【技术领域】
[0001] 本
发明涉及香精香料分析领域，尤其涉及香精香料傅立叶变换离子回旋共振质谱指纹图谱分析方法。【背景技术】
[0002] 烟用香精香料具有改善
卷烟吸味品质，赋予卷烟特征香气的作用，是构成卷烟品牌
风格的重要因素，与卷烟产品的
质量稳定性密切相关。目前香精香料的质量主要通过理化指标(
乙醇、1，2-丙二醇、丙三醇、酸值、相对
密度、折光指数、挥发性成分总量)和感官指标(外观、溶混度、香气和
香味质量)两个环节来控制。上述方法具有检验周期长、仪器设备种类多、允差范围较大及人为判定不确定因素的影响等缺点，致使检验结果的重复性和可比性较差，不能准确反映香精香料的内在质量及其
波动，故很难准确把握香精香料质量的变化，需要建立一种科学、准确、快速的质量分析及评价方法。
[0003] 目前用于香精香料质量分析及评价的色谱指纹图谱分析方法有：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用技术。常用的气相色谱和液相色谱指纹图谱分析具有检验周期长、分析具有选择性，不能全面的表征烟用香精香料的特征组分，且指纹图谱相似度的分析多采用夹
角余弦法，夹角余弦法在计算色谱指纹图谱相似度时，对等比例变化和小峰的影响不敏感，存在一定的不足之处，不能准确反映香精香料的差异性。
[0004] 而普通质谱在分析香精香料样品时，需要一定的的样品前处理(萃取、浓缩、SPME等)后，才可以进行分析；需要经过特定的色谱柱，目标物在一定的色谱条件下才能达到分离，而是针对适合该色谱柱分离的物质才能分离，且分析时间一般比较长；样品在普通质谱中的分析，一次最多分析出一百多种物质。【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服
现有技术中存在的问题，提供一种香精香料傅立叶变换离子回旋共振质谱指纹图谱分析方法，样品前处理过程简单，可以全面有效的表征香精香料的指纹信息。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 包括以下步骤：
[0008] (1)将香精香料待测样品用
溶剂稀释得到待测样品溶液；
[0009] (2)通过直接进样方式，采用傅立叶变换离子回旋共振质谱分析待测样品溶液，采集表征不同香精香料的分子离子或准分子离子指纹信息，得到待测样品指纹谱图；
[0010] (3)建立香精香料标准样品的傅立叶变换离子回旋共振质谱标准谱库；
[0011] (4)根据步骤(2)获得的待测样品指纹谱图和步骤(3)获得的标准谱库，确定共有特征离子峰，根据共有特征离子峰的数量及共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应和在标准谱库中的响应，计算香精香料待测样品与香精香料标准样品的相似度匹配得分，根据相似度匹配度得分的高低判断香精香料待测样品质量的稳定性及差异性，完成香精香料傅立叶变换离子回旋共振质谱指纹图谱分析。
[0012] 进一步地，香精香料为烟用香精香料。
[0013] 进一步地，步骤(1)中的溶剂为甲醇或者体积分数为75～80％的甲醇
水溶液。
[0014] 进一步地，步骤(1)中香精香料待测样品用溶剂稀释1000倍。
[0015] 进一步地，步骤(3)具体包括：将香精香料标准样品按步骤(1)和步骤(2)处理后，获得香精香料标准样品谱图，在
信噪比阈值为4％，相对响应阈值为0.01％，绝对响应阈值为100的条件下，进行特征离子峰的标记，将经过标记的香精香料标准样品谱图添加到谱库，获得香精香料标准样品的傅立叶变换离子回旋共振质谱标准谱库。
[0016] 进一步地，傅立叶变换离子回旋共振质谱的检测器为ESI源。
[0017] 进一步地，傅立叶变换离子回旋共振质谱的分析条件中，流速：2.0μL/min，干燥气：4.0L/min，干燥气
温度：150～180℃，采集模式：宽带采集，质量范围：150～3000。
[0018] 进一步地，步骤(4)中相似度匹配得分计算公式如下：
[0019] F＝1000×[A2/(T×L)]；R＝1000×[A2/(U×r)]；P＝1000×[A2/(U×L)]；
[0020] 其中：F-正相似度匹配得分；R–反向相似度匹配得分；P–峰纯度得分；
[0021] A2＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应与在标准谱库中的响应乘积加和的平方；
[0022] T＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中响应平方的加合；
[0023] L＝标准谱库中所有特征离子峰响应平方的加合；
