工程改造的细胞和方法
阅读：63发布：2021-11-14
专利汇可以提供工程改造的细胞和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及工程改造的细胞、工程改造的嵌合 抗原 配体(CAL)、多特异性结合剂用于桥连细胞的新型用途、以及 治疗 方法。本发明还提供了变异匹配的工程改造细胞。，下面是工程改造的细胞和方法专利的具体信息内容。
1.一种使CAL免疫细胞(例如，CAL T细胞、NK细胞或TIL)靶向靶细胞的方法，所述方法包括
A.提供桥连剂，其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
B.提供嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，其中所述免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和
iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
C.将所述CAL-免疫细胞和桥连剂与所述靶细胞组合，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
v.由此所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
2.一种用于靶向结合至抗原特异性桥连剂的嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，
A.其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
B.其中所述CAL-免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和
iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
C.其中当所述CAL-免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合时，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
v.所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
3.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第二抗原由CD3胞外结构域序列、任选地人CD3胞外结构域序列提供。
4.如权利要求3所述的方法或细胞，其中所述CD3胞外结构域为CD3γ、CD3δ或CDε结构域。
5.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第二靶结合位点包含选自由以下TM
组成的组的抗体的抗CD3结合位点的可变结构域：抗体L2K-07、抗体OKT3 、莫罗单抗-CD3、奥特利昔珠单抗、泰普利兹单抗、维西珠单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗和弗罗鲁单抗。
6.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的可变结构域：博纳吐单抗或抗体HD37的CD19结合位点；卡妥索单抗的EpCAM结合位点；AFM11的CD19结合位点；Lymphomun的CD20结合位点；厄妥索单抗的Her2结合位点；AMG211(MEDI-565、MT111)的CEA结合位点；帕索图西珠单抗的PSMA结合位点；索利妥单抗的EpCAM结合位点；RG7221或RG7716的VEGF或血管生成素2结合位点；RG7597的Her1或Her3结合位点；MM111的Her2或Her3结合位点；MM141的IGF1R或Her3结合位点；MGD006的CD123结合位点；MGD007的gpa33结合位点；TF2的CEA结合位点；AFM13的CD30结合位点；
AFM11的CD19结合位点；以及LY3164530的Her1或cMet结合位点。
7.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述桥连剂为博纳吐单抗或其CD3/CD19结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)B细胞)。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法或细胞，其中所述桥连剂为AMG211或其CD3/CEA结合衍生物(MEDI-565、MT111；任选地其中所述靶细胞为胃肠癌细胞)；帕索图西珠单抗或其CD3/PMSA结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为前列腺癌细胞)；索利妥单抗或其CD3/EpCAM结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为癌细胞)；或AFM11或其CD3/CD19结合衍生物(且任选地其中所述靶细胞为ALL细胞或非霍奇金氏淋巴瘤细胞)。
9.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一抗原为人CD19(且任选地，所述靶细胞为白血病或淋巴瘤细胞)、EpCAM(且任选地，所述靶细胞为肺癌细胞、胃肠癌细胞、腺癌、癌症干细胞)、CD20(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞)、MCSP(且任选地，所述靶细胞为黑素瘤细胞)、CEA、EGFR、EGFRvIII、唾液酸多糖、CD133、CD33(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞，例如AML细胞)、PMSA、WT1、CD22、L1CAM、ROR-1、MUC-16、CD30、CD47、CD52、gpA33、TAG-72、粘蛋白、CIX、GD2、GD3、GM2、CD123、VEGFR、整联蛋白、cMET、Her1、Her2、Her3、MAGE1、MAGE A3 TCR、NY-ESO-1、IGF1R、EPHA3、CD66e、EphA2、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、血管生成素、间皮素、糖脂F77或腱生蛋白。
10.如权利要求1至5中任一项所述的方法或细胞，所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的抗原结合位点的可变结构域：ReoProTM；阿昔单抗；RituxanTM；利妥昔单抗；ZenapaxTM；达克珠单抗；SimulectTM；巴利昔单抗；SynagisTM；帕利珠单抗；
RemicadeTM；英利昔单抗；HerceptinTM；曲妥珠单抗；MylotargTM；吉妥珠单抗；CampathTM；阿仑单抗；ZevalinTM；替伊莫单抗；HumiraTM；阿达木单抗；XolairTM；奥马珠单抗；BexxarTM；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；
TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；兰尼单抗；
SolirisTM；依库丽单抗；CimziaTM；赛妥珠单抗；SimponiTM；戈利木单抗；IlarisTM；康纳单抗；
StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；
ABThraxTM；雷昔库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；Ado-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥比妥珠单抗。
11.如权利要求2至10中任一项所述的细胞，其与所述桥连剂组合。
12.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述桥连剂具有小于IgG的人血清半衰期的人血清半衰期，任选地不超过15天。
13.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点各自选自由以下组成的组：scFv、nanobodyTM、dAb、duocalin、DARpin、avimer、adnectin和fynomer。
TM
14.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述桥连剂为或包括BiTE 抗体、双特异性scFv、三特异性scFv、tandabTM、dAb纳米抗体(例如二聚体或三聚体)、dAb多聚体(例如二聚体或三聚体)、双体、四体或DARTTM。
15.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一结合位点对于所述第一抗原的结合亲和力(KD)比所述第二结合位点对于所述第二抗原的亲和力低至少5倍。
16.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一结合位点对所述第一抗原具有10nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定；且所述第二结合位点对所述第二抗原具有50nM或更高的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定；任选地，其中所述第一结合位点对所述第一抗原具有2nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定，且所述第二结合位点对所述第二抗原具有60nM或更高的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定。
17.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述靶细胞为人细胞。
18.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述桥连剂包含第三抗原结合位点，任选地，其中所述第三抗原不同于所述第一抗原。
19.如权利要求18所述的方法或细胞，其中所述第三抗原为肿瘤相关抗原(TAA)，例如，由所述靶细胞所包含的细胞表面TAA。
20.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一抗原和/或第三抗原与在正常细胞上相比更通常地存在于癌细胞上。
21.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述靶细胞为血细胞；任选地，其中所述靶细胞为B细胞或T细胞。
22.如权利要求1至5和10至18中任一项所述的方法或细胞，其中所述第一抗原为自身免疫性疾病靶标且所述信号传导下调细胞毒活性或免疫细胞的增殖。
23.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第二抗原为免疫细胞(例如，人T细胞或NK细胞)胞外抗原。
24.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第二抗原为蛋白质抗原且所述免疫细胞包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列为表达与由所述CAL所包含的第二抗原的氨基酸序列相同的氨基酸序列(例如，CD3胞外结构域序列)的内源性序列。
25.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述胞外部分不含非自身表位。
26.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中
a.所述CAL的所述第二抗原在细胞中由非内源性核苷酸(S1)序列编码，所述内源性核苷酸(S1)序列包含编码所述抗原的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
b.所述细胞的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列包含SNP1并且编码与所述第二抗原的氨基酸序列相同并包含R1的氨基酸序列；或编码作为所述第二抗原的氨基酸序列的天然存在的变体并包含R1的氨基酸序列；且
c.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
27.如权利要求2至26中任一项所述的细胞，其用于治疗或预防人的疾病或病状的方法，其中所述方法包括向所述人施用所述桥连剂和所述细胞，其中
a.所述CAL的所述第二抗原在细胞中由非内源性核苷酸(S1)序列编码，所述非内源性核苷酸(S1)序列包含编码所述抗原的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；且b.其中所述CAL-细胞由自体或同种异体移植物所包含，其中所述方法包括在步骤(c)中向人施用所述移植物，其中将所述CAL-细胞与靶细胞组合，其中在所述施用之前所述人的基因组包含所述SNP1。
28.如权利要求26或27所述的方法或细胞，其中所述CAL的所述第二抗原为
(i)CD3γ胞外结构域且R1选自由I53、N53和T53组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:
1的位置)；
(ii)CD3δ胞外结构域且R1选自由N38和K38组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:3的位置)；或
(iii)CD3ε胞外结构域且R1选自由A108、E108和V108组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:5的位置)。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的细胞，其用于治疗或预防人的疾病或病状的方法，其中所述CAL-细胞由自体或同种异体移植物所包含，其中所述方法包括向人施用所述移植物和桥连剂，其中将所述CAL-细胞、桥连剂与靶细胞组合且所述疾病或病状得到治疗或预防，其中在施用所述移植物之前所述人包含所述SNP1。
30.根据权利要求2至29中任一项所述的细胞，其中所述细胞用于治疗或预防人的疾病或病状的方法，其中所述方法包括向所述人施用自体移植物和桥连剂，其中所述CAL-细胞由所述移植物所包含；其中将所述CAL-细胞、桥连剂与靶细胞组合且所述疾病或病状得到治疗或预防；且所述CAL-细胞为来自所述人的祖细胞的工程改造子代。
31.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中
a.所述第一信号传导结构域(SD1)在细胞中由核苷酸序列(S3)编码，所述核苷酸序列(S3)包含编码所述信号传导结构域的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；
b.所述细胞的基因组包含含有SNP2并编码信号传导结构域(SD2)的核苷酸序列(S4)，其中SD2(i)与SD1相同并包含R2或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R2；并且
c.其中S4为所述细胞的内源性基因组序列且SNP2为非同义SNP。
32.如权利要求31所述的方法或细胞，其中SD1和SD2各自包含含有R2的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
33.如权利要求32所述的方法或细胞，其中所述信号传导结构域的ITAM是相同的。
34.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述胞内部分包含在细胞中由核苷酸序列(S5)编码的另一胞内信号传导结构域(SD3)，S5包含编码SD3的氨基酸残基(R3)的人单核苷酸多态性(SNP3)；其中所述细胞的基因组包含编码信号传导结构域(SD4)的核苷酸序列(S6)，其中SD4(i)与SD3相同并包含R3；或(ii)为SD3的天然存在的变体并包含R3；且其中S6为所述细胞的内源性基因组序列且SNP3为非同义SNP。
35.如权利要求34所述的方法或细胞，其中所述受体的SD1与SD3是不同的。
36.如权利要求34或35所述的方法或细胞，其中SD3和SD4各自包含含有R3的ITAM。
37.如权利要求36所述的方法或细胞，其中SD3和SD4的ITAM是相同的。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法或细胞，其中SD3与SD4是相同的。
39.如权利要求34至38中任一项所述的方法或细胞，其中SD3各自为CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
40.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自以下的CD3胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-
1BB结构域。
41.如权利要求40所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、两个或三个选自以下的氨基酸基序：(a)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:10；(b)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:11；及(c)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:12。
42.如权利要求41所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域包含基序(a)且其中所述基序与SEQ ID NO:10的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、N73、R79、E82、D84、V85、D87和K88(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
43.如权利要求42所述的方法或细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：A61V、A61P、P62S、P62A、A63P、Q66H、G67S、N69T、Q70Y、Q70L、Q70P、Q70W、N73Y、R79L、R79G、E82K、D84G、D84A、D84Y、V85I、D87G和K88R(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
44.如权利要求41至43中任一项所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域包含基序(b)且其中所述基序与SEQ ID NO:11的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122和M128(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
45.如权利要求44所述的方法或细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：P100L、Q101L、Q101P、R103K、K104E、N105K、P106R、E108A、L110Q、A120V、A122V和M128T(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
46.如权利要求41至45中任一项所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域包含基序(c)且其中所述基序与SEQ ID NO:12的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多5个变化：E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、A155、L156(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
47.如权利要求46所述的方法或细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：E131K、R132H、R132C、R133Q、R133W、K136N、G137E、G140D、L145F、A148D、T152I、A155T、L156P(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
48.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、多个或全部选自由以下组成的组的氨基酸残基：S58、Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
49.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含由选自由以下组成的组的SNP编码的残基：rs368651001、rs372651048、rs767112686、rs765877580、rs751145956、rs772867144、rs55893506、rs761710510、rs776601547、rs768607376、rs193922741、rs193922740、rs193922739、rs780188126、rs772128174、rs757978223、rs779397562、rs749926653、rs181746205、rs181746205、rs753572867、rs371709798、rs145407267、rs143180729、rs148513413、rs367690333、rs144963570、rs367690333、rs144963570、rs770320255、rs139926301、rs56297636、rs760895755、rs112890541、rs370910340、rs145505909、rs754935006、rs751583971、rs766541481、rs763074967、rs745871212、rs372665461、rs764185491、rs756340039、rs773572491、rs201594815、rs781510519、rs147527561、rs751981677、rs763532939、rs753278244、rs771873949、rs186004179、rs186004179、rs762773775、rs748158220、rs776703680、rs561262982、rs758846009、rs746262183、rs376046446、rs201937405和rs752198795；且其中所述免疫细胞的基因组包含含有所述选择的SNP的内源性核苷酸序列。
50.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述第一信号传导结构域或第三信号传导结构域为包含至少13个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：
R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
51.如权利要求50所述的方法或细胞，其中所述CD28结构域包含所述组的全部残基。
52.如权利要求50或51所述的方法或细胞，其中所述CD28结构域包含氨基酸残基Y191和Y209(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
53.如权利要求50至52中任一项所述的方法或细胞，其中所述CD28结构域包含YMNM基序(对应于SEQ ID NO:13的Y191-M192-N193-M194)和/或PYAP基序(对应于SEQ ID NO:13的P208-Y209-A210-P211)。
54.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述CAL-免疫细胞为CAL-T细胞(例如，CD8+T细胞或CD4+T细胞，例如活化的T细胞)、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，例如，REP前TIL)、记忆T细胞、TSCM、TCM或TEM。
55.如任一前述权利要求所述的方法或细胞，其中所述CAL-免疫细胞为患有自身免疫性疾病、炎性疾病、病毒感染或癌症的人的细胞的子代，例如，其中所述人患有成淋巴细胞性白血病、ALL(例如，T-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
56.如权利要求1至10、12-26、28和31至55中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在将所述细胞混合在一起之后将所述混合的细胞与所述桥连剂组合。
57.如权利要求1至10、12-26、28和31至55中任一项所述的方法，其包括在将所述靶细胞与桥连剂混合在一起之后将所述靶细胞和试剂与所述免疫细胞组合。
58.如权利要求1至10、12-26、28和31至57中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后减少试剂的量。
59.如权利要求1至10、12-26、28和31至58中任一项所述的方法，其中所述CAL-细胞为患有成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、ALL(例如，T-ALL或B-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤的人的免疫细胞的子代。
60.如权利要求1至10、12-26、28和31至59中任一项所述的方法，其中各CAL-细胞来源于人的血液或肿瘤样品并且在体外活化和扩增。
61.如权利要求60所述的方法或细胞，其中所述人患有自身免疫性疾病，其中所述CAL-细胞无变应性或当通过所述桥连剂拷贝结合至靶细胞时具有降低的增殖和/或细胞毒活性。
62.一种CAL-免疫细胞、CAL-T细胞、CAL-NK细胞或CAL-TIL，其中所述CAL如权利要求2至61中任一项所定义。
63.一种CAL-免疫细胞、CAL-T细胞的群、CAL-NK细胞的群或CAL-TIL的群，其中所述细胞是根据权利要求62所述。
64.如权利要求62或63所述的细胞或群，其用于治疗人的疾病或病状或降低其风险的方法，其中所述方法是根据权利要求29或30所述。
65.如权利要求62至64中任一项所述的细胞或群，其是由医学IV容器、输注装置或注射器所包含。
66.一种哺乳动物干细胞，其包含编码如任一前述权利要求所述的CAL的核苷酸序列。
67.如权利要求66所述的细胞，其中所述细胞为多能性的或多潜能性的。
68.一种细胞群，其包含多个根据权利要求66或67所述的干细胞。
69.如权利要求66或67所述的干细胞，其用于如权利要求29或30所述的方法，其中所述方法包括向所述人施用所述桥连剂和所述干细胞，其中所述干细胞发育成所述CAL-免疫细胞，其中将所述免疫细胞与人中的所述靶细胞组合且所述细胞由所述桥连剂所桥连，由此所述疾病或病状得到治疗或预防。
70.一种CAL-免疫细胞或CAR-免疫细胞，其基因组包含(i)至(iii)中的一个、多个或全部：-
(i)编码包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列；
(ii)编码包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的核苷酸序列；和/或
(iii)编码包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的核苷酸序列。
71.一种供施用于人患者以治疗或预防疾病或病状(例如，癌症)的自体或同种异体细胞移植物，所述移植物包含多个CAL-免疫细胞或CAR-免疫细胞，其中所述细胞是一个或多个从人供体获得的祖细胞的子代，其中所述移植物的每个所述细胞的基因组包含(i)至(iii)中的一个、多个或全部：-
(i)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的内源性核苷酸序列；
(ii)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的内源性核苷酸序列；或(iii)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的内源性核苷酸序列。
72.如权利要求71所述的移植物，其中所述移植物的每个所述细胞包含所述内源性序列。
73.如权利要求70至72中任一项所述的细胞或移植物，其用于治疗或预防人患者的疾病或病状(例如，癌症)的方法，其中所述患者的生殖系基因组包含所述胞内结构域内源性序列，任选地其中所述生殖系基因组编码CD3ζ、CD28和4-1BB胞内结构域，它们分别包含SEQ ID NO:9、15和18。
74.如权利要求71、72或73所述的移植物，其用于治疗或预防人患者的疾病或病状(例如，癌症)，其中所述患者为所述供体。
75.如权利要求70至74中任一项所述的细胞或移植物，其中所述CAL或CAR包含胞外CD3(例如，CD3δ)或CD16(例如，CD16A)胞外结构域。
76.一种嵌合抗原配体(CAL)，其中所述CAL包含工程改造的多肽，所述工程改造的多肽(在N末端至C末端方向上)包含CD3胞外结构域；任选的铰链；跨膜结构域；和CD3ζ胞内信号传导结构域；其中当所述CAL由免疫细胞膜所包含且所述CAL接合桥连剂时，胞内信号传导在免疫细胞中被触发以调节免疫细胞活性。
77.一种包含至少第一多肽和第二多肽的CAL多肽复合物，其中
(i)所述第一多肽(在N末端至C末端方向上)包含CD3胞外结构域；任选的铰链；和跨膜结构域；且
(ii)所述第二多肽(在N末端至C末端方向上)包含跨膜结构域；和CD3ζ胞内信号传导结构域；
其中所述多肽中的一种或两种包含不为CD3结构域的胞内信号传导结构域(例如，4-
1BB和/或CD28胞内信号传导结构域)；并且
其中当所述CAL由免疫细胞膜所包含且所述CAL接合桥连剂时，胞内信号传导在免疫细胞中被触发以调节免疫细胞活性。
78.如权利要求76或77所述的CAL，其中所述CD3胞外结构域为人CD3胞外结构域。
79.如权利要求76、77或78所述的CAL，其包含一个或多个其它胞内信号传导结构域，各自选自由以下组成的组：CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、
4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域和CD16结构域。
80.一种嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，其中所述细胞表达根据权利要求76至79中任一项所述的CAL。
81.一种核酸，其编码根据权利要求76至79中任一项所述的CAL。
82.一种产生CAL的方法，所述方法包括在免疫细胞(例如，人T细胞、NK细胞或TIL细胞)中表达根据权利要求76至79中任一项所述的CAL。
工程改造的细胞和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及多特异性结合剂用于将工程改造的免疫细胞(例如CAR-细胞或CAL T细胞)桥连至靶细胞的新型用途、工程改造的免疫细胞、工程改造的嵌合抗原配体(CAL)及免疫治疗方法，例如人的过继性CAR-细胞或CAL T细胞疗法。本发明还提供了用于进行精确免疫治疗的人变异匹配的CAR-细胞和CAL-细胞。
背景技术
[0002] 一种免疫治疗手段涉及工程改造患者自身(或供体)的免疫细胞以表达识别和攻击肿瘤的细胞表面抗原受体(CAR)。虽然此手段(称为过继性细胞转移(ACT))迄今为止仅限于小型临床试验，但使用这些工程改造的免疫细胞的治疗已经在患有晚期癌症的患者中产生一些显著的响应。
[0003] 嵌合抗原受体(CAR)由源自抗体的靶向结构域与T细胞信号传导结构域融合组成，当由T细胞表达时其赋予T细胞以由CAR的靶向结构域所决定的抗原特异性。CAR可以潜在地将T细胞的效应功能重定向于细胞表面上表达的任何蛋白质和非蛋白质靶标，只要基于抗体的靶向结构域可用即可。此策略由此避免了靶细胞对抗原的加工和呈递的需要并且适用于非典型的T细胞靶标，像碳水化合物。HLA限制的这种规避意味着CAR T细胞手段可用作拓宽过继性T细胞疗法的应用潜力的一般工具。参见，例如Methods Mol Biol.2012；907:645-66.doi:10.1007/978-1-61779-974-7_36,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”,Cheadle EJ等人；
[0004] 第一个CAR-T构建体由免疫疗法先驱Zelig Eshhar于1989年在PNAS的论文中描述。CAR的结构现在包含跨膜多肽链，其为来自不同细胞蛋白质的不同结构域的嵌合体。例如，CAR具有(经常通过接头和/或绞链区)连接至胞内部分的胞外部分，其中CAR的跨膜部分使受体嵌入免疫细胞(通常是T细胞)的膜中。胞外部分包括抗体结合位点(通常以scFv的形式，如来源于小鼠mAb)，其识别靶抗原，所述靶抗原通常是在癌细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)。抗原识别以此方式省去了对TCR的依赖的需要，TCR需要MHC限制的抗原呈递，且其中结合亲和力可相对较低。CAR的胞内部分通常包括用于当抗原结合至胞外结合位点时进行胞内信号传导的CD3-zeta(CD3ζ)结构域。新一代CAR还包括增强T细胞介导的应答的其它结构域，其通常为4-1BB(CD137)或CD28胞内结构域。一旦遇到CAR结合位点的同源抗原配体，CAR便可激活胞内信号传导及由此CAR T细胞的活化以增强肿瘤细胞杀伤。
[0005] 大多数CAR-T在体内扩增，因此常规意义上的剂量滴定是困难的，且在很多情况下，工程改造的T细胞似乎“永远”有活性，即，迄今为止见于大部分CD19CAR-T临床研究中的持续的B细胞发育不全的观察结果。这对CAR T细胞方法提出了一个严重的问题。一些观察到的风险论述于Discov Med.2014年11月；18(100):265-71“, Challenges to chimeric antigen receptor(CAR)-T cell therapy for cancer”,Magee MS&Snook AE中，该文献说明了在结肠直肠癌症转移至肺和肝的患者中出现的CAR-T细胞治疗之后的首个严重不良事件(Morgan等人,2010)。此患者是用表达靶向表皮生长因子受体2(ERBB2、HER2)的第三代CAR的T细胞进行治疗。CAR含有来源于4D5抗体(曲妥单抗)的scFv，曲妥单抗被FDA批准用于治疗HER2阳性乳腺癌(Zhao等人,2009)。患者在接受单剂量的1010个CAR-T细胞的15分钟内发生呼吸窘迫，然后在5天过程期间有多次心跳停止，最终导致死亡。治疗之后四小时的血清分析揭示细胞因子IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-6和IL-10有明显增加。CAR-T细胞见于肺及腹部和纵隔淋巴结中，而未见于肿瘤转移中。研究者将毒性归结于HER2在肺上皮中的识别，由此造成产生肺毒性的炎性细胞因子的释放和细胞因子释放综合征(CRS)，从而导致多器官衰竭(Morgan等人,2010)。目前，其它研究者正在将遵循保守剂量递增策略并利用来源于不同抗体(FRP5)的第二代靶向HER2的CAR的试验用于多种HER2+恶性肿瘤(clinicaltrials.gov identifiers NCT01109095、NCT00889954和NCT00902044)。
[0006] 针对CAR T细胞主题的变化是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)治疗剂，其使用CD16A(FCγRIIIA)来结合至肿瘤特异性IgG的Fc区(参见，例如WO2015/058018)。该目标是通过滴定向患者施用的IgG在体内实现对CAR T细胞活性的更多控制。然而，CAR-T细胞的CD16结合位点可为游离的，还结合至患者的内源性IgG并且这降低了该方法的吸引力。该方法还需要考虑IgG在身体内固有的长半衰期(对于人中的IgG为约20天)，这可能限制了对CAR-细胞活性的控制。正在进行的研究可对此风险进行评估。希望提供一种替代方式来控制基于免疫细胞的疗法，像CAR-T细胞方法，以避免使用IgG控制活性的潜在并发症。
发明内容
[0007] 本发明通过使用新型工程改造的免疫细胞提供一种解决方法，其采用基于小型多特异性片段的方法作为开关(switch)，该开关不依赖Fc接合，并且通过容易调节开关半衰期来提供灵活的定制。一种类型的此新型方法使用称为“嵌合抗原配体”(CAL)的构建体并且它们被携带在CAL T细胞及其它免疫细胞上。
[0008] 本发明还提供了以下实施方案：与现有技术相反，具有在结合片段方法的相对较短血清半衰期方面的益处。本发明因此改进了本领域中现有的T细胞接合抗体方法(如来自Amgen的BiTEsTM)并改进了Ig对于CAR-细胞控制的用途。若干其它优点由本发明的方法提供，如下文所说明。
[0009] 本发明还提供了用于精确免疫疗法的免疫细胞、CAR、CAL、移植物和方法，其通过匹配天然的人基因型和表型变异而针对人和人细胞来定制。
[0010] 为此，本发明提供了以下构型。
[0011] 在第一构型中：-
[0012] 一种使免疫细胞靶向靶细胞的方法，所述方法包括
[0013] A.提供桥连剂，其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
[0014] i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
