一种潮汐式生物反应器及其培养百合籽球的方法
专利汇可以提供一种潮汐式生物反应器及其培养百合籽球的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 创新性的利用潮汐式 生物 反应器 来快速繁殖百合移栽小籽球，通过将常规固体繁殖培养基中培养生长到直径0.2～0.4cm百合小籽球作为外植体接入到潮汐式生物反应器中，在50天的培养过程中替换液体培养基配方，并通过添加药品控制污染，逐步进行籽球膨大与生根，籽球出瓶后，按照常规百合籽球春化、移栽、种植方法进行管理。本发明通过逐步进行籽球膨大和生根培养，可简化组培程序，极大的减少常规固体组织培养中的人工成本，并可有效控制污染与变异株的产生，缩短了百合繁育周期，节约了生产成本，能将百合新品种的优良性状快速固定并保持下来，解决了常规百合繁育体系生产的籽球繁育速度慢，种源混杂，籽球 质量 不稳定的难题。，下面是一种潮汐式生物反应器及其培养百合籽球的方法专利的具体信息内容。
1.一种潮汐式生物反应器，其特征在于包括营养液储存容器、培养容器、抽气泵、定时器、空气过滤膜、节水阀和加液过滤器，营养液储存容器与培养容器通过安装有节水阀的导管相连，所述的营养液储存容器和培养容器各自分别通过安装有空气过滤膜的导管与对应的抽气泵相连，所述的抽气泵与定时器相连，所述的培养容器中设有与底面平行的金属纱网，所述的在营养液储存容器与抽气泵之间的导管上设有加液过滤器。
2.基于权利要求1所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于包括如下步骤：
A. 将百合籽球中层及内层鳞片作为外植体接入培养基中，1L的培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.0～0.1mg/L
6-苄基腺嘌呤 1.0～1.5mg/L
蔗糖 30～60g/L
琼脂糖 6g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得培养基；
在光照强度为2000～2500lx，温度为25±2℃，光照时间为12～14h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.2～0.4cm的小籽球，切下得百合小籽球；
B．在无菌环境下将下列籽球膨大培养基灌入营养液储存容器中：1L的籽球膨大培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.1～0.2mg/L
6-苄基腺嘌呤 0.5～1.0mg/L
蔗糖 45～60g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得籽球膨大培养基；
C. 将A步骤培养得到的百合小籽球作为外植体，在无菌环境下置于培养容器中的金属纱网上；
D．设置潮汐培养程序：每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，控制温度为
25±2℃；每天在光照强度为2000～2500 lx的条件下进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每10～15天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；
E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以下列生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时浸没10分钟，每10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；
所述的1L的生根培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.00～0.05mg/L
蔗糖 45～60g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得生根培养基；
F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，用百合基质包装，在-1℃冷库春化85～90天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球。
3.根据权利要求2所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于A步骤中诱导和增殖培养时间为2.5～3.0个月。
4.根据权利要求2所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于A步骤所得小籽球是在超净工作台中切下的。
5.根据权利要求2所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于在潮汐培养过程中，每天进行观察，如出现轻微污染，立即通过加液过滤器加入含有1‰～5‰ppm微生物生长抑制剂的液体培养基，并培养2～3天后再换回原来的培养基继续进行培养。
6.根据权利要求2所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于所述步骤A的百合外植体通过下列常规方法获得：选择周径16～18cm的健康生长的百合籽球，剥去外层及有斑点、虫洞的鳞片，将百合籽球鳞片分开，先用洗衣粉水清洗，后用清水冲洗干净，在超净环境下用质量浓度为75%的酒精擦拭材料两遍后，先放入质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒15min；之后用无菌水冲洗3次，每次1min，即获得百合外植体，所述的混合液为每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有5滴吐温-20。
一种潮汐式生物反应器及其培养百合籽球的方法
技术领域
背景技术
发明内容
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.0～0.1mg/L
6-苄基腺嘌呤 1.0～1.5mg/L
蔗糖 30～60g/L
琼脂糖 6g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得培养基；
在光照强度为2000～2500lx，温度为25±2℃，光照时间为12～14h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.2～0.4cm的小籽球，切下得百合小籽球；
B．在无菌环境下将下列籽球膨大培养基灌入营养液储存容器中：1L的籽球膨大培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.1～0.2mg/L
