准光密度(O.D)。建立标准曲线，其绘制细胞因子浓度的对数相对O.D的对数的曲线并且可以通过回
归分析确定最佳拟合线。如果样品已被稀释，从标准曲线读出的浓度必需乘以稀释系数。应该对各个测定样品组产生标准曲线。使用Grugg′s测试避免极端值数据。随后弃去不在
SD的两倍区间内的数据。如果阳性对照显示如之前观察到的数据，则考虑独立实验。汇集
独立实验(N＞3)。

[0463] 以pg/ml的细胞因子释放或以与无抑制剂处理诱导条件相比的％提供数据。

[0464] 实施例5：对于细胞因子释放的THP1分化-刺激

[0465] 在下文中，将列出描述怎样诱导从由LPS激发6h的人PMA分化的THP1细胞的细胞因子产生以测试本发明的JNK抑制剂(尤其SEQ ID NO：172的JNK抑制剂)降低刺激-诱
导的细胞因子释放的能力的过程。对于细胞因子释放的读出，由不同配体离体刺激THP1细
胞。在非毒性剂量，JNK抑制剂效率与未处理样品相比细胞因子水平的降低标识并由ELISA
监控。由tretazolium盐(MTS)还原为甲瓒(产生紫色)评估化合物的毒性。

[0466] 过程：

[0467] a.材料

[0468] 细胞系：THP-1(编号TIB-202，ATCC，批次57731475)

[0469] 培养基，试剂和平板

[0470] RPMI(编号21875-091，Invitrogen)补充以：

[0471] 10％ FBS(编号A15-151，PAA)：在56℃，30分钟去补体

[0472] 10mM Hepes(编号H0887，Sigma)

[0473] 50Mβ-巯基乙醇(编号63690，Fluka：以14.3M储存)：加入560 l储存在-20℃的溶于PBS的50mM等分部分)

[0474] 1mM丙酮酸钠(编号S8636，Sigma)

[0475] 青霉素(100单位/ml)/链霉素(100μg/ml)(编号P4333，Sigma)

[0476] 随后将RPMI培养基用0.22M滤器(编号SCGPU05RE，Millipore)过滤。

[0477] PBS 10X(编号70011，Invitrogen)：用无菌H2O稀释到1X

[0478] DMSO：编号41444，Fluka

[0479] PMA(佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯，编号P1585，Sigma，浓度为于DMSO中1mM＝616.8ug/ml-20℃)。直接以在RPMI100nM的终浓度(10ml的培养基中1ul)使用。

[0480] LPS超纯(脂多糖，编号tlrl-eklps，Invivogen，浓度5mg/ml)：LPS储液：4℃ 3g/ml溶于PBS。直接用于在RPMI培养基中制备40ng/ml的4X浓缩溶液(最小1800 l/板；对于5个平板：125 l的LPS 3g/ml+9250 lRPMI)。

[0481] 96孔板：

[0482] 用于粘着细胞培养(编号167008，Nunc)

[0483] 用于收集上清(编号82.1581，Sarstedt)

[0484] 用于ELISA(F96maxisorp，编号442404，Nunc)

[0485] 包被溶液：聚D-赖氨酸(编号P9011，Sigma)：最终稀释于PBS 1x 25g/ml

[0486] ELISA试剂和试剂盒

[0487] 包被缓冲液ELISA：0.1M碳酸钠pH9.5( ＝7.13g NaHCO3(编号 71627，Fluka)+1.59g Na2CO3(编号71345，Fluka)于1升H2O中，用浓缩的NaOH调pH至9.5)

[0488] 洗涤缓冲液ELISA：PBS 1X+0.01％吐温20(编号P1379，Sigma，批次094K0052)(＝制备1升PBS 1X并缓慢加入100ul吐温20，同时用磁力搅拌器混合)

[0489] 测定稀释液：PBS 1X+10％FBS(编号A15-151，PAA，在56℃，30分钟去补体).

[0490] DAKO TMB(编号S1599，DAKO)：商业化底物溶液

[0491] 终止溶液：1M H3PO4(→对于200ml＝177ml H2O+23ml H3PO485％(编号345245，Aldrich).

[0492] TNF-：试剂盒人TNF ELISA组，BD OptEIA(编号555212，DB).

[0493] 细胞毒性测量：CellTiter96试剂(编号G3581，Promega)

[0494] 对照化合物：SP600125(编号ALX-270-339-M025，Alexis，浓度：20mM DMSO)

[0495] 吸光度读值：在Fusion Alpha平板读数器(Perkin Elmer)上对吸光度读数。

[0496] 重复移液器，数字移液器或多通道移液器。

[0497] TopSeal-A：96孔微孔板封条(编号600585，PerkinElmer).