[0015] ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
[0016] B.提供嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，其中所述免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
[0017] iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和[0018] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
[0019] C.将所述CAL-免疫细胞和桥连剂与所述靶细胞组合，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
[0020] v.由此所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
[0021] vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
[0022] 这实现了以下实施方案：其中桥连剂具有小于IgG的人血清半衰期的人血清半衰期，由此能够实现比迄今用先前的CAR-T方式所可能达到的更好控制且可能避免对Fc相互作用的依赖(这不容易与患者自身的抗体Fc区别开)。
[0023] 在第二构型中：-
[0024] 一种用于靶向结合至抗原特异性试剂的嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，
[0025] A.其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
[0026] i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
[0027] ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
[0028] B.其中所述CAL-免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
[0029] iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和[0030] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
[0031] C.其中当所述CAL-免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合时，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
[0032] v.所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，,
[0033] vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
[0034] 在第三构型中：-
[0035] CAL-免疫细胞或包含多个此类细胞的移植物，其是用于治疗人的疾病或病状(例如，癌症)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人施用CAL-细胞和所述桥连剂；其中将CAL-细胞与人的靶细胞组合并由桥连剂桥连，由此上调CAL-细胞中的信号传导以增强CAL-细胞的靶细胞细胞毒性(例如，ADCC介导的杀伤活性)，从而治疗人的所述疾病或病状或降低其风险。
[0036] 在第四构型中：-
[0037] CAL-免疫细胞或包含多个此类细胞的移植物，其是用于治疗人的疾病或病状(例如，自身免疫性疾病、GvHD或同种异体移植物排斥)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人施用CAL-细胞和所述桥连剂；其中将CAL-细胞与人的靶细胞组合并由桥连剂桥连，由此上调CAL-细胞中的信号传导以降低CAL-细胞的细胞毒性(例如，ADCC介导的杀伤活性)，从而治疗人的所述疾病或病状或降低其风险。
[0038] 在第五构型中：-
[0039] 一种使免疫细胞靶向靶细胞的方法，所述方法包括
[0040] A.提供桥连剂，其中所述试剂是多特异性结合片段，其包含
[0041] i.第一结合部分；和
[0042] ii.第二结合部分；
[0043] B.提供免疫细胞，其中所述免疫细胞表达包含以下的工程改造组合的跨膜蛋白[0044] iii.包含连接到跨膜结构域上第三结合部分的胞外部分；其中第二部分和第三部分形成特异性结合对(SBP1)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分；和
[0045] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号转导结构域用于当第二部分和第三部分结合在一起时进行胞内信号传导；
[0046] C.将免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合，所述靶细胞包含第四结合部分，其中所述第四部分为胞外的，
[0047] v.由此第一部分和第四部分形成特异性结合对(SBP2)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
[0048] vi.其中第二部分和第三部分结合在一起，由此触发免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性；并且
[0049] D.其中桥连剂的分子量不超过125kDa。
[0050] 利用小于Ig(具有150kDa的大小)的半衰期的桥连剂的血清半衰期可为有利的。
[0051] 在第六构型中：-
[0052] 一种用于靶向结合至抗原特异性试剂的免疫细胞，
[0053] A.其中所述试剂是多特异性结合片段，其包含
[0054] i.第一结合部分；和
[0055] ii.第二结合部分；
[0056] B.其中所述免疫细胞表达包含以下的工程改造组合的跨膜蛋白
[0057] iii.包含连接到跨膜结构域的第三结合部分的胞外部分；其中第二部分和第三部分形成特异性结合对(SBP1)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分；和
[0058] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号转导结构域用于当第二部分和第三部分结合在一起时进行胞内信号传导；
[0059] C.其中当免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合时(所述靶细胞包含第四结合部分，其中所述第四部分为胞外的)，
[0060] v.第一部分和第四部分形成特异性结合对(SBP2)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞；
[0061] vi.第二部分和第三部分结合在一起，由此触发免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性；并且
[0062] D.其中桥连剂的分子量不超过125kDa。
[0063] 在第七构型中：-
[0064] 一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0065] 其中所述蛋白质包含
[0066] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0067] B.跨膜部分；和
[0068] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0069] 其中
[0070] D.工程改造蛋白的SD1在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码SD1的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0071] E.细胞的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列(S2)包含SNP1并编码第二信号传导结构域(SD2)，其中第二信号传导结构域(i)与SD1相同并包含R1或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R1；并且
[0072] F.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0073] 一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0074] 其中所述蛋白质包含
[0075] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0076] B.跨膜部分；和
[0077] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0078] 其中
[0079] D.工程改造的蛋白质的第一抗原或配体结构域在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码抗原或配体结构域的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0080] E.细胞的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列(S2)包含SNP1并编码第二抗原或配体结构域，其中第二抗原或配体结构域(i)分别与第一抗原或配体结构域相同并包含R1或(ii)分别为第一抗原或配体结构域的天然存在的变体并包含R1；并且[0081] F.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0082] 一种人免疫细胞，其是用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0083] 其中所述蛋白质包含
[0084] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0085] B.跨膜部分；和
[0086] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0087] 其中
[0088] D.工程改造的蛋白质的SD1在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码SD1的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0089] E.人的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列(S2)包含SNP1并编码第二信号传导结构域(SD2)，其中SD2(i)与SD1相同并包含R1或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R1；
[0090] F.其中S2为人的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP；且
[0091] G.其中在免疫细胞的所述施用之前所述人基因组包含S2；并且
[0092] H.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0093] 一种人免疫细胞，其是用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0094] 其中所述蛋白质包含
[0095] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0096] B.跨膜部分；和
[0097] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0098] 其中
[0099] D.工程改造的蛋白质的第一抗原或配体结构域在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码抗原或配体结构域的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0100] E.人的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列(S2)包含SNP1并编码第二抗原或配体结构域，其中第二抗原或配体结构域(i)分别与第一抗原或配体结构域相同并包含R1或(ii)分别为第一抗原或配体结构域的天然存在的变体并包含R1；
[0101] F.其中S2为人的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP；且
[0102] G.其中在免疫细胞的所述施用之前所述人基因组包含S2；并且
[0103] H.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0104] 在第八构型中：-
[0105] 一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0106] 其中所述蛋白质包含
[0107] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0108] B.跨膜部分；和
[0109] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0110] D.其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含至少50个选自由以下组成的组的氨基酸残基：V53、K54、F55、R57、S58、D60、Y64、Q65、Q68、L71、E74、L75、N76、L77、G78、R80、E81、Y83、L86、R89、G91、P94、E95、G98、K99、R102、Q107、G109、Y111、N112、E113、L114、Q115、K116、D117、K118、M119、E121、A122、Y123、S124、E125、I126、G127、G130、R134、G135、H138、D139、L141、Y142、Q143、G144、S146、T147、T149、K150、D151、D154、H157、M158、Q159、L161和P162(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)；且
[0111] E.其中所述细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域的内源性核苷酸序列，其中所述第二结构域为CD3ζ(CD3-zeta)结构域或CD3η(CD3-eta)结构域，其包含至少40个(例如，45个或所有)所述选择的残基。
[0112] 一种人免疫细胞，其是用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0113] 其中所述蛋白质包含
[0114] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0115] B.跨膜部分；和
[0116] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0117] 其中
[0118] D.其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含至少50个选自由以下组成的组的氨基酸残基：V53、K54、F55、R57、S58、D60、Y64、Q65、Q68、L71、E74、L75、N76、L77、G78、R80、E81、Y83、L86、R89、G91、P94、E95、G98、K99、R102、Q107、G109、Y111、N112、E113、L114、Q115、K116、D117、K118、M119、E121、A122、Y123、S124、E125、I126、G127、G130、R134、G135、H138、D139、L141、Y142、Q143、G144、S146、T147、T149、K150、D151、D154、H157、M158、Q159、L161和P162(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)；且
[0119] E.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域的内源性核苷酸序列，其中第二结构域为包含至少40个(例如，45个或所有)所述选择的残基的CD3ζ(CD3-zeta)结构域或CD3η(CD3-eta)结构域；
[0120] F.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0121] 在第九构型中：-
[0122] 一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0123] 其中所述蛋白质包含
[0124] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0125] B.跨膜部分；和
[0126] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0127] D.其中SD1为包含至少13、14、15、16、17或18个氨基酸残基的CD28胞内结构域，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)；并且
[0128] E.其中细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少10个(或11、12或13个)所述选择的残基的CD28胞内结构域。
[0129] 一种人免疫细胞，其是用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0130] 其中所述蛋白质包含
[0131] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0132] B.跨膜部分；和
[0133] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0134] 其中
[0135] D.其中SD1为包含至少13、14、15、16、17或18个氨基酸残基的CD28胞内结构域，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)；
[0136] E.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少10个(或11、12或13个)所述选择的残基的CD28胞内结构域；并且
[0137] F.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0138] 在第十构型中：-
[0139] 一种包含工程改造跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0140] 其中所述蛋白质包含
[0141] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0142] B.跨膜部分；和
[0143] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0144] D.其中SD1为包含至少10、11、12、13、14个或全部以下残基的4-1BB胞内结构域，所述残基选自由以下组成的组：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)；并且
[0145] E.其中细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少8个(或9或10个)所述选择的残基的4-1BB胞内结构域。
[0146] 一种人免疫细胞，其是用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法中，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0147] 其中所述蛋白质包含
[0148] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0149] B.跨膜部分；和
[0150] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0151] 其中
[0152] D.其中SD1为包含至少10、11、12、13、14个或全部以下残基的4-1BB胞内结构域，所述残基选自由以下组成的组：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)；并且
[0153] E.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少8个(或9或10个)所述选择的残基的4-1BB胞内结构域。
[0154] F.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0155] 本发明还提供了包含本发明的CAL-免疫细胞和/或桥连剂的移植物、细胞群、试剂盒和装置。
具体实施方式
[0156] 本发明在其各个方面中是基于以下考虑-
[0157] ●使用相对较小的、多特异性配体结合片段用于开关和控制免疫疗法(适用于CAL-免疫细胞和CAR-免疫细胞)；
[0158] ●通过与免疫细胞介导的活性组合再利用现有的mAb和Ig或非Ig抗原结合片段以例如实现基于FDA或EMA批准的mAb的新模式的可能性；
[0159] ●提供CAL-细胞作为体内和离体的新颖类型的免疫效应细胞；
[0160] ●CAR-和CAL-细胞在体内扩增以减少如本领域中所见对施用较高毒性水平的多特异性片段的依赖的效用；
[0161] ●CAR-和CAL-细胞在体内扩增以减少如本领域中所见对长期(例如，连续泵送)施用多特异性片段的依赖的效用；
[0162] ●关于解决实体肿瘤，与mAb相对比片段的更佳肿瘤穿透力的可能性；
[0163] ●利用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与片段方法组合来解决实体肿瘤的可能性，包括使用较低剂量共施用的免疫上调剂如IL-2的可能性；以及
[0164] ●在CAR和CAL结合结构域中天然的人多态性变异并且与人及人细胞基因型和表型变异匹配以提供所谓的“精确免疫疗法”的观察结果。
[0165] 多特异性片段的效用
[0166] 根据本发明的具有多个配体结合位点的桥连剂的使用使得能够使用相对较小的双、三和多特异性片段(例如，如在本领域中已知的基于抗体的片段)，所述片段具有相对较短的半衰期(比IgG短得多，IgG具有约20天的人血清平均半衰期)。以此方式，本发明能够简便滴定桥连剂以充当本发明的免疫细胞中触发信号传导变化的开关。这提供了一种例如容易改变免疫疗法中的免疫细胞活性的可滴定方式，所述免疫细胞如向患者施用的CAR-细胞(例如，CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR TIL细胞)或CAL-细胞(例如，CAL T细胞、CAL NK细胞和CAL TIL细胞)，由此能够实现控制有效疗法的便利方式。这有助于解决本领域中关于如何避免CAR-细胞疗法在患者中的不必要的过度活性的问题。同样有利的是使用相对较小的片段作为桥连剂以使得已根据本发明桥连的靶标与免疫细胞之间更为接近。
[0167] 现有的双特异性片段技术如BiTEsTM(Amgen)或其它双特异性T细胞接合物(engager)可易于用作根据本发明的桥连剂，由此使得本发明变得方便(特别在试剂已经FDA或EMA批准的情况下)。一个实例为博纳吐单抗(blinatumonab)(来自Amgen的
BlincytoTM)，其具有连接到针对人CD19(肿瘤相关抗原，TAA)的scFv结合位点的针对人CD3δ的scFv结合位点。博纳吐单抗已被批准用于其中CD3接合激活肿瘤细胞的T细胞杀伤的某些癌症治疗。
BlincytoTM)，其具有连接到针对人CD19(肿瘤相关抗原，TAA)的scFv结合位点的针对人CD3δ的scFv结合位点。博纳吐单抗已被批准用于其中CD3接合激活肿瘤细胞的T细胞杀伤的某些癌症治疗。
[0168] 参考：Front Oncol.2014；4:63；2014年3月31日在线发表；doi:10.3389/fonc.2014.00063；PMCID:PMC3978294；“Blinatumomab,a Bi-Specific Anti-CD19/CD3Antibody for the Treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia:
Perspectives and Current Pediatric Applications”；Lindsey M.Hoffman和Lia Gore，其描述了此BiTETM的相对较短半衰期(大约2小时)及通过泵进行连续输注的药物施用，需要住院。如通过博纳吐单抗所例示，察觉到使用这种小片段的疗法受到试剂的相对较短半衰期的妨碍；在博纳吐单抗的情况下，为了解决这点，通过植入泵向患者施用大剂量，该植入泵经4周连续地泵送试剂。这样做很麻烦，因为需要由医务人员来安装泵且在治疗期间，患者不便于一天长达24小时接受治疗。此外，施用相对较大剂量的多特异性片段一般可有不良副作用。
Perspectives and Current Pediatric Applications”；Lindsey M.Hoffman和Lia Gore，其描述了此BiTETM的相对较短半衰期(大约2小时)及通过泵进行连续输注的药物施用，需要住院。如通过博纳吐单抗所例示，察觉到使用这种小片段的疗法受到试剂的相对较短半衰期的妨碍；在博纳吐单抗的情况下，为了解决这点，通过植入泵向患者施用大剂量，该植入泵经4周连续地泵送试剂。这样做很麻烦，因为需要由医务人员来安装泵且在治疗期间，患者不便于一天长达24小时接受治疗。此外，施用相对较大剂量的多特异性片段一般可有不良副作用。
[0169] 与本领域中长期持有的观点相反，本发明实际上反而注意到在双、三及多特异性片段方法的相对较短半衰期方面的效用；本发明人认识到这种试剂可用作更精确控制靶细胞由活化T细胞、NK细胞、TIL等杀伤的可容易控制的开关。具体说来，在一个实例中，这允许工程改造的免疫细胞活性、如ADCC样活性在患者中的更精确调节，先前在更早的CAR-T方法的情况下这是不可能的。这样做时，CAR细胞介导的和双特异性T细胞接合物(例如，BiTETM)介导的疾病(例如，癌症)治疗的益处可以比先前所可能的更受控的方式实现。因此，有利之处是基于免疫细胞的疗法可更容易被调整，开启了这种开创性策略的甚至更大的潜力。而且，小型多特异性片段治疗的察觉到的不期望的结果得以减少，由此实现了接合物试剂的给药减少的可能性及对长期连续药物泵送的依赖性的降低，而这是目前例如在博纳吐单抗及其它小型多特异性片段方法的情况下所见的。
[0170] 此外，不同于如在博纳吐单抗的情况下依赖于患者中足够大量的多特异性片段来促进靶细胞杀伤，本发明反倒能够利用工程改造的免疫细胞的扩增能力来提供靶细胞的放大杀伤或调控。也是出于此原因，桥连剂的量在某些情形下可减少，由此降低副作用的风险及正常细胞的脱靶杀伤或不希望有的调控。使用减少量的本发明的桥连剂的能力在减少同样表达低水平的第一靶抗原的正常细胞的不希望有的靶向方面可为有利的。因此，当第一抗原以比在正常细胞上更高的水平在靶标(例如肿瘤)上存在时，本发明可尤其有用，因为靶向的严格性可通过桥连剂的较低滴定而在一定程度上可控制。在如博纳吐单抗(已指出其活性依赖于连续裂解(需要连续的药物施用))的片段的情况下，反倒可能利用本发明打破对这种机制的依赖，因为本发明构建了由根据本发明的免疫细胞产生的细胞介导的细胞毒性(例如，ADCC样活性)的可能性，该作用可受益于免疫细胞在患者中扩增的能力。
[0171] 嵌合抗原配体受体(CAL)和CAL-免疫细胞
[0172] 认识到本发明与先前方法的区别之处不仅在于注意到片段方法的短半衰期方面的效用，而且在于通过交换抗原配体/结合位点对得到的某些构型以提供CAL-免疫细胞及它们的用途。现有技术CAR-T和CAR-NK方法依赖于提供抗原结合位点作为免疫细胞的“嵌合抗原受体(CAR)”的胞外特征；相比之下，本发明依赖于提供抗原配体本身作为免疫细胞的细胞表面特征，而结合位点位于桥连剂上。这不仅方便地提供使用现成的多特异性片段(如上所说明)的优点，而且可以有利地使用自体抗原作为免疫细胞信号传导复合物(例如，CD3胞外结构域或其它结构域的自体形式，通常见于人的T、NK或其它相关免疫细胞上的其它结构域)的胞外抗原。我们将其称为“嵌合抗原配体(CAL)”以便与CAR相区分。本发明的示例性免疫细胞为CAL T细胞、CAL NK细胞和CAL TIL细胞。使用自体抗原的能力降低了CAL-细胞被患者免疫系统靶向和清除的风险，这对自体或同种异体细胞移植物具有效用；在CAR-细胞的情况下存在以下风险：受体的抗原结合位点可包含免疫原性表位且因此可以是患者自身免疫系统的靶标，由此降低了功效。使用CAL使得胞外抗原能够由天然存在于患者的免疫细胞(例如T细胞)表面上的蛋白质类型(例如，CD3γ、δ或ε)提供，这对于与患者的相容性也是有用的。CAL-细胞中核苷酸序列的敲除可用于防止TCR-CD3信号传导复合物的一个或多个内源性结构域或蛋白质的表达，由此引导信号另外传导至本发明的CAL(或用于本发明的其它构型的CAR-细胞，这些构型使用CAR-细胞和桥连剂)。
[0173] 桥连剂
[0174] 本发明有另一优点：有可能调整桥连剂与CAL的结合亲和力以便调节细胞毒性或由工程改造的免疫细胞所引起的其它调控。在先前的CAR-T方法的情况下，结合相互作用是通过需要产生CAR的胞外结合位点与肿瘤细胞上的其靶抗原的相对较高的结合亲和力来叙述。然而，在本发明的方法的情况下，此关注转移到了桥连剂的第一结合位点(在本发明的第5和第6构型中的第一结合部分)且因此能够自由选择适当的亲和力以便例如强烈地结合至肿瘤细胞。这就允许在桥连剂的第二结合位点(在本发明的第5和第6构型中的第二结合部分)与由CAL所包含的第二靶抗原(由跨膜蛋白所包含的在本发明的第5和第6构型中的第三结合部分)之间的结合相互作用的灵活性。因此，有可能例如选择结合强度(例如，中等KD和/或中等Koff)来调低或调高工程改造的免疫细胞当其桥连至靶细胞时扩增和活化的活性。因此，本发明允许比先前CAR-T方法所可能达成的更精细的调节，因为本发明使得熟练技术人员能够根据目前的情形有目的地平衡半衰期与结合亲和力。在试剂的两个结合位点处的结合亲和力可得以平衡，这就允许比仅选择一个结合位点的亲和力(正如CAR的情况一样)更精细的调节。根据本发明的片段(如包含抗体或非Ig骨架结构域的那些，它们是有利地模块化的并且容易而又廉价地由大肠杆菌及其它系统产生)的使用提供了一种调节结合亲和力的简单直接的方式，因为其容许使用库选择方法，如结合成员的噬菌体或酵母展示，这在本领域中是常规便利的且充分开发的。本发明还适合于使用广为接受的现有单克隆抗体治疗剂的结合位点，所述单克隆抗体治疗剂已被批准并且证明在患者中是耐受的。通过将一个或多个这样的结合位点(例如，来自第一和第二不同抗体的结合位点)与CAL结合位点(或与CAR特异性地结合至的配体)组合，可制得适当的双或三特异性桥连剂，其中特异性亲和力已被有目的地设计用于当前的治疗背景。三特异性(或更高级别的多特异性)适用于例如靶向在靶细胞(例如肿瘤细胞)上的至少2个不同的细胞表面靶标，其中那些靶标不包含在正常细胞上或以比在肿瘤细胞上更低的水平一起存在。因此，本发明提供了与工程改造的免疫细胞组合的这样一种桥连剂，以及用于治疗如本文所述的疾病或病状或降低其风险的用途。
[0175] 此外，与依赖于大量IgG共施用的ACTR方法不同，本发明能够使用小得多的结合片段且因此，可选择比IgG(其为150kDa)小得多的桥连剂的分子量。这提供了减少患者给药量以及降低生产桥连剂产品的潜在成本的可能性。如上所论述，桥连细胞的更为接近及通过细菌(例如大肠杆菌)或酵母(例如毕赤酵母)的制造简便性是优于使用IgG的ACTR方法的又一益处。
[0176] 示例性结合片段的大小示于下表中。本发明的结合剂可为表中所示的任何多特异性结合片段或包含任何此类片段，其中所述试剂具有小于Ig的大小。举例来说，所述试剂的分子量小于125、120、115、110、100、90、80、70、60、50或40kDa。
[0177]
[0178]
[0179] *表示其中发现片段的大小范围
[0180] 参见“Multivalent antibodies:when design surpasses evolution”, M.Cuesta等人,Cell,第28卷,第7期,第355–362页,2010年7月中的图，该文献以引用方式并入本文。
[0181] 治疗实体肿瘤及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
[0182] 在一个实施方案中，本发明的益处利用小型多特异性结合片段的肿瘤穿透能力，这在例如治疗实体肿瘤方面很实用。此类片段(如基于ScFv的片段)保留亲本抗体的结合特异性并且提供与全长mAb相比的若干优点。例如，这些片段可比完整抗体更快地渗透到肿瘤中(参见，例如Chowdhury,P.S.；Viner,J.L.；Beers,R.；Pastan,I.“Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific for mesothelin from DNA-immunized mice by phage display and construction of a recombinant immunotoxin with anti-tumour activity”,Proc.National.Acad.Sci.USA 1998,95,669–674；及Deckert,P.M.“Current constructs and targets in clinical development for antibody-
based cancer therapy”,Curr.Drug Targets 2009,10,158–175)。认为最佳的肿瘤靶向片段将为组合了高组织渗透性、靶标保留度和快速血液清除率的双体(55-60kDa)(Robinson,M.K.等人,“Quantitative immuno-positron emission tomography imaging of HER2-positive tumour xenografts with an iodine-124labeled anti-HER2diabody”,Cancer Res.2005,65,1471–1478；及Sundaresan,G等人“,124I-labeled engineered anti-CEAcea minibodies and diabodies allow high-contrast,antigen-specific small-animal PETimaging of xenografts in athymic mice”,J.Nucl.Med.2003,44,1962–1969)。片段的小尺寸尽管对于组织渗透是合乎需要的性质(如在癌症疗法中)，但还造成短的体内半衰期，从而限制了靶分子对片段的暴露。在本发明中，相对较短的半衰期有利地用于实现免疫疗法的更精确开关。虽然不希望受任何具体理论的约束，在癌细胞的位点处由根据本发明的免疫细胞在体内对桥连剂的捕获可延长试剂在癌症微环境中的持续性，由此弥补了较低的全身半衰期。出于相似的原因，在一些实施方案中，有用的是使用TIL作为本发明的免疫细胞的基础，因为已显示这类细胞浸润实体肿瘤，并且这与捕获的桥连剂一起可对使用本发明治疗实体肿瘤有益处。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫细胞为用于治疗或预防患者(例如人)的实体肿瘤的TIL。与这种TIL(或包含多个这种TIL的移植物)一起使用的示例性试剂为包含两个或三个scFv结合位点的双和三特异性抗原结合片段。如以下进一步论述，现有mAb实体肿瘤疗法的益处可在本发明中通过使用这种mAb的抗体VH/VL结合位点作为本发明的桥连剂(例如，提供为scFv)中的第一结合位点(或第一结合部分)而被重新利用。因此，本发明提供了与本发明的桥连剂组合(混合在一起；或单独地并由试剂盒所包含)的本发明的免疫细胞(例如，CAL-TIL或CAR-TIL)用于治疗或预防患者(例如人)的实体肿瘤，其中所述试剂的结合位点任选地为通过接头连接的scFv结合位点。
based cancer therapy”,Curr.Drug Targets 2009,10,158–175)。认为最佳的肿瘤靶向片段将为组合了高组织渗透性、靶标保留度和快速血液清除率的双体(55-60kDa)(Robinson,M.K.等人,“Quantitative immuno-positron emission tomography imaging of HER2-positive tumour xenografts with an iodine-124labeled anti-HER2diabody”,Cancer Res.2005,65,1471–1478；及Sundaresan,G等人“,124I-labeled engineered anti-CEAcea minibodies and diabodies allow high-contrast,antigen-specific small-animal PETimaging of xenografts in athymic mice”,J.Nucl.Med.2003,44,1962–1969)。片段的小尺寸尽管对于组织渗透是合乎需要的性质(如在癌症疗法中)，但还造成短的体内半衰期，从而限制了靶分子对片段的暴露。在本发明中，相对较短的半衰期有利地用于实现免疫疗法的更精确开关。虽然不希望受任何具体理论的约束，在癌细胞的位点处由根据本发明的免疫细胞在体内对桥连剂的捕获可延长试剂在癌症微环境中的持续性，由此弥补了较低的全身半衰期。出于相似的原因，在一些实施方案中，有用的是使用TIL作为本发明的免疫细胞的基础，因为已显示这类细胞浸润实体肿瘤，并且这与捕获的桥连剂一起可对使用本发明治疗实体肿瘤有益处。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫细胞为用于治疗或预防患者(例如人)的实体肿瘤的TIL。与这种TIL(或包含多个这种TIL的移植物)一起使用的示例性试剂为包含两个或三个scFv结合位点的双和三特异性抗原结合片段。如以下进一步论述，现有mAb实体肿瘤疗法的益处可在本发明中通过使用这种mAb的抗体VH/VL结合位点作为本发明的桥连剂(例如，提供为scFv)中的第一结合位点(或第一结合部分)而被重新利用。因此，本发明提供了与本发明的桥连剂组合(混合在一起；或单独地并由试剂盒所包含)的本发明的免疫细胞(例如，CAL-TIL或CAR-TIL)用于治疗或预防患者(例如人)的实体肿瘤，其中所述试剂的结合位点任选地为通过接头连接的scFv结合位点。
