一种捕获血液稀有细胞的微流控芯片
阅读：261发布：2020-07-13
专利汇可以提供一种捕获血液稀有细胞的微流控芯片专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 与病理体液检测，涉及一种从 全血 细胞群体中分离高纯度稀有细胞的微流控芯片。，下面是一种捕获血液稀有细胞的微流控芯片专利的具体信息内容。
1.一种捕获生物流体中组分的微流控芯片，其中所述微流控芯片内部包括扰流柱阵列，所述扰流柱使得流体在芯片中通过时产生卡门涡街。
2.一种捕获生物流体中组分的微流控芯片，其中所述芯片主体包括由下而上依次设置的基片层和盖片层，所述基片层和盖片层之间设有组分捕获室，所述盖片层上设有与所述组分捕获室连通的流体入口和流体出口，所述组分捕获室分为缓冲区和泳道部分，所述泳道中沿流动方向设置有扰流柱阵列，其中所述微流控芯片内部转角表面均为平滑过渡的曲面。
3.根据前述权利要求任一项的微流控芯片，其中所述泳道通过分流块分为两个或者两个以上平行设置的泳道，优选地，每个泳道中包含5-500个扰流柱，优选10-200，进一步优选
15-100个，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个，最优选为17个；任选地，所述扰流柱在泳道中按照特定间距平行排列，所述间距为0.1-5个，优选0.5-1个扰流柱的直径。
4.根据前述权利要求任一项的微流控芯片，其中所述分流块两端分别构成泳道的进出口的部分，所述进出口表面经防溶血处理为平滑过渡的曲面，任选地，进出口的截面可以是圆弧形、倒圆形、圆角矩形、圆角梯形等。
5.根据前述权利要求任一项的微流控芯片，所述扰流柱在流动方向上的表面为平滑过渡的曲面，优选地，所述扰流柱横截面成圆柱形、圆角矩形、椭圆形、哑铃形、流线型、纺锤形或橄榄形，或者类似两个水滴尾尾相接形状，进一步优选为橄榄形。
6.根据前述权利要求任一项的微流控芯片，其中在所述组分捕获室的内表面和扰流柱表面负载有与流体中的目标组分结合的捕获配体，优选所述捕获配体是链霉亲和素-生物素-抗EPCAM抗体复合物。
7.根据前述权利要求任一项的微流控芯片，所述基片或者盖片的材料选自硅、玻璃、硅化玻璃、PDMS、PMMA，或是选自聚丙烯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯中的一种或两种以上的高分子聚合物材料。
8.根据前述权利要求任一项的微流控芯片的用途，其特征在于用于捕获循环稀有细胞，优选为循环肿瘤细胞。
9.一种微流控芯片的设计方法，所述方法包括在芯片泳道中设置扰流柱，其特征在于所述扰流柱使得流体在泳道中通过时产生卡门涡街。
10.前述权利要求任一项的微流控芯片的制作方法：所述方法包括下列步骤：
(1)、制作芯片掩膜；
(2)、感光膜制作及曝光：使用感光膜构建芯片设计图形凸骨架，将掩膜贴在感光膜上，使用紫外线照射；去除曝光后已溶解感光膜，洗涤后放入烘箱中烘干，得芯片设计图形凸骨架备用；
(3)、制作PDMS模具：将SLYGARD 184试剂在室温下搅拌均匀，倒入以芯片设计图形凸骨架为底板的PDMS芯片磨具中，真空除气后，烘箱烘干，待PDMS模具凝固；
(4)、键合PDMS：将上述步骤制作所得的PDMS芯片模具与玻片载体共同放入等离子清洗机键合，得设计芯片成品；
(5)、芯片包被：将制作完成的芯片再次放入等离子清洗机中，作用后取出芯片，然后将目标抗体注入芯片流道中进行包被。
一种捕获血液稀有细胞的微流控芯片
技术领域
背景技术