6-苄基腺嘌呤 0.5～1.0mg/L
蔗糖 45～60g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得籽球膨大培养基；
C. 将A步骤培养得到的百合小籽球作为外植体，在无菌环境下置于培养容器中的金属纱网上；
D．设置潮汐培养程序：每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，控制温度为
25±2℃；每天在光照强度为2000～2500 lx的条件下进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每10～15天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；
E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以下列生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时浸没10分钟，每10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；
所述的1L的生根培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.00～0.05mg/L
蔗糖 45～60g/L
去离子水 余量
pH 5.8～6.0；
将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8～6.0即得生根培养基；
F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，用百合基质包装，在-1℃冷库春化85～90天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球。
（2）培养速度快，潮汐式生物反应器技术百合籽球膨大阶段30天，生根阶段20天，较常规固体培养基培养膨大阶段80～90天，本发明生根阶段40～45天大大缩短；
（3）繁殖效率高，较常规固体培养基培养百合籽球，通常每瓶8～10个籽球，潮汐式生物反应器每批100个籽球，繁殖效率大大提高；
（4）在轻微污染时，通过潮汐式生物反应器加液过滤器加入微生物生长抑制剂，可有效控制液体培养过程中污染严重问题；
（5）节省大量的人力物力，潮汐式生物反应器培养百合籽球，从外植体接入到籽球出瓶，共需人工转接2次，且转接方法简便，常规固体培养基培养，由于愈伤组织丛生，转接较困难，且次数繁多，通常从外植体接入到籽球出瓶，共需人工转接4～5次，每次转接需重新配置固体培养基，从而浪费大量的人力物力；
（6）解决了常规繁育体系生产的种苗亲本来源复杂，籽球质量不稳定的难题，通过本发明，使籽球状稳定，籽球来源单一，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了籽球质量，可为市场提供统一标准的优良百合籽球；
（7）籽球田间栽培成活率较高；由于潮汐式生物反应器瓶内相对湿度远小于常规固体培养基，籽球生长环境更接近于自然环境，出瓶籽球炼苗成活率更高；
（8）本发明在外植体的选择方面，选择优良株系，通过本发明中的快速繁殖方法将抗性强的百合品种优良种性快速地固定并保持下来，有效缩短了繁育周期。
附图说明
图3是本发明潮汐式生物反应器不浸泡培养时的结构示意图；
其中，1-培养容器，2-营养液储存容器，3-抽气泵，4-定时器，5-空气过滤膜，6-节水阀，7-加液过滤器，8-金属纱网。
具体实施方式
1，即可进行浸泡培养；当不需要浸泡时，关闭与培养容器1相连的抽气泵3，打开与营养液储存容器2相连的抽气泵3，则培养基从培养容器1抽到营养液储存容器2中，如此即可完成潮汐式培养。
100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有5滴吐温-20，得到百合外植体，将百合外植体接入下列培养基中：1L的培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
6-苄基腺嘌呤 1.0mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂糖 6g/L
去离子水 余量
pH 5.8；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.8即得；
在光照强度为2000lx，温度为23℃，光照时间为12h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.2cm的小籽球，培养时间为2.5个月，超净工作台上切下小籽球；
B．按下述籽球膨大培养基配方配置籽球膨大培养基，在无菌环境下灌入营养液储存容器2中，1L的籽球膨大培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.1mg/L
6-苄基腺嘌呤 0.5mg/L
蔗糖 45g/L
去离子水 余量
pH 5.8；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.8即得籽球膨大培养基；
C. 将A步骤培养得到的百合小籽球100粒作为外植体在无菌环境下接入培养容器1中，即置于金属纱网8上；
D．设置潮汐培养程序：每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，放置于温度为23℃；每天在照强度为2000lx的条件下进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；
潮汐培养30天，每10天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；
E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以下列生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时潮汐浸没10分钟，每
10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；
所述的1L的生根培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
蔗糖 45g/L
去离子水 余量
pH 5.8；
将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.8即得生根培养基；
F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中消毒1min后，用百合基质包装，在-1℃冷库春化85天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球；
