1.一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、仪器准备：液氮罐、高速冷冻离心机、灭菌锅、超级纯水仪、电热恒温水箱、超级低温冰箱、紫外分光光度计、PCR仪、通风橱、电泳槽、小型涡旋仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、转膜仪、烧杯、天平、移液管、研钵研棒和荧光实时定量PCR仪；
步骤二、植物材料准备：用于山核桃Aux/IAA基因克隆的实验样品，选取山核桃的嫁接枝条进行采集，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，用作样品并存放入-70℃环境中备用；用于qRT-PCR和Western blot的样品，选取长势相似的两年生的实生苗砧木和留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生苗的接穗，并在实验基地中完成嫁接，采用两种不同的生长激素：IAA 4mg/l，NPA 0.3ug/l来处理山核桃接穗，时间为30min，砧木用蘸有激素的毛笔蘸湿。对照组用清水处理。在山核桃嫁接之后0天，1天，3天，5天，7天，14天采样，共有36个不同的样品，我们对每一个样品准备25个重复并用锡箔纸包好后立即放入液氮中，并存放于-70℃保存后备用。
样品编号如下：
对照组接穗：j0，j1，j3，j5，j7，j14；
对照组砧木：z0，z1，z3，z5，z7，z14；
IAA处理接穗：Ij0，Ij1，Ij3，Ij5，Ij7，Ij14；
IAA处理砧木：Iz0，Iz1，Iz3，Iz5，Iz7，Iz1；
NPA处理接穗：Nj0，Nj1，Nj3，Nj5，Nj7，Nj14；
NPA处理砧木：Nz0，Nz1，Nz3，Nz5，Nz7，Nz14；
步骤三、总RNA提取并检测：在实验室中，对经步骤二采集后的嫁接枝条样品进行总RNA的提取，获得嫁接枝条样品的总RNA提取液，并从总RNA的提取液中吸取2ul进行OD值测定，检测质量与浓度，从总RNA的提取液中吸取4ul与Buffer混匀后进行电泳检测；
步骤四、Aux/IAA基因的RACE扩增：步骤如下：
1)RACE引物设计：利用山核桃454测序数据库，找到一个320bp的生长素IAA基因，运用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物如下：
GSP1：GTTCTTCTCTGTCATCTGTCCCCCG
GSP2：TCAGAGAGGGAAGGCTACAAGGGGT
IAA-F：ATGGAAAGCAAGGTAGCATATG
IAA-R：TCATACTCCACATCCCAAGCCTC
2)扩增第一链cDNA：操作步骤如下：
①在两个200ul离心管中分别加入2.0ul 5×First-Stand Buffer，1.0ul DTT，1.0ul dNTP Mix混匀，轻微离心至底部，待用；
②在另两个200ul的离心管中加入2ul总RNA，在合成5’-RACE-Ready cDNA的离心管中加入1ul 5’-CDS Primer和0.75ul双蒸水；在合成3’-RACE-Ready cDNA的离心管中加入1ul 
3’-CDS Primer和1.75ul双蒸水，混合均匀，轻微离心至管底；
③对步骤②中的混合液72℃温育3min，42℃2min，瞬时离心；
④在合成5’-RACE-Ready cDNA的离心管中再加入1ul SMART Ⅱ A Oligo，混匀；
⑤在步骤①中的混合液中加入0.25ul RNase Inhibitor和1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase，混匀，PCR反应：42℃90min；72℃10min；
⑥加入100ul双蒸水稀释，保存在-20℃冰箱备用。
3)RACE扩增；以获得的5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA为模板分别进行5’和3’RACE-PCR反应，扩增5’和3’cDNA末端。RACE反应体系为50ul，内含10×UPM 5ul、基因特异性引物1ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、双蒸水16.5ul、模板2.5ul。RACE扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
4)阳性片段回收；对经过步骤3)所获得的5’和3’cDNA末端扩增产物割胶回收，操作步骤如下：
①利用1％琼脂糖凝胶电泳跑完胶，再用干净的手术刀把含有目的片段的胶块切割下来，最后放入已经编好号的1.5ml离心管中；
②依据胶块重量加入3倍体积的Buffer B2；
③在37℃水浴锅中水浴10min直至被完全融化；
④把融化完全的溶液移入吸附柱，12000rpm，离心1min，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱继续放进同样的收集管中；
⑤参照第④步重复一遍；
⑥往吸附柱里面加入700ul的Wash solution，12000rpm，离心1min，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱重新放到收集管里面；
⑦参照第⑥步重复一遍；
⑧将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm，离心1min；
⑨往吸附膜中央加入30ul Elution buffer，室温静置1min，将吸附管与新的离心管放入离心机中，12000rpm，离心1min；
⑩将DNA溶液放在-20℃下保存。
5)PCR回收产物和PMD18-T载体连接：在PCR回收产物与载体连接前必须添加PolyA尾巴，以获得的回收产物DNA为模板，加PolyA尾反应体系为10ul：内含10×Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Mg2+1.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水0.8ul，模板3ul；PCR反应条件为：72℃延伸
20min。外源DNA和质粒载体的连接反应，在200ul PCR管中反应，操作步骤如下：
①配制DNA溶液5ul：1.0ul的Pmd 18-T vector、0.1mol～0.3mol(4ul)的目的DNA；
②加入5ul的Solution Ⅰ，在16℃下连接过夜(10小时以上)。