[0498] b.方法

[0499] 孔包被

[0500] 用200 l聚D-赖氨酸(1x)包被平板并在37℃，CO2 5％和100％相对湿度孵育2小时。

[0501] 细胞铺板

[0502] 2小时之后，用200 l PBS 1X洗涤孔(立即使用或在37℃保持于200l的PBS 1X，但不超过3天)。

[0503] 计数细胞。取所需的细胞数量并重悬在达到1′000′000细胞/ml的稀释度所需要的培养基的量中。将100nM PMA加入以诱导THP1从悬浮的单核细胞到粘着巨噬细胞
的分化。将细胞以100′000细胞/孔的密度铺板于孔中100 l培养基中。接种之后，在
37℃，5％CO2和100％相对湿度孵育平板3天以让它们分化，之后加入实验药物。

[0504] 细胞处理

[0505] 3天后，用显微镜观察粘着细胞。吸出包含PMA的培养基并用100 l无PMA的新鲜RPMI培养基替代(无用PBS 1X洗涤的步骤)。

[0506] 以在H2O或DMSO中10mM的浓度制备实验药物并储存在-80℃。在每个每日使用之前，解冻JNK抑制剂的一个等分部分并在RPMI培养基中稀释达到4X的浓缩溶液(120M)
并随后在RPMI中稀释到所需的浓度。将SP600125在RPMI培养基中稀释达到4X浓缩的溶
液(40M)并随后在包含0.8％ DMSO的RPMI中稀释到所需浓度。

[0507] 用50 l培养基或4X最终所需药物浓度的溶液(对于JNK化合物0，100nM，1，3，10或30M终浓度或对于SP600125阳性对照0，10，100nM，1，3或10M终浓度)处理平板。加入
药物之后，在37℃，5％CO2和100％相对湿度孵育平板另外1h。

[0508] 1小时候，通过加入50 l LPS超纯4X浓缩稀释(3ng/ml终浓度)诱导TNF的分泌。

[0509] 测定

[0510] 6小时之后，将100 l的上清转移至96孔板。密封那些板并储存在-20°直到通过ELISA(例如参见实施例4)分析细胞因子的分泌。

[0511] 通过MTS吸光度(例如参见实施例4)评估化合物的细胞毒性效果并且使用倒置显微镜(Axiovert 40CFL；Zeiss；10X)观察细胞。

[0512] 数据分析

[0513] 如在ELISA(参见实施例4)中指示的进行数据分析。简略地，对于ELISA：将对于各个标准对照和各个样品的一式三份的读值平均。减去平均零标准光密度(O.D)。建立标
准曲线，其绘制细胞因子浓度的对数相对O.D的对数的曲线并且可以通过回归分析确定最
佳拟合线。如果样品已被稀释，从标准曲线读出的浓度必需乘以稀释系数。应该对各个测
定样品组产生标准曲线。使用Grugg′s测试避免极端值数据。随后弃去不在SD的两倍区
间内的数据。如果阳性对照显示如之前观察到的数据，则考虑独立实验。汇集独立实验(N
＞3)。

[0514] 对于细胞毒性效果评估：对于细胞因子释放实验分析考虑的各个独立实验的各个平板上，单独培养基的吸光度的平均值被认为是背景并且从各个吸光度值减去。各个化合
物的未处理细胞的一式三份的平均值被认为是100％生存能力。各个化合物的一式三份的
平均值由其100％标准化。使用Grugg′s测试避免极端值数据。随后随后弃去不在SD的
两倍区间内的数据。汇集独立实验(N＞3)。

[0515] 通过GraphPad Prism4软件以如下测试进行条件的所有统计比较：单向ANOVA测试，随后Tukey′s多重比较测试。P＜0.05被认为显著。

[0516] 实施例6：SEQ ID NO：172的JNK抑制剂和在原代大鼠或人全血细胞中TNFα释放

[0517] 使用连接于包含柠檬酸钠的预标记的真空管的静脉穿刺从麻醉的大鼠或人健康志愿者收集全血。通过倒置7-8次温和混合管；并随后保持在室温直到刺激。在PBS中6
倍浓缩制备SEQ ID NO：172JNK抑制剂，并且将30μl/孔的混合物加入96-孔板。在PBS
中1∶2稀释全血并将120μl稀释的血液加入各个孔，所述孔中之前已经仅加入PBS或
加入SEQ ID NO：172的JNK抑制剂。在37℃；85rpm(Stuart Orbital温箱SI500)孵育全
血60分钟。制备激活剂(LPS)，30μl/孔的LPS，6倍浓缩。孵育60分钟后，将LPS加入血
液，通过上下吸液混合血液病随后在搅拌条件(85rpm)在37℃下保持。孵育4h后，在预冷
的离心机中约770g，4℃离心平板15分钟。最终收集上清并保持在-20℃直到测量细胞因
子。随后使用标准Elisa试剂盒(例如来自R&D systems的：DuoSet Elisas；或来自BD
Biosciences的：BD Opteia Set Elisa)测量细胞因子(IL-6，IL-2，IFNγ和TNFα)。结
果表示为测量的细胞因子的上清的pg/ml。

[0518] 用PMA+离子霉素替代LPS作为激活剂/刺激剂进行类似的实验。

[0519] 实施例7：在本文中公开的特定JNK抑制剂的半衰期

[0520] 在人血清(10和50％于PBS1x中)中消化序列SEQ ID NOs：196，197，和172的JNK抑制剂(0.1mM终浓度)。如由Tugyi等人(Proc Natl Acad Sci U S A，2005，413-418)描
述的进行实验。用UPLC-MS定量残留的完整肽。同样地但在两个分开的测定中评估SEQ ID
NOs：196，197，和172的稳定性。在SEQ ID NO：196的JNK抑制剂在6小时内完全被降解
为氨基酸残基的同时，SEQ ID NO：172的JNK抑制剂仅在14天后被完全降解。SEQ ID NO：
197的JNK抑制剂在30天后仍然稳定。