[0002] 稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等)中的一些非典 型细胞。研究表明，对稀有细胞的收集及利用其完成NGS分析，对找到疾病潜在治疗机理、 病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。目前血液中稀有细胞检测研究方法主要有流式 分选技术、形态分离方法、密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术，如BD FACSAris 可以实现细胞高速分选，但流式分选的瞬时激光将损伤所分选细胞，分选活性后细胞活性受 损。循环肿瘤细胞(CTCs)是指进入人体外周血的肿瘤细胞。虽然肿瘤患者外周血中CTCs数 目极少，一般约107数量级血细胞中的CTCs仅为个位数(2-10个/ml)，但是CTCs是一种 极重要的液体活检、一种判断预后及治疗间期随访的工具。由于循环肿瘤细胞数量极其稀少， 对其检测的精准性和特异性要求颇高，而对其进一步的分析就更加困难，因此急需发展能够 高效、大通量、快速的循环肿瘤细胞从血液样本中分离出来的便携方法与工具。
[0003] 人外周血中的循环肿瘤细胞是肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞(CTCs)或细胞团 (CTM)，幸存的CTCs或CTM离开血液循环进入到继发脏器的局部微环境，在各类生长因 子的作用下增殖生长并最终可形成转移灶。循环肿瘤细胞是肿瘤血道转移灶的重要来源，而 远处转移是导致肿瘤治疗失败、复发及死亡的直接原因之一，然而，只要早期发现和干预将 可能大幅降低复发及转移率，因此从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视；通过 对CTCs的捕获及分析，可以辅助临床医生进行肿瘤转移复发预测以及早期预警，进行患者 总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)的评估、临床放化疗的疗效监测等，进而具有指导 个体化医疗、改善肿瘤患者的生存状态的重要临床意义。
[0004] 但是，要想实现临床诊断或者对CTC进行实验室分析的前提是能够获取足够的CTC细胞。 由于CTCs在外周血中每106～107个单核细胞仅含有1个CTCs，因此对CTCs检测技术的 灵敏度和特异度均提出了极高要求。目前各种CTCs的检测方案主要包括CTCs分离和富集系 统，以及CTCs检测和鉴定系统。
[0005] 近年来通过将微流控芯片技术与抗体捕获相结合发展出了一系列的循环肿瘤细胞芯片捕 获技术。微流控芯片分选和富集CTCs的原理主要分为4类：①利用抗原抗体亲和性进行分 选；②利用细胞物理特征的不同进行分选，比如细胞大小、变形性以及不同大小的细胞在流 场中的力学特性；③利用免疫磁珠具有磁性兼连接抗体的作用进行分选；④利用不同细胞的 电学性能差异进行分选等。微流控细胞免疫芯片的方法是通过微流控装置(micro-fluid device) 检测CTCs，该检测方法具有极高的特异性、敏感性等特点，捕获的CTCs具有细胞活性，可 分离，并用于细胞培养和其他各种下游技术研究，是CTCs临床应用价值研究的一种全新高 效的方法。目前，依赖抗体的CTCs芯片(On-Q-ity，Waltham，MA)、依据大小变形性原理 的ClearCellTM系统(ClearbridgeBioMedics，Singapore)、依据免疫磁珠的IsoFluxTM系统 (Fluxion)、依据流体体动力特征的ApostreamTM(Apocell)和根据双向电泳原理的DEPArrayTM 系统等产品正推向市场。然而，一般认为微流控芯片具有样本用量少、高灵敏度等优点，但 正是由于每种设备检测血液样本量少，样本选择性偏移不可避免，假阴性发生率高居不下， 对样品分析、临床诊断产生重要影响。此外，由于芯片往往体积较小，在血液通过时，流速 太小时效率太低，同时增加凝血可能性，流速过大会导致对目标组分的结合时间短，捕获不 充分，另外，血细胞受到的剪切力也较大，可能造成溶血，因此，开发具有更高流速，更好 结合效率和更低溶血的微流控芯片检测系统成为当前研究的重点，这样才能为临床提供可靠 数据支持。另一方面，有些特殊的芯片造价昂贵不便于推广应用。如何改进微流控芯片技术 在进行细胞分选时所遇到的上述问题，充分发挥其优势，将是微流控芯片(芯片组)开展CTCs 捕获的关键。