[0183] 在本发明的这些方面(或本文的任何其它方面)的一个实施例中，所述试剂为双体(例如，大小＝55-65kDa)、三体(例如，大小＝85-95KDa)或四体(例如，大小＝115-125kDa)。双体优于单体scFv之处是更佳的肿瘤血液比(Appl Microbiol Biotechnol.2013年5月；97(9):3855-63.doi:10.1007/s00253-012-4632-9.Epub 2012年12月19日“,Production and characterization of a CD25-specific scFv-Fc antibody secreted from Pichia
pastoris”,Wan L等人)。因此，已发现60–100kDa的重组抗体与完整抗体相比呈现有效的肿瘤穿透力和快速的循环清除且因此很适合体内肿瘤靶向。因此，在本文的任何方面的一个实施例中，试剂的大小为60至100kDa。
pastoris”,Wan L等人)。因此，已发现60–100kDa的重组抗体与完整抗体相比呈现有效的肿瘤穿透力和快速的循环清除且因此很适合体内肿瘤靶向。因此，在本文的任何方面的一个实施例中，试剂的大小为60至100kDa。
[0184] 在一个替代方案中，CAL-细胞为CAL T细胞；或CAL NK细胞；或CAL TIL、CAR T细胞和CAR NK细胞中的两种或三种的混合物。在一个替代方案中，CAR-细胞为CAR T细胞；或CAR NK细胞；或CAR TIL、CAR T细胞和CAR NK细胞中的两种或三种的混合物。
[0185] 实体肿瘤是由多种组分构成，包括恶性细胞及内皮细胞、结构细胞和免疫细胞。癌细胞能够形成满足其自身代谢和免疫需求的微环境。与此相反，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)被募集到肿瘤中，以试图控制其生长。越来越多的证据表明，在诊断时TIL的数量与预后有关。来自患者的TIL可被操纵以用作对所述患者的癌症的治疗。
[0186] 采用TIL的过继性细胞疗法(ACT)是一种用于治疗癌症如转移性黑素瘤的有效策略。此项技术涉及由患者的黑素瘤活检产生TIL培养物以及呈现高抗肿瘤活性的淋巴细胞在含有白细胞介素-2(IL-2)的培养基中的快速扩增。随后，在淋巴细胞清除(Iymphodepletion)之后且在高剂量IL-2存在下将TIL再引入同一患者中。尽管在十多年前已有描述，但使用淋巴细胞清除的采用TIL的ACT没有因为其明显的功效而如所预期地被广泛利用。其中的一个影响因素可能是与高剂量IL-2有关的毒性，虽然这一般是瞬时的，但可为严重的。
[0187] 因此，在本发明的一个实施方案中，免疫细胞(例如，CAL-免疫细胞或CAR-免疫细胞)为TIL。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗患者(例如人)的癌症(例如，实体肿瘤或黑素瘤)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人施用本发明的CAL-TIL或CAR-TIL和桥连剂以及任选地IL-2。在一个实施例中，所述方法包括向人施用自体或同种异体TIL移植物，其中所述移植物包含多个本发明的CAL-TIL或CAR-TIL。通过使用这种TIL疗法，伴随其在体内的细胞扩增及针对癌细胞的细胞毒性的潜能，本发明在一个实施例中提供了与先前所用相比较低剂量的IL-2的使用。因此，在一个实施例中，向人施用低或中等剂量的IL-2(如在曲妥单抗试验领域中的技术人员所理解)。在一个实施例中，低剂量IL-2是每天1百万IU/m(2)或更少。在一个实施例中，皮下地(SC))施用IL-2。作为替代或除IL-2施用之外，向人(例如，以低剂量)施用IL-12、IL-15和IL-21中的一种、两种或全部。参见，例如采用低和中等IL-2剂量的先前试验：Breast Cancer Res Treat.2009Sep；117(1):83-9.doi:10.1007/s10549-008-0251-7.Epub 2008年12月3日“,A phase II trial of trastuzumab in combination with low-dose interleukin-2(IL-2)in patients(PTS)with
metastatic breast cancer(MBC)who have previously failed trastuzumab”,Mani A等人；及J Immunother Cancer.2014；2(增刊3):Published online 2014年11月6日doi:
10.1186/2051-1426-2-S3-P1,PMCID:PMC4288376“,Adoptive cell therapy with tumour infiltrating lymphocytes and intermediate dose IL-2for metastatic melanoma”,Rikke Andersen等人。在本发明的基于TIL的方法的一个实施方案中，所述方法治疗患者(例如人)的癌症或降低其风险，其中在向患者施用本发明的免疫细胞之前，所述患者已经历了淋巴细胞清除。
metastatic breast cancer(MBC)who have previously failed trastuzumab”,Mani A等人；及J Immunother Cancer.2014；2(增刊3):Published online 2014年11月6日doi:
10.1186/2051-1426-2-S3-P1,PMCID:PMC4288376“,Adoptive cell therapy with tumour infiltrating lymphocytes and intermediate dose IL-2for metastatic melanoma”,Rikke Andersen等人。在本发明的基于TIL的方法的一个实施方案中，所述方法治疗患者(例如人)的癌症或降低其风险，其中在向患者施用本发明的免疫细胞之前，所述患者已经历了淋巴细胞清除。
[0188] 三阴性乳腺癌(TNBC)及通过桥连剂实现的HER2靶向
[0189] 若干研究支持乳腺癌是免疫原性的观点。将来自三阴性乳腺癌(TNBC)的辅助试验的数据用于研究TIL在TNBC中的预后牵涉并且与曲妥单抗的联合在过度表达HER2的疾病中是有益的。在诊断时存在的TIL的量与TNBC的预后之间存在正相关。在较高水平的TIL与来自曲妥单抗的增加受益之间也存在相互作用。因此，在一个实施例中，第一抗原为HER2(或这是在第5和第6构型中的第四结合部分)。在一个实施例中，第一结合位点(第5和第6构型中的第一结合部分)包含曲妥单抗或HerceptinTM的VH/VL结合位点，例如，其中结合剂包含第一scFv，其中scFv结合HER2(第一抗原或第四结合部分)并且包含VH-接头-VL，其中VH和VL为曲妥单抗或HerceptinTM的可变结构域。在一个实施例中，本文中的任何scFv的接头为(G4S)n接头，其中n＝2或更大(例如，3、4、5或6)。在一个实施例中，本发明的免疫细胞(例如，本发明的CAL-细胞或CAR-TIL或CAL-TIL)或方法用于治疗人的乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)或降低其风险。在一个实施例中，所述方法包括向人施用细胞移植物，其中所述移植物为自体的或同种异体的并且包含多个本发明的TIL和本发明的桥连剂，其中桥连剂的第一结合位点(第一结合部分)特异性地结合HER2，例如，其中第一结合位点(第一结合部分)包TM含曲妥单抗或Herceptin 的VH/VL结合位点，例如，如上所述提供为scFv。
[0190] 在一个实施例中，一个方面提供了本发明的CAL-TIL(或CAL-T或CAL-NK)，其是用于治疗人的乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)或降低其风险的方法中，其中第一抗原为HER2且任选地，桥连剂的第一结合位点包含曲妥单抗或HerceptinTM的VH/VL结合位点，其中所述方法包括向人施用CAL-细胞和桥连剂，其中乳腺癌得到治疗或乳腺癌的风险由此降低。
[0191] 在一个实施例中，结合剂包含scFv抗HER2结合位点，任选地其中scFv包含VH-接头-VL，其中VH和VL为曲妥单抗或HerceptinTM的结合位点的可变结构域。在一个实施例中，结合剂的第二结合位点特异性地结合人CD3胞外结构域或CD16(例如CD16A)胞外结构域。
[0192] 在一个实施例中，本发明的CAL-细胞是由包含多个本发明的CAL-TIL(或CAL-T或CAL-NK细胞)的移植物所包含，并且向人施用所述移植物以治疗或预防疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病、GvHD的移植物排斥)或所述细胞或移植物是用于这种用途。
[0193] 在一个实施例中，所述人是女性；或男性。
[0194] 在一个实施例中，患者或人在施用本发明的免疫细胞(例如CAL-细胞)之前已经历了淋巴细胞清除。
[0195] 用于产生CAR和CAR T细胞的技术是本领域中已知的和常规的，并且这些技术一般可应用于产生本发明的CAL和CAL-细胞(例如，参见WO2012079000A1；J Immunother.2009年9月；32(7):689–702,doi:10.1097/CJI.0b013e3181ac6138“, Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19Chimeric Antigen Receptor”,James
N.Kochenderfer等人；及WO 2014012001，关于适用于本发明的一般方法)。例如，如熟练技术人员已知的电穿孔、逆转录病毒载体或慢病毒载体的使用可用于将编码本发明的CAL的元件的核苷酸序列引入T细胞、NK细胞、TIL或其它免疫细胞中以产生本发明的CAL-细胞。从患者(自体细胞样品)或从另一供体(同种异体样品)分离的细胞可用于提供祖细胞，将这些祖细胞进行遗传工程改造以包括CAL-编码序列。细胞的扩增可用于该过程中，如本领域中已知。例如，在将CAL-细胞工程改造之后，可使用常规技术将细胞群大规模扩增以产生施用于(例如输入)患者的移植物。患者可为人或非人动物。可使用从患者或另一供体处获得的细胞对一个或多个CAL元件(例如，第二抗原和/或第一信号传导结构域)的核苷酸序列进行克隆或测序。
N.Kochenderfer等人；及WO 2014012001，关于适用于本发明的一般方法)。例如，如熟练技术人员已知的电穿孔、逆转录病毒载体或慢病毒载体的使用可用于将编码本发明的CAL的元件的核苷酸序列引入T细胞、NK细胞、TIL或其它免疫细胞中以产生本发明的CAL-细胞。从患者(自体细胞样品)或从另一供体(同种异体样品)分离的细胞可用于提供祖细胞，将这些祖细胞进行遗传工程改造以包括CAL-编码序列。细胞的扩增可用于该过程中，如本领域中已知。例如，在将CAL-细胞工程改造之后，可使用常规技术将细胞群大规模扩增以产生施用于(例如输入)患者的移植物。患者可为人或非人动物。可使用从患者或另一供体处获得的细胞对一个或多个CAL元件(例如，第二抗原和/或第一信号传导结构域)的核苷酸序列进行克隆或测序。
[0196] 结构域变异和匹配
[0197] 在第5和第6构型的一个实施方案中，第二结合部分为配体(例如抗原)且第三部分为配体受体或结合位点(例如，VH/VL结合位点)，例如，其中免疫细胞为CAR细胞。在有利的实施例中，第二结合部分序列对于天然地见于人的第二部分的编码序列中的一个或多个非同义SNP是SNP匹配的。
[0198] 在与CAL有关的第1至第4构型的一个有利的实施例中，第二抗原序列对于见于人中的第二抗原的编码序列中的一个或多个非同义SNP(例如，参照天然地见于人CD3胞外结构域中的一个或多个SNP)是SNP匹配的。
[0199] 用于评估和鉴别SNP的合适的数据库为本领域技术人员所知，如Ensembl和1000基因组数据库。参考在可表达的序列中的具体核苷酸位置处的变异，本领域技术人员认识到在具体的核苷酸位置处的“非同义SNP”为在那个位置处的单核苷酸多态性，其中天然变异在所编码的蛋白质序列中产生不同的氨基酸残基结果。对在桥连剂的第二结合部分(本发明的第5和第6构型)或CAL胞外结构域的第二抗原(第1至第4构型)中的一个或多个SNP变异或相应的氨基酸变化的考量适用于匹配所述试剂或CAL的此元件以反映在由本发明的免疫细胞(或祖细胞，本发明的免疫细胞为其子代)所编码和/或由患者基因组所编码的等价蛋白质中的天然SNP变异。当接受本发明的免疫细胞(或细胞移植物)的患者的基因组编码这种匹配的SNP时，这是特别有用的，在此情况下，这提高了桥连剂(在第5和第6构型中)或CAL胞外部分(在第1至第4构型中)与患者免疫系统的相容性(且由此可适用于减轻针对所述试剂或CAL的免疫应答，否则会降低效用)。在一个有利的实施方案中，患者表达第二结合部分(第5和第6构型)或第二抗原(第1至第4构型)，即一种蛋白质，其氨基酸序列与这种试剂的第二部分或CAL的第二抗原的氨基酸序列相同。因此，例如，第二结合部分(第5和第6构型)或第二抗原(第1至第4构型)为CD3γ、δ或ε结构域，其中根据本发明的试剂和免疫细胞的接受者分别表达匹配的CD3γ、δ或ε结构域。
[0200] 类似地，本发明的方面匹配跨膜蛋白(例如CAR或CAL)的一个或多个胞内信号传导结构域以便使工程改造的免疫细胞内的表现最佳。在这种情况下，SNP匹配是在以下之间使用：(i)编码跨膜蛋白的第一(或每个)信号传导结构域的核苷酸序列(非内源性序列，例如，引入慢病毒或逆转录病毒载体上)与(ii)编码这种信号传导结构域的细胞的内源性核苷酸序列。通过以此方式的匹配，信号传导结构域还与细胞中的内源性信号传导级联的其它组分相匹配，以帮助使表现最佳。如本文所用，“内源性”是指在生物体、细胞、组织或系统中或来自其或由其内部产生的任何天然存在的材料，例如见于已经或将要施用根据本发明的免疫细胞(例如，CAR-或CAL-细胞)的患者的非工程改造细胞中或来自免疫细胞所来源于的供体。
[0201] 例如，第一信号传导结构域为人CD3ζ结构域且本发明的细胞为包含编码所述人CD3ζ结构域的内源性核苷酸序列的人细胞。在一个实施例中，CD3ζ信号传导结构域包含如WO2012079000A1中所公开的SEQ ID NO:24的氨基酸序列，其序列明确地并入本文以用于本发明中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。在一个实施例中，CD3ζ信号传导结构域由如WO2012079000A1中所公开的SEQ ID NO:18的核酸序列编码，其序列明确地并入本文以用于本发明中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0202] 例如，第一信号传导结构域为人CD28结构域且本发明的细胞为包含编码所述人CD28结构域的内源性核苷酸序列的人细胞。
[0203] 例如，第一信号传导结构域为人4-1BB结构域且本发明的细胞为包含编码所述人4-1BB结构域的内源性核苷酸序列的人细胞。
[0204] 例如，第一信号传导结构域为人OX40结构域且本发明的细胞为包含编码所述人OX40结构域的内源性核苷酸序列的人细胞。
[0205] 在一个实施例中，当第二结合部分(第5和第6构型)或第二抗原(第1至第4构型)为CD3γ、δ或ε结构域且第一信号传导结构域为CD3ζ结构域时，部分/抗原和结构域不是一起天然地存在于单细胞(例如，人野生型细胞或从患者分离的细胞)中。在另一实施例中，当第二结合部分或第二抗原为CD3γ、δ或ε结构域且第一信号传导结构域为CD3ζ结构域时，跨膜蛋白(例如，CAL或CAR)包含不是CD3结构域的另一结构域，例如，所述另一结构域为CD28、CD27、OX40或4-1BB结构域。
[0207] (A)：在一个实施例中，CAL是一种工程改造的单一多肽，其(在N末端至C末端方向上)包含人CD3胞外结构域；任选的铰链(例如，人CD8α铰链)；跨膜结构域(例如，人CD8α或CD28跨膜结构域)；及人CD3ζ结构域。在一个实施例中，CAL为两种或更多种所述多肽的复合物。任选地，CAL包含位于跨膜与CD3ζ结构域之间的另一胞内信号传导结构域(i)。任选地，CAL包含另一胞内信号传导结构域，其中CD3ζ结构域位于另一信号传导结构域与跨膜结构域之间。在一个实施例中，所述另一信号传导结构域为人CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域或CD16结构域。在一个替代方案中，代替单一多肽，CAL包含至少2个包含所述结构域的多肽的工程改造的复合物。在一个替代方案中，当CAR用于本发明中时，CAR与这种CAL相同，例外的是CAR具有代替CD3胞外结构域的抗原结合位点。
[0208] (B)：在一个实施例中，CAL是一种工程改造的单一多肽，其(在N末端至C末端方向上)包含人CD16(例如，CD16A)胞外结构域；任选的铰链(例如，人CD8α铰链)；跨膜结构域(例如，人CD8α跨膜结构域)；及人CD3ζ结构域。在一个实施例中，CAL为两个或更个种所述多肽的复合物。任选地，CAL包含位于跨膜与CD3ζ结构域之间的另一胞内信号传导结构域(i)。任选地，CAL包含另一胞内信号传导结构域，其中CD3ζ结构域位于另一信号传导结构域与跨膜结构域之间。在一个实施例中，所述另一信号传导结构域为人CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域或CD3结构域。在一个替代方案中，代替单一多肽，CAL包含至少2个包含所述结构域的多肽的工程改造的复合物。在一个替代方案中，当CAR用于本发明中时，CAR与这种CAL相同，例外的是CAR具有代替CD16胞外结构域的抗原结合位点。
[0209] (C)：在一个实施方案中，CAL为两个或更多个多肽的复合物，第一所述CAL多肽是根据(A)且第二所述多肽是根据(B)的CAL多肽。在另一实施方案中，CAR为两个或更多个多肽的复合物，第一所述CAL多肽是根据(A)且第二所述多肽是根据(B)的CAR多肽。
[0210] 在一个实施例中，CAL-细胞不由细胞的内源性核苷酸序列表达所述第二抗原或其天然存在的变体。例如，内源性序列已在细胞中失活，例如通过全部或部分地敲除或通过突变实现。举例来说，突变为CRISPR/Cas介导的基因组修饰的产物。通过排除表达内源性第二抗原(例如，CD3胞外结构域)的可能性，第二抗原的所有接合都是针对触发CAL(而非任何内源性受体复合物，如内源性TCR-CD3复合物)，否则它可能竞争结合至桥连剂。
[0211] 在一个实施方案中，将本发明的免疫细胞(例如，CAR-细胞或CAL-细胞)联合免疫抑制剂一同施用。可使用本领域中已知的任何免疫抑制剂。举例来说，免疫抑制剂可为环孢菌素、咪唑硫嘌呤、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克(Mycophenolate mofetil)、霉酚酸、强的松、西罗莫司、巴利昔单抗、或达珠单抗、或其任何组合。
[0212] 可使用的另外的或替代的免疫抑制剂包括但不限于ORTHOCLONE OKTTM 3(莫罗单抗-CD3)、SANDIMMUNETM、NEORALTM、SANGDYATM(环孢菌素)、PROGRAFTM(FK506，他克莫司)、TM TMCELLCEPT (霉酚酸莫非替克，其中的活性代谢物为霉酚酸)、IMURAN (咪唑硫嘌呤)、糖皮质激素、肾上腺皮质类固醇如DELTASONETM(强的松)和HYDELTRASOLTM(泼尼松龙)、FOLEXTM和MEXATETM(甲氨蝶呤)、OXSORALEN-ULTRATM(甲氧沙林)、RITUXANTM(利妥昔单抗)及RAPAMUNETM(西罗莫司)。
[0213] 本发明的免疫细胞可在免疫抑制剂之前、之后或同时向患者施用。例如，本发明的细胞可在免疫抑制剂向患者施用之后施用，或者本发明的细胞可在免疫抑制剂向患者施用之前施用。或者或另外，本发明的细胞是在免疫抑制剂向患者施用的同时施用。
[0214] 本发明的免疫细胞和/或免疫抑制剂可在器官或组织的移植之后向患者施用。或者或另外，本发明的免疫细胞和/或免疫抑制剂可在移植之前向患者施用。本发明的免疫细胞和/或免疫抑制剂也可在移植手术期间向患者施用。
[0215] 在一些实施方案中，向患者施用免疫细胞的本发明方法是在免疫抑制疗法开始后进行。在一些实施方案中，进行所述方法一次以上，以便例如随时间监测移植物接受者且如果适用的话，在不同的免疫抑制疗法方案中。在一些实施方案中，如果预测移植物接受者能耐受移植物，那么减少免疫抑制疗法。在一些实施方案中，如果预测移植物接受者能耐受移植物，那么不开出免疫抑制疗法的处方，例如，终止免疫抑制疗法。如果移植物接受者表现非耐受的生物标志物特征，那么免疫抑制疗法可恢复到标准水平或在标准水平下继续。
[0216] 器官或组织移植物可为心脏、心瓣膜、肺、肾、肝、胰脏、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞。
[0217] 本发明的免疫细胞可单独或作为与稀释剂和/或其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物来施用。
[0218] 肿瘤抗原(TAA)是由引发免疫应答(尤其是T细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的桥连剂的第一抗原结合特异性的选择将取决于待治疗的癌症的具体类型。肿瘤抗原是本领域中公知的并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶(intestinal carboxyi esterase)、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体及间皮素。第一抗原(本发明的第1至第4构型)或第四结合部分(第5或第6构型)可为这些TAA中的任一个或可为这些TAA中的任一个的抗原性序列。
[0219] 在一个实施方案中，肿瘤抗原包含一个或多个与恶性肿瘤有关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可充当免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，如在黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及在前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，如致癌基因HER-2/Neu ErbB-2。又一组靶抗原为肿瘤胎儿抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成真实的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，它是单个肿瘤所特有的。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37为B细胞淋巴瘤中的靶抗原的其它候选物。一些抗原(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已用作采用单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标，但成效很有限。第一抗原或第四结合部分可为这些TAA中的任一个或可为这些TAA中的任一个的抗原性序列。
[0220] TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，如MART-I/MelanA(MART-1)、g l OO(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过度表达的胚胎抗原，如CEA；过度表达的致癌基因和突变肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如EB病毒抗原(Epstein Barr virus antigen)EBVA和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它较大的基于蛋白质的抗原包括：TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl 85erbB2、pl 80erbB-3、c-met、nm-23H l、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4(791Tgp72}甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA
242、CA-50、CAM43、CD68\I、CO-029、FGF-5、G250、Ga733VEpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
242、CA-50、CAM43、CD68\I、CO-029、FGF-5、G250、Ga733VEpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
[0221] 在一个实施方案中，第一抗原或第四结合部分为人CD 19且第一抗原结合位点或桥连剂的第一结合部分为抗CD 19scFV，任选地其中抗CD19scFV是由WO2012079000A1中所公开的SEQ ID:14编码。在一个实施方案中，抗CD 19scFV包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0222] 在一个实施方案中，使用与CAR或CAL中的一个结构域天然地有关的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可被选出或通过氨基酸取代被修饰以避免这类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域上，以便使与受体复合物的其它成员的相互作用最小。
[0223] 跨膜结构域可来源于天然或合成来源。当来源为天然的时，结构域可来源于任何膜结合的蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别使用的跨膜区可来源于(即包含至少以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137或CD 154。或者，跨膜结构域可为合成的，在此情况下，它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。任选地，苯丙胺酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成跨膜结构域的各末端处。
[0224] 任选地，短的寡肽或多肽接头(优选地，长度介于2个氨基酸与10个氨基酸之间)在跨膜蛋白(例如，CAL或CAR)的跨膜结构域与胞内部分之间形成键。甘氨酸-丝氨酸双联体提供尤其合适的接头(例如，如本文所公开的(G4S)n接头)。
[0225] 任选地，跨膜结构域为由SEQ ID NO:16的核酸序列编码的CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0226] 在一些情况下，跨膜结构域包含由SEQ ID NO:15的核酸序列编码的CD8铰链结构域。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0227] 本发明的跨膜蛋白的胞内部分或者是胞内信号传导结构域负责表达跨膜蛋白(例如，CAL或CAR)的免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活。术语“效应功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应功能可为细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应功能信号并指导细胞执行特殊功能的部分。虽然通常可采用整个胞内信号传导结构域，但在很多情况下，无需使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可使用这种截短部分来代替完整的链，只要它能转导效应功能信号即可。术语“信号传导结构域”因此旨在包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。用于本发明的跨膜蛋白中的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的胞质序列及协调起作用以便在抗原受体接合之后引发信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体及具有相同功能能力的任何合成序列。
[0228] 已知通过单独TCR生成的信号不足以使T细胞完全活化并且还需要次生或共刺激信号。因此，T细胞活化据说可由两种截然不同类别的胞质信号传导序列来介导：引发通过TCR的抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式作用以提供次生或共刺激信号的那些(次生胞质信号传导结构域)。初级胞质信号传导序列以刺激性方式或抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式作用的初级胞质信号传导序列可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0229] 在一个实施例中，第一信号传导结构域为初级胞质信号传导结构域(例如，CD3ζ结构域)。在一个实施例中，第一信号传导结构域为次生胞质信号传导结构域(例如，CD28或4-1BB结构域)。
[0230] 在一个实施例中，第一信号传导结构域包含一个或多个ITAM。
[0231] 含有在本发明中特别有用的初级胞质信号传导结构域的合适的ITAM的实例包括来源于以下的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。特别优选的是，本发明的跨膜蛋白中的胞质信号传导分子包含来源于CD3ζ的胞质信号传导序列。
[0232] 胞内部分任选地包含共刺激分子的结构域(例如，作为第一信号传导结构域或另一胞内结构域)。共刺激分子是淋巴细胞(例如，T或NK细胞)对抗原的有效应答所需的除抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。这种分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83特异性结合的配体等等。因此，这些及其它共刺激元件在本发明的范围内用于跨膜蛋白的胞内部分中。
[0233] 胞内部分结构域可通过一个或多个接头，例如，如本文所公开的(G4S)n接头连接在一起。
[0234] 在一个实施方案中，胞内部分包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一实施方案中，胞内部分包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在又一实施方案中，胞内部分包含CD3-ζ的信号传导结构域及CD28和4-1BB的信号传导结构域。
[0235] 在一个实施方案中，胞内v包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域由SEQ ID NO:17中列出的核酸序列编码且CD3-ζ的信号传导结构域由SEQ ID NO:18中列出的核酸序列编码。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0236] 在一个实施方案中，胞内部分包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0237] 在一个实施方案中，胞内部分包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列。在本段落中的序列出现于WO2012079000A1中并且明确地并入本文以用于本发明的桥连剂中并且可能包括于一项或多项本文的权利要求中。
[0238] 本发明提供了一种核酸载体，其包含编码跨膜蛋白(例如，本发明的CAR或CAL)的可表达的核苷酸序列。本发明提供了第一核酸载体，其包含编码本发明的跨膜蛋白的可表达的核苷酸序列；和第二核酸载体，其包含编码本发明的桥连剂的可表达的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明(例如，本文所公开的用于治疗患者(如人)的疾病或病状或降低其风险的任何方法)包括向患者施用编码跨膜蛋白的载体，由此将载体引入患者的一个或多个第一细胞中以用于表达跨膜蛋白。在一个实施例中，跨膜蛋白在子代细胞中表达，其中所述细胞为第一细胞的子代。在一个实施例中，第一细胞为患者的干细胞(例如，骨髓细胞、造血干细胞和/或T记忆细胞)。如下所论述，本领域已包括用于执行此实施方案的合适的载体和技术，举例来说，所述载体为慢病毒、腺病毒或逆转录病毒。在一个实施例中，编码跨膜蛋白的DNA被基因组并入第一细胞中。这就避免了对以下的需要：采集祖细胞用于离体工程改造以编码跨膜蛋白，然后输注到患者中。相反，载体施用是唯一需要的步骤并且得到的子代细胞的相容性极大，因为它们仅基于患者的第一细胞，而无由离体操作所引起的变化的风险。此外，可施用患者自身的系统(任选用试剂如IL-2刺激，这会上调免疫细胞扩增)以扩增子代细胞群。桥连剂可例如离体产生并在患者已产生子代细胞之后向患者施用，由此可实现本发明方法的可滴定优点。
[0239] 在一个实施例中，载体为用于引入到人细胞(例如，人T细胞、NK细胞、TIL、干细胞、骨髓细胞或其祖细胞)中的基因疗法载体。本发明还提供了这样一种细胞，其包含编码跨膜蛋白的核苷酸序列(例如DNA)或载体。本发明还包括逆转录病毒、腺病毒或慢病毒，它们包含编码本发明的跨膜蛋白(例如CAL)的可表达的核苷酸序列。所述序列当由本发明的免疫细胞所包含时是可表达的，例如，可在人T细胞、NK细胞或TIL中表达。
[0240] 本发明还提供了其中插入本发明的DNA的载体。来源于逆转录病毒如慢病毒的载体为实现长期基因转移的合适的工具，因为它们容许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体具有的与来源于肿瘤逆转录病毒如鼠科白血病病毒的载体相比的附加优点是它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。
[0241] 本发明的构建体和载体也可用于核酸免疫和使用标准基因递送方案的基因疗法。用于基因递送的方法是本领域中已知的。参见，例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,
589,466，它们以引用的方式整体并入本文。
589,466，它们以引用的方式整体并入本文。
[0242] 本发明提供了一种编码跨膜蛋白(例如，本发明的CAL或CAR)的mRNA。熟练技术人员知道将mRNA递送到生物体(如人)中以用于在体内表达编码蛋白的技术。在一个实施例中，本发明包括将mRNA引入第一免疫细胞或第一免疫细胞祖细胞(例如，人T细胞、NK细胞的TIL或造血干细胞或T记忆干细胞)中以用于在细胞或其子代中表达跨膜蛋白。任选地，在治疗或预防如本文所述的疾病或病状的方法中向患者(例如人)施用细胞或子代产物。在一个替代方案中，当将mRNA引入细胞中时，第一细胞是由患者(例如人)所包含。
[0243] T细胞和其它免疫细胞的来源以及其产生、活化和扩增的方法公开于WO2012079000A1中。这些公开内容涉及在研究本发明方面的可能用途。
[0244] 癌症
[0245] 可被治疗的癌症包括未血管化、或大体上未血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待用本发明的CAL治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤、胚细胞瘤和肉瘤；及某些白血病或淋巴恶性肿瘤；良性和恶性肿瘤；以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌瘤和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
[0246] 血液癌为血液或骨髓的癌症。血液(或造血)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病及成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(低度恶性和高级)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病及脊髓发育不良。