[0521] 实施例8：由序列SEQ ID NO：172的JNK抑制剂对大鼠原代T-细胞中CD3/CD28-诱导的IL-2释放的剂量依赖的抑制

[0522] 牺牲对照动物，收获淋巴结(LN)并保持在RPMI培养基中。在70μm滤器上使用5ml 活塞用完全RPMI粉碎LN。加入几滴培养基以保持滤器潮湿。在450g和4℃离心细胞
7分钟。在5ml新鲜培养基中重悬沉淀。将细胞再次通过细胞滤器。计数一个等分部分的
7
细胞，同时在1400rpm和4℃离心细胞10分钟。在MACS缓冲液(每10 细胞80μl MACS
缓冲液)中重悬细胞。每1千万加入10μl抗大鼠MHC微珠，将细胞在4°-8℃孵育15分
钟。将细胞用15ml MACS缓冲液洗涤并在700g和4℃离心7分钟。以500μl MACS缓冲液
8
每10 细胞重悬沉淀。每个动物将一个LS柱置于MACS分离器的磁场中。首先用3ml MACS
缓冲液冲洗柱。将一个管置于所述柱下方冰中以收集细胞＝T细胞(负选择，因此我们收
集洗脱的物质)。加入细胞重悬液并在冰上收集洗脱液。用3mL MACS缓冲液洗涤柱3次。
将洗脱的T细胞在700g和4℃离心7分钟。计数重悬细胞并以200000细胞/孔的密度铺
于100μl完全培养基中。在实验前一天，平板预包被有2μg/mL的CD3抗体，并且实验当
天用PBS洗涤平板三次。用100μl的(多)肽JNK抑制剂(SEQ ID NO：172)(在配体活
化前1h两倍浓缩)处理细胞。用(多)肽JNK抑制剂(SEQ ID NO：172)预处理1h之后，
随后用2μg/mL的抗CD28抗体刺激细胞24h。刺激24h之后，收集上清并储存在-20℃直
到分析。随后使用标准Elisa试剂盒测量细胞因子。结果表示为测量的细胞因子的上清的
pg/ml。

[0523] 在进一步实验中，基本上使用如上文列出的相同的方案，但除了SEQ ID NO：172的(多)肽JNK抑制剂之外，还测试序列SEQ ID NO：197的JNK抑制剂和药物分子SP600125，这样以允许比较这些抑制剂在抑制CD3/CD28-诱导的IL-2释放方面的效果。

[0524] 实施例9：JNK抑制剂和人全血中TNFα/IL-2释放：

[0525] 使用连接于包含柠檬酸钠的预标记的真空管的静脉穿刺从人健康志愿者收集全血。通过倒置7-8次温和混合管；并随后保持在室温直到刺激。将350μl的RPMI+P/S加入
1,2ml-96-孔板。在RPMI+P/S中制备10倍浓缩的SEQ ID NO：172(50μl每孔)。将50μl
加入1.2ml-96孔板。随后将50μl的全血加入各个孔，所述孔中之前已经仅加入培养基或
加入JNK抑制剂。在37℃，5％ CO2孵育全血60分钟。制备稀释于RPMI+P/S中的50μl/
孔的配体，对应于最终10倍浓缩的稀释。孵育60分钟后，加入配体；随后通过上下吸液混
合血液。在37℃孵育全血3天(通过每天每孔良好地上下吸液一次混合孔)。孵育的最后，
将平板混合并随后在预冷的离心机中2500rpm，4℃离心15分钟。随后使用标准Elisa试剂
盒测量细胞因子。结果表示为测量的细胞因子的上清的pg/ml。

[0526] 以细小的修饰进行类似实验。在CD3/CD8刺激的情况下，以2μg/mL于PBS 4℃过夜包被CD3抗体。实验当天，用PBS洗涤孔三次并以PBS在37℃保持直到使用。在SEQ ID
NO：172终浓度2g/mL之后1h加入CD28抗体；刺激3天后收集上清。

[0527] 实施例10：内毒素诱导的葡萄膜炎(uveitis)(EIU)的大鼠模型中的抗炎症效力

[0528] 在大白鼠中按照静脉内施用(EIU/LPS模型)测试SEQ ID NO：172JNK抑制剂的抗炎症效力。本研究的目的是确定内毒素-诱导的葡萄膜炎(uveitis)大白鼠模型中单一静
脉内注射SEQ ID NO：172(0.015，0.18，和1.80mg/kg)对炎症应答的效果和将这些效果与
用现有技术JNK抑制剂SEQ ID NO：197(2mg/kg)获得的效果比较。用作进一步控制使用的
地塞米松磷酸钠。

[0529] 将六十(60)只雄性Lewis大鼠随机分为六(6)组，每组十(10)只动物。通过爪垫注射脂多糖(LPS，1mg/kg)诱导EIU。通过静脉内注射施用NaCl(0.9％)，2mg/kg的SEQ
ID NO：197和三个浓度(1.80mg/kg，0.18mg/kg和0.015mg/kg)的SEQ ID NO：172。通过结
膜下注射在双眼中施用地塞米松磷酸钠(20μg/眼)。LPS注射后24小时，通过临床评分
评估炎症应答。