在潮汐培养过程中，每天进行观察，如出现轻微污染，立即通过加液过滤器7加入含有
1‰ppm微生物生长抑制剂的液体培养基，并培养2天后再换回原来的培养基继续进行培养。
100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有5滴吐温-20，得到百合外植体，将百合外植体接入下列培养基中：1L的培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.1mg/L
6-苄基腺嘌呤 1.5mg/L
蔗糖 60g/L
琼脂糖 6g/L
去离子水 余量
pH 6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为6.0即得；
在光照强度为2500lx，温度为27℃，光照时间为14h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.4cm的小籽球，培养时间为3.0个月，超净工作台上切下小籽球；
B．按下述籽球膨大培养基配方配置籽球膨大培养基，在无菌环境下灌入营养液储存容器2中，1L的籽球膨大培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.2mg/L
6-苄基腺嘌呤 1.0mg/L
蔗糖 60g/L
去离子水 余量
pH 6.0；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为6.0即得籽球膨大培养基；
C. 将A步骤培养得到的百合小籽球100粒作为外植体在无菌环境下接入培养容器1中，置于金属纱网8上；
D．设置潮汐培养程序：每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，放置于温度为27℃；每天在照强度为2500 lx的培养室进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每15天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；
E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时潮汐浸没10分钟，每10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；
所述的1L的生根培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.05mg/L
蔗糖 60g/L
去离子水 余量
pH 6.0；
将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为6.0即得生根培养基；
F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.2%的多菌灵溶液中消毒2min后，用百合基质包装，在-1℃冷库春化90天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球；
在潮汐培养过程中，每天进行观察，如出现轻微污染，立即通过加液过滤器7加入含有
5‰ppm微生物生长抑制剂的液体培养基，并培养3天后再换回原来的培养基继续进行培养。
100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有5滴吐温-20，得到百合外植体，将百合外植体接入下列培养基中：1L的培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.05mg/L
6-苄基腺嘌呤 1.25mg/L
蔗糖 48g/L
琼脂糖 6g/L
去离子水 余量
pH 5.9；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.9即得；
在光照强度为2300lx，温度为25℃，光照时间为13h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.28cm的小籽球，培养时间为2.8个月，超净工作台上切下小籽球；
B．按下述籽球膨大培养基配方配置籽球膨大培养基，在无菌环境下灌入营养液储存容器2中，1L的籽球膨大培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.13mg/L
6-苄基腺嘌呤 0.78mg/L
蔗糖 52g/L
去离子水 余量
pH 5.9；
将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.9即得籽球膨大培养基；
C. 将A步骤培养得到的百合小籽球100粒作为外植体在无菌环境下接入培养容器1中，置于金属纱网8上；
D．设置潮汐培养程序：每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，放置于温度为24℃；每天在照强度为2400 lx的培养室进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每13天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；
E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时潮汐浸没10分钟，每10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；
所述的1L的生根培养基含有如下组分：
MS培养基 4.4g
萘乙酸 0.03mg/L
蔗糖 52g/L
去离子水 余量
pH 5.85；
将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀后，并调节pH为5.85即得生根培养基；
F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.16%的多菌灵溶液中消毒
1.5min后，用百合基质包装，在-1℃冷库春化88天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球；
在潮汐培养过程中，每天进行观察，如出现轻微污染，立即通过加液过滤器8加入含有
3‰ppm微生物生长抑制剂的液体培养基，并培养2.5天后再换回原来的培养基继续进行培养。
籽球鲜重（g） 2.0 2.0 2.2
籽球直径（cm） 1.0 1.15 1.25
出瓶时间（天） 365 125 125
籽球成活率（%） 75 53 92
畸形比率（%） 1.4 2.0 1.2
生根率（%） 95 85 93
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