[0247] 实体肿瘤为通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤是以形成它们的细胞类型来命名(如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体肿瘤如肉瘤和癌瘤的实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤、及CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合性胶质细胞瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、胚组织瘤、成神经管细胞瘤、许旺氏细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移)。
[0248] 在一个实施方案中，本发明的桥连剂的第一结合部分或第一抗原结合位点被设计来治疗特定的癌症。例如，它特异性地结合至CD19以用于治疗癌症和病症，例如，前B ALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或用于同种异体骨髓移植后的救治。在另一实施方案中，第一部分或第一结合位点特异性地结合CD22以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。
[0249] 在一个实施方案中，癌症和病症包括但不限于前B ALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后救治等，它们可使用靶向以下两个或三个的桥连剂的组合(或由单试剂所包含的结合部分或位点)来治疗：CD19、CD20、CD22和ROR1(例如，CD19和其它靶标中的一个)。
[0250] 在一个实施例中，本发明的细胞包含不同的第一跨膜蛋白和第二跨膜蛋白(例如，CAL或CAR)，例如，在它们的第二抗原方面不同的CAL(且任选地，否则为相同的)。类似地，本发明提供了本发明的免疫细胞的混合物(例如，CAL-细胞的混合物)，例如，由本发明的移植物所包含，其中所述混合物包含含有不同跨膜蛋白(例如，在它们的第二抗原方面不同的CAL)的细胞。在一个实施例中，本发明的细胞包含第一桥连剂和第二桥连剂，它们是不同的，例如在它们的第一部分/第一抗原结合位点特异性方面不同(且任选地，否则为相同的，例如，包含相同的第二部分/第二抗原结合位点)。这可适用于降低例如癌症对治疗的抗性或更有效地靶向细胞群，如表面表达多个靶抗原的癌细胞。
[0251] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至间皮素以治疗或预防间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌。
[0252] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至CD33/IL3Ra以治疗或预防急性骨髓性白血病。
[0253] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至c-Met以治疗或预防三阴性乳腺癌或非小细胞肺癌。
[0254] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至PSMA以治疗或预防前列腺癌。
[0255] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至糖脂F77以治疗或预防前列腺癌。
[0256] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至EGFRvIlI以治疗或预防成胶质细胞瘤。
[0257] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至GD-2以治疗或预防神经母细胞瘤或黑素瘤。
[0258] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至NY-ESO-1TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤或黑素瘤。
[0259] 在一个实施方案中，桥连剂的第一部分/第一抗原结合位点特异性地结合至MAGE A3TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤和黑素瘤。
[0260] 在一个实施例中，使用方法的所述治疗减慢疾病或病状或其症状的进展。在一个实施例中，使用方法的所述治疗减少疾病或病状或其症状的发病率，例如持续至少1、2、3、4或5年。
[0261] 在一个实施例中，离体执行本发明的方法以产生移植物，其中靶细胞已被杀伤或在数量上减少，其中向患者(例如人)施用(例如输注)所述移植物以用于治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0262] 在一个实施例中，所述方法是体外的。在另一实施例中，所述方法是在哺乳动物的体内，例如，人、男性或女性、或男童或女童、或人婴儿(例如，不超过1、2、3或4岁)。在一个实施例中，所述患者为成年人或儿科人患者。
[0263] 具体实施方案
[0264] 本发明在以下编号段落中提供具体的实施方案：-
[0265] 1.一种使免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)靶向靶细胞的方法，所述方法包括[0266] A.提供桥连剂，其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
[0267] i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
[0268] ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
[0269] B.提供嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，其中所述免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
[0270] iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和[0271] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
[0272] C.将所述CAL-免疫细胞和桥连剂与所述靶细胞组合，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
[0273] v.由此所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
[0274] vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
[0275] CAL被工程改造，即包含部分和结构域的非天然存在的组合。例如，配体包含单一多肽(即仅具有一个这种多肽)，所述多肽包含CD3胞外结构域(第二抗原)、CD28或4-1BB结构域(第一信号传导结构域)和CD3ζ结构域。在此情况下，配体包含工程改造的结构域组合，因为CD3胞外结构域和CD28或4-1BB结构域不天然地存在于同一受体中(例如，不在天然的CD3受体复合物中)。因此，在一个实施例中，第二抗原和第一信号传导结构域不天然地被细胞的受体所包含或者不天然地被人或作为本发明方法的受试者的人所包含。例如，免疫细胞不包含编码包含所述组合的受体的内源性核苷酸序列。
[0276] 如本文所用，术语“特异性地结合”就抗体或结合位点而言意指以1mM或更低(如由SPR所测定)的结合亲和力识别特异性抗原的抗体或结合位点。
[0277] 靶结合能力、特异性和亲和力(KD(也称为Kd)、Koff和/或Kon)可通过本领域中任何常规方法(例如，通过表面等离子体共振(SPR))测定。如本文所用，术语“KD”旨在指的是具体的结合位点/配体、受体/配体或抗体/抗原相互作用的平衡解离常数。
[0278] 在一个实施方案中，表面等离子体共振(SPR)是在25℃下进行。在另一实施方案中，SPR是在37℃下进行。
[0279] 在一个实施方案中，SPR是在生理pH下进行，如约pH 7或pH7.6(例如，使用在pH 7.6下的Hepes缓冲盐水(也称为HBS-EP))。
[0280] 在一个实施方案中，SPR是在生理盐水平下进行，例如，150mM NaCl。
[0281] 在一个实施方案中，SPR是在不大于0.05体积％的洗涤剂水平下，例如在0.05％的P20(聚山梨醇酯20；例如Tween-20TM)和3mM EDTA存在下进行。
[0282] 在一个实施例中，SPR是在25℃或37℃下，在pH 7.6的缓冲液、150mM NaCl、0.05％洗涤剂(例如P20)和3mM EDTA中进行。缓冲液可含有10mM Hepes。在一个实施例中，SPR是在25℃或37℃下在HBS-EP中进行。HBS-EP可获自Teknova Inc(California；目录编号H8022)。
[0283] 在一个实施例中，亲和力(例如，包含VH/VL结合位点的试剂的亲和力)是使用SPR，通过使用任何标准SPR仪器、如通过BiacoreTM或使用ProteOn XPR36TM(Bio- )来测定。可将结合数据拟合到使用标准技术所固有的1:1模型，例如，使用ProteOn XPR36TM分析软件所固有的模型。
[0284] 在CAL的第二抗原(其可为结构域或肽)与跨膜结构域之间或在CAL的第一信号传导结构域与跨膜结构域之间任选地存在间隔区(结构域或肽)。如本文所用，术语“间隔区”一般意指用于将跨膜结构域连接到CAL中的第二抗原或信号传导结构域上的任何寡肽或多肽。间隔区可包含至多300个氨基酸，优选地从10至100个氨基酸且最优选从25至50个氨基酸。
[0285] 任选地，桥连剂的每个结合位点包含抗体结合位点，例如，针对抗原的VH/VL结合位点。
[0286] 所述信号传导可上调或下调免疫细胞活性，例如，细胞毒性或细胞增殖。
[0287] 第5和第6构型实施例
[0288] 在一个替代方案中，段落1提供了以下替代条目I至VII。因此，接下来的段落2的特征可与条目I至VII中的任一条组合。在下文中对“段落1”的提及因此可作为替代被当作条目I至VII中的任一条；在接下来的段落2的任一个中的“第一抗原结合位点”可被当作条目I至VII中任一条所述的“第一结合部分”；在接下来的段落2的任一个中的“第二抗原结合位点”可被当作条目I至VII中任一条所述的“第二结合部分”；在接下来的段落2的任一个中的“第一抗原”可被当作条目I至VII中任一条所述的“第四结合部分”；在接下来的段落2的任一个中的“第二抗原”可被当作条目I至VII中任一条所述的“第三结合部分”；并且在接下来的段落2的任一个中的CAL可被当作条目I至VII中任一条所述的“跨膜蛋白”、“CAR”或“CAL”。
[0289] I.一种使免疫细胞靶向靶细胞的方法，所述方法包括
[0290] A.提供桥连剂，其中所述试剂是多特异性结合片段，其包含
[0291] vii.第一结合部分；和
[0292] viii.第二结合部分；
[0293] B.提供免疫细胞，其中所述免疫细胞表达包含以下的工程改造组合的跨膜蛋白[0294] ix.包含连接到跨膜结构域上的第三结合部分的胞外部分；其中第二部分和第三部分形成特异性结合对(SBP1)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分；和
[0295] x.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当第二部分和第三部分结合在一起时进行胞内信号传导；
[0296] C.将免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合，所述靶细胞包含第四结合部分，其中所述第四部分为胞外的，
[0297] xi.由此第一部分和第四部分形成特异性结合对(SBP2)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
[0298] xii.其中第二部分和第三部分结合在一起，由此触发免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性；并且
[0299] xiii.其中桥连剂的分子量不超过125kDa。
[0300] II.条目I的方法，其中第一结合部分和第二结合部分为配体结合位点。
[0301] III.条目II的方法，其中第一结合部分和第二结合部分分别为第一抗原结合位点和第二抗原结合位点(例如，VH/VL抗原结合位点)。
[0302] 抗体VH结构域与抗体VL结构域如何配对形成特异性地结合抗原的VH/VL结合位点是众所周知的。
[0303] IV.条目I至III中任一条的方法，其中SBP1和SB2各自选自由以下组成的组：-
[0304] (a)抗原和抗原结合位点(例如，抗原和VH/VL抗原结合位点；或超抗原和抗体可变结构域或恒定结构域)；及
[0305] (b)受体和配体。
[0306] 超抗原的实例为蛋白A(例如，来自金黄色葡萄球菌(S aureus)的蛋白A的配体结合结构域)、蛋白G和蛋白L((例如，来自大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的蛋白L的配体结合结构域)或gp120的配体结合结构域。
[0307] 在一个实施例中，SB1和/或SB2各自为生长因子结构域-生长因子受体对；或激素结构域-激素受体对。受体包含针对同源配体的结合位点，但在别的方面不必为完整受体，即可为受体片段。
[0308] V.条目I至IV中任一条的方法，其中所述跨膜蛋白为嵌合抗原配体(CAL)，其中第三部分为抗原且第二部分为抗原结合位点(例如scFv)；且任选地，第一部分为抗原结合位点(例如scFv)且第四部分为抗原。
[0309] VI.条目I至IV中任一条的方法，其中所述跨膜蛋白为嵌合抗原受体(CAR)，其中第三部分为抗原结合位点且第二部分为抗原；且任选地，第一部分为抗原结合位点(例如scFv)且第四部分为抗原。
[0310] VII.条目I至VI中任一条的方法，其中桥连剂的分子量不超过115kDa，例如，从55至115kDa或从60至100kDa。
[0311] 以下特征可适用于所有构型。
[0312] 在一个实施例中，结合剂为配体阱(ligand trap)，其分子量不超过125、120、115、110、100或50kDa。在一个实施例中，阱的第一结合部分包含配体结合位点，例如配体受体的结合位点，且第二结合位点包含抗体Fc区(例如，人IgG1Fc区)，其中第三结合部分包含Fc受体的结合位点(例如，CD16、CD16A或CD16B)且第四结合部分由所述配体所包含。本发明的这种结合剂有利地具有比如上所述的抗体更短的半衰期。在一个实施例中，所述配体为人IL-
1A、IL-1β、IL-1RN、IL-6、BLys、APRIL、活化素A、TNFα、a BMP、BMP2、BMP7、BMP9、BMP10、GDF8、GDF11、RANKL、TRAIL、VEGFA、VEGFB或PGF。在一个实施例中，第一结合部分包含IL-1R结构域、gp130结构域、ActRIIA结构域、ActRIIB结构域、Alk1结构域、OPG结构域和VEGFR1和/或VEGFR2结构域。在一个实施例中，第一结合部分包含人IL-1R、gp130、ActRIIA结构域、ActRIIB、Alk1、OPG、VEGFR1或VEGFR2的配体结合位点。
1A、IL-1β、IL-1RN、IL-6、BLys、APRIL、活化素A、TNFα、a BMP、BMP2、BMP7、BMP9、BMP10、GDF8、GDF11、RANKL、TRAIL、VEGFA、VEGFB或PGF。在一个实施例中，第一结合部分包含IL-1R结构域、gp130结构域、ActRIIA结构域、ActRIIB结构域、Alk1结构域、OPG结构域和VEGFR1和/或VEGFR2结构域。在一个实施例中，第一结合部分包含人IL-1R、gp130、ActRIIA结构域、ActRIIB、Alk1、OPG、VEGFR1或VEGFR2的配体结合位点。
[0313] 在一个实施例中，所述试剂选自由以下组成的组：阿柏西普、ZaltrapTM或EyleaTM(且第四结合部分为VEGFA、VEGFB或PGF)、兰尼单抗或LucentisTM(且第四结合部分为VEGFA、VEGFB或PGF)、依那西普或EnbrelTM(且第四结合部分为TNFα)、赛妥珠单抗(即，赛妥珠单抗的Fab或排除PEG的CimziaTM)(且第四结合部分为TNFα)、阿塞西普(且第四结合部分为BLys)、利纳西普或ArcalystTM(且第四结合部分为IL-1)；或本发明的桥连剂的第一结合部分包含选自所述组的试剂的配体结合位点。
[0314] 在一个实施例中，各结合部分为人的或来源于人部分，例如，人配体或人结合位点。
[0315] 2.段落1所述的方法，其中所述桥连剂具有小于IgG的人血清半衰期的人血清半衰期。
[0316] 任选地，桥连剂具有小于IgA的人血清半衰期的人血清半衰期。任选地，桥连剂具有小于IgM的人血清半衰期的人血清半衰期。任选地，桥连剂具有小于IgD的人血清半衰期的人血清半衰期。任选地，桥连剂具有小于IgE的人血清半衰期的人血清半衰期。
[0317] 3.段落2所述的方法，其中所述桥连剂具有不超过15、10或5天的人血清半衰期。
[0318] 熟练技术人员将知道如何常规地测定这种半衰期。许多现有技术片段(包括本文所公开的片段)的血清半衰期是本领域中已知的。
[0319] 4.段落3所述的方法，其中半衰期小于1天。
[0320] 5.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点为VH/VL结合位点。
[0321] 6.任一前述段落所述的方法，其中第二结合位点为VH/VL结合位点。
[0322] 7.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点对于第一抗原的结合亲和力(KD)比第二结合位点对于第二抗原的亲和力低至少5、10或20倍。
[0323] 因此，与第一抗原的结合比与第二抗原的更强。这可适用于控制桥连剂的开关活性。
[0324] 例如，博纳吐单抗经由CD19(一种仅由B细胞表达的标志物)高度特异性地(1.6x 10-9M的亲和力)靶向恶性B细胞。而且博纳吐单抗经由与CD3的降低的亲和力相互作用(8.7x
10-8M)募集并活化T细胞。在一个实施例中，桥连剂为博纳吐单抗或包括博纳吐单抗。博纳吐单抗的序列示于下文的SEQ ID NO:19中。在一个实施方案中，因此，所述试剂包含SEQ ID NO:19。
10-8M)募集并活化T细胞。在一个实施例中，桥连剂为博纳吐单抗或包括博纳吐单抗。博纳吐单抗的序列示于下文的SEQ ID NO:19中。在一个实施方案中，因此，所述试剂包含SEQ ID NO:19。
[0325] 8.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点对第一抗原具有10nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定；且第二结合位点对第二抗原具有50nM或更高(例如，高达1mM)的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定。
[0326] 这适用于产生与同免疫细胞相比与靶细胞的优先结合，以有助于体内免疫细胞活性的缓和。
[0327] 天然TCR-肽/MHC相互作用的结合亲和力为约KD约0.1–500μM。在一个实施例中，本发明的第二结合位点与第二抗原(第1至第4构型)/第二部分与第三部分(第5或第6构型)结合的KD小于100nM，例如，50nM≥KD<100nM，例如从50nM至95、90、85或80nM。低于100nM的亲和力适用于促进与本发明的免疫细胞表面上的天然TCR结合相比与工程改造的跨膜蛋白(例如CAL或CAR)的优先结合。在一个实施例中，免疫细胞为CAL-T或CAR-T细胞且桥连剂对第一抗原的结合亲和力比桥连剂对第二抗原/第三部分的亲和力更高，其中对第二抗原/第三部分的亲和力小于100、90或85nM。因此，当TCR和第二抗原或第三部分在本发明的免疫细胞上共表达时，通过以此方式选择相对结合亲和力，细胞可比经由T细胞的任何内源性TCR优先地结合至本发明的工程改造的跨膜蛋白(例如CAL或CAR)。这适用于经由跨膜蛋白驱动信号传导。
[0328] 9.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点对第一抗原具有2nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定；且第二结合位点对第二抗原具有60nM或更高(例如，高达1mM)的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定。
[0329] 10.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点对第一抗原具有100nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定。
[0330] 11.任一前述段落所述的方法，其中第一结合位点对第一抗原具有Koff＝10-3sec-1或更低的结合解离速率，如通过SPR所测定。
[0331] 12.任一前述段落所述的方法，其中第二结合位点对第二抗原具有100nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定。
[0332] 13.任一前述段落所述的方法，其中第二结合位点对第二抗原具有Koff＝10-3sec-1或更低的结合解离速率，如通过SPR所测定。
[0333] 本发明包括关于桥连剂的下列任选实施方案：-
[0334] 第一结合位点动力学
[0335] (a)第一抗原结合位点以如下解离常数(KD)特异性地结合人FA(FA＝所述第一抗原)：从(或从约)0.1至(或至约)10000nM、任选地从(或从约)1至(或至约)6000nM，如通过表面等离子体共振所测定；
[0336] (b)第一抗原结合位点以如下解离速率常数(Kd)特异性地结合人FA：从(或从约)1.5x 10-4至(或至约)0.1sec-1、任选地从(或从约)3x 10-4至(或至约)0.1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；并且
[0337] (c)第一抗原结合位点以如下结合速率常数(Ka)特异性地结合人FA：从(或从约)2x 106至(或至约)1x 104M-1sec-1、任选地从(或从约)1x 106至(或至约)2x 104M-1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；
[0338] 还任选地：-
[0339] (d)第一抗原结合位点以如下解离常数(KD)特异性地结合猕猴FA：从(或从约)0.1至(或至约)10000nM、任选地从(或从约)1至(或至约)6000nM，如通过表面等离子体共振所测定；
[0340] (e)第一抗原结合位点以如下解离速率常数(Kd)特异性地结合猕猴FA：从(或从约)1.5x 10-4至(或至约)0.1sec-1、任选地从(或从约)3x10-4至(或至约)0.1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；并且
[0341] (f)第一抗原结合位点以如下结合速率常数(Ka)特异性地结合猕猴FA：从(或从6 4 -1 -1 6 3 -1 -1
约)2x 10至(或至约)1x 10M sec 、任选地从(或从约)1x 10至(或至约)5x 10M sec ，如通过表面等离子体共振所测定。
约)2x 10至(或至约)1x 10M sec 、任选地从(或从约)1x 10至(或至约)5x 10M sec ，如通过表面等离子体共振所测定。
[0342] 任选地，第一结合位点具有根据(a)和(d)的KD、根据(b)和(e)的Kd及根据(c)和(f)的Ka。
[0343] 第二结合位点动力学
[0344] (a’)第二抗原结合位点以如下解离常数(KD)特异性地结合人SA(SA＝所述第二抗原)：从(或从约)0.1至(或至约)10000nM、任选地从(或从约)1至(或至约)6000nM，如通过表面等离子体共振所测定；
[0345] (b’)第二抗原结合位点以如下解离速率常数(Kd)特异性地结合人SA：从(或从约)1.5x 10-4至(或至约)0.1sec-1、任选地从(或从约)3x10-4至(或至约)0.1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；并且
[0346] (c’)第二抗原结合位点以如下结合速率常数(Ka)特异性地结合人SA：从(或从约)2x 106至(或至约)1x 104M-1sec-1、任选地从(或从约)1x 106至(或至约)2x 104M-1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；
[0347] 还任选地：-
[0348] (d’)第二抗原结合位点以如下解离常数(KD)特异性地结合猕猴SA：从(或从约)0.1至(或至约)10000nM、任选地从(或从约)1至(或至约)6000nM，如通过表面等离子体共振所测定；
[0349] (e’)第二抗原结合位点以如下解离速率常数(Kd)特异性地结合猕猴SA：从(或从约)1.5x 10-4至(或至约)0.1sec-1、任选地从(或从约)3x10-4至(或至约)0.1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定；并且
[0350] (f’)第二抗原结合位点以如下结合速率常数(Ka)特异性地结合猕猴SA：从(或从约)2x 106至(或至约)1x 104M-1sec-1、任选地从(或从约)1x 106至(或至约)5x 103M-1sec-1，如通过表面等离子体共振所测定。
[0351] 任选地，第二结合位点具有根据(a’)和(d’)的KD、根据(b’)和(e’)的Kd及根据(c’)和(f’)的Ka。
[0352] 14.任一前述段落所述的方法，其中所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点各自选自由以下组成的组：scFv、nanobodyTM、dAb、duocalin、DARpin、avimer、adnectin和fynomer。
[0353] 15.任一前述段落所述的方法，其中所述桥连剂的大小不超过125kDa。
[0354] 在一个实施例中，大小不超过115、110、100、90、80、70或60kDa。
[0355] 这对于提供具有如上所述的本发明的有用益处的人血清半衰期是有利的。
[0356] 16.任一前述段落所述的方法，其中所述桥连剂的大小不超过80kDa(例如，不超过50或55kDa)。
[0357] 17.任一前述段落所述的方法，其中所述桥连剂为或包括BiTETM抗体、双特异性TMscFv、三特异性scFv、tandab 、dAb纳米抗体(例如二聚体或三聚体)、dAb多聚体(例如二聚体或三聚体)、双体、四体或DARTTM。
[0358] 在一个实施例中，桥连剂包含一个、两个或更多个Fab以提供结合位点。
[0359] 抗原结合位点
[0360] 在一个实施例中，所述或每个抗原结合位点(或当根据第5或第6构型时的配体结合部分)选自由以下组成的组：抗体可变结构域(例如，VL或VH、抗体单一可变结构域(结构域抗体或dAb)、骆驼VHH抗体单一可变结构域、鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域(NA V)、NanobodyTM或骆驼化VH单一可变结构域)；T细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；无颌纲动物可变淋巴细胞受体(J Immunol；2010年8月1日；185(3):1367-74；"Alternative adaptive immunity in jawless vertebrates；Herrin BR&Cooper M D.)；
纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；scFv；(scFv)2；sc-双体；scFab；centyrin和来源于选自CTLA-4(EvibodyTM)的骨架的抗原结合位点；脂笼蛋白结构域；蛋白A，如蛋白A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如，AvimerTM或MaxibodyTM)；热休克蛋白(如及来源于GroEI和GroES的表位结合结构域)；转铁蛋白结构域(例如反式体)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶状体蛋白或人泛素(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；以及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；scFv；(scFv)2；sc-双体；scFab；centyrin和来源于选自CTLA-4(EvibodyTM)的骨架的抗原结合位点；脂笼蛋白结构域；蛋白A，如蛋白A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如，AvimerTM或MaxibodyTM)；热休克蛋白(如及来源于GroEI和GroES的表位结合结构域)；转铁蛋白结构域(例如反式体)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶状体蛋白或人泛素(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；以及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
[0361] 抗原结合位点的其它来源为抗体的可变结构域和VH/VL对，公开于WO2007024715第40页第23行至第43页第23行中。此具体的公开内容以引用的方式并入本文，如同其在本文中明确记载一般，以提供用于本发明中的表位结合部分的基础并且可能包括于本文的权利要求中。“结构域”为具有不依赖于蛋白质的其余部分的三级结构的折叠蛋白质结构。一般说来，结构域负责蛋白质的离散功能性质并且在很多情况下，可被添加、移除或转移到其它蛋白质中，而不会有蛋白质的其余部分和/或结构域的功能损失。“单一抗体可变结构域”为包含抗体可变结构域的序列特征的折叠的多肽结构域。因此，它包括完整抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已被不是抗体可变结构域的特征的序列取代；或已被截短或包含N或C末端延长的抗体可变结构域；以及保留全长结构域的至少结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
[0362] 短语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指不依赖于不同V区或结构域而特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单一可变结构域可与其它不同的可变区或可变结构域以(例如，同型或异型多聚体)形式存在，其中其它区域或结构域不是单一免疫球蛋白可变结构域进行抗原结合所需的(即，其中免疫球蛋白单一可变结构域不依赖于另外的可变结构域来结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与能够结合至如本文所使用的术语抗原的“免疫球蛋白单一可变结构域”相同。免疫球蛋白单一可变结构域可为人抗体可变结构域，而且还包括来自其它物种如啮齿动物(例如，如WO 00/29004中所公开)、护士鲨和骆驼VHH免疫球蛋白单一可变结构域的单一抗体可变结构域。来源于包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和原驼的物种的骆驼VHH sre免疫球蛋白单一可变结构域多肽产生天然地不含轻链的重链抗体。这种VHH结构域可根据本领域中可用的标准技术被人源化，并且这种结构域仍被认为是根据本发明的“结构域抗体”。如本文所用，“VH”包括骆驼VHH结构域。NAV为另一类型的免疫球蛋白单一可变结构域，其在包括护士鲨的软骨鱼中被鉴别出。这些结构域也称为新型抗原受体可变区(通常缩写成V(NAR)或NARV)。关于更多详情请参见Mol.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原
4)为主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。
对应于抗体的CDR的环可被异源序列取代以赋予不同的结合性质。被工程改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibodies。关于更多详情请参见Journal of
Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂笼蛋白为一种胞外蛋白家族，其转运疏水性小分子如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性的β折叠二级结构，其中在锥形结构的开口端处有许多环，其可被工程改造以结合至不同靶抗原。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并且来源于脂笼蛋白。关于更多详情请参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体为来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的骨架，其可被工程改造以结合至抗原。该结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化产生文库。关于更多详情请参见Protein Eng.Des.Sel.17,
455-462(2004)和EP1641818A1。AvimersTM是来源于A-结构域骨架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采用所限定的二硫键结构。通过改组由A-结构域家族所展现的天然变异产生多样性。关于更多详情请参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。转铁蛋白为单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可通过将肽序列插入许可的表面环中而被工程改造以结合不同的靶抗原。工程改造的转铁蛋白骨架的实例包括反式体。关于更多详情请参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPinsTM)来源于介导完整膜蛋白连接到细胞骨架上的蛋白质家族的锚蛋白。单个锚蛋白重复为33个残基基序，其是由两个a-螺旋和一个β-转角组成。它们可通过随机化在每个重复的第一a-螺旋和β-转角中的残基被工程改造以结合不同的靶抗原。它们的结合界面可通过增加模块的数量(亲和力成熟方法)而增加。关于更多详情请参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),
1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。纤连蛋白为可被工程改造以结合至抗原的骨架。AdnectinsTM由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单位的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。在β-夹心的一端处的三个环可被工程改造以使得Adnectin能够特异性地识别所关注的治疗靶标。关于更多详情请参见Protein
Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体为由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，通常为含有在活性位点处插入的限制性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于更多详情请参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微体来源于长度为25-50个氨基酸天然存在的微蛋白(microprotein)，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI和芋螺毒素(conotoxin)和打结素(knottin)。微蛋白具有可被工程改造以包括多达25个氨基酸而不会影响微蛋白的整体折叠的环。关于工程改造的打结素结构域的更多详情，请参见WO2008098796。其它表位结合部分和结构域包括已用作工程改造不同靶抗原结合性质的骨架的蛋白质，包括人γ-晶状体蛋白和人泛素
(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C型凝集素结构域(四柄蛋白)，它们都综述于第7章-Non-Antibody
Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,由Stefan Dubel编著)and Protein Science 15:14-27(2006)中。本发明的桥连剂的抗原结合位点或配体结合部分可来源于这些替代蛋白质结构域中的任一个。
4)为主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。
对应于抗体的CDR的环可被异源序列取代以赋予不同的结合性质。被工程改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibodies。关于更多详情请参见Journal of
Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂笼蛋白为一种胞外蛋白家族，其转运疏水性小分子如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性的β折叠二级结构，其中在锥形结构的开口端处有许多环，其可被工程改造以结合至不同靶抗原。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并且来源于脂笼蛋白。关于更多详情请参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体为来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的骨架，其可被工程改造以结合至抗原。该结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化产生文库。关于更多详情请参见Protein Eng.Des.Sel.17,
455-462(2004)和EP1641818A1。AvimersTM是来源于A-结构域骨架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采用所限定的二硫键结构。通过改组由A-结构域家族所展现的天然变异产生多样性。关于更多详情请参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。转铁蛋白为单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可通过将肽序列插入许可的表面环中而被工程改造以结合不同的靶抗原。工程改造的转铁蛋白骨架的实例包括反式体。关于更多详情请参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPinsTM)来源于介导完整膜蛋白连接到细胞骨架上的蛋白质家族的锚蛋白。单个锚蛋白重复为33个残基基序，其是由两个a-螺旋和一个β-转角组成。它们可通过随机化在每个重复的第一a-螺旋和β-转角中的残基被工程改造以结合不同的靶抗原。它们的结合界面可通过增加模块的数量(亲和力成熟方法)而增加。关于更多详情请参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),
1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。纤连蛋白为可被工程改造以结合至抗原的骨架。AdnectinsTM由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单位的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。在β-夹心的一端处的三个环可被工程改造以使得Adnectin能够特异性地识别所关注的治疗靶标。关于更多详情请参见Protein
Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体为由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，通常为含有在活性位点处插入的限制性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于更多详情请参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微体来源于长度为25-50个氨基酸天然存在的微蛋白(microprotein)，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI和芋螺毒素(conotoxin)和打结素(knottin)。微蛋白具有可被工程改造以包括多达25个氨基酸而不会影响微蛋白的整体折叠的环。关于工程改造的打结素结构域的更多详情，请参见WO2008098796。其它表位结合部分和结构域包括已用作工程改造不同靶抗原结合性质的骨架的蛋白质，包括人γ-晶状体蛋白和人泛素
(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C型凝集素结构域(四柄蛋白)，它们都综述于第7章-Non-Antibody
Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,由Stefan Dubel编著)and Protein Science 15:14-27(2006)中。本发明的桥连剂的抗原结合位点或配体结合部分可来源于这些替代蛋白质结构域中的任一个。
[0363] 18.任一前述段落所述的方法，其中所述CAL包含介于第二抗原与跨膜结构域之间的绞链区和/或接头。
[0364] 19.任一前述段落所述的方法，其中所述靶细胞为人细胞。
[0365] 20.任一前述段落所述的方法，其中所述桥连剂包含第三抗原结合位点。
[0366] 21.段落20所述的方法，其中所述第三抗原不同于所述第一抗原。
[0367] 22.段落20或21所述的方法，其中所述第三抗原为肿瘤相关抗原(TAA)，例如，由所述靶细胞所包含的细胞表面TAA。
[0368] 23.任一前述段落所述的方法，其中所述第一和/或第三抗原与在正常细胞上相比更通常地存在于癌细胞上。
[0369] 24.任一前述段落段所述的方法，其中所述靶细胞为肿瘤细胞且所述信号传导上调细胞毒活性(例如ADCC)或免疫细胞的增殖。
[0370] 25.段落24所述的方法，其中所述信号传导上调所述细胞毒性且所述肿瘤细胞被杀伤或肿瘤细胞增殖受到下调。
[0371] 26.任一前述段落所述的方法，其中所述靶细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞、腺癌细胞或癌症干细胞。
[0372] 27.任一前述段落所述的方法，其中所述第一抗原为肿瘤相关抗原(TAA)。
[0373] 28.任一前述段落所述的方法，其中所述第一抗原为人CD19(且任选地，所述靶细胞为白血病或淋巴瘤细胞)、EpCAM(且任选地，所述靶细胞为肺癌细胞、胃肠癌细胞、腺癌、癌症干细胞)、CD20(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞)、MCSP(且任选地，所述靶细胞为黑素瘤细胞)、CEA、EGFR、EGFRvIII、唾液酸多糖(sialyl Tn)、CD133、CD33(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞，例如AML细胞)、PMSA、WT1、CD22、L1CAM、ROR-1、MUC-16、CD30、CD47、CD52、gpA33、TAG-72、粘蛋白、CIX、GD2、GD3、GM2、CD123、VEGFR、整联蛋白、cMET、Her1、Her2、Her3、MAGE1、MAGE A3TCR、NY-ESO-1、IGF1R、EPHA3、CD66e、EphA2,TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、血管生成素、间皮素、糖脂F77或腱生蛋白。
[0374] 29.任一前述段落所述的方法，其中所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的可变结构域：博纳吐单抗或抗体HD37的CD19结合位点；卡妥索单抗(Catumaxomab)的EpCAM结合位点；AFM11的CD19结合位点；Lymphomun的CD20结合位点；厄妥索单抗(Ertumaxomab)的Her2结合位点；AMG211(MEDI-565、MT111)的CEA结合位点；帕索图西珠单抗(Pasotuxizumab)的PSMA结合位点；索利妥单抗(solitomab)的EpCAM结合位点；
RG7221或RG7716的VEGF或血管生成素2结合位点；RG7597的Her1或Her3结合位点；MM111的Her2或Her3结合位点；MM141的IGF1R或Her3结合位点；MGD006的CD123结合位点；MGD007的gpa33结合位点；TF2的CEA结合位点；AFM13的CD30结合位点；AFM11的CD19结合位点；以及LY3164530的Her1或cMet结合位点。
RG7221或RG7716的VEGF或血管生成素2结合位点；RG7597的Her1或Her3结合位点；MM111的Her2或Her3结合位点；MM141的IGF1R或Her3结合位点；MGD006的CD123结合位点；MGD007的gpa33结合位点；TF2的CEA结合位点；AFM13的CD30结合位点；AFM11的CD19结合位点；以及LY3164530的Her1或cMet结合位点。
[0375] 30.任一前述段落所述的方法，其中所述桥连剂为博纳吐单抗或其CD3/CD19结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)B细胞)；AMG211或其CD3/CEA结合衍生物(MEDI-565、MT111；任选地其中所述靶细胞为胃肠癌细胞)；帕索图西珠单抗或其CD3/PMSA结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为前列腺癌细胞)；索利妥单抗或其CD3/EpCAM结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为癌细胞)；或AFM11或其CD3/CD19结合衍生物(且任选地其中所述靶细胞为ALL细胞或非霍奇金氏淋巴瘤细胞)。
[0376] 31.段落1至27任一段所述的方法，所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的抗原结合位点的可变结构域：ReoProTM；阿昔单抗；RituxanTM；利妥昔单抗；ZenapaxTM；达克珠单抗；SimulectTM；巴利昔单抗；SynagisTM；帕利珠单抗；RemicadeTM；英利昔单抗；HerceptinTM；曲妥珠单抗；MylotargTM；吉妥珠单抗；CampathTM；阿仑单抗；
TM TM TM TM
Zevalin ；替伊莫单抗；Humira ；阿达木单抗；Xolair ；奥马珠单抗；Bexxar ；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；兰尼单抗；SolirisTM；依库丽单抗；CimziaTM；赛妥珠单抗；SimponiTM；戈利木单抗；IlarisTM；康纳单抗；StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；ABThraxTM；雷昔库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；
PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；Ado-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥比妥珠单抗。
TM TM TM TM
Zevalin ；替伊莫单抗；Humira ；阿达木单抗；Xolair ；奥马珠单抗；Bexxar ；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；兰尼单抗；SolirisTM；依库丽单抗；CimziaTM；赛妥珠单抗；SimponiTM；戈利木单抗；IlarisTM；康纳单抗；StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；ABThraxTM；雷昔库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；
PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；Ado-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥比妥珠单抗。
[0377] 32.任一前述段落所述的方法，其中所述靶细胞为血细胞。
[0378] 在一个替代方案中，所述靶细胞为人或动物的干细胞或骨髓细胞。
[0379] 33.任一前述段落所述的方法，其中所述靶细胞为B细胞或T细胞。
[0380] 34.段落1至21和31至33任一段所述的方法，其中所述第一抗原为自身免疫性疾病靶标且所述信号传导下调细胞毒活性或免疫细胞的增殖。
[0381] 如本文所用，术语“自身免疫性疾病”被定义为由自身免疫反应所引起的病症。自身免疫性疾病是针对自体抗原的不适当的和过度应答的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于爱迪生氏病(Addision's disease)、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏病、格利巴利综合征、桥本氏症(Hashimoto’s disease)、溶血性贫血、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白斑病、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
[0382] 35.任一前述段落所述的方法，其中所述第二抗原为免疫细胞(例如，人T细胞或NK细胞)胞外抗原。
[0383] 在一个实施例中，抗原是由与本发明的细胞类型相同的细胞类型所包含，例如，本发明的CAL-细胞为T细胞、NK细胞或TIL，且第二抗原分别为T细胞、NK细胞或TIL的细胞表面抗原。
[0384] 36.任一前述段落所述的方法，其中所述第二抗原为蛋白质抗原且所述免疫细胞包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列为表达与由所述CAL所包含的第二抗原的氨基酸序列相同的氨基酸序列(例如，CD3胞外结构域序列)的内源性序列。
[0385] 因此，第二抗原是自体的且由桥连剂所识别。当人患者接受所述细胞时，如果患者也表达第二抗原，那么这将降低人对CAL-细胞的免疫排斥的风险。
[0386] 在一个实施例中，第二抗原是由合成蛋白序列提供。
[0387] 37.任一前述段落所述的方法，其中第二抗原由人CD3或人CD16(例如CD16A)胞外结构域序列提供。
[0388] 在一个实施例中，第二结合位点包含tandabTM AFM12或AFM13的CD16A结合位点的可变结构域。
[0389] 在一个实施例中，CAL-细胞不表达来自内源性核苷酸序列的所述第二抗原，例如，其中所述序列在细胞基因组中被敲除或失活。在一个实施例中，第二抗原是由CD3或CD16(例如CD16A)胞外结构域序列提供并且CAL-T细胞的内源性基因组包含致使TCR信号传导失去功能的修饰。例如，内源性相应CD3或CD16A胞外结构域外显子序列已被敲除或失活。在一个实施例中，CD3胞外结构域为CD3γ、CD3δ或CDε结构域。熟练技术人员将知道用于精确敲除或修饰细胞基因组中的序列的常规方法，例如，通过利用同源重组和/或CRISPR/Cas(例如Cas9)核酸酶切割。
[0390] 38.段落37所述的方法，其中所述CD3胞外结构域为CD3γ、CD3δ或CDε结构域。
[0391] 任选地，CD3胞外结构域为CD3γ结构域。任选地，CD3胞外结构域为CD3δ结构域任选地，CD3胞外结构域为CD3ε结构域。
[0392] 39.任一前述段落所述的方法，其中所述第二靶结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的抗CD3结合位点的可变结构域：抗体L2K-07、抗体OKT3TM、莫罗单抗-CD3、奥特利昔珠单抗(otelixizumab)、泰普利兹单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、卡妥索单抗、厄妥索单抗和弗罗鲁单抗(foralumab)。
[0393] 40.任一前述段落所述的方法，其中所述胞外部分不含非自身表位。
[0394] 当接受者患者也表达胞外部分的结构域时，这可降低排斥的风险。在一个实施例中，“自身”是由患者、例如本发明的免疫细胞和桥连剂的人接受者的表型和/或免疫细胞所来源于的祖细胞(例如，从所述患者处获得的祖细胞)的表型决定。
[0395] 41.任一前述段落所述的方法，其中
[0396] A.所述CAL的所述第二抗原在细胞中由非内源性核苷酸(S1)序列编码，所述非内源性核苷酸(S1)序列包含编码所述抗原的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0397] B.所述细胞的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列包含SNP1并且编码与所述第二抗原的氨基酸序列相同并包含R1的氨基酸序列；或编码作为所述第二抗原的氨基酸序列的天然存在的变体并包含R1的氨基酸序列；且
[0398] C.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0399] 这提供了以下匹配益处：本发明的细胞与工程改造跨膜蛋白(例如CAL)之间的相容性机会的增加，如本文进一步所论述。
[0400] 在一个实施例中，变体的氨基酸序列与第二抗原的序列具有至少80、90或95％同一性。
[0401] 术语“非同义”SNP如上所解释。
[0402] 42.任一前述段落所述的方法，其中
[0403] A.所述CAL的所述第二抗原在细胞中由非内源性核苷酸(S1)序列编码，所述非内源性核苷酸(S1)序列包含编码所述抗原的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；且[0404] B.其中所述CAL-细胞为同种异体移植物所包含，其中所述方法包括在步骤(c)中向人施用所述移植物，其中将所述CAL-细胞与靶细胞组合，其中在所述施用之前所述人的基因组包含所述SNP1。
[0405] 这提供了如本文所论述的匹配益处。
[0406] 如本文所用，“移植物”是指引入个体中的细胞、组织或器官。移植材料的来源可为培养细胞、来自另一个体的细胞或来自同一个体的细胞(例如，在体外培养细胞之后)。
[0407] 43.段落41或42所述的方法，其中所述CAL的第二抗原为CD3γ胞外结构域且R1选自由I53、N53和T53组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)。
[0408] 44.段落43所述的方法，其中所述第二抗原包含I53。
[0409] 本发明人发现，此位置示出了人中的天然变异且I53变体是如由Ensembl所示的最常见的变异；因此，本发明人认识到，此实施方案提供了将与接受本发明的CAL-细胞的大多数患者相匹配的实施方案。
[0410] 45.段落41或42所述的方法，其中所述CAL的第二抗原为CD3δ胞外结构域且R1选自由N38和K38组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:3的位置)。
[0411] 46.段落45所述的方法，其中所述第二抗原包含N38。
[0412] 本发明人发现，此位置示出了人中的天然变异且N38变体是如由Ensembl所示的最常见的变异；因此，本发明人认识到，此实施方案提供了将与接受本发明的CAL-细胞的大多数患者相匹配的实施方案。
[0413] 47.段落41或42所述的方法，其中所述CAL的第二抗原为CD3ε胞外结构域且R1选自由A108、E108和V108组成的组(位置编号对应于SEQ ID NO:5的位置)。
[0414] 48.段落47所述的方法，其中所述第二抗原包含A108。
[0415] 本发明人发现，此位置示出了人中的天然变异且A108变体是如由Ensembl所示的最常见的变异；因此，本发明人认识到，此实施方案提供了将与接受本发明的CAL-细胞的大多数患者相匹配的实施方案。
[0416] 49.根据段落42至48中任一段所述的方法，其中所述CAL-细胞为同种异体移植物所包含，其中所述方法包括在步骤(c)中向人施用所述移植物，其中将所述CAL-细胞与靶细胞组合，其中人在移植物施用之前包含所述SNP1。
[0417] 50.根据段落1至48任一段所述的方法，其中所述CAL-细胞为来自人的祖细胞的工程改造子代，其中所述方法包括步骤(c)中向人施用工程改造的CAL-细胞，其中将CAL-细胞与靶细胞组合。
[0418] 51.任一前述段落所述的方法，其中
[0419] A.所述第一信号传导结构域(SD1)在细胞中由第三核苷酸序列(S3)编码，所述第三核苷酸序列(S3)包含编码所述信号传导结构域的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；
[0420] B.细胞的基因组包含含有SNP2并编码信号传导结构域(SD2)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD2与SD1相同并包含R2或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R2；并且
[0421] C.其中S4为所述细胞的内源性基因组序列且SNP2为非同义SNP。
[0422] 52.段落51所述的方法，其中SD1和SD2各自包含含有R2的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
[0423] 鉴于ITAM在细胞信号传导中的重要性，本发明的此方面匹配ITAM中的SNP以使得其匹配与细胞的内源性信号传导机构一起发挥作用的天然情形。
[0424] 53.段落52所述的方法，其中所述信号传导结构域的ITAM是相同的。
[0425] 54.任一前述段落所述的方法，其中胞内部分包含在细胞中由第五核苷酸序列(S5)编码的另一胞内信号传导结构域(SD3)，S5包含编码SD3的氨基酸残基(R3)的人单核苷酸多态性(SNP3)；其中细胞的基因组包含编码信号传导结构域(SD4)的第六核苷酸序列(S6)，其中SD4与SD3相同并包含R3；或为SD3的天然存在的变体并包含R3；且其中S6为细胞的内源性基因组序列且SNP3为非同义SNP。
[0426] 55.段落54所述的方法，其中所述受体的SD1与SD3是不同的。
[0427] 56.段落54或55所述的方法，其中SD3和SD4各自包含含有R3的ITAM。
[0428] 57.段落56所述的方法，其中SD3和SD4的ITAM是相同的。
[0429] 58.段落54至57任一段所述的方法，其中SD3与SD4是相同的。
[0430] 59.段落54至58任一段所述的方法，其中SD3为人的。
[0431] 60.段落54至59任一段所述的方法，其中SD3各自为CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0432] CD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。其替代名称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、4-1BB，并通过淋巴细胞活化(ILA)而诱导。它目前作为共刺激免疫检查点分子受到免疫学家的关注。
[0433] 61.任一前述段落所述的方法，其中所述第一信号传导结构域为选自以下的CD3胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域(其中第二抗原不是CD3结构域)、CD3η(CD3-eta)结构域(其中第二抗原不是CD3结构域)、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域(其中第二抗原不是CD16结构域)、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0434] 在本文的任何方面中，第一信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体。
[0435] 62.段落61所述的方法，其中第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、两个或三个选自以下的氨基酸基序：(a)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:10；(b)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:11；及(c)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:12。
[0436] 63.段落62所述的方法，其中所述第一信号传导结构域包含基序(a)且其中所述基序与SEQ ID NO:10的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、N73、R79、E82、D84、V85、D87和K88(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0437] 这是基于本发明人关于CD3ζ序列中的天然人基因组多态性的分析以及本发明人对于这些位置是天然变体且因此容许变化的认识。使用相似的分析，本发明人还设计了在下文的段落和实施例中的其它可能的变异和匹配方面。
[0438] 64.段落63所述的方法，其中所述变化选自由以下组成的组：A61V、A61P、P62S、P62A、A63P、Q66H、G67S、N69T、Q70Y、Q70L、Q70P、Q70W、N73Y、R79L、R79G、E82K、D84G、D84A、D84Y、V85I、D87G和K88R(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0439] 发明人发现这些为天然存在的变异(且因此被人所耐受)。
[0440] 65.段落62至64任一段所述的方法，其中所述第一信号传导结构域包含基序(b)且其中所述基序与SEQ ID NO:11的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122和M128(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0441] 66.段落65所述的方法，其中所述变化选自由以下组成的组：P100L、Q101L、Q101P、R103K、K104E、N105K、P106R、E108A、L110Q、A120V、A122V和M128T(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0442] 67.段落62至66任一段所述的方法，其中所述第一信号传导结构域包含基序(c)且其中所述基序与SEQ ID NO:12的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多5个变化：E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、A155、L156(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0443] 68.段落67所述的方法，其中所述变化选自由以下组成的组：E131K、R132H、R132C、R133Q、R133W、K136N、G137E、G140D、L145F、A148D、T152I、A155T、L156P(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0444] 69.段落61至68任一段所述的方法，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、多个或所有选自由以下组成的组的氨基酸残基：S58、Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号是根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0445] 本发明人认识到，这种残基参与了胞内途径中的信号传导和识别，且因此，这些残基的保守性适用于使用本发明的跨膜蛋白(例如CAL)的良好信号传导。
[0446] 70.段落61至69任一段所述的方法，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含由选自由以下组成的组的SNP编码的残基：rs368651001、rs372651048、rs767112686、rs765877580、rs751145956、rs772867144、rs55893506、rs761710510、rs776601547、rs768607376、rs193922741、rs193922740、rs193922739、rs780188126、rs772128174、rs757978223、rs779397562、rs749926653、rs181746205、rs181746205、rs753572867、rs371709798、rs145407267、rs143180729、rs148513413、rs367690333、rs144963570、rs367690333、rs144963570、rs770320255、rs139926301、rs56297636、rs760895755、rs112890541、rs370910340、rs145505909、rs754935006、rs751583971、rs766541481、rs763074967、rs745871212、rs372665461、rs764185491、rs756340039、rs773572491、rs201594815、rs781510519、rs147527561、rs751981677、rs763532939、rs753278244、rs771873949、rs186004179、rs186004179、rs762773775、rs748158220、rs776703680、rs561262982、rs758846009、rs746262183、rs376046446、rs201937405和rs752198795；且其中所述免疫细胞的基因组包含含有所述选择的SNP的内源性核苷酸序列。
[0447] 本发明人认识到，这些SNP编码在天然存在的CD3-ζ和CD3-η中容许变化的位置处的残基。有用的是，例如，细胞的内源性基因组还包含SNP以提供如本文所论述的匹配益处。
[0448] 71.任一前述段落所述的方法，其中第一信号传导结构域或第三信号传导结构域为包含至少13个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0449] 本发明人认识到，这些为CD28胞内结构域中天然存在的变异，且因此形成根据本发明的匹配方面匹配的基础。有用的是，例如，细胞的内源性基因组还编码选择的残基以提供如本文所论述的匹配益处。
[0450] 72.段落71所述的方法，其中CD28结构域包含所述组的所有残基。
[0451] 73.段落71或72所述的方法，其中CD28结构域包含氨基酸残基Y191和Y209(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0452] 如在实施例中进一步描述，本发明人认识到这些位置出现在对于胞内信号传导来说重要的保守CD28胞内基序(YMNM和PYAP)中。
[0453] 74.段落71至73任一段所述的方法，其中CD28结构域包含YMNM基序(对应于SEQ ID NO:13的Y191-M192-N193-M194)和/或PYAP基序(对应于SEQ ID NO:13的P208-Y209-A210-P211)。
[0454] 75.任一前述段落所述的方法，其中所述CAL-免疫细胞为CAL-T细胞(例如，CD8+T细胞或CD4+T细胞，例如活化的T细胞)、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，例如REP前TIL)、记忆T细胞、TSCM、TCM或TEM。
[0455] 在总体记忆T细胞群内，已描述了若干截然不同的亚群并且该亚群可通过趋化因子受体CCR7和L-选择素(CD62L)的差异表达识别。记忆TSCM干细胞(像幼稚细胞)是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+，但它们还表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并且显示了记忆细胞所独有的众多功能属性。中央记忆TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，而不是IFNγ或IL-4。然而，效应记忆TEM细胞不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4。记忆T细胞如TSCM可尤其适用于在人中建立工程改造免疫细胞的持续存在的群。
[0456] 在一个实施例中，本文中的任何干细胞可为TSCM、TCM或TEM细胞，例如，人TSCM、TCM或TEM细胞。
[0457] 76.任一前述段落所述的方法，其中所述CAL-免疫细胞为患有自身免疫性疾病、炎性疾病、病毒感染或癌症的人的细胞的子代，例如，其中所述人患有成淋巴细胞性白血病、ALL(例如，T-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
[0458] 77.任一前述段落所述的方法，其中所述CAL-免疫细胞已被工程改造以用于增强信号传导，其中所述信号传导选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS和CD40信号传导。
[0459] 78.任一前述段落所述的方法，其中步骤(c)包括在将所述细胞混合在一起之后将混合的细胞与桥连剂组合。
[0460] 79.段落1至77任一段所述的方法，其包括在将所述靶细胞与桥连剂混合在一起之后将所述靶细胞和试剂与所述免疫细胞组合。
[0461] 80.任一前述段落所述的方法，其中所述方法是用多个所述靶细胞、多个所述CAL-免疫细胞和多个拷贝的所述桥连剂进行，其中在步骤(c)中将所述靶细胞、CAL-免疫细胞和试剂组合且所述免疫细胞的活性由此得以调节。
[0462] 81.段落80所述的方法，其中在步骤(c)之后减少试剂的量。
[0463] 82.段落80所述的方法，其中在步骤(c)之后组合更多的所述试剂。
[0464] 83.段落80至82任一段所述的方法，其是在人或动物中进行。
[0465] 84.段落80至82任一段所述的方法，其是使用靶标和CAL-细胞在体外进行。
[0466] 85.段落80至84任一段所述的方法，其是用于治疗包含靶细胞的人的疾病或病状或降低其风险，其中步骤(c)包括向人同时或依次施用桥连剂拷贝和CAL-细胞(或其祖细胞)，其中所述桥连剂结合至第一抗原和第二抗原以使CAL-细胞靶向靶细胞，由此触发CAL-细胞中的胞内信号传导以调节CAL-细胞活性，从而使所述疾病或病状得到治疗或所述疾病或病状的风险被降低。
[0467] 86.段落85所述的方法，其中所述疾病或病状是在人中的癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病或病毒感染。
[0468] 87.段落85或86所述的方法，其中靶细胞(例如，肿瘤细胞)被杀伤。
[0469] 88.段落86或87所述的方法，其中各靶细胞为肿瘤细胞且所述方法治疗人的癌症或降低其风险，或治疗或降低人中的癌症进展的风险。
[0470] 89.段落85至88任一段所述的方法，其中所述人患有癌症。
[0471] 在一个实施例中，所述癌症为血液癌。在一个实施例中，所述人患有B细胞起源的癌症。在一个实施例中，所述人患有T细胞起源的癌症。
[0472] 举例来说，所述癌症为肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。本发明使用的优选癌症靶标为B细胞起源的癌症，尤其包括急性成淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病或B细胞非霍奇金氏淋巴瘤。
[0473] 90.段落89所述的方法，其中所述癌症为T细胞或B细胞起源的癌症，例如，成淋巴细胞性白血病、ALL(例如，T-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
[0474] 91.段落85至90任一段所述的方法，其中所述CAL-细胞为所述人的免疫细胞的子代，例如，其中所述人患有成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、ALL(例如，T-ALL或B-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
[0475] 92.段落85至91任一段所述的方法，其中各所述细胞为所述人的自体细胞(例如，T细胞)或这种自体细胞的子代。
[0476] 如本文所用，术语“自体”意指来源于个体的任何材料，所述材料稍后被再引入同一个体中。
[0477] “同种异体”是指来源于相同物种的不同动物的移植物。
[0478] 93.段落92所述的方法，其中各CAL-细胞来源于人的血液或肿瘤样品并且在步骤(c)之前在体外活化和扩增。
[0479] 如本文所用，“活化”是指T细胞被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化还可与所诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能有关。术语“活化的T细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的T细胞。
[0480] 94.段落80所述的方法，其中所述人患有自身免疫性疾病，其中所述CAL-细胞当通过桥连剂拷贝结合至靶细胞时是无变应性的或具有降低的增殖和/或细胞毒活性，由此CAL-细胞与所述人中上调所述自身免疫性疾病的内源性免疫细胞竞争。
[0481] 95.段落85至94中任一段所述的方法，其中施用是通过将CAL-细胞输注到患者的血液中而完成。
[0482] 96.段落85至95中任一段所述的方法，其包括扩增所述CAL-免疫细胞以产生扩增的免疫细胞群，所述扩增的免疫细胞群在步骤(c)中与靶细胞组合。
[0483] 97.任一前述段落所述的方法，其包括活化所述工程改造的免疫细胞以产生活化的免疫细胞群，所述活化的免疫细胞群步骤(c)中与靶细胞组合。
[0484] 98.一种用于靶向结合至抗原特异性试剂的嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞，