[0006] 本发明的发明人经过创造性劳动，提供了高效收集血液循环肿瘤细胞的芯片。该芯片具 有下列优点：改进的微流控芯片采用特定的扰流板及扰流柱，在保障循环肿瘤细胞高效收集 的同时降低对血细胞的损伤，降低溶血风险；可以将通过基于微流控芯片技术捕获到的循环 肿瘤细胞无损的取出，进行分析或体外培养，将能更体现循环肿瘤细胞在肿瘤复发、耐药预 测等发面的作用；本发明的芯片不仅可以用于捕获血液中的稀有细胞，还可以用于捕获其他 生物流体中的各种细胞，或者细胞组分。
发明内容
[0007] 在一方面，本发明提供一种捕获生物流体包括血液中稀有细胞或者细胞组分的微流控芯 片，所述芯片在内部设置多个扰流柱，形成扰流柱阵列，从而增加芯片内部表面与流体的接 触面积，增加捕获目标组分的概率。
[0008] 在一方面，本发明提供一种微流控芯片的设计方法：所述方法原理在于，在满足一定血 液流量下，血液中细胞或者其他组分能在芯片中具有较长的停留时间，从而可以在相同流量 的情况下，结合更多的目标组分，同时意味着在结合相同量的目标组分的情况下，可以采用 更高的流速，由此提高芯片的工作效率。为了满足该原理，所述设计方法包括在芯片泳道中 设置扰流柱，其特征在于所述扰流柱使得流体在泳道中通过时不仅能产生卡门涡街。由于卡 门涡街的存在，不仅使流体在单位面积流道中上停滞时间延长，还能让流体在停滞一定时间 后脱离涡街继续流动，从而使得流体在泳道内的流动路径及流体停滞时间进一步增加，并影 响了扰流柱周围局部及芯片内整体流体流速，从而增加了流体中的成分与泳道的接触时间， 有利于对目标组分的捕获。
[0009] 在一方面，本发明提供了一种微流控芯片或芯片组，所述微流控芯片内部包括扰流柱阵 列，所述扰流柱使得流体在泳道中通过时产生卡门涡街。
[0010] 根据前述任一方面，所述组分是循环稀有细胞，优选为循环肿瘤细胞。
[0011] 根据前述任一方面，其中所述微流控芯片主体包括由下而上依次设置的基片层和盖片层， 所述基片层和盖片层之间设有组分捕获室，所述盖片层上设有与所述组分捕获室连通的流体 入口和流体出口，所述组分捕获室分为缓冲区和泳道部分，所述泳道中沿流动方向设置有扰 流柱阵列，其中所述组分捕获室的内表面和扰流柱的表面均为平滑过渡的曲面。
[0012] 根据前述任一方面，其中所述缓冲区在靠近入口和出口处，为泳道汇合处，设置前端分 流块，具有分流、降低流速及缓冲作用。
[0013] 根据前述任一方面，其中所述泳道通过分流块分为两个或者两个以上平行设置的泳道， 优选地，每个泳道中包含5-500个扰流柱，优选10-200，进一步优选15-100个，例如15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个，最优选为17个；任选地，所述扰流柱在泳 道中按照特定间距平行排列，所述间距为相同方向上的0.1-5个，优选0.5-1个扰流柱的直径 (长径或短径)。
[0014] 根据前述任一方面，扰流柱柱高100-500μm，柱长径1.0-3.25mm，短径0.5-1.0mm， 每组扰流柱由3个品字形排列的单独扰流柱组成，组间扰流柱间距为0.1-1mm，优选 0.3-0.7mm，最优选0.45mm；组内扰流柱间距为0.1-1.5mm，优选0.5-1mm，最优选0.7mm。
[0015] 根据前述任一方面，所述组分捕获室入口流速为0.01-0.05m/s。
[0016] 根据前述任一方面，其中所述分流块两端分别构成泳道的进出口的部分，所述进出口表 面经防溶血处理为平滑过渡的曲面，任选地，进出口的截面可以是圆弧形、倒圆形、圆角矩 形、圆角梯形等。
[0017] 根据前述任一方面，所述扰流柱在流动方向上的表面为平滑过渡的曲面，具体而言，所 述扰流柱横截面成圆柱形、圆角矩形、椭圆形、哑铃形、流线型、纺锤形或橄榄形，或者类 似两个水滴尾尾相接形状，优选为橄榄形，使得其在流动方向上的表面为平滑过渡的曲面， 从而减少机械剪切力对流体内细胞的损伤。
[0018] 根据前述任一方面，其中在所述组分捕获室的内表面和扰流柱表面负载有与流体中的目 标组分结合的捕获配体，优选所述捕获配体是链霉亲和素-生物素-抗EPCAM抗体复合物。