[0530] 对于每个眼，以从0至4的级别对临床眼的炎症的强度评分：

[0531]

[0532] (+1)纤维蛋白形成和瞳孔闭锁(seclusion of pupils)

[0533] LPS诱导二十四小时后，对于载体处理的大鼠，临床得分是3.6±0.2(平均值±SEM，n＝20)，中位数是4(范围，2-5)。诱导24小时和用SEQ ID NO：197(2mg/kg)静脉
内处理后检测到眼的炎症的严重度的显著降低(p＜0.001)(平均得分：2.2±0.3，中位数：
2)，对应于与在载体组中观察到的得分相比EIU得分的40％的降低。用SEQ ID NO：172以
大约相同的剂量(1.80mg/kg)静脉内处理也以42％显著降低眼的炎症的严重度(平均得
分：2.1±0.3，中位数：2，p＝0.001)。更低的剂量(0.18和0.015mg/kg)分别以33％(平
均得分：2.4±0.3，中位数：2)和36％(平均得分：2.3±0.3，中位数：2)降低炎症。降低是显著的，p＜0.001。

[0534] 以用作阳性对照的药物地塞米松(dexamethasone)(20μg/眼)结膜下处理也以79％显著降低临床得分(平均得分：0.8±0.2，中位数：0.5，p＜0.001)。

[0535] 在这些实验条件下，可以说以2mg/kg单次静脉内注射SEQ ID NO：197部分阻止在前房中观察到的内毒素-诱导的炎症。相比之下，以0.015，0.18，1.80mg/kg静脉内注射的SEQ ID NO：172也降低前房中内毒素-诱导的炎症。

[0536] 实施例11：慢性建立的II型胶原性关节炎大鼠模型中14天后静脉内施用JNK抑制剂的剂量-响应效果

[0537] 大鼠胶原关节炎是多关节炎(polyarthritis)的实验模型，其已被广泛用于很多在临床前或临床研究中的或目前用作该疾病中的治疗剂抗关节炎剂的临床前测试。该模型
的特点是可靠的发病和稳健的进程，容易测量的多关节炎的炎症，与血管翳形成相关的显
著的软骨破坏，和轻度到中度骨吸收和骨膜骨增生。

[0538] 在所述实验模型中确定用于抑制炎症(足肿胀)每日(QD)施用SEQID NO：172的JNK抑制剂14天(关节炎d1-14)的静脉内(IV)效力，软骨破坏，和建立的大鼠II型胶原
关节炎中发生的骨吸收。

[0539] 用异氟烷麻醉动物(对于关节炎，8只/组)，并于第0和第6天，在尾的基部和背部的2个位点注射以300μl包含2mg/ml牛II型胶原(Elastin Products，Owensville，
Missouri)的弗氏不完全佐剂(Difco，Detroit，MI)。在研究的第10天(关节炎d0)，出现
关节炎发病并且将大鼠随机分配到治疗组。在至少一只后爪明显产生踝关节肿之后进行随
机分入各组。

[0540] 在关节炎的第1-14天，每日(QD)通过静脉内(IV)途径用载体(NaCl)，SEQ IDNO：172(0.01，0.1，1，或5mg/kg)，或参照化合物地塞米松(dexamethasone)(Dex，0.05mg/kg)处理具有建立的II型胶原关节炎的雌性Lewis大鼠。动物在关节炎第14天终止。效
力评价基于动物体重，每日踝卡尺测量，表达为曲线下面积(AUC)的踝直径，末期后爪重，和选择的组的踝和膝盖的组织病理学评价。

[0541] 根据以下标准的对于炎症，血管翳形成和骨吸收的0-5的得分给出关节胶原关节炎的踝和膝盖的评分：

[0542] 膝盖和/或踝炎症

[0543]

[0544] 踝血管翳

[0545] 0 正常

[0546] 0.5 软骨和软骨下骨中血管翳的最小浸润，仅影响边缘区并且仅影响少数关节

[0547] 1 软骨和软骨下骨中血管翳的最小浸润，主要影响边缘区

[0548] 2 轻度浸润(胫骨或跗骨的＜1/4在边缘区)

[0549] 3 中度浸润(胫骨或小跗骨的1/4至1/3在边缘区受影响)

[0550] 4 显著浸润(胫骨或跗骨的1/2至3/4在边缘区受影响)

[0551] 5 严重浸润(胫骨或跗骨的＞3/4在边缘区受影响，总体结构的严重变形)

[0552] 膝盖血管翳

[0553] 0 正常

[0554] 0.5 软骨和软骨下骨中血管翳的最小浸润，仅影响边缘区和仅影响少数关节

[0555] 1 软骨和软骨下骨中血管翳的最小浸润，软骨表面或软骨下骨的大约1-10％受影响

[0556] 2 轻度浸润(延伸达胫骨或股骨的表面或软骨下区域的1/4)，软骨表面或软骨下骨的大约11-25％受影响

[0557] 3 中度浸润(延伸胫骨或股骨的表面或软骨下区域的＞1/4但＜1/2)软骨表面或软骨下骨的大约26-50％受影响

[0558] 4 显著浸润(延伸胫骨或股骨表面的1/2至3/4)软骨表面或软骨下骨的大约51-75％受影响

[0559] 5 严重浸润软骨表面或软骨下骨的大约76-100％受影响

[0560] 踝软骨损伤(着重在小跗骨上)