[0024] U＝待测样品指纹谱图中所有特征离子峰响应平方的加合；
[0025] r＝共有特征离子峰在标准谱库中响应平方的加合。
[0026] 进一步地，基准值为1000，在P值、F值和R值均不小于980时，香精香料待测样品质量合格。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0028] 本发明中采用傅立叶变换离子回旋共振质谱分析香精香料，傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)采用回旋共振方式来同时记录所有离子
信号，无需色谱柱分离，只需适当的对样品稀释后，直接进样分析，前处理简单；稀释的样品直接进样，全部样品进入离子源进行分析，一般采集20张
叠加谱图的时间小于40秒；一次可以分离出几千种物质，可以全面有效的表征香精香料的指纹信息，同时本发明所采用的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪的超高分辨能
力，避免了色谱峰的重叠现象，分析香精香料更准确。本发明对香精香料的指纹分析和质量差异性分析具有快速、准确的特点，对于香精香料的质量稳定性评价具有重要意义，同时对于降低香精香料的采购风险具有重要作用。【
附图说明】
[0029] 图1质荷比在381到388之间的放大谱图；
[0030] 图2质荷比为707.18800、707.19941和707.22851的分离效率；
[0031] 图3香料A的FT-ICR MS质谱表征图；
[0032] 图4香料B的FT-ICR MS质谱表征图；
[0033] 图5香精香料FT-ICR MS指纹图谱相似性比较分析。【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
[0035] 1.试验仪器：傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR MS)，检测器：ESI源。
[0036] 2.试验
试剂及耗材：色谱纯甲醇、超纯水、香精A、香料B(标准样品由华宝食用香精香料(上海)有限公司提供，不同批次样品由陕西中烟工业有限责任公司提供)、10mL移液枪、20μL移液枪、一次性移液枪头、20mL
螺纹口玻璃小瓶。
[0037] 3.仪器分析条件
[0038] 流速：2.0μL/min，干燥气：4.0L/min，干燥气温度：150～180℃，采集模式：宽带采集，质量范围：150～3000。
[0039] 4.处理步骤
[0040] (1)用10mL移液枪移取10mL甲醇于20mL螺纹口玻璃小瓶，再用20μL移液枪移取待测香精香料10μL，摇匀待测样品待分析；待测样品在甲醇中有沉淀物生成时，先用2～2.5mL的纯水溶解后，再加入7.5～8mL的甲醇摇匀待测样品待分析，也就是说，当香精香料能够完全溶于甲醇时，采用甲醇将香精香料待测样品稀释1000倍；当香精香料不能完全溶于甲醇时，采用体积分数75～80％的甲醇水溶液将香精香料待测样品稀释1000倍。
[0041] (2)用250μL
注射器移取150～200μL香精香料待测样品溶液装于质谱仪器上，采用直接进样方式，进行傅立叶变换离子回旋共振质谱分析，采集表征不同香精香料的分子离子或准分子离子指纹信息，得到待测样品指纹谱图。
[0042] (3)指纹标准谱库建立：将厂家提供的香精香料标准样品按步骤(1)进行稀释，然后按照步骤(2)进行傅立叶变换离子回旋共振质谱分析；对于傅立叶变换离子回旋共振质谱采集的香精香料标准样品谱图，应用DataAnalysis处理谱图，打开标准样品的谱图，在信噪比阈值为4％，相对响应阈值为0.01％，绝对响应阈值为100的条件下，进行特征离子峰的标记，应用谱图编辑功能，将经过峰标记的标准样品谱图添加到谱库，建立香精香料标准样品的傅立叶变换离子回旋共振质谱标准谱库，用作后续的比对分析。
[0043] (4)
数据处理：本发明的数据处理采用傅立叶变换离子回旋共振质谱指纹图谱相似度匹配得分结合统计分析判断香精香料的质量差异性。
[0044] 差异性分析：所获得的香精香料傅立叶变换离子回旋共振质谱待测样品指纹谱图，包含了待测样品的特征离子峰个数、特征离子峰响应等详细信息，可以全面的表征烟用香精香料的组成特征，根据待测样品和标准样品特征离子峰的数量及特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应和在标准谱库中的响应，计算待测样品的相似度匹配得分，根据匹配度得分的高低判断样品质量的稳定性及差异性。