[0019] 根据前述任一方面，所述基片或者盖片的材料选自硅、玻璃、硅化玻璃、PDMS、PMMA， 或是选自聚丙烯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯中的一种或 两种以上的高分子聚合物材料。
[0020] 在一方面，本发明提供前述任一方面的微流控芯片的制作方法：所述方法包括下列步骤：
[0021] 1、制作芯片掩膜；
[0022] 2、感光膜制作及曝光：使用感光膜构建芯片设计图形凸骨架，将掩膜贴在感光膜上，使 用紫外线照射；去除曝光后已溶解感光膜，洗涤后放入烘箱中烘干，得芯片设计图形凸骨架 备用；
[0024] 4、键合PDMS：将上述步骤制作所得的PDMS芯片模具与玻片载体共同放入等离子清洗 机(Plasma Cleaner)键合，得设计芯片成品；
[0025] 5、芯片包被：将制作完成的芯片再次放入等离子清洗机中，作用后取出芯片，然后将目 标抗体注入芯片流道中进行包被。
[0027] 图1流体组分捕获系统示意图，其中11-15是动力装置，2是流体管道，3是细胞捕获 设备，4是人体，5是抗凝剂释放设备。
[0028] 图2微流控芯片及其连接示意图。
[0029] 图3分光光度法检测溶血情况。
[0030] 图4循环肿瘤细胞采集图。
[0031] 图5本发明芯片的压力模拟图。通过缓冲池前的①②③④位置处的导流片设计，使各泳 道内流量分布均匀，并在A/B/C处形成流体的阻滞，起到控制流道内流量的作用。
[0032] 图6扰流柱后方卡门涡街形成模拟图，左图显示不产生卡门涡街的流速模拟，右图为产 生卡门涡街的流速模拟，右图箭头处显示卡门涡街的产生。
[0033] 图7循环肿瘤细胞采集图。
具体实施方式
[0034] 如本文所用，“稀有细胞”稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、 脑脊液等)中的一些非典型细胞。稀有细胞的例子包括但不限于循环肿瘤细胞(CTC)、循环内 皮细胞(CEC)和循环多发性骨髓瘤细胞(CMMC)。优选的稀有细胞为CTC和CEC，特别优选的 稀有细胞为CTC。“循环肿瘤细胞”(CTC)是指在受试者的循环血液中检测到的恶性肿瘤细胞。
[0035] “分析物”是指作为检测、分离、浓缩或提取的方法的目标的流体中的分子或组分。示例 性分析物包括细胞、病毒、核酸、蛋白质、碳水化合物和有机小分子。
[0036] “血液组分”是指全血的任何组分，包括宿主红细胞、白细胞和血小板。血液组分还包括 血浆组分，例如蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物，以及例如由于当前或过去怀孕、器官移 植或感染而可能存在于血液中的任何其他细胞，包括稀有细胞。
[0037] “流体”或“生物流体”意在包括天然流体(例如血液、淋巴、脑脊液、尿、子宫颈灌洗液、 唾液和水样品)，这些流体的一部分和已经引入细胞的流体(例如，培养基和液态组织样品)。 该术语还包括裂解物。
[0038] “捕获单元”或“捕获配体”根据情况可能是指用于结合分析物的化学样品、或者全细胞凭借 的其表面的组分结合物质。捕获单元可以是偶联到表面的化合物或构成表面的材料。典型的 捕获单元包括抗体、寡核苷酸或多肽、核酸、其他蛋白质、合成聚合物和碳水化合物。
[0039] “通道”或“泳道”是指流体可以流过的间隙。通道可以是疏水表面上的毛细管、导管或含水 液体可被限制的疏水表面的亲水纹理。
[0040] 细胞的“组分”是指能够在细胞溶解液中分离到的任何组分。细胞组分可以是细胞器(例如， 细胞核、近核区室、核膜、线粒体、叶绿体或细胞膜)、聚合物或分子复合物(例如，脂质、多 糖、蛋白质(膜、跨膜或细胞质)、核酸(天然的、治疗性的或病原性的)、病毒颗粒或核糖体) 或其他分子(例如，激素、离子、辅因子或药物)。细胞样品的“组分”是指样品中包含的细胞组 分子集。
