技术领域
[0001] 本
发明涉及超快时间分辨中红外光谱测量领域，尤其是涉及一种中红外光谱仪。
背景技术
[0002]
蛋白质科学是21世纪人类科学发展最快也是最热
门的科学。红外光谱技术由于其包含有大量的物质结构信息，已经被广泛的应用于蛋白质科学研究。目前，采用红外光谱技术研究蛋白质的结构变化主要有两个领域：蛋白质的稳态结构变化及蛋白质的动态结构变化。红外光谱技术研究蛋白质的稳态结构变化主要依赖于傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)。它可以给出蛋白质的基本结构信息，但无法给出蛋白质的动态结构信息。
[0003] 为了研究蛋白质的动态结构变化，人们发展了反应-停留法，脉冲升温法和激光诱导化学反应的方法用于引发蛋白质的结构变化。反应-停留法具有至少微秒量级的死时间，很难达到纳秒量级的时间分辨。而激光诱导化学反应的方法，需要在蛋白溶液中加入用于激
光激发的物质，对蛋白质有一定损伤。而激光脉冲升温法因为只加热蛋白质溶液而对蛋白质几乎没有损伤，成为了诱导蛋白质变化的较具优势的方法。受限于激光技术，当前快速升温时间分辨红外光谱技术，多采用调Q Nd:YAG
激光器输出的1064nm激光经过高压氢气池产生1900nm的激光的方法来产生重
水升温的脉冲源。这种方法由于需要经过一个
拉曼频移的非线性过程，导致所产生的1900nm的激光，光斑
质量比较差，且空间抖动非常大，系统的长期工作
稳定性也较差。
发明内容
[0004] 本发明的目的旨在提供一种可以利用脉冲升温实现纳秒时间分辨的中红外光谱仪，可以实现高
精度的蛋白质二级结构动态变化的测量。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种中红外光谱仪，用于测量蛋白质的动态结构变化，该中红外光谱仪包括：宽频可调谐一
氧化
碳激光器，用于向待测蛋白质溶液发出中红外探测激光；纳秒调Q钬激光器，用于发出
泵浦激光以加热待测蛋白质溶液；泵浦探测光路系统，用于探测透过待测蛋白质溶液后的中红外探测激光的强度；以及
数据采集系统，用来采集来自泵浦探测光路系统所探测的强度的数据；纳秒调Q钬激光器发出的泵浦激光形成在样品池上的光斑直径为2mm。
[0006] 进一步地，泵浦探测光路系统包括依次设置的光路部分、探测器、
放大器和
滤波器。
[0007] 进一步地，探测器为液氮制冷型高速碲镉汞探测器；放大器为DC-100MHz放大器。
[0008] 进一步地，宽频可调谐
一氧化碳激光器的输出
波长为5.2μm～6.2μm。
[0009] 进一步地，调Q钬激光器的输出脉宽为50ns，输出波长为2080nm。
[0010] 进一步地，该中红外光谱仪还包括用于放置待测蛋白质溶液的样品池，样品池具有用于放置参比样重水的第一区域和用于放置含待测蛋白质溶液的重水溶液的第二区域。
[0011] 进一步地，样品池为旋转式结构，并通过其旋转使得第一区域和第二区域均能接收到宽频可调谐一氧化碳激光器发出的中红外探测激光和纳秒调Q钬激光器发出的泵浦激光。
[0012] 宽频可调谐一氧化碳激光器发出的中红外探测激光形成在样品池上的光斑直径为0.4mm。
[0013] 进一步地，数据采集系统包括8位高速采集卡，最小分辨为0.36mV。
[0014] 进一步地，数据采集系统设置成以纳秒到秒时间量级的降
采样模式采集数据。
[0015] 本发明的有益效果：采用本发明提供的纳秒脉冲升温时间分辨中红外光谱仪，可以准确测量蛋白质动态结构变化的瞬态红外光谱数据和蛋白质动态结构变化的动
力学信息，其红外光谱数据精度可以达到1×10-4OD。其中，采用高稳定性低温流动式宽频可调谐一氧化碳激光器作为探测光探测蛋白质的二级结构信息，可以实现宽的中红外光谱测量，完全