[0045] 本发明的指纹图谱数据处理，既考虑了特征离子峰的数量，又考虑了特征离子峰的响应(待测谱图中的响应和标准谱库中的响应)，具体相似度匹配得分计算公式如下：
[0046] F＝1000×[A2/(T×L)]其中：F-正相似度匹配得分
[0047] A2＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应与在标准谱库中的响应乘积加和的平方；共有特征离子峰是指同时在待测样品指纹谱图中和标准谱库中具有响应；
[0048] T＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中响应平方的加合；
[0049] L＝标准谱库中所有特征离子峰响应平方的加合；
[0050] R＝1000×[A2/(U×r)]
[0051] 其中：R–反向相似度匹配得分
[0052] A2＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应与在标准谱库中的响应乘积加和的平方；
[0053] U＝待测样品指纹谱图中所有特征离子峰响应平方的加合；
[0054] r＝共有特征离子峰在标准谱库中响应平方的加合；
[0055] P＝1000×[A2/(U×L)]
[0056] 其中：P–峰纯度得分
[0057] A2＝共有特征离子峰在待测样品指纹谱图中的响应与在标准谱库中的响应乘积加和的平方；
[0058] U＝待测样品指纹谱图中所有特征离子峰响应平方的加合；
[0059] L＝标准谱库中所有特征离子峰响应平方的加合。
[0060] 5.结果与分析
[0061] 5.1香精香料的FT-ICR MS分辩率高的优势
[0062] 图1为质荷比在381到388之间的放大谱图，分离出了9个峰，图2为质荷比707.18800、707.19941和707.22851的分离效果，由图分析可知，FT-ICR MS分析技术比普通气质分析具有超高的
分辨率，避免了色谱图中重叠峰的现象。
[0063] 5.2香精香料的FT-ICR MS指纹信息采集分析
[0064] 图3为香精A的质谱图，图中的质荷比从150到3000之间采集了2646个峰，远远超过普通质谱的峰个数，指纹信息量至少是普通质谱的二三十倍，甚至百倍以上，说明FT-ICR MS分析香精香料具有全面性。
[0065] 图4为香料B的质谱图，图中的质荷比从150到3000之间采集了3212个峰，远远超过普通质谱的峰个数，指纹信息量至少是普通质谱的二三十倍，甚至百倍以上，说明FT-ICR MS分析香精香料具有全面性。
[0066] 5.3干燥气温度的确定
[0067] 试验对不同样品在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，考察干燥气温度对香精香料分析结果的影响。
[0068] 5.3.1含糖类样品
[0069] 含糖类样品以蜂蜜为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。在干燥气温度大于150℃时，随着干燥气温度的升高，样品匹配度越低，说明蜂蜜在测试时受干燥气温度的变化而变化。
[0070] 表1不同干燥气温度对蜂蜜分析结果的影响
[0071]
[0073] 有机酸类样品以十六酸为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。在干燥气温度大于180℃时，随着干燥气温度的升高，样品匹配度越低，说明十六酸在测试时受干燥气温度的变化而变化。
[0074] 表2不同干燥气温度对十六酸分析结果的影响
[0075]
[0076]
[0077] 5.3.3皂苷类样品
[0078] 皂苷类样品以甘草酊剂为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。在干燥气温度大于240℃时，随着干燥气温度的升高，样品匹配度越低，说明甘草酊剂在测试时受干燥气温度的变化而变化。
[0079] 表3不同干燥气温度对甘草酊剂分析结果的影响
[0080]
[0081] 5.3.4酯类样品
[0082] 酯类样品以
柠檬酸三丁酯为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。随着干燥气温度的升高，样品匹配度变化不明显，说明柠檬酸三丁酯在分析时不受干燥气温度变化的影响。
[0083] 表4不同干燥气温度对柠檬酸三丁酯分析结果的影响
[0084]
[0085] 5.3.5多酚类样品
[0086] 多酚类样品以
绿原酸为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。在干燥气温度大于150℃时，随着干燥气温度的升高，样品匹配度降低，说明绿原酸在分析时受干燥气温度变化的影响。