[0041] “富集的样品”是指含有这样分析物的样品：相对于通常存在的样品，其已经被处理从而 增加分析物的相对含量。例如，可以通过将目标分析物的量增加至少10％、25％、50％、75％、 100％或至少10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000倍的系数来富集样品。
[0042] “剖面”是指轮廓侧视图图像。
[0043] “稀有量”的细胞指少于100个细胞/毫升流体、少于10个细胞/毫升流体、或甚至少于1 个细胞/毫升流体。
[0045] 为了实现发明目的，本发明人经过创造性劳动设计了一种用于稀有细胞捕获的微流控芯 片设备；细胞捕获设备与流体管道串联或并联连接，使得流体可以从细胞捕获设备经过，从 而捕获流体中含有的细胞。优选地，所述流体是血液。优选地，所述细胞是循环稀有细胞， 进一步优选地，所述细胞是循环肿瘤细胞。所述细胞捕获设备包括微流控芯片或芯片组。
[0046] 在一个实施方案中，本发明提供一种捕获生物流体包括血液中稀有细胞或者细胞组分的 微流控芯片，所述芯片在内部设置多个扰流柱，形成扰流柱阵列。
[0047] 在一个实施方案中，本发明的微流控芯片的设计方法包括在芯片泳道中设置扰流柱，其 特征在于所述扰流柱使得流体在泳道中产生卡门涡街。
[0049] 在一个实施方案中，所述芯片主体包括由下而上依次设置的基片层和盖片层，所述基片 层和盖片层之间设有组分捕获室，所述盖片层上设有与所述组分捕获室连通的流体入口和流 体出口，所述组分捕获室分为缓冲区和泳道部分，缓冲区在靠近组分捕获室入口和出口处， 为泳道汇合处，具有降低流速及缓冲作用，泳道部分包括一个或多个泳道，优选通过分流块 分为至少两个泳道，泳道中沿流动方向设置有扰流柱阵列。
[0050] 在一个实施方案中，所述分流块两端分别构成泳道的进出口的部分，所述进出口表面经 防溶血处理为平滑过渡的曲面，例如，进出口的截面可以是圆弧形、倒圆形、圆角矩形、圆 角梯形等。
[0051] 在一个实施方案中，所述分流块由前端T型导流板，中段直线型导流板和后端圆型导流 板组成，前端和后端导流板压缩泳道宽度使得泳道的进口和出口相比泳道宽度收窄，中段导 流板将泳道分割成平行的多个泳道。
[0052] 在一个实施方案中，所述前端T型导流板呈方锤型，方锤型长径1.0-2.0mm，短径 0.5-1.0mm；后端圆型导流板直径1-3mm，优选2.4mm。
[0053] 在一个实施方案中，所述扰流柱横截面成圆柱形、圆角矩形、椭圆形、哑铃形、流线型、 纺锤形或橄榄形，或者类似两个水滴尾尾相接形状，优选为橄榄形，使得其在流动方向上的 表面为平滑过渡的曲面，从而减少机械剪切力对流体内细胞的损伤。扰流柱阵列高度等于芯 片组分捕获室的内部高度。
[0054] 在一个实施方案中，扰流柱设置于盖片靠近基片的一侧。
[0055] 在一个实施方案中，扰流柱设置于基片靠近盖片的一侧。
[0056] 在一个实施方案中，每个泳道直径3mm-5mm，高度50-500μm，扰流柱间距0.1-5个， 优选0.5-1个扰流柱的长径或短径，扰流柱阵列高度为10-500μm，每个泳道中包含5-500 个扰流柱，形成微阵列。
[0057] 在一个实施方案中，扰流柱柱高100-500μm，柱长径1.0-3.25mm，短径0.5-1.0mm， 每组扰流柱由3个品字形排列的单独扰流柱组成，组间扰流柱间距为0.1-1mm，优选0.3-0.7mm，最优选0.45mm；组内扰流柱间距为0.1-1.5mm，优选0.5-1mm，最优选0.7mm。
[0058] 在一个实施方案中，所述组分捕获室入口流速为0.01-0.05m/s。
[0059] 在一个实施方案中，所述泳道平行设置。
[0060] 在一个实施方案中，所述基片的长度为5-100mm，优选20-80mm，进一步优选30-60mm， 最优选50mm；宽度为5-50mm，优选10-30mm，最优选20mm。
[0061] 在一个实施方案中，所述泳道的数量为1-20条，优选4-15条，进一步优选6-10条， 最优选8条。
[0062] 在一个实施方案中，所述泳道的长度为5-100mm，优选20-40mm，最优选30mm；宽 度为0.1-50mm，优选0.5-5mm，进一步优选1-3mm，最优选1.5mm；高度为0.05-0.5mm， 优选0.05-0.1mm。