[0561] 0 正常

[0562] 0.5 T蓝染色的最小减少，仅影响边缘区和仅影响少数关节

[0563] 1 最小＝甲苯胺蓝染色的最小至轻度损失，伴有不明显的软骨细胞损失或胶原破坏

[0564] 2 轻度＝甲苯胺蓝染色的轻度损失，伴有病灶轻度(表面的)软骨细胞损失和/或胶原破坏

[0565] 3 中度＝甲苯胺蓝染色的中度损失，伴有多病灶中度(深至中间区)软骨细胞损失和/或胶原破坏，受影响到1/2至3/4深度的较小的跗骨，伴有罕见的完全厚度丧失的区
域

[0566] 4 显著＝甲苯胺蓝染色的显著损失，伴有多病灶显著(深至深层)软骨细胞损失和/或胶原破坏，1或2小跗骨表面具有软骨的完全厚度丧失

[0567] 5 严重＝甲苯胺蓝染色的严重扩散丧失，伴有多病灶严重(深至潮痕(tidemark))软骨细胞损失和/或胶原破坏，影响多于2个软骨表面

[0568] 膝盖软骨损伤

[0569] 0 正常

[0570] 0.5 T蓝染色的最小减少，仅影响边缘区

[0571] 1 最小＝甲苯胺蓝染色的最小至轻度损失，伴有不明显的软骨细胞损失或胶原破坏

[0572] 2 轻度＝甲苯胺蓝染色的轻度损失，伴有病灶轻度(表面的)软骨细胞损失和/或胶原破坏轻度，可以具有很少的软骨的50％深度受影响的小区域

[0573] 3 中度＝甲苯胺蓝染色的中度损失，伴有多病灶至扩散的中度(深至中间区)软骨细胞损失和/或胶原破坏中度，可以具有1-2个完全厚度丧失小区域(影响少于
表面的总宽度的1/4和不多于所有表面的总宽度的25％)

[0574] 4 显著的＝甲苯胺蓝染色的显著损失，伴有多病灶至扩散的显著(深至深层)软骨细胞损失和/或胶原破坏或几乎完全损失的1个表面及其它的部分损失，总损失
少于组合的所有表面的宽度的50％

[0575] 5 严重＝在股骨和/或胫骨二者上甲苯胺蓝染色的严重扩散丧失，伴有多病灶严重(深至潮痕(tide mark))软骨细胞损失和/或胶原破坏严重，总损失大于组合的所
有表面的宽度的50％

[0576] 踝骨吸收

[0577] 0 正常

[0578] 0.5 仅边缘区的最小的再吸收影响和仅影响少数关节

[0579] 1 最小＝小的再吸收区域，在低放大倍数不很明显，少见破骨细胞

[0580] 2 轻度＝更多的再吸收区域，在低放大倍数不很明显，破骨细胞更多，胫骨或跗骨的＜1/4在边缘区再吸收

[0581] 3 中度＝髓骨小梁和皮质骨明显的再吸收，皮质中没有完全厚度缺陷，损失一些髓骨小梁，在低放大倍数明显的损伤，更多破骨细胞，胫骨或跗骨的1/4至1/3在边缘
区受影响

[0582] 4 显著＝皮质骨中完全厚度缺陷，经常伴有残留的皮质表面外形变形，显著的髓骨缺失，很多破骨细胞，胫骨或跗骨的1/2至3/4在边缘区受影响

[0583] 5 严重＝皮质骨中完全厚度缺陷，经常伴有残留的皮质表面外形变形，显著的髓骨缺失，很多破骨细胞，胫骨或跗骨的＞3/4在边缘区受影响，整体结构的严重变形

[0584] 膝盖骨吸收

[0585] 0 正常

[0586] 0.5 最小的再吸收，仅影响边缘区

[0587] 1 最小＝小的再吸收区域，在低放大倍数不很明显，软骨下骨总关节宽度的大约1-10％受影响

[0588] 2 轻度＝更多的再吸收区域，明确的软骨下骨损失，软骨下骨的总关节宽度的大约11-25％受影响

[0589] 3 中度＝明显的软骨下骨再吸收，软骨下骨的总关节宽度大约26-50％受影响

[0590] 4 显著的＝明显的软骨下骨再吸收，软骨下骨的总关节宽度的大约51-75％受影响

[0591] 5 严重＝由于破坏导致的整个关节变形，软骨下骨的总关节宽度的大约76-100％受影响

[0592] 结果：

[0593] 疾病对照组中疾病严重度从第1至第5天增加，在第4-5天具有最大的每日增加。随后增加的增加量更小，到第7天达到峰值。从那个点向前，急性肿胀普遍减少并且卡尺测量值减少。治疗组也遵循这个普遍的样式。

[0594] 在所有疾病组中观察到体重损失，然而正常对照组具有体重增加。对于与载体处理的疾病对照相比的用5mg/kg SEQ ID NO：172处理的大鼠，体重损失显著被(25％，通过
ANOVA p＜0.05)抑制。当使用Student′s t-检验与疾病对照比较时，对于用1mg/kg SEQ
ID NO：172(21％，p＜0.05)或Dex(21％，p＜0.05)处理的大鼠，体重损失的抑制也是显
著的。对于该参数，用SEQ ID NO：172处理的结果是剂量响应的。