[0485] A.其中所述试剂是多特异性抗原结合片段，其包含
[0486] i.特异性地结合第一靶抗原的第一抗原结合位点；和
[0487] ii.特异性地结合第二靶抗原的第二抗原结合位点；
[0488] B.其中所述CAL-免疫细胞包含跨膜配体，所述配体包含以下的工程改造组合
[0489] iii.包含所述第二抗原的胞外部分，其中所述第二抗原连接至跨膜结构域；和[0490] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当所述试剂结合至所述第二抗原时进行胞内信号传导；
[0491] C.其中当所述CAL-免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合时，所述靶细胞包含所述第一靶抗原，其中所述第一抗原为胞外抗原，
[0492] v.所述桥连剂结合至所述第一抗原和第二抗原以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞，
[0493] vi.由此触发所述免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性。
[0495] 在一个替代方案中，段落98提供了以下替代条目VIII至XV。因此，接下来的段落99的特征可与条目VIII至XV中的任一条组合。在下文中对“段落98”的提及可作为替代被当作条目VIII至XV中的任一条；在接下来的段落99的任一个中的“第一抗原结合位点”可被当作条目VIII至XV中任一条所述的“第一结合部分”；在接下来的段落99的任一个中的“第二抗原结合位点”可被当作条目VIII至XV中任一条所述的“第二结合部分”；在接下来的段落99的任一个中的“第一抗原”可被当作条目VIII至XV中任一条所述的“第四结合部分”；在接下来的段落99的任一个中的“第二抗原”可被当作条目VIII至XV中任一条所述的“第三结合部分”；并且在接下来的段落99的任一个中的CAL可被当作条目VIII至XV中任一条所述的“跨膜蛋白”、“CAR”或“CAL”。
[0496] VIII.一种用于靶向结合至抗原特异性试剂的免疫细胞，
[0497] A.其中所述试剂是多特异性结合片段，其包含
[0498] i.第一结合部分；和
[0499] ii.第二结合部分；
[0500] B.其中所述免疫细胞表达包含以下的工程改造组合的跨膜蛋白
[0501] iii.包含连接到跨膜结构域上的第三结合部分的胞外部分；其中第二和第三部分形成特异性结合对(SBP1)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分；和
[0502] iv.包含第一信号传导结构域的胞内部分，所述第一信号传导结构域用于当第二部分和第三部分结合在一起时进行胞内信号传导；
[0503] C.其中当免疫细胞和桥连剂与靶细胞组合时，所述靶细胞包含第四结合部分，其中所述第四部分为胞外的，
[0504] v.第一部分和第四部分形成特异性结合对(SBP2)，其中一个部分特异性地结合至另一个部分以使所述免疫细胞靶向所述靶细胞；
[0505] vi.第二部分和第三部分结合在一起，由此触发免疫细胞中的胞内信号传导以调节免疫细胞活性；并且
[0506] D.其中桥连剂的分子量不超过125kDa。
[0507] IX.条目VIII的免疫细胞，其与所述桥连剂组合。
[0508] X.条目IX的VIII的免疫细胞，其中第一和第二结合部分为配体结合位点。
[0509] XI.X的免疫细胞，其中第一结合部分和第二结合部分分别为第一抗原结合位点和第二抗原结合位点(例如，VH/VL抗原结合位点)。
[0510] XII.条目VIII至XI中任一条的免疫细胞，其中SBP1和SB2各自选自由以下组成的组：-
[0511] (a)抗原和抗原结合位点(例如，抗原和VH/VL抗原结合位点；或超抗原和抗体可变结构域)；及
[0512] (b)受体和配体。
[0513] XIII.条目VIII至XII中任一条的免疫细胞，其中所述跨膜蛋白为嵌合抗原配体(CAL)，其中所述第三部分为抗原且所述第二部分为抗原结合位点(例如scFv)；且任选地，所述第一部分为抗原结合位点(例如scFv)且所述第四部分为抗原。
[0514] XIV.条目VIII至XII中任一条的免疫细胞，其中所述跨膜蛋白为嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第三部分为抗原结合位点且所述第二部分为抗原；且任选地，所述第一部分为抗原结合位点(例如scFv)且所述第四部分为抗原。
[0515] XV.条目VIII至XIV中任一条的免疫细胞，其中所述桥连剂的分子量不超过115kDa，例如从55至115kDa、或从60至100kDa。
[0516] 一般适用的特征：-
[0517] 99.段落98所述的CAL-细胞，其中所述CAL包含介于第二抗原与跨膜结构域之间的绞链区和/或接头。
[0518] 100.段落99所述的CAL-细胞，其中所述绞链区为CD8α绞链区。
[0519] 在一个实施例中，跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。在一个实施例中，第二抗原和/或第一信号传导结构域为人的；任选地，跨膜结构域和/或铰链为人的。
[0520] 101.段落98至100中任一段所述的CAL-细胞，其中所述信号传导上调CAL-细胞的细胞毒性。
[0521] 102.段落98至101中任一段所述的CAL-细胞，其中所述信号传导上调CAL-细胞的ADCC活性。
[0522] 103.段落98至102中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第一抗原为肿瘤相关抗原(TAA)。
[0523] 104.段落98至103中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第一抗原为人CD19(且任选地，所述靶细胞为白血病或淋巴瘤细胞)、EpCAM(且任选地，所述靶细胞为肺癌细胞、胃肠癌细胞、腺癌、癌症干细胞)、CD20(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞)、MCSP(且任选地，所述靶细胞为黑素瘤细胞)、CEA、EGFR、EGFRvIII、HER2、唾液酸多糖、CD133、CD33(且任选地，所述靶细胞为白血病细胞，例如AML细胞)、PMSA、CD30、CD47、CD52、gpA33、TAG-72、粘蛋白、CIX、GD2、GD3、GM2、CD123、VEGFR、整联蛋白、cMET、Her1、Her2、Her3、IGF1R、EPHA3、CD66e、EphA2、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、血管生成素或腱生蛋白。
[0524] 105.段落98至104中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的可变结构域：博纳吐单抗或抗体HD37的CD19结合位点；卡妥索单抗的EpCAM结合位点；AFM11的CD19结合位点；Lymphomun的CD20结合位点；厄妥索单抗的Her2结合位点；AMG211(MEDI-565、MT111)的CEA结合位点；帕索图西珠单抗的PSMA结合位点；索利妥单抗的EpCAM结合位点；RG7221或RG7716的VEGF或血管生成素2结合位点；RG7597的Her1或Her3结合位点；MM111的Her2或Her3结合位点；MM141的IGF1R或Her3结合位点；MGD006的CD123结合位点；MGD007的gpa33结合位点；TF2的CEA结合位点；AFM13的CD30结合位点；AFM11的CD19结合位点；以及LY3164530的Her1或cMet结合位点。
[0525] 106.段落98至105中任一段所述的CAL-细胞，其中所述桥连剂为博纳吐单抗或其CD3/CD19结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)B细胞)；AMG211或其CD3/CEA结合衍生物(MEDI-565、MT111；任选地其中所述靶细胞为胃肠癌细胞)；
帕索图西珠单抗或其CD3/PMSA结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为前列腺癌细胞)；索利妥单抗或其CD3/EpCAM结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为癌细胞)；或AFM11或其CD3/CD19结合衍生物(且任选地其中所述靶细胞为ALL细胞或非霍奇金氏淋巴瘤细胞)。
帕索图西珠单抗或其CD3/PMSA结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为前列腺癌细胞)；索利妥单抗或其CD3/EpCAM结合衍生物(任选地其中所述靶细胞为癌细胞)；或AFM11或其CD3/CD19结合衍生物(且任选地其中所述靶细胞为ALL细胞或非霍奇金氏淋巴瘤细胞)。
[0526] 107.段落98至106中任一段所述的CAL-细胞，所述第一抗原结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的抗原结合位点的可变结构域：ReoProTM；阿昔单抗；RituxanTM；利妥昔单抗；ZenapaxTM；达克珠单抗；SimulectTM；巴利昔单抗；SynagisTM；帕利珠单抗；RemicadeTM；英利昔单抗；HerceptinTM；曲妥珠单抗；MylotargTM；吉妥珠单抗；CampathTM；阿仑单抗；ZevalinTM；替伊莫单抗；HumiraTM；阿达木单抗；XolairTM；奥马珠单抗；BexxarTM；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；
TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；兰尼单抗；
TM TM TM TM
Soliris ；依库丽单抗；Cimzia ；赛妥珠单抗；Simponi ；戈利木单抗；Ilaris ；康纳单抗；
StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；
ABThraxTM；雷昔库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；Ado-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥比妥珠单抗。
TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；兰尼单抗；
TM TM TM TM
Soliris ；依库丽单抗；Cimzia ；赛妥珠单抗；Simponi ；戈利木单抗；Ilaris ；康纳单抗；
StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；
ABThraxTM；雷昔库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；Ado-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥比妥珠单抗。
[0527] 108.段落98至102中任一段所述的CAL-细胞，其中第一抗原为自身免疫性疾病靶标且所述信号传导下调免疫细胞的细胞毒活性或增殖。
[0528] 109.段落98至108中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第二抗原为免疫细胞(例如，人T细胞或NK细胞)胞外抗原。
[0529] 110.段落98至109中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第二抗原为蛋白质抗原且所述免疫细胞包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列为表达与由所述CAL所包含的第二抗原的氨基酸序列相同的氨基酸序列(例如，CD3胞外结构域序列)的内源性序列。
[0530] 111.段落98至110中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第二抗原由人CD3或人CD16胞外结构域序列提供。
[0531] 112.段落111所述的CAL-细胞，其中所述CD3胞外结构域为CD3γ、CD3δ或CDε结构域。
[0532] 113.段落98至112中任一段所述的CAL-细胞，其中所述第二靶结合位点包含选自由以下组成的组的抗体的抗CD3结合位点的可变结构域：抗体L2K-07、抗体OKT3TM、莫罗单抗-CD3、奥特利昔珠单抗、泰普利兹单抗、维西珠单抗、卡妥索单抗、厄妥索单抗和弗罗鲁单抗。
[0533] 114.段落98至113中任一段所述的CAL-细胞，其中所述胞外部分不含非自身表位。
[0534] 115.段落98至114中任一段所述的CAL-细胞，其中
[0535] a.所述CAL的所述第二抗原在细胞中由非内源性核苷酸(S1)序列编码，所述非内源性核苷酸(S1)序列包含编码所述抗原的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0536] b.所述细胞的基因组包含第二核苷酸序列(S2)，所述第二核苷酸序列包含SNP1并且编码与所述第二抗原的氨基酸序列相同并包含R1的氨基酸序列；或编码作为所述第二抗原的氨基酸序列的天然存在的变体并包含R1的氨基酸序列；且
[0537] c.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0538] 116.段落98至115中任一段所述的CAL-细胞，其中所述CAL-细胞用于治疗人的疾病或病状(例如癌症)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向所述人施用所述CAL-细胞和所述桥连剂；其中将CAL-细胞与人的靶细胞组合并由桥连剂桥连，由此上调CAL-细胞中的信号传导以提高CAL-细胞的靶细胞细胞毒性(例如，ADCC介导的杀伤活性)，从而治疗人的所述疾病或病状或降低其风险。
[0539] 在本文的方法中，施用有效量的CAL-细胞和桥连剂。如本文所用，“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
[0540] 在本发明方法的一个实施方案中，所述方法治疗患者(例如人)的癌症或降低其风险，其中在向所述患者施用本发明的免疫细胞之前，所述患者经历了淋巴细胞清除。
[0541] 117.段落98至115中任一段所述的CAL-细胞，其中CAL-细胞用于治疗人的疾病或病状(例如，自身免疫性疾病、GvHD或同种异体移植物排斥)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人施用CAL-细胞和所述桥连剂；其中将CAL-细胞与人的靶细胞组合并由桥连剂桥连，由此上调CAL-细胞中的信号传导以降低CAL-细胞的细胞毒性(例如，ADCC介导的杀伤活性)，从而治疗人的所述疾病或病状或降低其风险。
[0542] 118.段落117所述的CAL-细胞，其中所述桥连触发人中CAL-细胞的无变应性。
[0543] 119.一种移植物(例如，同种异体移植物)，其包含多个根据段落117或118所述的CAL-细胞，其中所述移植物是与人的内源性疾病或病状介导的免疫细胞(例如，由T细胞活性所介导)竞争以治疗或减轻所述疾病或病状。
[0544] 例如，CAL-细胞有效地“稀释(dilute)”疾病介导的内源性免疫细胞在组织损伤或其它疾病活性部位处的出现。通过以此方式降低所述疾病介导的内源性免疫细胞的局部浓度，内源性免疫细胞(如T细胞)的不需要的活性(例如，自身免疫、GvHD或排斥活性)可在人中受到抑制。在此情况下，在一个实施方案中，有利的是CAL-细胞(例如CAL-T细胞)变得无变应性，由此这种无变应性的细胞“稀释”内源性T细胞的活性且因此抑制人的疾病或病状或降低所述疾病或病状的风险。
[0545] 在另一实施例中，本发明的免疫细胞变得活化以杀伤患者的靶细胞(例如T细胞)，由此治疗或预防所述疾病或病状。
[0546] 如本文所用的术语“治疗”疾病意指降低由受试者所经历的疾病或病状的至少一种体征或症状的发生频率或严重性。
[0547] 120.当从属于段落115时的段落116至119中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中在所述施用之前人的基因组包含所述SNP1。
[0548] 以此方式，细胞或移植物在胞外部分中是匹配的以提高与接受者人的相容性。
[0549] 121.段落98至120中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述靶细胞为人细胞。
[0550] 122.段落98至121中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述靶细胞为肿瘤细胞且所述信号传导上调免疫细胞的细胞毒活性(例如ADCC)或增殖。
[0551] 123.段落98至122中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述靶细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞、腺癌细胞或癌症干细胞。
[0552] 124.段落98至123中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述靶细胞为血细胞。
[0553] 125.段落98至123中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述靶细胞为B细胞或T细胞。
[0554] 126.段落115或当从属于段落115时的段落116至125中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述CAL的所述第二抗原为CD3γ胞外结构域且R1选自由以下组成的组：I11、M11、A22、T22、I53、N53、T53、V131、F131、R166、G166、Y171和H171(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)。
[0555] 如同以上方面一样，本发明人认识到这种位置对于在人中天然存在的CD3γ变异是容许的，且因此，本发明人将它们鉴别为根据本发明的匹配的候选位置。
[0556] 127.段落126所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第二抗原包含I11、A22、I53、N53、V131、R166和Y171。
[0557] 本发明人认识到，这些变异是人中最常见的(如由Ensembl所示)且因此，此特征可能与大多数人和大多数人细胞相容。
[0558] 128.段落115或当从属于段落115时的段落116至125任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述CAL的第二抗原为CD3δ胞外结构域且R1选自由以下组成的组：Q18、K18、N38和K38(位置编号对应于SEQ ID NO:3的位置)。
[0559] 如同以上方面一样，本发明人认识到这种位置对于在人中天然存在的CD3δ变异是容许的，且因此，本发明人将它们鉴别为根据本发明的匹配的候选位置。
[0560] 129.段落128所述的CAL-细胞或移植物，其中第二抗原包含Q18和N38。
[0561] 本发明人认识到，这些变异是人中最常见的(如由Ensembl所示)且因此，此特征可能与大多数人和大多数人细胞相容。
[0562] 130.段落115或当从属于段落115时的段落116至125中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述CAL的第二抗原为CD3ε胞外结构域且R1选自由以下组成的组：D71、N71、H71、Y71、A108、E108、V108、A157和V157(位置编号对应于SEQ ID NO:5的位置)。
[0563] 如同以上方面一样，本发明人认识到这种位置对于在人中天然存在的CD3ε变异是容许的，且因此，本发明人将它们鉴别为根据本发明的匹配的候选位置。
[0564] 131.段落130所述的CAL-细胞或移植物，其中第二抗原包含D71、A108和A157。
[0565] 本发明人认识到，这些变异是人中最常见的(如由Ensembl所示)且因此，此特征可能与大多数人和大多数人细胞相容。
[0566] 132.段落116至131中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中各CAL-细胞为来自人的祖细胞的工程改造子代，其中所述方法包括向人施用工程改造的CAL-细胞或移植物，其中将CAL-细胞与靶细胞组合。
[0567] 133.段落98至132中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中
[0568] a.第一信号传导结构域(SD1)在各CAL-细胞中由第三核苷酸序列(S3)编码，所述第三核苷酸序列(S3)包含编码信号传导结构域的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；
[0569] b.所述细胞的基因组包含含有SNP2并编码信号传导结构域(SD2)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD2与SD1相同并包含R2或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R2；并且
[0570] c.其中S4为所述细胞的内源性基因组序列且SNP2为非同义SNP。
[0571] 134.段落133所述的CAL-细胞或移植物，其中SD1和SD2各自包含含有R2的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
[0572] 135.段落134所述的CAL-细胞或移植物，其中信号传导结构域的ITAM是相同的。
[0573] 136.段落98至135中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述胞内部分包含在细胞种由第五核苷酸序列(S5)编码的另一胞内信号传导结构域(SD3)，S5包含编码SD3的氨基酸残基(R3)的人单核苷酸多态性(SNP3)；其中所述细胞的基因组包含编码信号传导结构域(SD4)的第六核苷酸序列(S6)，其中SD4与SD3相同并包含R3；或为SD3的天然存在的变体并包含R3；且其中S6为所述细胞的内源性基因组序列且SNP3为非同义SNP。
[0574] 137.段落136所述的CAL-细胞或移植物，其中所述受体的SD1与SD3是不同的。
[0575] 138.段落136或137所述的CAL-细胞或移植物，其中SD3和SD4各自包含含有R3的ITAM。
[0576] 139.段落138所述的CAL-细胞或移植物，其中SD3和SD4的ITAM是相同的。
[0577] 140.段落136至139中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中SD3与SD4是相同的。
[0578] 141.段落136至140中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中SD3为人的。
[0579] 142.段落136至141中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中SD3各自为CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16(例如CD16A)结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0580] 143.段落98至142中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域为选自以下的CD3胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域(其中第二抗原不是CD3结构域)、CD3η(CD3-eta)结构域(其中第二抗原不是CD3结构域)、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域(其中第二抗原不是CD16结构域)、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0581] 144.段落143所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、两个或三个选自以下的氨基酸基序：(a)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:10；(b)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:11；及(c)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:12。
[0582] 145.段落144所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域包含基序(a)且其中所述基序与SEQ ID NO:10的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、N73、R79、E82、D84、V85、D87和K88。
[0583] 146.段落145所述的CAL-细胞或移植物，其中所述变化选自由以下组成的组：A61V、A61P、P62S、P62A、A63P、Q66H、G67S、N69T、Q70Y、Q70L、Q70P、Q70W、N73Y、R79L、R79G、E82K、D84G、D84A、D84Y、V85I、D87G和K88R。
[0584] 147.段落144至146中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一信号传导结构域包含基序(b)且其中所述基序与SEQ ID NO:12的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多五个变化：P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122和M128。
[0585] 148.段落147所述的CAL-细胞或移植物，其中所述变化选自由以下组成的组：P100L、Q101L、Q101P、R103K、K104E、N105K、P106R、E108A、L110Q、A120V、A122V和M128T。
[0586] 149.段落144至148中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域包含基序(c)且其中所述基序与SEQ ID NO:13的不同之处为在选自由以下组成的组的残基处有至多5个变化：E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、A155、L156。
[0587] 150.段落149所述的CAL-细胞或移植物，其中所述变化选自由以下组成的组：E131K、R132H、R132C、R133Q、R133W、K136N、G137E、G140D、L145F、A148D、T152I、A155T、L156P。
[0588] 151.段落98至150中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、多个或所有选自由以下组成的组的氨基酸残基：S58、Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)。
[0589] 152.段落98至151中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含由选自由以下组成的组的SNP编码的残基：rs368651001、rs372651048、rs767112686、rs765877580、rs751145956、rs772867144、rs55893506、rs761710510、rs776601547、rs768607376、rs193922741、rs193922740、rs193922739、rs780188126、rs772128174、rs757978223、rs779397562、rs749926653、rs181746205、rs181746205、rs753572867、rs371709798、rs145407267、rs143180729、rs148513413、rs367690333、rs144963570、rs367690333、rs144963570、rs770320255、rs139926301、rs56297636、rs760895755、rs112890541、rs370910340、rs145505909、rs754935006、rs751583971、rs766541481、rs763074967、rs745871212、rs372665461、rs764185491、rs756340039、rs773572491、rs201594815、rs781510519、rs147527561、rs751981677、rs763532939、rs753278244、rs771873949、rs186004179、rs186004179、rs762773775、rs748158220、rs776703680、rs561262982、rs758846009、rs746262183、rs376046446、rs201937405和rs752198795；且其中所述免疫细胞的基因组包含含有所述选择的SNP的内源性核苷酸序列。
[0590] 153.段落98至152中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一信号传导结构域或第三信号传导结构域为包含至少13个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0591] 154.段落153所述的CAL-细胞或移植物，其中CD28结构域包含所述组的所有残基。
[0592] 155.段落153或154所述的CAL-细胞或移植物，其中CD28结构域包含氨基酸残基Y191和Y209(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0593] 156.段落153至155中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中CD28结构域包含YMNM基序(对应于SEQ ID NO:全长CD28seq的Y191-M192-N193-M194)和/或PYAP基序(对应于SEQ ID NO:13的P208-Y209-A210-P211)。
[0594] 157.段落98至156中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中各CAL-免疫细胞为CAL-T细胞(例如，CD8+T细胞或CD4+T细胞，例如活化的T细胞)、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，例如REP前TIL)、记忆T细胞、TSCM、TCM或TEM。
[0595] 158.段落98至157中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中各CAL-免疫细胞为患有自身免疫性疾病、炎性疾病、病毒性感染或癌症的人的细胞的子代，例如，其中所述人患有成淋巴细胞性白血病、ALL(例如，T-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
[0596] 在一个实施方案中，所述人对至少一种化疗剂有抗性。
[0597] 在一个实施方案中，慢性淋巴细胞性白血病为难治性CD 19+白血病和淋巴瘤。
[0598] 本发明还包括一种在诊断有癌症的人中产生持久的遗传工程改造的T细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向人施用本发明的T细胞(例如，CAL T细胞)，其中所述持久的遗传工程改造的T细胞群在施用之后在人中持续存在至少一个月。在一个实施方案中，所述持久的遗传工程改造的T细胞群包含记忆T细胞。在一个实施方案中，所述持久的遗传工程改造的T细胞群在施用之后在人中持续存在至少三个月。在另一实施方案中，所述持久的遗传工程改造的T细胞群在施用之后在人中持续存在至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、两年、或三年。
[0599] 在一个实施方案中，慢性淋巴细胞性白血病得到治疗。本发明还提供了一种在诊断有癌症的人中扩增工程改造的T细胞或NK细胞群的方法。
[0600] 任选地，将自体淋巴细胞输注用于治疗中。自体PBMC是从需要治疗的患者收集并且将T细胞工程改造以表达本发明的跨膜蛋白，使用本领域中已知的方法对其进行活化和扩增，然后与桥连剂的施用同时或依次地输注回到患者中。
[0601] 159.段落98至158中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中各CAL-免疫细胞已被工程改造以用于增强信号传导，其中所述信号传导选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS和CD40信号传导。
[0602] 160.段落98至159中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中各CAL-细胞来源于人(例如癌症患者)的血液或肿瘤样品且所述细胞为活化细胞。
[0603] 161.段落98至160中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其与所述桥连剂组合。
[0604] 162.段落161所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂具有小于IgG的人血清半衰期的人血清半衰期。
[0605] 163.段落161或162所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂具有不超过5天的人血清半衰期。
[0606] 164.段落163所述的CAL-细胞或移植物，其中半衰期小于1天。
[0607] 165.段落161至164中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点为抗体VH/VL结合位点。
[0608] 166.段落161至165中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第二结合位点为抗体VH/VL结合位点。
[0609] 167.段落161至166中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对于第一抗原的结合亲和力(KD)比第二结合位点对于第二抗原的亲和力低至少5、10或20倍。
[0610] 168.段落161至167中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对第一抗原具有10nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定；且第二结合位点对第二抗原具有50nM或更高(例如，高达1mM)的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定。
[0611] 169.段落161至168中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对第一抗原具有2nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定；且第二结合位点对第二抗原具有60nM或更高(例如，高达1mM)的结合亲和力(KD)，如通过SPR所测定。
[0612] 170.段落161至169中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对第一抗原具有100nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定。
[0613] 171.段落161至170中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对第一抗原具有Koff＝10-3sec-1或更低的结合解离速率，如通过SPR所测定。
[0614] 172.段落161至172中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第二结合位点对第二抗原具有100nM或更低的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定。
[0615] 173.段落161至172中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第一结合位点对第一抗原的结合亲和力(KD)比第二结合位点对第二抗原的亲和力低(KD)更高，其中对第二抗原的亲和力小于100nM。
[0616] 174.段落161至173中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中第二结合位点对第二抗原具有Koff＝10-3sec-1或更低的结合解离速率，如通过SPR所测定。
[0617] 175.段落161至174中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点各自选自由以下组成的组：scFv、nanobodyTM、dAb、duocalin、DARpin、avimer、adnectin和fynomer。.