[0063] 在一个实施方案中，所述基片或者盖片的材料为硅、玻璃、硅化玻璃、PDMS、PMMA 等，还可以是选自聚丙烯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯中 的一种或两种以上的高分子聚合物材料。
[0064] 在一个实施方案中，细胞捕获设备包括芯片组合器，所述芯片组合器是医用级连接管道 和卡槽，用于安放微流控芯片，使多个芯片并联或串联连接成芯片组。
[0065] 在一个实施方案中，在所述组分捕获室的内表面和扰流柱表面负载链霉亲和素 (Streptavidin)，该链霉亲和素能够与抗上皮细胞粘附分子(EPCAM)抗体-生物素(Biotin) 复合物中的标记生物素特异性结合，该EPCAM抗体-生物素复合物中的EPCAM抗体能够与 循环肿瘤细胞表面EPCAM抗原特异性结合；其中链霉亲和素-生物素-EPCAM抗体复合物中 链霉亲和素-生物素复合体的链接存在被高浓度生物素竞争洗脱的能力。任选地，也可以在组 分捕获室的内表面和扰流柱表面还可以包被其他捕获配体，例如抗原、抗体、蛋白A、蛋白 G、凝集素等。
[0066] 在一个实施方案中，本发明提供本发明的微流控芯片的制作方法：所述方法包括下列步 骤：
[0067] 1、制作芯片掩膜；
[0068] 2、感光膜制作及曝光：使用感光膜构建芯片设计图形凸骨架，将掩膜贴在感光膜上，使 用紫外线照射；去除曝光后已溶解感光膜，洗涤后放入烘箱中烘干，得芯片设计图形凸骨架 备用；
[0069] 3、制作PDMS模具：将SLYGARD 184试剂在室温下搅拌均匀，倒入以芯片设计图形凸 骨架为底板的PDMS芯片磨具中，真空除气后，烘箱烘干，待PDMS模具凝固；
[0070] 4、键合PDMS：将上述步骤制作所得的PDMS芯片模具与玻片载体共同放入等离子清洗 机键合，得设计芯片成品；
[0071] 5、芯片包被：将制作完成的芯片再次放入等离子清洗机(Plasma Cleaner)中，作用后 取出芯片，然后将目标抗体注入芯片流道中进行包被。
[0072] 在一个实施方案中，所述掩膜大小为(5-10)×(2-4)cm。
[0073] 在一个实施方案中，所述感光膜为3-13张厚度为35μm/张规格的感光膜。
[0074] 在一个实施方案中，所述感光膜制作及曝光步骤包括：使用厚度为35μm/张规格的感光 膜构建芯片设计图形凸骨架，常规使用3-13张感光膜，并将掩膜贴在感光膜上，使用紫外线 照射30秒-120秒曝光；使用清洗液及柔软毛刷，小心去除曝光后已溶解感光膜，清洗过程 中使用振荡器均匀震荡以确保充分去除残留的已溶解感光膜，用去离子水洗涤；然后放入烘 箱中10-30分钟烘干，得芯片设计图形凸骨架；体视显微镜下观察芯片骨架情况，确保芯片 骨架边缘光滑，微小扰流柱无破损；骨架成品用无尘自封袋密封保存。
[0075] 在一个实施方案中，所述制作PDMS模具包括：将SLYGARD 184试剂按质量比1：10 比例在室温下搅拌均匀，缓慢倒入以芯片设计图形凸骨架为底板的PDMS芯片磨具中，用真 空泵(压力0.06pa)真空除气8-15分钟。除气完成后，60℃烘箱中烘干(3小时)，待PDMS 模具凝固。
[0076] 在一个实施方案中，键合PDMS：将上述步骤制作所得的PDMS芯片模具与玻片载体共 同放入等离子清洗机键合；抽真空2分钟后将PDMS压在玻片上；然后在60摄氏度平板上， 加温30分钟，得设计芯片成品(成品用无尘自封袋密封保存)。
[0077] 在一个实施方案中，所述芯片包被包括将制作完成的芯片再次放入等离子清洗机(Plasma Cleaner)中，作用1-5分钟，优选2分钟后取出芯片；将目标抗体缓慢注入芯片流道中，大 约4℃环境中保留1-20小时，优选12小时；去除抗体再加入5％BSA于大约37℃环境中封 闭1-5，优选2小时。