[0595] 与疾病对照相比，对于用5mg/kg SEQ ID NO：172(第4-12天p＜0.05)或Dex(第3-14天p＜0.05)处理的大鼠，每日踝直径测量值显著(通过双向RMANOVA，p＜0.05)向
正常降低。

[0596] 与疾病对照相比，对于用5mg/kg SEQ ID NO：172(降低43％)，1mg/kg SEQ ID NO：172(27％)，或Dex(97％)处理的大鼠，踝直径AUC显著(通过ANOVAp＜0.05)向正常降
低。对于该参数，用SEQ ID NO：172处理的结果是剂量响应的。

[0597] 与疾病对照相比，对于用5mg/kg SEQ ID NO：172(26％降低)或Dex(114％)处理的大鼠，最终爪重显著(通过ANOVA p＜0.05)向正常降低。对于该参数，用SEQ ID NO：
172处理的结果是剂量响应的。

[0598] 与疾病对照相比，对于任何处理组中的大鼠，相对肝重不显著(通过ANOVA)受影响。

[0599] 与疾病对照相比，对于用Dex处理的大鼠，相对于体重的脾重显著(通过ANOVA p＜0.05)降低。与正常对照相比，对于Dex处理的大鼠，相对脾重也显著降低。对于用SEQ
ID NO：172处理的大鼠，相对脾重未显著受影响。

[0600] 与疾病对照相比，相对于体重的胸腺重量显著(通过ANOVA p＜0.05)降低。对于Dex处理的大鼠。与正常对照相比，对于Dex处理的大鼠，相对胸腺重量也显著降低。对
于用SEQ ID NO：172处理的大鼠，相对胸腺重量未显著受影响。

[0601] 与疾病对照相比，对于用5mg/kg SEQ ID NO：172处理的大鼠(合计得分降低25％)，所有踝组织病理学参数显著(通过曼-惠特尼U检验)向正常降低。

[0602] 与疾病对照相比，对于用5mg/kg SEQ ID NO：172处理的大鼠(合计得分降低73％)，所有膝盖组织病理学参数显著(通过曼-惠特尼U检验)向正常降低。

[0603] 该研究结果显示用SEQ ID NO：172(5mg/kg)每日静脉内处理在与大鼠中建立II型胶原关节炎相关的临床和组织病理学参数方面具有显著的有益效果。用SEQ ID NO：
172(1mg/kg)处理导致显著减少的踝直径AUC。尽管疾病对照动物中第7天之后肿胀减少，
但直到第12天观察到对踝直径的有益效果。用SEQ ID NO：172处理的结果是剂量响应的。

[0604] 不像地塞米松(dexamethasone)，用SEQ ID NO：172的处理对于器官重量无副作用。

[0605] 实施例12：三个剂量的SEQ ID NO：197的完全-D-逆反JNK-抑制剂(多)肽和SEQ ID NO：172的JNK抑制剂(多)肽在东莨菪碱-诱导的鼠干眼模型中的效果

[0606] 研究理念

[0607] 本研究的目的是评估三个剂量水平的两种不同化合物(SEQ ID NO：197的完全-D-逆反JNK-抑制剂(多)肽和SEQ ID NO：172的JNK抑制剂(多)肽)在东莨菪
碱-诱导的鼠干眼模型中的效果。

[0608] 在该鼠干眼模型中测试SEQ ID NO：197和SEQ ID NO：172的肽的效力。以低，中和高剂量测试两种肽。对于SEQ ID NO：197的肽，对低，中和高剂量水平的制剂样品中测量的浓度分别是0.06％(w/v)，0.25％(w/v)和0.6％(w/v)，并且对于SEQ ID NO：172，对低，中和高剂量水平的制剂样品中的测量浓度分别是0.05％(w/v)，0.2％(w/v)和0.6％(w/
v)。载体(还用作阴性对照)为用于注射USP的0.9％氯化钠。

[0609] 本研究由总共9组雌性C57BL/6小鼠组成，包含每组12只小鼠的8组和另外一个4只小鼠的组。通过东莨菪碱氢溴酸盐(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)注射(皮下
(SC)，每日四次，0.5mg/剂，第0-21天)和将小鼠暴露于连续通气的干燥环境的组合诱导
双侧短期干眼。第1天开始，组1-8的小鼠每日三次(TID)以双侧眼表面(双眼；OU)施用
(5μL/眼/剂)载体(0.9％无菌盐水；阴性对照物)；SEQ ID NO：197的肽(0.06％，0.25％
和0.6％)，the SEQ ID NO：172的肽(0.05％，0.2％和0.6％)；或环孢菌素(0.05％；阳性对照，用于降低免疫系统活性的免疫抑制剂药物)治疗达21天。组9的小鼠维持为未诱导
的，(无干眼)未治疗对照。

[0610] 在存活(治疗)期间，每日记录一次临床观察；用角膜荧光素染色的裂隙灯检查(SLE)，泪膜破裂时间测试(TBUT)，和酚红棉线试验(PRTT)每周进行三次。在第22天进行
尸检；从每个动物的双眼收集眼，眼睑，结膜，和泪腺。固定源自右眼(右眼，OD)的组织并随后在显微镜下评估。源自左眼(左眼；OS)的组织被快速冷冻于液氮中并冷冻储存在-80℃
用于可能的后续分析。