[0618] 176.段落161至175中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂的大小不超过100kDa。
[0619] 177.段落161至176中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂的大小不超过80kDa(例如，不超过50或55kDa)。
[0620] 178.段落161至177中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂为或包括BiTETM抗体、双特异性scFv、三特异性scFv、tandabTM、dAb纳米抗体(例如二聚体或三聚体)、dAb多聚体(例如二聚体或三聚体)、双体、四体或DARTTM。
[0621] 179.段落161至178中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述桥连剂包含第三抗原结合位点。
[0622] 180.段落179所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第三抗原不同于所述第一抗原。
[0623] 181.段落179或180所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第三抗原为肿瘤相关抗原(TAA)，例如，由所述靶细胞所包含的细胞表面TAA。
[0624] 182.段落161至180中任一段所述的CAL-细胞或移植物，其中所述第一抗原和/或第三抗原与在正常细胞上相比更通常地存在于癌细胞上。
[0625] 183.一种CAL-免疫细胞、CAL-T细胞、CAL-NK细胞或CAL-TIL，其中所述CAL如段落98至182中任一段所定义。
[0626] 一种CAR-免疫细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞或CAR-TIL，其中所述CAR如段落98至182中任一段所定义(参考条目VIII至XV中任一条)。
[0627] 184.一种CAL-免疫细胞、CAL-T细胞的群、CAL-NK细胞的群或CAL-TIL的群，其中所述细胞是根据段落183所述。
[0628] 一种CAR-免疫细胞、CAR-T细胞的群、CAR-NK细胞的群或CAR-TIL的群，其中所述细胞是根据权利段落183所述。
[0629] 185.段落183或184所述的细胞或群，其是用于治疗人的疾病或病状或降低其风险的方法，其中所述方法是根据段落116至120任一段所述。
[0630] 186.段落98至185任一段所述的细胞或群，其是由医学IV容器、输注装置或注射器所包含。
[0631] 187.一种哺乳动物干细胞，其包含编码任一前述段落中所述的工程改造的跨膜蛋白的核苷酸序列。
[0632] 188.段落187所述的细胞，其中所述工程改造的蛋白质为CAL。
[0633] 189.段落187所述的细胞，其中所述工程改造的蛋白质为CAR。
[0634] 190.段落187至189中任一段所述的细胞，其中所述细胞为多能性的或多潜能性的。
[0635] 所述干细胞不能发育成人。在一个实施方案中，所述干细胞不能发育成人胚胎或受精卵。
[0636] 191.段落187至190中任一段所述的细胞，其中所述细胞为骨髓干细胞。
[0637] 192.段落187至191中任一段所述的细胞，其中所述细胞为造血干细胞。
[0638] 193.段落187至192中任一段所述的细胞，其中所述细胞为非人干细胞。
[0639] 194.段落187至193中任一段所述的细胞，其中所述细胞为离体的。
[0640] 195.一种细胞群，其包含多个根据段落187至194中任一段所述的干细胞。
[0641] 196.段落1至97中任一段所述的方法，其中步骤(c)包括向人施用段落187至194中任一段所述的桥连剂和干细胞，其中所述干细胞发育成表达工程改造的跨膜蛋白(例如CAL或CAR)的所述免疫细胞，其中将所述免疫细胞与人中的靶细胞组合。
[0642] 197.段落196所述的方法，其中所述方法包括施用段落195所述的群，其中所述干细胞发育成表达工程改造的跨膜蛋白的多个免疫细胞，其中将所述免疫细胞与人中的靶细胞组合。
[0643] 198.段落187至195中任一段所述的细胞或群，其用于段落196或197所述的治疗人的疾病或病状(例如，癌症或自身免疫性疾病或病状)或降低其风险的方法。
[0644] 精确免疫疗法：结构域变异和其它匹配方面
[0645] 认识到，人类个体在它们的序列方面是不同的且近年来，已对若干个体的基因组进行了测序，例如James Watson和Craig Venter。个体的基因组序列的比较已揭示了它们在基因组的编码与非编码部分的序列方面的差异。在人中一些变异是显著的并且促成个体之间的表型差异。在极端的情况下，这些将导致遗传疾病。1000基因组计划具有对人基因组中的序列进行编目的目的，涉及来自本领域已知的不同人种群的个体的非常大的采样的基因组的测序。
[0646] 收集胞内信号传导蛋白质多态性与各种疾病状态有关的证据，这在本发明中找到应用。例如，参考以下：Genes Immun.2015年3月；16(2):142-50.doi:10.1038/gene.2014.73.Epub 2015年1月8日,“Genetic association of CD247(CD3ζ)with SLE in a large-scale multiethnic study”,Martins M等人；Rheumatology(Oxford).2013年9月；52(9):1551-5.doi:10.1093/rheumatology/ket119.Epub 2013年3月22日,
“CD247variants and single-nucleotide polymorphisms observed in systemic lupus erythematosus patients”,Takeuchi T&Suzuki K；“Polymorphisms in CD28,CTLA-4,CD80and CD86genes may influence the risk of multiple sclerosis and its age of onset”,Wagner M等人,J Neuroimmunol.2015年11月15日；288:79-86.doi:10.1016/
j.jneuroim.2015.09.004.Epub 2015年9月18日；“CTLA-4and CD28genes'polymorphisms and renal cell carcinoma susceptibility in the Polish population--a
prospective study”,Tupikowski K等人,Tissue Antigens.2015年11月；86(5):353-
61.doi:10.1111/tan.12671.Epub 2015年9月25日；and“CTLA-4,CD28,and ICOS gene polymorphism associations with non-small-cell lung cancer”,Karabon L,Hum
Immunol.2011年10月；72(10):947-54.doi:10.1016/j.humimm.2011.05.010.Epub2011年5月24日。
“CD247variants and single-nucleotide polymorphisms observed in systemic lupus erythematosus patients”,Takeuchi T&Suzuki K；“Polymorphisms in CD28,CTLA-4,CD80and CD86genes may influence the risk of multiple sclerosis and its age of onset”,Wagner M等人,J Neuroimmunol.2015年11月15日；288:79-86.doi:10.1016/
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prospective study”,Tupikowski K等人,Tissue Antigens.2015年11月；86(5):353-
61.doi:10.1111/tan.12671.Epub 2015年9月25日；and“CTLA-4,CD28,and ICOS gene polymorphism associations with non-small-cell lung cancer”,Karabon L,Hum
Immunol.2011年10月；72(10):947-54.doi:10.1016/j.humimm.2011.05.010.Epub2011年5月24日。
[0647] 通过运用人类基因变异分析和合理设计的序列选择，本发明提供了基于在CAR和CAL的蛋白质组分中的人变异的改进的人患者疗法。重要的是，本发明能够实现针对人患者个体的基因型或表型的定制药物。
[0648] 本发明人对大量天然存在的人基因组序列的分析揭示了在不同人群间存在显著变异并且提供了检测人患者个体之间的相关性的能力和针对靶标的定制医疗方法。根据本发明的这些研究结果的技术应用因此有助于在人中的更佳治疗和预防并且通过实现个性化药物和疗法提供患者益处。这提供了以下优点：开出更好的处方、较少的药物浪费及在患者中改进的药物功效机会。
[0649] 借此，本发明人认识到，根据指导对CAR和CAL的蛋白质结构域的选择以便向人患者施用供治疗和/或预防疾病和病状，对于本发明存在显著的产业和医疗应用。以此方式，患者接受按他们的需要定制的免疫疗法--如由患者的基因或表型组成所决定。与此同时，本发明提供了与这种治疗有关的患者的基因分型和/或表型分析，由此容许药物与患者的适当匹配。这增加了医疗功效的机会，降低了使用与患者不匹配(例如，不良功效和/或副作用)的药物的次等治疗的可能性并且避免药物处方不当和浪费。
[0650] 如上所述且在实施例1中进一步说明，本发明的一个实施方案提供了用于工程改造的跨膜蛋白(例如CAL或CAR)的序列与接受者细胞或人患者的内源性(即天然存在的)基因型的匹配。在这个的一方面中，本发明人已匹配了工程改造的蛋白质结构域以反映见于人群中且见于接受者人细胞和患者基因组中的天然变异。这部分地基于以下认识：在人中的天然耐受的氨基酸变异(及相应的非同义SNP)将共同进化以与胞内信号传导机构的其它组分一起有效地起作用。如由上面的出版物所示，信号传导蛋白质中的突变会导致不想要的作用，可能部分归因于较差的信号传导。本发明旨在匹配工程改造的蛋白以便更密切地反映本发明中使用的人细胞和患者的内源性蛋白质和基因型。
[0651] 除了与胞内信号传导机构的匹配之外，另一方面，本发明还实现了工程改造的跨膜蛋白的胞外部分将在免疫细胞表面处暴露于接受者患者的免疫系统。因此，本发明的匹配实施方案还实现了使得跨膜蛋白的胞外部分看上去尽可能是人接受者患者的“自体”的期望。因此，在各方面中，在胞外部分中(例如，在CAL的第二抗原中或在铰链中)的一种或多种多态性与患者中天然所见的多态性相匹配。在各实施例中，本发明人已鉴别了常见的个体多态性或多态性组，其将适用于与这种常见多态性匹配的人细胞群和患者群。
[0652] 作为对此的扩展，本发明鉴别了“通用构架”用于本发明的跨膜蛋白的结构域。这是基于对在容许在人群中天然地有变异的特定结构域中的残基组的鉴别；本发明已鉴别了这种变异的集合，其各自代表在人中最常见的多态性且因此认为将适用于产生“通用CAR”和“通用CAL”，它们可为许多人细胞和人患者所使用，因为它们将匹配所述细胞和患者中的许多天然多态性。
[0653] 因此，本发明提供采用基因组和表型匹配的本发明的此实施方案的以下具体方面。
[0654] 1.一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0655] 其中所述蛋白质包含
[0656] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0657] B.跨膜部分；和
[0658] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0659] 其中
[0660] D.工程改造的蛋白质的SD1在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码SD1的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0661] E.细胞的基因组包含含有SNP1并编码第二信号传导结构域(SD2)的第二核苷酸序列(S2)，其中第二信号传导结构域(i)与SD1相同并包含R1或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R1；并且
[0662] F.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0663] 另外或替代地，方面1提供了：-
[0664] 一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0665] 其中所述蛋白质包含
[0666] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0667] B.跨膜部分；和
[0668] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0669] 其中
[0670] D.工程改造的蛋白质的第一抗原或配体结构域在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码抗原或配体结构域的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0671] E.细胞的基因组包含含有SNP1并编码第二抗原或配体结构域的第二核苷酸序列(S2)，其中第二抗原或配体结构域(i)分别与第一抗原或配体结构域相同并包含R1或(ii)分别为第一抗原或配体结构域的天然存在的变体并包含R1；并且
[0672] F.其中S2为所述细胞的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP。
[0673] 另外或替代地，方面1提供了：-
[0674] 一种人免疫细胞，其用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0675] 其中所述蛋白质包含
[0676] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0677] B.跨膜部分；和
[0678] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0679] 其中
[0680] D.工程改造的蛋白质的SD1在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码SD1的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0681] E.人的基因组包含含有SNP1并编码第二信号传导结构域(SD2)的第二核苷酸序列(S2)，其中SD2(i)与SD1相同并包含R1或(ii)为SD1的天然存在的变体并包含R1；
[0682] F.其中S2为人的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP；且
[0683] G.其中在免疫细胞的所述施用之前所述人基因组包含S2；并且
[0684] H.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0685] 另外或替代地，方面1提供了：-
[0686] 一种人免疫细胞，其用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0687] 其中所述蛋白质包含
[0688] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0689] B.跨膜部分；和
[0690] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0691] 其中
[0692] D.工程改造的蛋白质的第一抗原或配体结构域在细胞中由第一核苷酸序列(S1)编码，所述第一核苷酸序列(S1)包含编码抗原或配体结构域的氨基酸残基(R1)的人单核苷酸多态性(SNP1)；
[0693] E.人的基因组包含含有SNP1并编码第二抗原或配体结构域的第二核苷酸序列(S2)，其中第二抗原或配体结构域(i)分别与第一抗原或配体结构域相同并包含R1或(ii)分别为第一抗原或配体结构域的天然存在的变体并包含R1；
[0694] F.其中S2为人的内源性基因组序列且SNP1为非同义SNP；且
[0695] G.其中在免疫细胞的所述施用之前所述人基因组包含S2；并且
[0696] H.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0697] 在一个实施例中，S1与S2具有至少80％、90％或95％同一性。
[0698] 在一个实施例中，胞外部分包含抗原结合结构域。在一个实施例中，跨膜蛋白为CAR，例如，本文所公开的任何CAR。
[0699] 在一个实施例中，胞外部分包含抗原或配体(例如，受体配体)。在一个实施例中，跨膜蛋白为CAL，例如，本文所公开的任何CAL。
[0700] 在一个实施例中，免疫细胞用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用免疫细胞，其中在所述施用之前患者的基因组包含S2和/或SNP1，其中在人中的所述疾病或病状得到治疗或预防。在一个实施例中，本发明的免疫细胞用于这种方法。
[0701] 当本发明的跨膜蛋白在本文中“被工程改造”时，这意味着它们并非天然地见于人或人细胞或者它们所引入的细胞或哺乳动物中。
[0702] 2.方面1的细胞，其中各所述信号传导结构域为选自由以下组成的组的胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40(CD134)结构域、CD40L结构域和4-1BB(CD137)结构域。
[0703] 3.任一前述方面的细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含至少50个选自由以下组成的组的氨基酸残基：V53、K54、F55、R57、S58、D60、Y64、Q65、Q68、L71、E74、L75、N76、L77、G78、R80、E81、Y83、L86、R89、G91、P94、E95、G98、K99、R102、Q107、G109、Y111、N112、E113、L114、Q115、K116、D117、K118、M119、E121、A122、Y123、S124、E125、I126、G127、G130、R134、G135、H138、D139、L141、Y142、Q143、G144、S146、T147、T149、K150、D151、D154、H157、M158、Q159、L161和P162(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)。
[0704] 4.方面3的细胞，其中所述第一信号传导结构域为包含所述组的所有残基的CD3ζ(CD3-zeta)结构域。
[0705] 5.方面3或4的细胞，其中所述第一信号传导结构域包含氨基酸残基Y64、Y72和Y83；Y64和Y72；Y72和Y83；Y111和Y123；Y142和Y153；Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153；或Y64、Y72、Y111、Y123、Y142和Y153；或Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)。
[0706] 6.任一前述方面的细胞，其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含SEQ ID NO:9。
[0707] 这是根据本发明的通用构架(如上且进一步在实施例1中所说明)。
[0708] 7.一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0709] 其中所述蛋白质包含
[0710] A.包含一个或多个配体结合结构域或一个或多个配体结构域的胞外部分；
[0711] B.跨膜部分；和
[0712] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0713] D.其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含至少50个选自由以下组成的组的氨基酸残基：V53、K54、F55、R57、S58、D60、Y64、Q65、Q68、L71、E74、L75、N76、L77、G78、R80、E81、Y83、L86、R89、G91、P94、E95、G98、K99、R102、Q107、G109、Y111、N112、E113、L114、Q115、K116、D117、K118、M119、E121、A122、Y123、S124、E125、I126、G127、G130、R134、G135、H138、D139、L141、Y142、Q143、G144、S146、T147、T149、K150、D151、D154、H157、M158、Q159、L161和P162(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)；且
[0714] E.其中所述细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域的内源性核苷酸序列，其中所述第二结构域为CD3ζ(CD3-zeta)结构域或CD3η(CD3-eta)结构域，其包含至少40个(例如，45个或全部)所述选择的残基。
[0715] 这是基于由本发明人鉴别容许在人群中天然地有变异的CD3ζ和CD3η结构域中的残基组；本发明已鉴别了这种变异的集合，其各自代表在人中最常见的多态性且因此认为可为许多人细胞和人患者所使用，因为它们将匹配所述细胞和患者中的许多天然多态性。
[0716] 另外或替代地，方面7提供了：-
[0717] 一种人免疫细胞，其用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0718] 其中所述蛋白质包含
[0719] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0720] B.跨膜部分；和
[0721] C.包含第一信号传导结构域的胞内部分；
[0722] 其中
[0723] D.其中所述第一信号传导结构域为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且包含至少50个选自由以下组成的组的氨基酸残基：V53、K54、F55、R57、S58、D60、Y64、Q65、Q68、L71、E74、L75、N76、L77、G78、R80、E81、Y83、L86、R89、G91、P94、E95、G98、K99、R102、Q107、G109、Y111、N112、E113、L114、Q115、K116、D117、K118、M119、E121、A122、Y123、S124、E125、I126、G127、G130、R134、G135、H138、D139、L141、Y142、Q143、G144、S146、T147、T149、K150、D151、D154、H157、M158、Q159、L161和P162(位置编号对应于SEQ ID NO:1的位置)；并且
[0724] E.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域的内源性核苷酸序列，其中第二结构域为包含至少40个(例如，45个或全部)所述选择的残基的CD3ζ(CD3-zeta)结构域或CD3η(CD3-eta)结构域；
[0725] F.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0726] 8.方面7的细胞，其中第一信号传导结构域包含氨基酸残基Y64、Y72和Y83；Y64和Y72；Y72和Y83；Y111和Y123；Y142和Y153；Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153；或Y64、Y72、Y111、Y123、Y142和Y153；或Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)。
[0727] 9.方面7或8的细胞，其中第一信号传导结构域为包含SEQ ID NO:9的CD3ζ(CD3-zeta)结构域；且第二结构域为包含SEQ ID NO:9的CD3ζ(CD3-zeta)结构域。
[0728] 10.方面7至9中任一个的细胞，其中第一信号传导结构域和第二信号传导结构域为CD3ζ(CD3-zeta)结构域且任选地，各结构域包含所述至少50个所选残基。
[0729] 11.任一前述方面的细胞，其中第一信号传导结构域和第二信号传导结构域各自包含含有R1的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
[0730] 12.方面11的细胞，其中所述信号传导结构域的ITAM是相同的。
[0731] 13.任一前述方面的细胞，其中第一信号传导结构域与第二信号传导结构域是相同的。
[0732] 14.任一前述方面的细胞，其中第一信号传导结构域为人的。
[0733] 15.任一前述方面的细胞，其中胞内部分包含在细胞中由第三核苷酸序列(S3)编码的另一胞内信号传导结构域(第三信号传导结构域，SD3)，S3包含编码SD3的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；其中细胞的基因组包含编码第四信号传导结构域(SD4)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD4(iii)与SD3相同并包含R2或(iv)为SD3的变体并包含R2；且其中S4为所述细胞的内源性基因组序列且SNP2为非同义SNP。
[0734] 在一个附加或替代方面中，胞内部分包含在人基因组中由第三核苷酸序列(S3)编码的另一胞内信号传导结构域(第三信号传导结构域，SD3)，S3包含编码SD3的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；其中所述人的基因组包含编码第四信号传导结构域(SD4)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD4(iii)与SD3相同并包含R2或(iv)为SD3的变体并包含R2；且其中S4为所述人的内源性基因组序列且SNP2为非同义SNP。
[0735] 16.方面15的细胞，其中SD1与SD3结构域是不同的。
[0736] 17.方面15或16的细胞，其中SD3和SD4各自包含含有R2的ITAM。
[0737] 18.方面17的细胞，其中SD3和SD4的ITAM是相同的。
[0738] 19.方面15至18中任一个的细胞，其中SD3与SD4是相同的。
[0739] 20.方面15至19中任一个的细胞，其中SD3为人的。
[0740] 21.方面15至20中任一个的细胞，其中SD3和SD4各自为CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0741] 22.方面15至21中任一个的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，且所述第三结构域为FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域或4-1BB结构域。
[0742] 23.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域且为跨膜蛋白的C末端结构域。
[0743] 24.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、两个或三个选自以下的氨基酸基序：(a)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:10；(b)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:11；及(c)任选地具有至多10、9、8、7、6或5个(例如至多5个)氨基酸差异但其中酪氨酸是保守的SEQ ID NO:12。
[0744] 25.方面24的细胞，其中SD1包含基序(a)且其中所述基序与SEQ ID NO:10的不同之处为在至多5个选自由以下组成的组的残基处有变化：A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、N73、R79、E82、D84、V85、D87和K88。
[0745] 26.方面25的细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：A61V、A61P、P62S、P62A、A63P、Q66H、G67S、N69T、Q70Y、Q70L、Q70P、Q70W、N73Y、R79L、R79G、E82K、D84G、D84A、D84Y、V85I、D87G和K88R。
[0746] 27.方面24至26中任一个的细胞，其中SD1包含基序(b)且其中所述基序与SEQ ID NO:11的不同之处为在至多5个选自由以下组成的组的残基处有变化：P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122和M128。
[0747] 28.方面27的细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：P100L、Q101L、Q101P、R103K、K104E、N105K、P106R、E108A、L110Q、A120V、A122V和M128T。
[0748] 29.方面24至28中任一个的细胞，其中SD1包含基序(c)且其中所述基序与SEQ ID NO:12的不同之处为在至多5个选自由以下组成的组的残基处有变化：E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、A155、L156。
[0749] 30.方面29的细胞，其中所述变化选自由以下组成的组：E131K、R132H、R132C、R133Q、R133W、K136N、G137E、G140D、L145F、A148D、T152I、A155T、L156P。
[0750] 31.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，第一信号传导结构域包含多个(例如3个)ITAM，其中第二信号传导结构域包含相同的相应的ITAM。
[0751] 32.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含一个、多个或所有选自由以下组成的组的氨基酸残基：S58、Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置。
[0752] 33.方面32的细胞，其中SD1包含C72和N153中的一个或两个。
[0753] 34.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含选自由以下组成的组的残基(所述R1)：R52、S56、A59、A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、Y72、N73、R79、E82、D84、V85、D87、K88、R90、R92、D93、M96、G97、P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122、M128、K129、E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、Y153、A155、L156、A160、P163和R164(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)。
[0754] 35.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含为Y72或Y153(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)的残基(所述R1)。
[0755] 36.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含由选自由以下组成的组的SNP(SNP1)编码的残基(所述R1)：rs368651001、rs372651048、rs767112686、rs765877580、rs751145956、rs772867144、rs55893506、rs761710510、rs776601547、rs768607376、rs193922741、rs193922740、rs193922739、rs780188126、rs772128174、rs757978223、rs779397562、rs749926653、rs181746205、rs181746205、rs753572867、rs371709798、rs145407267、rs143180729、rs148513413、rs367690333、rs144963570、rs367690333、rs144963570、rs770320255、rs139926301、rs56297636、rs760895755、rs112890541、rs370910340、rs145505909、rs754935006、rs751583971、rs766541481、rs763074967、rs745871212、rs372665461、rs764185491、rs756340039、rs773572491、rs201594815、rs781510519、rs147527561、rs751981677、rs763532939、rs753278244、rs771873949、rs186004179、rs186004179、rs762773775、rs748158220、rs776703680、rs561262982、rs758846009、rs746262183、rs376046446、rs201937405和rs752198795。
[0756] 37.任一前述方面的细胞，其中SD1为选自CD3ζ(CD3-zeta)结构域和CD3η(CD3-eta)结构域的CD3胞内结构域，并且包含选自由以下组成的组的残基(所述R1)：R52、S56、A59、A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、Y72、N73、R79、E82、D84、V85、D87、K88、R90、R92、D93、M96、G97、P100、Q101、R103、K104、N105、P106、E108、L110、A120、A122、M128、K129、E131、R132、R133、K136、G137、G140、L145、A148、T152、Y153、A155、L156、A160、P163和R164(位置编号对应于SEQ ID NO:7的位置)；且任选地其中SD2还包含所述选择的残基(R1)。
[0757] 38.任一前述方面的细胞，其中SD1或SD3为包含至少13个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0758] 39.方面38的细胞，其中CD28结构域包含所述组的所有残基。
[0759] 40.方面38或39的细胞，其中CD28结构域包含氨基酸残基Y191和Y209(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0760] 41.方面38至40中任一个的细胞，其中CD28结构域包含YMNM基序(对应于SEQ ID NO:13的Y191-M192-N193-M194)和/或PYAP基序(对应于SEQ ID NO:13的P208-Y209-A210-P211)。
[0761] 42.任一前述方面的细胞，其中CD结构域包含SEQ ID NO:15。
[0762] 43.一种包含工程改造的跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0763] 其中所述蛋白质包含
[0764] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0765] B.跨膜部分；和
[0766] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0767] D.其中SD1为包含至少13、14、15、16、17或18个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)；并且
[0768] E.其中细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少10个(或11、12或13个)所述选择的残基的CD28胞内结构域。
[0769] 另外或替代地，方面7提供了：-
[0770] 一种人免疫细胞，其用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0771] 其中所述蛋白质包含
[0772] A.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0773] B.跨膜部分；和
[0774] C.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0775] 其中
[0776] D.其中SD1为包含至少13、14、15、16、17或18个选自由以下组成的组的氨基酸残基的CD28胞内结构域：R180、S181、K182、R183、S184、R185、L186、D190、Y191、N193、P196、P199、T202、K204、Q207、F215、A217和Y218(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)；
[0777] E.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少10个(或11、12或13个)所述选择的残基的CD28胞内结构域；并且
[0778] F.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0779] 44.方面43的细胞，其中SD1包含氨基酸残基Y191和Y209(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0780] 45.方面43或44的细胞，其中SD1包含SEQ ID NO:15；且第二结构域为包含SEQ ID NO:15的CD28结构域。
[0781] 46.方面43、44或45中任一个的细胞，其中SD1和SD2各结构域包含所述至少13个选择的残基。
[0782] 47.方面43至46中任一个的细胞，其中胞内部分包含在细胞中由第三核苷酸序列(S3)编码的另一信号传导结构域(第三信号传导结构域，SD3)，S3包含编码SD3的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；其中细胞或人的基因组包含编码第四信号传导结构域(SD4)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD4(iii)与SD3相同并包含R2或(iv)为SD3的变体并包含R2；且其中SD4分别为细胞或人的内源性基因组序列。
[0783] 48.方面47的细胞，其中SD1与SD3结构域是不同的。
[0784] 49.方面47或48的细胞，其中SD3与SD4是相同的。
[0785] 50.方面47至49中任一个的细胞，其中SD3为人的。
[0786] 51.方面47至50中任一个的细胞，其中SD3和SD4各自为选自由以下组成的组的胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域和4-1BB结构域。
[0787] 52.方面47至51中任一个的细胞，其中SD1为受体的C末端结构域或受体的最N末端的胞内结构域。
[0788] 53.任一前述方面的细胞，其中SD1或SD3结构域为包含选自由以下组成的组的残基(所述R1或R2)的CD28胞内结构域：L187、H188、S189、M192、M194、T195、R197、R198、G200、P201、R203、H205、Y206、P208、Y209、A210、P211、P212、R213、D214、A216、R219和S220(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0789] 54.任一前述方面的细胞，其中SD1或SD3为包含以下残基(所述R1或R2)的CD28胞内结构域：M192、M194、P208、Y209、A210或P211(位置编号对应于SEQ ID NO:13的位置)。