[0078] 本公开所述的微流控芯片组根据实际采血量需要，采用串联或并联方式接入体外循环系 统(如图1所示)。血液经血管引导后进入体外循环系统的循环动力系统获得体外循环动力， 并在远端分叉为一个或多个并联导管，分别接入微流控芯片组及旁路中，并在进入微流控芯 片组后设置限流阀。连接方式如图2所示。优选地，所述限流阀为三通限流阀。通过设置旁 路管道，使得可以方便调节通过组分捕获室的流速和压力，不容易对血细胞产生较高的剪切 力，防止溶血，并且不容易造成管路堵塞。
[0079] 将微流控芯片或芯片组接入血液循环系统，循环血液混合后通过微流控芯片微通道，与 表面负载的抗体接触，并利用微通道表面负载的抗体与循环肿瘤细胞表面特异性抗原的结合 将循环肿瘤细胞从血液样品中捕获并固定在微通道表面上。
[0080] 在一个实施方案中，通过将链霉亲和素–生物素复合体切断实现抗体以及被其捕获的循环 肿瘤细胞从微通道表面释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞，并在循环收集结束后用细胞 清洗液清洗所述微流控芯片，从而实现对所述被捕获的循环肿瘤细胞的收集。所述细胞清洗 液是含有高浓度生物素蛋白的缓冲液，根据保存的需要可以加入防腐剂。采用CD45、CK8/18 荧光抗体对洗脱的CTC细胞染色，通过荧光显微镜观察，将CD45(-)、CK8/18(+)细胞 群判定为CTC细胞。
[0081] 本公开所述的低溶血性经过“分光光度法”检测的经抗凝后血液通过本公开芯片后的所测 定的红细胞溶血情况进行验证(图3)。
[0082] 与现有技术相比，本发明具有以下的优点和特点：
[0083] 1、相比于基于靶向多肽循环肿瘤细胞捕获方法及微流控芯片，本发明无需在收集CTC 之前进行红细胞裂解，相反更是要在收集CTC过程中对红细胞进行保护；2、本发明中的链 霉亲和素-生物素复合物组合可被细胞清洗液打断，能将通过基于微流控芯片技术捕获到的循 环肿瘤细胞无损的取出进行进一步分析或体外培养，将能更好的发挥循环肿瘤细胞的作用。3、 微流控芯片组泳道出入口及连接管道出入口均设计为光滑过渡的曲线形状，避免了系统内部 结构对血液细胞造成的潜在损伤；4、扰流柱微阵列既增加了与血液接触的表面积又防止对血 细胞的机械损伤，相比现有CTC检测或血液细胞清除装置，本专利设计的扰流柱芯片更适用 于在线式的血液收集系统，以芯片组形式进行血液采集保障CTC高效采集，并减少了血液溶 血现象发生，保障了循环后血液的质量。5、本发明的芯片不仅可以在线体外循环捕获稀有细 胞，也可以离线实现流体的体外循环，从而提高捕获效率。6、本发明的芯片不仅可以用于捕 获血液中的稀有细胞，还可以用于捕获其他生物流体中的各种细胞，或者细胞组分。
[0084] 实施例
[0085] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0086] 实施例1：芯片的制作
[0088] 2、感光膜制作及曝光：使用厚度为35μm/张规格的感光膜构建芯片设计图形凸骨架，常 规使用3-13张感光膜，并将掩膜贴在感光膜上，使用紫外线照射30秒-120秒曝光；使用清 洗液及柔软毛刷，小心去除曝光后已溶解感光膜，清洗过程中使用振荡器均匀震荡以确保充 分去除残留的已溶解感光膜，用RO清水洗涤3次；然后放入烘箱中10-30分钟烘干，得芯 片设计图形凸骨架；体视显微镜下观察芯片骨架情况，确保芯片骨架边缘光滑，微小扰流柱 无破损；骨架成品用无尘自封袋密封保存。
[0089] 3、制作PDMS模具：将SLYGARD 184试剂按质量比1：10比例在室温下搅拌均匀，缓 慢倒入以芯片设计图形凸骨架为底板的PDMS芯片磨具中，用真空泵(压力0.06pa)真空除 气8分钟。除气完成后，60℃烘箱中烘干(3小时)，待PDMS模具凝固。
[0090] 4、键合PDMS：将上述步骤制作所得的PDMS芯片模具与玻片载体共同放入等离子清洗 机(Plasma Cleaner)中键合；抽真空2分钟后将PDMS压在玻片上；然后在60摄氏度平板 上，加温30分钟，得设计芯片成品(成品用无尘自封袋密封保存)。所示芯片布局如图4所 示。
[0091] 5、芯片包被：
[0092] (1)用200μL无菌PBS清洗芯片3次，确定芯片通道中没有气泡残留。