覆盖蛋白质二级结构酰胺Ⅰ’的吸收。采用纳秒短脉冲调Q钬激光器，可以作为泵浦激光直接对含有蛋白质的重水溶液进行纳秒时间的升温，具有对重水溶液加热的纵向均匀、横向均匀以及长时间的稳定加热等优点。采用泵浦探测光路系统实现对样品的泵浦探测过程，具有操作方便且系统稳定，有效减少了杂散光等优势。采用数据采集系统实现纳秒时间到秒时间的高速数据采集。
[0016] 根据下文结合
附图对本发明具体
实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
[0017] 后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
[0018] 图1为本发明实施例中所采用的纳秒脉冲升温时间分辨中红外光谱仪的结构
框图；
[0019] 图2为本发明本发明实施例中所采用的高稳定性低温流动式宽频可调谐一氧化碳激光器的结构示意图；
[0020] 图3为本发明典型实施例的纳秒短脉冲调Q钬激光器的光学腔的结构示意图；
[0021] 图4为本发明实施例中采用降采样的方式数据采集的长时间结果示意图；
[0022] 图5为本发明实施例中瞬间升温时重水溶液在1645cm-1处的吸光度动态变化曲线示意图；
[0023] 图6为本发明实施例中瞬间升温时重水溶液和含细胞色素C蛋白重水溶液在1645cm-1处的吸光度动态变化曲线图；
[0024] 图7为本发明实施例中重水溶液在1645cm-1处的吸光度的动态精度示意图；
[0025] 图8为本发明实施例中瞬间升温时细胞色素C蛋白在1645cm-1处的吸光度动态变化示意图；以及
[0026] 图9为本发明实施例中瞬间升温2微秒之后的细胞色素C的瞬态光谱示意图。
具体实施方式
[0027] 如图1所示，本发明提供的利用脉冲升温可以实现纳秒时间分辨的中红外光谱仪主要包括宽频可调谐一氧化碳激光器10、纳秒短脉冲调Q钬激光器20、泵浦探测光路系统和数据采集系统40。本发明的中红外光谱仪可以准确测量蛋白质动态结构变化的瞬态红外光谱数据和蛋白质动态结构变化的动力学信息，其红外光谱数据精度可以达到1×10-4OD。
[0028] 下面分别对中红外光谱仪的各个组成部分进行详细介绍：
[0029] 高稳定性低温流动式宽频可调谐一氧化碳激光器10用于向待测蛋白质发出中红外探测激光，以探测待测蛋白质的二级结构信息，可以实现宽的中红外光谱测量，完全覆盖蛋白质二级结构的吸收。具体地，该宽频可调谐一氧化碳激光器10采用液氮冷却的含有固定配比的氦气、氮气、一氧化碳和氧气的混合气体作为激光介质，气体的配比根据所需波长范围的不同进行调节。如图2所示，工作时，经由
电子流量计混合好的气体进入
石英管通道。石英管通道连接石英螺旋管的一端为气体输入端，另一端为连接有
真空泵的出气端。由电子
阀控和
真空泵(图中未显示)来实现气体的稳定流动，工作时气压约为26.5torr。工作气体由液氮进行冷却。
[0030] 在探测蛋白结构变化方面，可以直接用于探测蛋白二级结构的红外激光器，主要有铅盐激光器和一氧化碳(CO)激光器及最近新出的量子级联激光器。相对于铅盐激光器和量子级联激光器而言，一氧化碳(CO)激光器10具有宽光谱输出，可以完全覆盖蛋白质的二级结构酰胺Ⅰ’带的红外
指征的优点。
[0031] 图2为高稳定性低温流动式宽频可调谐一氧化碳激光器的基本结构。该宽频可调谐一氧化碳激光器10采用双向高压电泵浦作为激光的激励方式。高压电泵浦的具体结构为：激光腔两端是
阳极，两个阳极共用中间的
阴极。阴阳极之间的
电压约为7KV。激光腔的一端为r＝5m的
镀金凹面镜，一端为电动控制转动光栅。光栅结合垂直于光栅表面放置的镀金平面镜及相应的光路设计可以实现在光栅转动过程中，输出激光的波长变化但输出激光的方向不发生变化。R＝5m的凹面金镜端镜，用于对红外光进行全反射。该凹面金镜装在一个可以电动微调的镜架上，以便于对激光的光腔进行微调。
[0032] 该激光器巧妙地采用了光栅作为激光器的输出镜。光栅的1级光返回到激光腔，0级光输出，输出效率约为10％。为了使输出光的方向不发生变化，在光学上进行了一些设计：将光栅与一片平面金镜垂直放置，并将二者固定在同一个转台上。光栅与平面金镜同时进行转动。光栅的转动所引起的光的方向的偏折由与其一起转动的平面金镜补偿回来，从而保证了光的出射方向不会发生变化。在本发明的一个实施例中，采用可以进行温控的瑛