[0790] 55.前述任一方面的细胞，其中SD1或SD3为CD28胞内结构域，并且包含由选自由以下组成的组的SNP(SNP1或SNP2)所编码的残基(所述R1或R2)：rs139881881、rs139881881、rs751945323、rs753396357、rs754453810、rs200221759、rs562969933、rs765515314、rs145761335、rs199647272、rs200751829、rs201547332、rs200642723、rs367908475、rs199549636、rs199549636、rs749688881、rs769098383、rs572738990、rs200606770、rs371850110、rs201773411、rs762144222、rs770610915、rs199777674、rs201909740、rs200016310、rs200936737、rs201598596和rs762747357。
[0791] 56.任一前述方面的细胞，当从属于方面15和/或47时，其中SD3和SD4为人4-1BB结构域并且R2选自由以下组成的组：R215、Q215、W215、R217、G217、K218、N218、Y222、C222、P227、S227、M229、I229、V232、A232、Q236、H236、D239、C241、Y241、R244、Q244、E247、G247、E250、G250、G252、E252、V252、R252、C253和S253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0792] 57.方面56的细胞，其中SD3包含至少10、11、12、13、14个或全部选自由以下组成的组的残基：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0793] 58.任一前述方面的细胞，当从属于方面15和/或47时，其中SD3和SD4为人4-1BB结构域，其中SD3包含Q236和D239(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0794] 这些是保守的TRAF结合残基，如实施例1中所说明。
[0795] 59.任一前述方面的细胞，当从属于方面15和/或47时，其中SD3包含SEQ ID NO:18。
[0796] 这是本发明的通用4-1BB构架，其保留保守的天然存在的残基和TRAF结合基序。
[0797] 60.一种包含工程改造跨膜蛋白的人免疫细胞，
[0798] 其中所述蛋白质包含
[0799] F.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0800] G.跨膜部分；和
[0801] H.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0802] I.其中SD1为包含至少10、11、12、13、14个或全部选自由以下组成的组的残基的4-1BB胞内结构域：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)；并且
[0803] J.其中细胞的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少8个(或9个或10个)所述选择的残基的4-1BB胞内结构域。
[0804] 另外或替代地，方面7提供了：-
[0805] 一种人免疫细胞，其用于治疗疾病或病状(例如，如本文所公开的，例如癌症或自身免疫性疾病)或降低其风险的方法，其中所述方法包括向人患者施用所述免疫细胞，所述免疫细胞包含工程改造的跨膜蛋白，
[0806] 其中所述蛋白质包含
[0807] G.包含第一抗原或配体结构域的胞外部分；
[0808] H.跨膜部分；和
[0809] I.包含第一信号传导结构域(SD1)的胞内部分；
[0810] 其中
[0811] J.其中SD1为包含至少10、11、12、13、14个或全部选自由以下组成的组的残基的4-1BB胞内结构域：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)；并且
[0812] K.其中人的基因组包含编码第二信号传导结构域(SD2)的内源性核苷酸序列，其中SD2为包含至少8个(或9或10个)所述选择的残基的4-1BB胞内结构域。
[0813] L.其中所述方法治疗人的疾病或病状或降低其风险。
[0814] 61.方面60的细胞，其中SD1包含氨基酸残基Q236、D239、E247和E250(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0815] 62.方面60或61的细胞，其中SD1包含SEQ ID NO:18；且第二结构域为包含SEQ ID NO:18的4-1BB结构域。
[0816] 63.方面60、61或62中任一个的细胞，其中SD1和SD2各结构域包含所述至少13个选择的残基。
[0817] 64.方面60至63中任一个的细胞，其中胞内部分包含在细胞中由第三核苷酸序列(S3)编码的另一信号传导结构域(第三信号传导结构域，SD3)，S3包含编码SD3的氨基酸残基(R2)的人单核苷酸多态性(SNP2)；其中细胞或人的基因组包含编码第四信号传导结构域(SD4)的第四核苷酸序列(S4)，其中SD4(iii)与SD3相同并包含R2或(iv)为SD3的变体并包含R2；且其中SD4分别为细胞或人的内源性基因组序列。
[0818] 65.方面64的细胞，其中SD1与SD3结构域是不同的。
[0819] 66.方面64或65的细胞，其中SD3与SD4是相同的。
[0820] 67.方面64至66中任一个的细胞，其中SD3为人的。
[0821] 68.方面64至67中任一个的细胞，其中SD3和SD4各自为选自由以下组成的组的胞内结构域：CD3ζ(CD3-zeta)结构域、CD3η(CD3-eta)结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域、CD16结构域、CD27结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域和CD28结构域。
[0822] 69.方面60至68中任一个的细胞，其中SD1为受体的C末端结构域或受体的最N末端胞内结构域。
[0823] 70.任一前述方面的细胞，其中SD1或SD3结构域为包含选自由以下组成的组的残基(所述R1或R2)的4-1BB胞内结构域：R215、R217、K218、Y222、P227、M229、V232、Q236、D239、C241、R244、E247、E250、G252和C253(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0824] 71.任一前述方面的细胞，其中SD1或SD3为包含以下残基(所述R1或R2)的4-1BB胞内结构域：Q236、D239、E247或E250(位置编号对应于SEQ ID NO:16的位置)。
[0825] 72.前述方面中任一个的细胞，其中SD1或SD3为4-1BB胞内结构域，并且包含由选自由以下组成的组的SNP(SNP1或SNP2)所编码的残基(所述R1或R2)：rs753016242、rs143524950、rs780812476、rs755927735、rs144908104、rs533883433、rs367584804、rs141498457、rs751542955、rs764017912、rs752191416、rs554909019、rs759184548、rs776878260、rs113310001、rs113310001、rs761088691和rs772691718。
[0826] 73.任一前述方面的细胞，其中所述胞外部分包含含有抗体VH结构域的抗原结合位点，其中所述VH结构域来源于人VH基因区段与DH和JH基因区段的重组，其中所述VH基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP3)。
[0827] 74.任一前述方面的细胞，其中所述胞外部分包含含有抗体VL结构域的抗原结合位点，其中所述VL结构域来源于人VL基因区段与JL基因区段的重组，其中所述VL基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP4)。
[0828] 75.方面1至73中任一个的细胞，其中所述胞外部分包含含有TCR Vα结构域的抗原结合位点，其中所述Vα结构域来源于人Vα基因区段与Jα基因区段的重组，其中所述Vα基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP5)。
[0829] 76.方面1至73和74中任一个的细胞，其中所述胞外部分包含含有TCR Vβ结构域的抗原结合位点，其中所述Vβ结构域来源于人Vβ基因区段与Dβ和Jβ基因区段的重组，其中所述Vβ基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP6)。
[0830] 77.任一前述方面的细胞，其中所述胞外部分包含由Cα基因区段序列所编码的TCR Cα序列，其中所述Cα基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP7)，其中SNP7编码Cα胞外氨基酸残基(R3)且R3由胞外部分的Cα序列所包含。
[0831] 78.任一前述方面的细胞，其中所述胞外部分包含由Cβ基因区段序列所编码的TCR Cβ序列，其中所述Cβ基因区段包含由细胞或人的基因组所包含的SNP(SNP8)，其中SNP8编码Cβ胞外氨基酸残基(R4)且R4由胞外部分的Cβ序列所包含。
[0832] 79.任一前述方面的细胞，其中所述细胞为T细胞(例如，CD8+T细胞，例如，活化的T细胞)、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，例如，REP前TIL)、干细胞、记忆干细胞、骨髓细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、记忆T细胞、TSCM、TCM或TEM。
[0833] 80.任一前述方面的细胞，其中所述细胞已被工程改造以用于增强信号传导，其中所述信号传导选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS和CD40信号传导。
[0834] 81.一种免疫细胞群，其包含多个根据任一前述方面的细胞。
[0835] 82.任一前述方面的细胞或群，其用于治疗人中的癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病或病毒感染。
[0836] 在一个实施方案中，所述癌症、疾病或病状为本文所公开的任何癌症、疾病或病状。
[0837] 83.方面82的细胞或群，其中所述癌症为T细胞或B细胞起源的癌症，例如，成淋巴细胞性白血病、ALL(例如，T-ALL)、CLL(例如，B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或非霍奇金氏淋巴瘤。
[0838] 84.方面82或89的细胞或群，其中各所述细胞为所述人的自体细胞(例如，T细胞)或这种自体细胞的子代。
[0839] 85.方面84的细胞或群，其中各自体细胞来源于人的血液或肿瘤样品并且在体外活化和扩增。
[0840] 86.一种产生根据任一前述方面的细胞的方法，所述方法包括
[0841] i.获得人免疫细胞(例如，记忆T细胞、NK细胞、骨髓细胞、干细胞或TIL)；
[0842] ii.获得编码所述工程改造的跨膜蛋白的可表达的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含由SNP(SNP1)编码的所述残基(R1)，所述SNP是由细胞的基因组所包含；以及
[0843] iii.将所述核苷酸序列引入细胞中用于表达所述受体。
[0844] 87.方面86的方法，其还包括培养、分化和/或活化由步骤(iii)产生的细胞，由此产生表达所述受体的细胞群。
[0845] 88.方面86或87的方法，其中步骤(i)的细胞从患有癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病或病毒感染的人获得。
[0846] 89.一种治疗人的癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病或病毒感染的方法，所述方法包括向人施用任一前述方面或通过方面87或88的方法产生的细胞或群，其中实现细胞杀伤并且所述癌症、疾病或病状得到治疗。
[0847] 在一个实施例中，人的癌症、疾病或感染的严重性降低或进展减缓。
[0848] 90.方面89的方法，其中所施用的细胞为从人处获得的细胞的子代并且用于方面86、87或88的方法的步骤(i)中。
[0849] 91.任一前述方面的细胞或群，其用于方面89或90的方法中以治疗人中的癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病或病毒感染或降低其进展的风险。
[0850] 92.一种医用V袋或注射装置，其包含方面1至85和91中任一个的细胞或群。
[0851] 93.一种哺乳动物干细胞，其包含编码任一前述方面所述的工程改造的跨膜蛋白的核苷酸序列。
[0852] 94.方面93的细胞，其中所述工程改造的蛋白质为CAL。
[0853] 95.方面93的细胞，其中所述工程改造的蛋白质为CAR。
[0854] 96.方面93至95中任一个的细胞，其中所述细胞为多能性的或多潜能性的。
[0855] 所述干细胞不能发育成人。在一个实施方案中，所述干细胞不能发育成人胚胎或受精卵。
[0856] 97.方面93至96中任一个的细胞，其中所述细胞为骨髓干细胞。
[0857] 98.方面93至97中任一个的细胞，其中所述细胞为造血干细胞。
[0858] 99.方面93至98中任一个的细胞，其中所述细胞为非人干细胞。
[0859] 100.方面93至99中任一个的细胞，其中所述细胞为离体的。
[0860] 101.一种细胞群，其包含多个根据方面93至100中任一个的干细胞。
[0861] 102.任一前述方面的方法，其中所述方法包括向人施用免疫细胞和桥连剂以治疗或预防人的疾病或病状。
[0862] 103.方面102的方法，其包括向人施用方面93至100中任一个的干细胞，其中所述干细胞发育成表达工程改造的跨膜蛋白(例如CAL或CAR)的所述免疫细胞，其中将免疫细胞与人中的靶细胞组合，其中所述工程改造的免疫细胞被活化且所述靶细胞被杀伤。
[0863] 104.方面103的方法，其中所述方法包括施用段落101所述的群，其中所述干细胞发育成表达工程改造跨膜蛋白的多个免疫细胞，其中将免疫细胞与人中的靶细胞组合，且工程改造的免疫细胞被活化且靶细胞被杀伤，由此所述疾病或病状得到治疗或预防。
[0864] 105.方面93至101中任一个的细胞或群，其用于方面103或104的方法以用于治疗人的疾病或病状(例如，癌症或自身免疫性疾病或病状)或降低其风险。
[0865] 如实施例中所述，本发明人已设计了通用的胞内信号传导结构域构架：SEQ ID NO:9、15和18。为此，本发明还提供了以下方面：-
[0866] 1.一种CAL-免疫细胞或CAR-免疫细胞，其基因组包含(i)至(iii)中的一个或多个或所有：-
[0867] (i)编码包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列；
[0868] (ii)编码包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的核苷酸序列；和/或
[0869] (iii)编码包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的内源性核苷酸序列；和编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的核苷酸序列。
[0870] 2.一种供施用于人患者以治疗或预防疾病或病状(例如，癌症)的自体或同种异体细胞移植物，所述移植物包含多个CAL-免疫细胞或CAR-免疫细胞，其中所述细胞是一个或多个从人供体获得的祖细胞的子代，其中所述移植物的每个所述细胞的基因组包含(i)至(iii)中的一个或多个或全部：-
[0871] (i)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:9的CD3ζ胞内结构域的内源性核苷酸序列；
[0872] (ii)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域的内源性核苷酸序列；或
[0873] (iii)编码所述CAL或CAR的包含SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的核苷酸序列，其中所述祖细胞的基因组包含编码含有SEQ ID NO:18的4-1BB胞内结构域的内源性核苷酸序列。
[0874] 3.方面2的移植物，其中所述移植物的每个所述细胞包含所述内源性序列。
[0875] 在一个实施例中，CAL或CAR包含SEQ ID NO:9且所述移植物包含编码SEQ ID NO:9的内源性CD3ζ胞内结构域序列；和/或CAL或CAR包含SEQ ID NO:15且所述移植物包含编码SEQ ID NO:15的内源性CD28胞内结构域序列；和/或CAL或CAR包含SEQ ID NO:18且所述移植物包含编码SEQ ID NO:18的内源性4-1BB胞内结构域序列。
[0876] 在一个替代方案中，一个或多个这种内源性序列可在所述移植细胞或免疫细胞中被敲除(即，使得变成非功能性或不可表达的)。然而，细胞仍将表达信号传导机构，所述信号传导机构在供体中以包含SEQ ID NO:9、15和18中的一个或多个的CAR或CAL的胞内结构域来发挥作用。这种敲除可适用于将信号传导集中于细胞的CAR或CAL，而非内源性信号传导结构域。
[0877] 4.方面1至3中任一个的细胞或移植物，其用于治疗或预防人患者的疾病或病状(例如，癌症)的方法，其中所述患者的生殖系基因组包含所述胞内结构域内源性序列，任选地其中所述生殖系基因组编码CD3ζ、CD28和4-1BB胞内结构域，它们分别包含SEQ ID NO:9、15和18。
[0878] 在一个实施例中，CAL或CAR包含SEQ ID NO:9且所述生殖系基因组包含编码SEQ ID NO:9的内源性CD3η胞内结构域序列；和/或CAL或CAR包含SEQ ID NO:15且所述生殖系基因组包含编码SEQ ID NO:15的内源性CD28胞内结构域序列；和/或CAL或CAR包含SEQ ID NO:18且所述生殖系基因组包含编码SEQ ID NO:18的内源性4-1BB胞内结构域序列。
[0879] 5.方面2、3或4的移植物，其是用于治疗或预防人患者的疾病或病状(例如，癌症)，其中所述患者为所述供体。
[0880] 6.方面1至5中任一个的细胞或移植物，其中所述CAL或CAR包含胞外CD3(例如，CD3δ)或CD16(例如，CD16A)胞外结构域。任选地，CD3胞外结构域为CD3γ、CD3δ或CDε结构域。
[0881] 本发明还提供以下概念：-
[0882] 1.一种嵌合抗原配体(CAL)，其中CAL包含工程改造的多肽，所述工程改造的多肽(在N末端至C末端方向上)包含：CD3胞外结构域(例如CD3δ或CD3ε胞外结构域)；任选的铰链(例如CD8α铰链)；跨膜结构域(例如CD8α或CD28跨膜结构域)；和CD3ζ胞内信号传导结构域；其中当所述CAL由免疫细胞膜所包含且所述CAL接合桥连剂时，胞内信号传导在免疫细胞中被触发以调节免疫细胞活性。
[0883] 任选地，跨膜结构域不为CD3结构域。
[0884] 在一个实施例中，CAL包含人CD3δ胞外结构域。在一个实施例中，CAL包含人CD8α铰链。在一个实施例中，CAL包含人CD8α或CD28跨膜结构域。在一个实施例中，CAL包含人CD3ζ结构域。在还包含CD3ζ胞内信号传导结构域的工程改造的多肽中提供CD3胞外结构域是非天然存在的构型。
[0885] 任选地，每个所述CD3结构域可根据本文所述的任何CD3结构域，例如包含一个或多个本文所述的CD3结构域SNP。
[0886] 在一个替代方案中，概念1提供：-
[0887] 一种包含至少第一多肽和第二多肽的CAL多肽复合物，其中
[0888] (i)第一多肽(在N末端至C末端方向上)包含CD3胞外结构域(例如，CD3δ或CD3ε胞外结构域)；任选的铰链(例如，CD8α铰链)和跨膜结构域(例如，CD3δ、CD3ε、CD8α或CD28跨膜结构域)；并且
[0889] (ii)第二多肽(在N末端至C末端方向上)包含跨膜结构域(例如，CD3ζ、CD8α或CD28跨膜结构域)；和CD3ζ胞内信号传导结构域；
[0890] 其中所述多肽中的一种或两种包含不为CD3结构域的胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28胞内信号传导结构域)；并且
[0891] 其中当所述CAL由免疫细胞膜所包含且所述CAL接合桥连剂时，胞内信号传导在免疫细胞中被触发以调节免疫细胞活性。
[0892] 在一个实施例中，CAL包含(a)CD3δ、CD3ε或CD3γ链和(b)CD3ζ链；其中一条或两条或所述链包含不为CD3结构域的胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28胞内信号传导结构域)。例如，一条或两条链各自包含一个或多个胞内信号传导结构域，所述一个或多个胞内信号传导结构域各自选自由以下组成的组：CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域和CD16结构域，例如，包含CD28胞内信号传导结构域和胞内信号传导4-1BB结构域。在一个实施例中，CAL包含CD3δ链(例如，一条所述链)；还任选地，CAL包含CD3ε链(例如，2条所述链)和/或CAL包含CD3γ链(例如，一条所述链)；任选地，CAL包含CD3ζ链(例如，2条所述链)。在一个实施例中，(a)的链包含人胞外CD3结构域(例如，CD3δ结构域)。在一个实施例中，CAL包含以下的复合物：一条CD3δ链、2条CD3ε链、一条CD3γ链和两条CD3ζ链，其中所述链中的至少一条(例如，全部CD3ζ链)包含各个所述胞内信号传导结构域，其不是CD3结构域(例如，4-1BB和/或CD28胞内信号传导结构域)。CAL可例如包含天然存在的CD3链复合物，包括CD3γ、δ、ε和ζ链的复合物，但其中其一条或多条链(例如，其一条或多条ζ链或δ链)包含所述非CD3胞内信号传导结构域(例如，4-1BB或CD28胞内信号传导结构域)。
[0893] 一方面，本发明提供了一种工程改造的CD3ζ链，其包含一个或多个不为CD3结构域的胞内信号传导结构域(例如，各自为4-1BB和/或CD28胞内信号传导结构域)。举例来说，每个非CD3结构域选自由以下组成的组：CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域和CD16结构域，例如，包括CD28胞内信号传导结构域和胞内信号传导4-1BB结构域。任选地，CD3ζ链包含CD3(例如CD3δ或CD3ε)胞外结构域或CD16(例如CD16A)胞外结构域。胞外结构域可为人结构域。
[0894] 在一个实施例中，所有CD3链或结构域都是人的，例如，来源于相同的人基因组(例如，患者或CAL的预期接受者的基因组)，例如，来源于人供体细胞或组织(例如，骨髓或造血干细胞样品)。
[0895] 在一个实施例中，本发明的CAL是由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL细胞)膜所包含。
[0896] 2.概念1的CAL，其中CD3胞外结构域为人CD3胞外结构域。
[0897] 3.概念1或2的CAL，其包含一个或多个其它胞内信号传导结构域，各自选自由以下组成的组：CD27结构域、CD28结构域、ICOS结构域、OX40结构域、CD40结构域、4-1BB结构域、FcεRIγ结构域、CD64结构域和CD16结构域，例如包含CD28胞内信号传导结构域和胞内信号传导4-1BB结构域。
[0898] 在一个实施例中，工程改造的多肽(在N末端至C末端方向上)包含所述CD3ζ胞内信号传导结构域和一个或多个所述其它胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28)。
[0899] 在一个实施例中，工程改造的多肽(在N末端至C末端方向上)包含一个或多个所述其它胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28)和所述CD3ζ胞内信号传导结构域。
[0900] 在一个实施例中，工程改造的多肽(在N末端至C末端方向上)包含所述其它胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28)、所述CD3ζ胞内信号传导结构域和一个或多个所述其它胞内信号传导结构域(例如，4-1BB和/或CD28)。
[0901] 4.一种嵌合抗原配体(CAL)-免疫细胞(例如，人T细胞、NK细胞或TIL细胞)，其中所述细胞表达根据概念1至3中任一个的CAL。
[0902] 5.一种核酸，其编码根据概念1至3中任一个的CAL。
[0903] 6.一种产生CAL的方法，所述方法包括在细胞(例如，人T细胞、NK细胞或TIL细胞)中表达根据概念1至3中任一个的CAL。
[0904] 在本发明的某些方面中，桥连剂为能够结合第一靶抗原(例如，在癌细胞上表达的TAA，例如CD19)并且也能结合第二靶抗原(其由人或可施用桥连剂的患者的细胞天然地表面表达)的多特异性试剂。在此情况下，例如其中细胞是免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL细胞)，桥连剂当不结合至本发明的CAL-免疫细胞时能够结合人或所述患者的野生型(即内源性)免疫细胞。例如，桥连剂能够结合CD3胞外结构域(例如，CD3δ胞外结构域)，其中桥连剂当结合至本发明的CAL-免疫细胞的胞外结构域(第二靶抗原)时能够触发胞内信号传导，或替代地，当结合至患者的内源性T细胞时，桥连剂能够触发内源性T细胞中的胞内信号传导。例如，桥连剂可为BiTETM。例如，桥连剂是博纳吐单抗或卡妥索单抗。因此，在本发明的这些方面中，本发明有利地包括两种在已施用CAL-免疫细胞(例如T细胞)的患者中触发免疫细胞信号传导的方式。
[0905] 实施例
[0906] 实施例1：结构域变异的分析
[0907] 基于来自Ensembl的信息，对人免疫细胞蛋白质和结构域中天然存在的变异进行分析。这提供了信息以有助于工程改造的蛋白质(例如CAR或CAL)与人细胞、接受者或供体人之间有目的的SNP和氨基酸变异匹配。根据本发明的这种匹配的益处在上文中更详细地论述。本发明人鉴别了以下非同义SNP变异，这在本发明中具有效用。
[0908] (a)人CD3变异
[0909] 表1：所选的人CD3-γ变异
[0910]
[0911] *参考转录物ENST00000532917的产物
[0912] 表2：所选的人CD3-δ变异
[0913]
[0914] *参考转录物ENST00000300692的产物
[0915] 表3：所选的人CD3-ε变异
[0916]
[0917]
[0918] *参考转录物ENST00000361763的产物
[0919] 表4：所选的人CD3η变异
[0920] CD3-η：Uniprot P20963
[0921]
[0922]
[0923]
[0924] 位置参考以下，其氨基酸和核苷酸序列以引用的方式并入本文。
[0925]
[0926]
[0927] 表5:CD3-η拓扑结构
[0928]
[0929] *参考Ensembl转录物ID ENST00000392122及由Uniprot编号P20963所鉴别的蛋白质，其序列以引用的方式整体并入本文。
[0930] 以下位置是在T细胞受体触发之后被磷酸化：S58、Y64、Y72、Y83、Y111、Y123、Y142和Y153。粗体＝ITAM残基：在本发明的一个优选实施方案中，工程改造的蛋白质CAR或CAL的CD3-ζ信号传导结构域至少包含Y72和Y152，且优选所有6个酪氨酸。
[0931] ITAM(各自29个氨基酸)
[0932] 位置61-89(位置参考SEQ ID NO:7)
[0933] APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR
[0934] 位置100-128
[0935] PQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM
[0936] 位置131-159
[0937] ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
[0938] 参考Ensembl转录物编号ENST00000392122的蛋白质产物中的位置编号：-
[0939] 本发明人鉴别了以下变体位置用于根据本发明的这一个或多个的潜在匹配(编号根据SEQ ID NO:7中的位置)。
[0940] R52、S56、A59、A61、P62、A63、Q66、G67、N69、Q70、Y72、N73、R79、E82、D84、V85、D87、K88、R90、R92、D93、M96、G97、P100、R102、R103、K104、N105、E107、L109、A119、A121、M127、K128、E130、R131、R132、K135、G136、G139、L144、A147、T151、Y152、A154、L155、A159、P162和R163。
[0941] 在此基础上，本发明人鉴别了一种通用的人CD3-ζ胞内结构域构架，其中某些位置是恒定的以便于与大部分人患者和人细胞的通用相容性并且保留ITAM酪氨酸以用于胞内信号传导级联。在这方面，参见SEQ ID NO:9，其示出了本发明的通用CD3-ζ构架胞内结构域(其中X＝任何氨基酸)。本发明因此提供了包含胞内CD3-ζ结构域的工程改造的蛋白质CAR或CAL，所述结构域包含SEQ ID NO:9。在一个实施例中，工程改造的蛋白质CAR或CAL是由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗人的疾病或病状(例如，如本文所公开的)或降低其风险的方法，所述方法包括向所述人施用免疫细胞(例如CAR-细胞或CAL-细胞)，其中所述人包含编码SEQ ID NO:9的CD3-ζ胞内结构域核苷酸序列。因此，所述蛋白质(例如CAR或CAL)关于与患者的相容性是匹配的。
[0942] (b)人CD28变异
[0943] CD28(分化簇28；Uniprot P10747)是在T细胞上表达的提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号的蛋白质中的一种。通过CD28和T细胞受体(TCR)的T细胞刺激可提供用于产生各种白介素(特别是IL-6)的有效信号。CD28是用于CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。
[0944] 拓扑结构：
[0945] 跨膜＝位置153-179；
[0946] 胞内结构域＝位置180-220
[0947] (位置编号参考SEQ ID NO:13)。
[0948] CD28具有含有若干个对其有效信号传导来说关键的残基的胞内结构域。从酪氨酸170开始的YMNM基序对于募集含有SH2-结构域的蛋白质(特别是PI3K、Grb2和Gads)尤其关键。Y170残基对于经由mTOR诱导Bcl-xL及经由PKCθ增加IL-2转录很重要，但对增殖没有作用并且造成IL-2产生的稍微减少。N172残基(作为YMNM的一部分)对于Grb2和Gads的结合很重要并且似乎能够诱导IL-2mRNA稳定性，而不是NF-κB易位。NF-κB的诱导似乎更加依赖于Gads与YMNM及两个富脯胺酸基序在分子内的结合。然而，基序的最后一个氨基酸M173(其不能结合PI3K，但能够结合Grb2和Gads)的突变产生极少的NF-κB或IL-2，提示那些Grb2和Gads不能弥补PI3K的损失。IL-2转录似乎具有两个阶段：Y170-依赖性、PI3K-依赖性初始阶段，其容许转录；和PI3K非依赖性第二阶段，其依赖于免疫突触的形成，由此造成IL-2mRNA稳定性的提高。两者都是IL-2的全规模生产所需的。
[0949] CD28还含有两个能够结合含SH3的蛋白质的富脯胺酸基序。Itk和Tec能够结合至紧继Y170YMNM之后的这两个基序的N末端；Lck结合C末端。Itk和Lck都能够磷酸化酪氨酸残基，由此容许含有SH2的蛋白质与CD28的结合。Tec与CD28的结合增加IL-2产生，这依赖于其SH3和PH结构域分别与CD28和PIP3的结合。CD28中的C末端富脯胺酸基序对于使Lck和脂质筏经由细丝蛋白-A进入免疫突触中来说很重要。C末端基序内两个脯胺酸的突变减少了增殖和IL-2的产生，但正常诱导Bcl-xL。PYAP基序内酪氨酸的磷酸化(在成熟人类CD28中的Y191)形成用于src激酶Lck的SH2结构域的高亲和力结合位点，其又结合至丝氨酸激酶PKC-θ。
[0950] 基于此及天然的SNP非同义变异分析，本发明人鉴别了一种通用的人CD28胞内结构域构架，其中某些位置是恒定的以便于与大部分人患者和人细胞的通用相容性并且保留保守的YMNM和PYAP酪氨酸以用于胞内信号传导级联。在这方面，参见SEQ ID NO:15，其示出了本发明的通用CD28构架胞内结构域(其中X＝任何氨基酸)。本发明因此提供了包含胞内CD28结构域的工程改造的蛋白质(例如CAR或CAL)，所述结构域包含SEQ ID NO:15。在一个实施例中，所述蛋白质(例如CAR或CAL)由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗人的疾病或病状(例如，如本文所公开的)或降低其风险的方法，所述方法包括向所述人施用免疫细胞(例如CAR-细胞或CAL-细胞)，其中所述人包含编码SEQ ID NO:15的CD28胞内结构域核苷酸序列。因此，所述蛋白质CAR或CAL关于与患者的相容性是匹配的。
[0951] 表6：所选的人CD28变异
[0952] 跨膜变异
[0953]
[0954]
[0955] 胞内结构域变异
[0956]
[0957]
[0958] *YMNM基序的一部分
[0959] **PYAP基序的一部分
[0960] (c)人4-1BB变异
[0961] CD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。其替代名称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、4-1BB，并且通过淋巴细胞活化(ILA)而诱导。它目前作为共刺激免疫检查点分子受到免疫学家的关注。CD137的最充分表征的活性是其对于活化的T细胞的共刺激活性。CD137的交联提高T细胞增殖、IL-2分泌存活及细胞溶解活性。此外，其可增强免疫活性以消除小鼠中的肿瘤。
[0962] Ensembl转录物：ENST00000615230
[0963] 拓扑结构：跨膜：187–213
[0964] 胞内结构域：214–255
[0965] (位置编号根据SEQ ID NO:16)
[0966] 表7：所选的人4-1BB(CD137)变异
[0967] 胞内结构域变异
[0968]
[0969]
[0970] *TRAF2结合位点
[0971] 参考：Mol Cells.2001年12月31日；12(3):304-12；“A novel leucine-rich repeat protein(LRR-1):potential involvement in 4-1BB-mediated signal transduction”；Jang LK等人，其解释了一旦T细胞受体复合物与结合至MHC的抗原接合，4-1BB(即肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一个成员)便在CD4+和CD8+T细胞上被诱导。4-1BB在T细胞活化期间传送共刺激信号中起重要作用。然而，对4-1BB介导的信号传导途径进行了研究。作者进行了酵母双杂交筛选以鉴别与4-1BB有关的胞内信号传导分子。发现含有富亮氨酸重复(LRR)的新型蛋白质(称为LRR-1)特异性地与4-1BB的胞质结构域相互作用。LRR-1的过度表达抑制由4-1BB或TNF受体相关因子(TRAF)2所诱导的NF-KB的活化。另外，LRR-1下调由4-1BB所诱导的JNK1活性。作者推断，这些结果表明LRR-1负调节4-1BB介导的信号传导级联，这造成了NF-κB和JNK1的活化。
[0972] 还参考：Mol Cell Biol.1998年1月；18(1):558–565；“4-1BB and Ox40Are Members of a Tumor Necrosis Factor(TNF)-Nerve Growth Factor Receptor Subfamily That Bind TNF Receptor-Associated Factors and Activate Nuclear FactorκB”；Robert Arch&Craig Thompson，其解释了在4-1BB和OX40的胞质尾部中的TRAF结合结构域在物种之间是保守的。(A)4-1BB和Ox40的胞质结构域的蛋白质序列的比对。对显示对于TRAF分子与任一受体的相互作用很重要的氨基酸残基进行了研究。在此报告中，作者证明4-1BB和OX40(TNF-NGF受体家族的两个成员)可使用TRAF分子触发胞质信号传导级联。此报告描述了TNF-NGF受体家族的两个成员(4-1BB和Ox40)的胞质结构域结合至胞内衔接分子的TRAF家族的蛋白质的能力。4-1BB和Ox40的胞质结构域在转染细胞中的多聚化可以TRAF依赖性方式激活转录因子NF-κB。有趣的是，单个TRAF蛋白的增加的表达可以积极或消极地影响这些受体诱导NF-κB活化的能力。这些数据表明单个TRAF蛋白的差异结合亲和力和相对丰度可能影响针对受体交联的细胞反应。这些结果提供了关于当TNF-NGF受体家族的成员在活化的T细胞上交联时观察到的可变效应的可能解释。
[0973] 本发明人因此认识到对于在工程改造的蛋白质(例如CAR和CAL)的实施方案中使用的4-1BB胞内结构域中的保守TRAF结合位点的需要以及根据本发明的匹配的需要以使得工程改造的蛋白质(例如CAR或CAL)结构域与带有嵌合受体的人免疫细胞的胞内机构的使用相匹配。本发明因此提供了包含此的本发明的工程改造跨膜蛋白(CAR或CAL)或免疫细胞，其中所述蛋白质包含含有Q236和E247的胞内4-1BB结构域(例如，包含Q236-E237-E238-D239和247E-248E-249E-250E，其中位置编号参考SEQ ID NO:16)。
[0974] 基于SNP和变异分析，本发明人鉴别了一种通用的人4-1BB胞内结构域构架，其中某些位置是恒定的以便于与大部分人患者和人细胞的通用相容性并且保留TRAF结合残基以用于胞内信号传导级联。在这方面，参见SEQ ID NO:18，其示出了本发明的通用4-1BB构架胞内结构域(其中X＝任何氨基酸)。本发明因此提供了包含含有SEQ ID NO:18的胞内4-1BB结构域的工程改造的蛋白质CAR或CAL。
[0975] 在一个实施例中，工程改造的蛋白质CAR或CAL由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)表达。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗人的疾病或病状(例如，如本文所公开的)或降低其风险的方法，所述方法包括向所述人施用免疫细胞、CAR-细胞或CAL-细胞，其中所述人包含含有Q236和E247(例如，包含Q236-E237-E238-D239和247E-248E-249E-250E，其中位置编号参考SEQ ID NO:16)或含有SEQ ID NO:16的4-1BB胞内结构域核苷酸序列。因此，所述蛋白质(CAR或CAL)关于与人细胞或患者的相容性是匹配的。
[0976] 实施例2：通过博纳吐单抗的CD3δ-CAL T细胞调控
[0977] WO2015/058018的实施例中所公开的方法可容易适用于将编码CAL的转基因插入到免疫细胞中(代替如那个专利申请中所公开的编码CAR的转基因)。
[0978] CAL转基因将包含编码(在N末端至C末端方向上)本文的SEQ ID NO:4的人CD3δ胞外结构域、CD8α铰链和跨膜结构域、4-1BB胞内结构域和CD3ζ结构域的核苷酸序列。适合地，CAL序列可为WO2015/058018的CD16F-BB-ζ或CD16V-BB-ζ构建体的修饰，其中用CD3δ结构域序列代替CD16序列。转基因将被插入从患有B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的人供体获得的细胞中，并且工程改造的T细胞群将离体发育并扩增。CAL和转基因在胞外和胞内CAL CD3和4-1BB结构域中是氨基酸多态性匹配的。任选地，内源性CD3δ和/或CD3ζ基因将在工程改造细胞中例如使用基因的Cas9靶向失活而被敲除。另外，内源性TCR基因座可关于TCR表达表现出失活。
[0979] 在一个试验中，工程改造的CAL T细胞将被输注回供体中，然后施用作为桥连剂的博纳吐单抗。CAL-细胞与CD19+B细胞的桥连将导致活化的CAL T细胞在体内对癌细胞的杀伤，由此治疗供体中的ALL。
[0980] 在另一试验中，CAL T细胞将在输注到供体中之前与博纳吐单抗预孵育。
[0981] 将对供体进行监测并对博纳吐单抗进行滴定以调节CAL T细胞活性。
[0982] 表8：序列
[0983]
[0984]
[0985]
[0986]
[0987]
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