[0093] 用注射器将100ul链霉亲和素蛋白注入到芯片中，然后将芯片置于湿盒中，37摄氏度包 被2小时。
[0094] (2)捕获抗体的包被
[0095] 2.1将人源-EpCAM捕获抗体(生物素标记)添加到1×PBS无菌溶液中，混匀，制备成 5μg/ml浓度抗体捕获工作液。
[0096] 2.2用注射器将100μL抗体捕获工作液注入到芯片中，然后将芯片置于湿盒中，4℃孵育 过夜。在整个孵育过程中，确保所有芯片流道内始终覆盖着抗体捕获工作液。
[0097] 2.3用200μL的1×PBS无菌溶液清洗包被了捕获抗体的芯片3次，除去残留在芯片中的 捕获抗体工作液。
[0098] 2.4用200μl 5％BSA溶液27℃封闭芯片2小时。
[0099] 2.5至此，芯片上捕获抗体的包被完成，并且随时可以使用。
[0100] 实施例2：芯片的功能参数检测
[0101] 在Gambit2.4版本软件中创建芯片设计的网格模型，并用ANSYS Fluent 19.0版本软件模 拟液体流体在芯片中的流动状态。通过模拟数据可见，①各流道中流体流量分布均匀，T型 导流板将缓冲池的液体较为均匀的导流到各流道中；②在设置入口流速为0.01m/s-0.05m/s 模拟总流速，流体密度设置为“WATER-LIQUID”，计算得各流道内流速在0.026-0.199m/s；③ 各扰流柱后均有卡门涡街形成(如图5和图6所示)。达到设计要求。
[0102] 实施例3：乳腺癌循环肿瘤细胞捕获能力检测
[0103] 将实施例1制作的芯片接入含10ml乳腺癌患者血液容器中。血液经血管引导出后进入 包含本发明微流控芯片组的体外血液循环系统。
[0104] 通过医疗级导管接入并联/串联方式组成的微流控芯片组，打开前端抗凝剂缓控释放器。
[0106] 关闭装置动力开关，关闭自动前端抗凝剂缓控释放器，循环肿瘤细胞采集结束。
[0107] 用200μL 1×PBS无菌溶液注入清洗芯片3次。
[0108] 循环肿瘤细胞及溶血的观察
[0109] 利用“分光光度法”检测经循环后血液中红细胞溶血情况，未发现血红蛋白值异常升高(图 3)。
[0110] 镜下观察收集循环肿瘤细胞数量；根据细胞形态大小及核质比判断CTC细胞(图7A)。
[0111] 实施例4：乳腺癌细胞抓捕效率检测
[0112] 将实施例1制作的芯片接入含10ml乳腺癌患者血液容器中。血液经血管引导出后进入 包含本发明微流控芯片组的体外血液循环系统。
[0113] 通过医疗级导管接入并联/串联方式组成的微流控芯片组，打开前端抗凝剂缓控释放器。
[0114] 打开动力开关，不间断循环采集细胞悬液1小时。
[0115] 关闭装置动力开关，关闭自动前端抗凝剂缓控释放器，循环肿瘤细胞采集结束。
[0116] 用200μL 1×PBS无菌溶液注入清洗芯片3次。
[0117] 将细胞清洗液(含高浓度生物素)200μl用注射器注入芯片中，室温静置30min，使链霉 亲和素-生物素复合物分离，释放出生物素-EPCAM复合物复合物。
[0118] 用200μL 1×无菌PBS清洗芯片3次，收集细胞清洗液。
[0119] 用注射器取95％乙醇200μl固定所收集到的循环肿瘤细胞30分钟。
[0120] 用200μL 1×无菌PBS溶液清洗3次，去除残留的检测抗体混合液。
[0121] CTC细胞进行CK8和CD45荧光染色，在荧光显微镜下观察。CK8(+)和CD45(-)表 示该细胞为肿瘤细胞，证明装置捕获效率，结果如图7B所示。
[0122] 结果表明，本发明可用于检测乳腺癌患者外周血液中的循环肿瘤细胞，通过尽可能多的 扫描血液，提高乳腺癌的循环肿瘤细胞检测灵敏度，特别是利用创新设计的微流控芯片组， 显著提高了乳腺癌循环肿瘤细胞的检测灵敏度。同时，在科学研究领域和临床试验验证的基 础上，利用免疫鉴定循环肿瘤细胞的特异细胞角蛋白CK、白细胞共同抗原CD45、细胞核加 上细胞形态染色的方法，有效检测出乳腺癌患者外周血中上皮来源的循环肿瘤细胞。
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