[0611] 表5：实验设计

[0612]

[0613] *环孢菌素

[0614] 方法

[0615] 1.剂量制备

[0616] SEQ ID NO：197的(多)肽作为包含300.65mg干粉的1.5-mL透明塑料离心小瓶获自多肽实验室(法国)。

[0617] SEQ ID NO：172的(多)肽作为包含302.7mg干粉的1.5-mL透明塑料离心小瓶获自多肽实验室(法国)。

[0618] 在研究开始之前，将SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：197的(多)肽配制于无菌盐水(载体)中。每个浓度的剂量给药溶液使用0.2-μm滤器灭菌，等分到多个预先标记的
小瓶并在-20℃冷冻。对于SEQ ID NO：197的肽，测量的在制剂样品中的浓度为0.058％，
0.25％和0.624％，四舍五入为0.06％，0.25％和0.6％。对于SEQ ID NO：172的肽，测量
的在制剂样品中的浓度为0.053％，0.217％和0.562％，四舍五入为0.05，0.2％和0.6％。

[0619] 在剂量给药的每天，解冻一组剂量给药溶液并用于那天的剂量施用。提供即用型对照(载体，环孢菌素)；不需要剂量制备。

[0620] 2.裂隙灯检查(SLE)

[0621] 在进入研究之前，每个动物经历使用表面应用的荧光素的SLE和间接的眼检查。使用Draize眼评分量表(Draize scale ocular scoring)记录眼的研究结果。在存活期
间，每周重复SLE和Draize评分三次。

[0622] 3.泪膜破裂时间(TBUT)测试和随后的角膜检查

[0623] 通过测量向角膜施用荧光素之后的完全眨眼和泪膜中的第一个随机干斑的出现之间的逝去时间(以秒记录)，每周实施TBUT测试三次。为了进行TBUT，将0.1％液体荧光
素钠滴入结膜囊，手动关闭眼睑三次并随后保持开启，显示覆盖角膜的连续的包含荧光素
的泪膜，并且记录所述膜破裂(干斑或干条纹的出现)所需的时间(以秒记录)。至少九十
秒之后，在另一滴0.1％荧光素再施用于角膜之后，通过使用具有钴蓝滤片的裂隙灯对角膜上皮的破坏进行分级；随后根据Draize眼量表对角膜评分。

[0624] 4.酚红棉线泪液测试(PRTT)

[0625] 每周使用PRTT测试条(Zone-Quick；Menicon，Nagoya，日本)在双眼中三次测量泪液生成。在该日的第一次治疗之前，棉线在裂隙灯生物显微镜下应用于每只眼的结膜穹
窿的外眦30秒。使用毫米刻度测量泪液在棉线上的迁移(即，浸湿的棉线的长度)。

[0626] 5.尸检和病理学

[0627] 在第22天尸检时，从每只动物摘除双眼(包括球体，泪腺，眼睑，和结膜)。通过过夜浸没在改进的Davidson′s溶液中随后转移至10％中性缓冲福尔马林(NBF)，固定右眼和相关组织。将右眼的固定的组织脱水，包埋在石蜡中，切片为3至5-μm的厚度，并且用
苏木精和伊红(H&E)染色装载于载玻片上的组织。通过光学显微镜评价染色的载玻片。对
眼的所有部分进行详细的和完全的组织学评价，在至少两个切片水平对每个右眼进行组织
学检查。对角膜、结膜和角膜的上皮(包括杯状细胞)，以及泪腺给予特别关注。对这些组
织的损伤基于0-4的量表进行评分，其中0为正常，1为最小，2为轻微，3为中等，和4为严
重。对于每个角膜，评分是基于角膜上皮厚度和角膜炎症。关于侵蚀和炎症以及杯状细胞
的存在或缺失，对结膜进行评分。

[0628] 结果

[0629] 每日四次SC施用东莨菪碱(0.5mg/剂量)在雌性C57BL/6小鼠中诱导干眼综合征，其特征在于水性的泪液的产生体积的减少和泪液的物理化学性质的改变，使得它们较
不能够维持能够有效润滑和保护眼的稳定泪膜。

[0630] 1.泪膜破裂时间(TBUT)测试和角膜检查

[0631] 在诱导干眼之前进行，和在干眼诱导后的第2，4，7，9，11，14，16，18和21天再次进行泪膜破裂时间测试(TBUTs)。在用东莨菪碱剂量给药开始(干眼诱导)之后，在所有动物中TBUT平均值开始降低，但似乎在组6(中间剂量的SEQ ID NO：172)中更缓慢地减少。对
于组5，6，7(低，中和高剂量的SEQ ID NO：172肽)，和组8(环孢菌素)，TBUT平均最低点
发生在第7天，达到相似的值(分别为6.6±0.4，6.7±0.4，6.7±0.3，和6.4±0.4s)。随
后，这些组的TBUT平均值在第9天增加到峰。组6和7(SEQ ID NO：172的中和高剂量组)
TBUT平均值上升到比组8(环孢菌素组(8.5±0.3s))更高的值(分别为10.0±0.7s和
9.9±0.8s)，同时组5(低剂量的SEQ ID NO：172)的TBUT峰平均值(8.0±0.4s)稍微低于
组8(环孢菌素)的TBUT峰平均值。对于中和高剂量的SEQ ID NO：197-治疗的动物(组
3和4)，TBUT平均值在剂量给药开始之后继续下降，在第9天达到最低值，同时低剂量组2
在第9天增加。SEQ ID NO：172-治疗的动物的低，中和高剂量TBUT平均值(分别为组2，
3和4)超过载体组并普遍低于SEQ ID NO：172治疗的动物的低，中和高剂量组平均值。