6)制备感受态并转化：
感受态的制备步骤如下：
①受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜(12h左右)；将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250ul菌液转接到25ml LB液体的培养基里面，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右；
②感受态的细胞制备：在超净工作台上，将细菌液体转入50ml离心管中，然后冰上放置
10min；在4℃下，4000r/min，离心10min，弃去上清并将管倒置1min以便培养液流尽；用在冰上已经预冷的0.1mol/l的CaCl2溶液10ml轻轻重悬细胞，然后冰上放置30min；0～4℃
4000r/min，离心10min，然后弃去上清并且加入2ml预冷的0.1mol/l的CaCl2溶液，再轻轻重悬细胞，必须冰上放置；
③感受态的细胞分装与冻存：在2ml已经制备完全的感受态的细胞里面加入2ml30％甘油(即1:1体积，甘油终浓度15％)；将此感受态细胞分装成每份200μL(1.5ml dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
将连接过夜的产物转化，操作步骤如下：
①将感受态的细胞在冰上溶化并且加入需要转化的10ul连接产物，冰上放置30min；
②42℃水浴锅中热击45s，冰上放置2min；
③加入750ul LB(不含Amp)培养基，200rpm 37℃恒温摇床来培养1h左右；
④4000rpm离心5min，留100ul涂板(含Amp)；
⑤37℃倒置培养12-16小时左右。
7)细菌检测：操作步骤如下：
①1.5ml离心管加入1ml LB(含Amp)培养基；
②挑取单菌落(>3个)；
③200rpm、37℃恒温摇床来培养5h左右；
④验证：以菌液为模板，菌检反应体系为25ul：内含内含10×Buffer 2.5ul、dNTP 2ul、Mg2+1.5ul、rTaq酶0.2ul、上下游引物各2.5ul、双蒸水10.8ul、模板3ul。菌检反应条件为：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
⑤1％琼脂糖的凝胶电泳检测；
⑥重摇含有目的基因的菌液，测序，然后由5’和3’cDNA末端序列拼接得到全长cDNA序列。
步骤五、CcIAA基因验证和分析：根据全长序列设计的引物，进行验证。用5’-RACE-Ready cDNA为模板进行PCR，反应体系为50ul，内含上下游引物各3ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、双蒸水16ul、模板3ul。PCR扩增条件为：94℃1min；94℃30s，67℃30s，72℃1min 
30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增后的产物割胶回收，并加PolyA尾后利用pMD-
18T载体连接并测序，得到全长序列。测定得到的序列利用NCBI，DNAMAN软件搜索并对同源性进行比对以及推导氨基酸的序列；
步骤六、CcIAA基因生物信息学的分析：利用在线软件分析CcIAA蛋白质理化性质；
Clustalx软件来进行序列的比对；DNAMAN软件对蛋白序列进行比对；DNAMAN软件来构建系统的进化树并进行分析；
步骤七、CcIAA基因在转录水平上的分析：步骤如下：
1)提取山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA；
2)对内参与目的基因进行引物设计：根据CcIAA的cDNA序列，运用Primer premier 5.0软件设计基因引物三对：
Aux/IAA-f-1：5’-ATGGAGATTGGATGCTGGTTGG
Aux/IAA-r-1：5’-TGGGTTGCTGTGACTTGTAGGT
Aux/IAA-f-2：5’-CTGGTTGGAGATGTTCCGTGGGA
Aux/IAA-r-2：5’-CTGGGTTGCTGTGAGTTGTAGGT
Aux/IAA-f-3：5’-CAGGCTGAGGCTGCTGGTATTTA
Aux/IAA-r-3：5’-ATTCCGACCCCTTGTAGCCTTCC
Primer premier 5.0软件设计引物：
a-F(Cc-actin内参引物)5’-GCTGAACGGGAAATTGTC
a-R(Cc-actin内参引物)5’-AGAGATGGCTGGAAGAGG
3)合成cDNA第一链：反转录反应体系为10ul体系，所述的反应体系如下：在200ul反应管中加入模板RNA 1.0ul，OligdT 1.0ul，双蒸水6.0ul，反应条件为70℃5min，冰浴10min；
然后在该反应管中加入5×Reverse Transcription M-MLV Buffer 2.0ul，dNTP 0.5ul，RNA酶抑制剂0.25ul和逆转录酶(M-MLV)0.25ul，反应条件为42℃60min，70℃15min；
4)验证模版与引物：以反转录好的cDNA为模板，挑选一对合适的目的基因引物进行荧光定量RT-PCR。反应体系为25ul体系：内含上下游引物各2.5ul，10×Buffer 2.5ul，dNTP 
2+
2ul，Mg 1.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水10.8ul，反转录好的cDNA模板3ul。PCR扩增反应条件：
94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；然后72℃延伸5min，1％琼脂糖凝胶电泳检测；
5)实时荧光定量PCR：采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒，编号TaKaRa Code：DRR041A。以反转录好的cDNA为模板，反应体系为10ul体系：内含上下游引物各0.2ul，SYBR Premix Ex TaqTM(5×)5ul，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)
0.2ul，双蒸水3.4ul，反转录cDNA模板1ul。荧光定量PCR反应条件：95℃30s；95℃15s，60℃
15s，共40个循环，在Bio-RAD荧光定量PCR仪上进行。