[0087] 表5不同干燥气温度对绿原酸分析结果的影响
[0088]
[0089] 5.3.6醇类样品
[0090] 醇类样品以薄荷醇为代表，在不同干燥气温度下，进行FT-ICR MS分析，结果表明，以150℃时的样品建库，其他温度测定结果与之匹配。在干燥气温度大于180℃时，随着干燥气温度的升高，样品匹配度降低，说明薄荷醇在分析时受干燥气温度变化的影响。
[0091] 表6不同干燥气温度对醇类分析结果的影响
[0092]
[0093] 香精香料样品在进行FT-ICR MS分析时，有些物质受干燥气温度的变化而变化，有些物质不受干燥气温度的变化而变化，通过上述分析，香精香料的FT-ICR MS分析，干燥气的温度选择过低，不利于溶剂的挥发，干燥气温度过度，有些物质会发生变化，依据上述分析，干燥气温度选择为150～180℃，最佳值150℃。
[0094] 5.4精密度和重复性
[0095] 实验对香精香料制备5个平行样，进行FT-ICRMS分析，相似度匹配得分结果见表7和表8。由表分析可知，香精香料的变异系数均小于1％，说明本发明方法的重复性较好，适于香精香料的分析。
[0096] 表7香精A的日内精密度
[0097]
[0098] 表8香料B的日精密度
[0099]
[0100] 5.5烟用香精香料指纹图谱的建立和结果分析
[0101] 对香精香料样品通过FT-ICR MS分析，应用DataAnalysis进行数据处理，建立香精香料的FT-ICR MS标准指纹图谱，依据标准谱库检索功能对待测样品进行比对分析，自动给出相似度匹配得分，如图5所示，方便香精香料的质量稳定性和差异性快速分析。
[0102] 5.6实际应用
[0103] 5.6.1为了考察同比例稀释对样品分析的结果的影响，实验对香精A和香料B分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍，进行高分辨质谱分析，结果见表9和表10。由表分析可知，香精香料中的成分同比例变化时，浓度同比例增加，其匹配度降低，同比例缩小，结果无匹配结果。
[0104] 表9等比例稀释香精A的相似度匹配得分
[0105]
[0106] 表10等比例稀释香料B的相似度匹配得分
[0107]
[0108] 5.6.2不同批次香精香料的差异性分析
[0109] 试验对不同批次的香精A和香料B进行FT-ICR MS分析，不同批次分析结果见表11和表12，由表分析可知，1000是基准值，不同批次香精香料的峰纯度得分最低在980，正相似度匹配得分最低为982，反向相似度匹配得分为981，匹配得分的高低反应待测样品与标准样品之间的质量差异性，就是看待测样品与标准样品是否一致，因此，以不同批次香精香料的最低波动值作为香精香料质量差异性评判的最低限，即不同批次香精香料与标准香精香料的指纹谱图相比较，P、F、R值不能低于980，才算产品质量合格。P值和F值越接近1000匹配度越高；F值越低，说明待测样品与标准谱库相比，特征离子峰缺失越多；R值越低，说明待测样品与标准谱库相比，多出的峰比较多；F和R值均影响P值。
[0110] 表11不同批次香精A的相似度匹配得分
[0111]
[0112]
[0113] 表12不同批次香料B的相似度匹配得分
[0114]
[0115] 5.6.3实际样品的差异性分析
[0116] 应用上述方法，对6个标段24个香精香料样品进行FT-ICR MS分析，以6个标段的香精香料标样建立标准谱库，应用DataAnalysis进行差异性分析，中标结果与分析结果一致。说明FT-ICR MS分析香精香料具有快速、表征全面、准确的特点，适于香精香料的质量差异性分析。
[0117] 表13 6个标段香精香料的相似度匹配得分
[0118]
[0119]
[0120] 本发明提供了一种快速、全面、准确、便捷的分析烟用香精香料的方法，即采用傅立叶变换离子回旋共振质谱仪对烟用香精香料进行分析，采集烟用香精香料的指纹信息，建立烟用香精香料的指纹图谱，用于烟用香精香料的质量控制和差异性分析。本发明的方法适于不同的香精香料，如配方模
块、香精、料液、酊剂及香原料。
[0121] 本发明具有以下优点：(1)样品前处理简便，直接进样分析，实现快速且进样无损失；(2)具有快速分析的特点，普通色谱分析一般要几十分钟，本发明20张叠加谱图采集时间不到1分钟；(3)无需色谱柱分离，避免了色谱柱在样品分离时对组分的选择性，能够全面的表征香精香料的特征组成(质量扫描范围150-3000)；(4)由于其超高分辨能力(分辨率100万)，避免了色谱峰的重叠现象，分析烟用香精香料更准确。