[0632] 当从第7天至第21天的TBUT值的曲线下面积(AUC)用于比较各种用载体对照的治疗，用低，中和高剂量的SEQ ID NO：172的肽(分别为0.05％，0.2％和0.6％)治疗时，
组5，6，和7，以及用环孢菌素(0.05％)治疗的动物(组8)显示显著的TBUT AUC的增加
(Kruskal-Wallis非参数的ANOVA)。SEQ ID NO：172的肽似乎产生剂量依赖的TBUT的增
加，中和高剂量经常产生类似的效果。此外，环孢菌素-治疗组，用三个剂量水平的SEQ ID NO：172治疗的组和未诱导的组(组5，6，7，8，和9)之间TBUT AUC无显著差异。该研究结
果提示SEQ ID NO：172的肽的全部三个剂量和环孢菌素在改善或逆转在该干眼模型中经历
TBUT改变的眼科改变方面大致效果相当。

[0633] 以低，中和高剂量水平的SEQ ID NO：197肽治疗的组(组2-4)显示稍微普遍的剂量依赖的TBUT的增加，其比用SEQ ID NO：172或环孢菌素治疗的动物大约晚两天开始增
加。

[0634] 表6：计算的TBUT AUC平均值：

[0635]

[0636] 2.酚红棉线泪液测试(PRTT)

[0637] 在干眼诱导之前进行，和在第2，4，7，9，11，14，16，18和21天再次进行PRTT测试。自第0天到第4天的PRTT值在所有进行干眼诱导的小鼠中都降低，表明在施用东莨菪碱和
暴露于增加的通风(由吹风机产生)的干燥环境中之后，泪液的产量减少。在大多数组中，
PRTT的最低值在大约第7天发生。在载体对照组(组1)中，PRTT持续降低，在第14天达
到最低值。最低值之后，在所有干眼组有增加。这些发现表明，比化合物治疗的开始早一天开始东莨菪碱处理，足以起始与干眼综合征相关的眼中的生理变化。甚至环孢菌素-治疗
组类似于其它组，经过大约第7天显示PRTT的减少，随后在第11-14天增加到峰值，随后稍
微减少。在最后的PRTT测试中(第21天)，环孢菌素(组8)，和组6和7都具有类似的
PRTT值，提示中和高剂量组的SEQ ID NO：172的肽治疗在此种鼠干眼模型中增加水性泪液
产生方面具有类似于环孢菌素的治疗效果。

[0638] 与载体治疗的动物相比，以低，中和高剂量的SEQ ID NO：172肽治疗的动物产生显著更多水性泪液。因此，类似于TBUT，SEQ ID NO：172的肽在该模型中普遍产生剂量相关的水性泪液产量的显著增加。

[0639] 以低，中和高剂量水平的SEQ ID NO：197肽(分别为0.06％，0.25％和0.6％，组2，3和4)治疗的组普遍显示剂量依赖的PRTT的增加。

[0640] 表7：PRTTAUC平均值

[0641]

[0642] 3.组织病理学

[0643] 在该研究中，组织学改变通常局限于角膜。角膜中的发现由以下几方面组成：角膜上皮表面的增加的角质化，角膜上皮增加的厚度，角膜上皮增加的细胞结构
(cellularity)，与增加的上皮细胞更新一致的基底上皮层的有丝分裂的发生率的稍微增
加。这些发现表明对角膜干燥和角膜表面刺激的生理学适应性反应。在本研究中未看到
表面溃疡，角膜基质水肿和炎症浸润到角膜中。组9(未处理组(正常小鼠，无东莨菪碱处
理))中的眼在正常范围内。存在一些分散遍及所有组的眼睑的最小的非化脓性炎症，但结
膜，视网膜，泪腺和眼的其它部分在正常限度内。在所有组中，杯状细胞似乎在限度内。杯状细胞是粘蛋白的主要生产者，所述粘蛋白帮助泪液形成更强更粘的膜。

[0644] 在除了未治疗的正常眼组(组9)外的所有组中注意到轻度至中度角膜改变并且与其它治疗组相比，在组1(载体治疗组)和组2(低剂量的SEQ ID NO：197肽)中略微更
严重。这些研究结果与角膜上增加的泪液产量的阳性有益效果一致。

[0645] 当将不同治疗组组织学评分与环孢菌素组中的与组织学评分比较以确定任何其它治疗是否产生与环孢菌素“类似的评分降低”时，发现组4，6，和7与环孢菌素组评分没有显著不同。因此，这三种治疗，中和高剂量的SEQ ID NO：172肽和高剂量的SEQ ID NO：197肽，在降低/缓解与该鼠干眼模型相关的角膜改变方面是环孢菌素之后最有效的。

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