钢管来保证激光器腔长的稳定。激光器的配气系统，光栅控制及高压控制都由labview程序控制电子学元件实现。
[0033] 采用本发明的高稳定性低温流动式宽频可调谐一氧化碳激光器10，具有如下性能：1)在1580cm-1～1980cm-1范围内输出
能量大于10mw；2)波长间隔约为4cm-1；3)短时间的稳定性为千分之一，说明可调谐一氧化碳激光器10的激光输出比较稳定；4)长时间的抖动＜20％，说明其工作气流及电压的长期稳定。
[0034] 纳秒短脉冲调Q钬激光器20可以作为泵浦光对含有蛋白质的重水溶液进行纳秒时间的升温，具有对重水溶液加热的纵向和横向均匀以及长时间的稳定加热等优点，可以直接对重水进行脉冲升温。图3为纳秒短脉冲调Q Ho激光器20光学腔的结构图。激光腔采用平平腔结构，一端为全反镜21，一端为输出效率为20％的输出耦合镜22。纳秒短脉冲调Q钬激光器采用掺杂有1.5％Cr，5.8％Tm，0.35％Ho元素的Cr，Tm，Ho:YAG晶体作为激光晶体23，
闪光灯24作为泵浦源。电光调Q晶体为：La3Ga5SiO14(LGS)晶体25，采用退压式调Q工作模式。起偏器为布儒斯特
角放置的一对氧化
铝(Al2O3)晶体26，用λ/4石英波片27来调制热退偏效应。闪光灯电源以及调Q晶体采用的电源(二者图中均无示出)均来源于商业采购。激光晶体的水冷由控温精度为0.1度的大功率水冷机(图中未示出)实现，工作时水冷机水冷
温度为9℃。采用水冷方式主要是因为纳秒短脉冲调Q Ho激光器的激光晶体23增益较低，必须较大的泵浦才能实现激光输出，激光晶体23工作时温度较高，且易形成热量聚集，必须精确控制其温度来保证激光工作的稳定。在本发明的一个实施例中，纳秒短脉冲调Q Ho激光器20的工作性能如下：工作
频率:3Hz，输出波长2080nm，输出脉宽：50ns，输出能量：20mj，能量稳定性:约为1％。
[0035] 在本发明的一个典型实施例中，还包括用于放置待测蛋白质的样品池50。该样品池可以采用一池双样的结构。也就是说样品池可以具有两个区域，用于放置参比样重水的第一区域51和用于放置含待测蛋白质的重水溶液的第二区域52。样品池优选为旋转式结构，这样可以通过样品池的旋转使得第一区域51和第二区域52均能接收到宽频可调谐一氧化碳激光器10发出的中红外探测激光和纳秒调Q钬激光器20发出的泵浦激光。样品池50的结构为：两
块氟化
钙的平片中间放置一个带有两个圆孔的聚四氟薄片，聚四氟薄片的厚度为50微米，从而实现样品的厚度为50微米。
[0036] 为了达到较高的瞬间升温幅度，将纳秒调Q Ho激光器20输出的激光通过透镜进行聚焦，控制纳秒短脉冲调Q激光在样品处的光斑大小为2mm。同时，为了让探测激光完全处于被加热的样品范围内，且处于温度相对稳定的区域，将探测光用短透镜进行聚焦，光斑直径控制在0.2mm。在本发明的一个优选实施例中，调Q钬激光器20发出的泵浦激光形成在样品池上的光斑直径为2mm，宽频可调谐一氧化碳激光器10发出的中红外探测激光形成在样品池50上的光斑直径为0.4mm。
[0037] 泵浦探测光路系统用于探测透过待测蛋白质溶液后的中红外探测激光的强度。采用泵浦探测光路系统实现对待测蛋白质样品的泵浦探测过程，其中，该泵浦探测光路系统中所采用的所有反射镜均为金镜32，所有透镜均为氟化钙透镜33，采用线栅31用来调节到达样品池50处的探测光能量。
[0038] 在本发明的一个优选实施例中，泵浦探测光路系统包括依次设置的光路部分、探测器34、放大器35和滤波器36。其中，探测器34用以探测透过待测蛋白质后的中红外探测激光的强度。探测器优选液氮制冷型高速碲镉汞探测器。放大器35用以对中红外探测激光的强度进行放大。放大器优选为DC-100MHz放大器。滤波器36用以对放大后的中红外探测激光的强度
信号进行过滤，滤除系统及空间的
电磁干扰，以得到所需频率的电学信号。
[0039] 采用数据采集系统40可以实现纳秒时间到秒时间的高速数据采集。为了实现纳秒到秒量级的数据采集，在本发明的一个优选实施例中，数据采集系统40采用了指数级的降采样技术，这样既能保证短时间动力学的高时间分辨精度，又能保证长时间的动力学数据采集。降采样数据采集长时间结果如图4所示。从图4中可以看出，采集系统在1毫秒以内的采集精度较高，可以得到详细的前期动力学变化信息，同时又实现了长达10毫秒的数据采集范围，可以粗略得到长时间的动态变化信息，同时又能保证数据采集的流畅。
[0040] 具体地，泵浦探测光路系统和数据采集系统40的工作模式如下：液氮制冷型高速碲镉汞探测器34输出的信号首先经过一个DC-100MHz的
电流-电压的放大器35放大，然后经过0～500MHz
低通滤波器36的滤波输入到NI5152型的采集卡(图中未显示)中，之后采用labview数据采集
软件实现纳秒-秒量级的数据采集并进入电脑中进行数据保存。
[0041] 综上，采用本发明所提供的纳秒脉冲升温时间分辨中红外光谱仪具有以下效果：1)可以实现宽的中红外光谱测量，完全覆盖蛋白质二级结构的吸收；2)可以得到高精度的瞬态红外光谱数据，测量精度可达到1×10-4OD；3)可以实现纳秒到秒量级的数据采集。
[0042] 下面结合对细胞色素C蛋白瞬态红外光谱的测量详细描述中红外光谱仪的运作过程。
[0043] 1)样品准备：采样一池双样样品池，并在其第一区域装上重水作为参比，第二区域装上溶有1％细胞色素c蛋白的重水溶液作为样品。
[0044] 2)实验条件：
基础温度25℃，Ho激光单脉冲能量17mj，温跳幅度约为11℃，探测光光斑直径小于100微米，泵浦光光斑直径约为1mm。
[0045] 3)将可调谐CO激光器的波长调节到想要测量的波长处：比如1645cm-1
波数处，分别对参比和样品进行纳秒脉冲升温实验。此时，随着脉冲对重水的瞬间升温，透过参比和样品的1645cm-1的激光能量会发生变化，利用labview采集程序调用NI数据采集卡采集透过参比和样品的激光能量随时间的变化，并换算成吸收强度(OD)值。采集到的参比和样品的信号如图5-9所示。
[0046] 其中，图5为重水在1645cm-1处的瞬态动力学信号两次的测量结果。图6为重水和样品在1645cm-1中的信号示意图，从图6中可以看出样品的信号要大于参比的信号。图7为两次重水的动力学信号之差，从图7中可以看出，本发明的中红外光谱仪的
信噪比已经达到10-4OD的精度。
[0047] 4)将得到的蛋白质在重水中的样品信号减去重水的信号就能得到1645cm-1处的细胞色素C蛋白在温度瞬间升高之后的变化动力学信息，如图8所示。从图8中可以看出温度瞬间升高时，细胞色素C在1645cm-1处的吸光度降低，并在温度稳定后达到稳定。
[0048] 5)然后改变可调谐CO激光器的输出波长，重复步骤3)和4)就能得到不同波数处的蛋白动力学信息。
[0049] 6)将步骤5)得到的不同波数处的动力学信息取加热脉冲来之后的同一时间比如2微秒处的值作图(例如，1645cm-1处为2.5×10-3OD)，就可以得到加热脉冲到达之后2微秒细胞色素C蛋白的瞬态红外光谱，如图9所示。从图9中可以看出瞬间升温之后，细胞色素C在1620cm-1-1645cm-1处的吸光度降低，在1662cm-1和1683cm-1处的吸光度上升，意味着细胞色素C在瞬间升温之后，亲水的螺旋结构(1620cm-1-1645cm-1)的消失以及无序结构(1662cm-1)和转角(1683cm-1)的生成。
[0050] 至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或
修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