步骤八、CcIAA基因在翻译水平上的表达分析：对不同时期山核桃嫁接茎上的总蛋白进行提取并检测，然后通过Western blot技术了解CcIAA基因在山核桃嫁接过程中的翻译水平表达情况。
2.如权利要求1所述的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：所述的步骤三中的总RNA的提取步骤和步骤七中山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA的提取步骤如下：
1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4ml CTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；
2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀(1min)，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀(每隔10min)加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min；
3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1(氯仿：异戊醇)上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
4)重复第3)步，直至中间层消失；
5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20℃冰箱中静置30min～1h；
6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
7)再加入65℃预热好的SSTE 0.3ml，待沉淀溶解完全后转入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，在冰上放置3min，再加入氯仿0.2ml，冰上静置5min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心15min；
8)将离心后的上清液装入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置10min，混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
9)将收集到的沉淀加入处理的75％乙醇1ml，将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子，4℃，
12000rpm，离心3min；
10)将液体倒掉，再加入1ml 75％乙醇洗涤一次；
11)4℃，12000rpm，离心5min，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据沉淀加入合适的DEPC水来溶解沉淀(50ul)，然后保存备用。
3.如权利要求1所述的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：所述的步骤三中的总RNA的提取步骤如下：
1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4ml CTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；
2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀(1min)，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀(每隔10min)加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min；
3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1(氯仿：异戊醇)上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
4)重复第3)步，直至中间层消失；
5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20℃冰箱中静置30min～1h；
6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
7)在沉淀中加入600ul裂解液RTL Plus，4℃，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
8)将混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置1min，13000rpm离心30s，将废液倒掉；
10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；
12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ul ddH2O，室温下放置1min，12000rpm，离心1min，获得溶解好的RNA。
4.如权利要求1所述的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：所述的步骤八中山核桃嫁接茎上的总蛋白的提取步骤如下：
1)取700mg的山核桃嫁接部位的新鲜组织，把样品放在研钵中用液氮磨样，把磨碎的样品放在10ml离心管中；
2)用8ml预冷的沉淀缓冲液(在丙酮中加入10％的三氯乙酸和0.07％β-巯基乙醇)重悬样品；
3)上下颠倒离心管15s，然后-20℃冰箱中静置1h，在离心机中16000rpm离心15min；
4)慢慢的倒掉上清液，向沉淀中加入8ml预冷的漂洗液(含有0.07％β-巯基乙醇的丙酮)，-20℃冰箱静置1h，16000rpm离心10min；
5)慢慢弃掉废液，沉淀部分在蛋白真空冷冻机中干燥2h，然后用玻璃棒轻轻捣碎沉淀；
6)用溶解缓冲液重悬粉末，一般10～30ul/mg粉末，这种缓冲液包含尿素，去污剂(Triton-X 100)，还原剂(DTT)和IPG缓冲液；
7)在室温条件下4000rpm离心4min，取上清，重复一遍；
8)上清液保存在-80℃冰箱中。
5.如权利要求1所述的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：所述的步骤八中山核桃嫁接茎上的总蛋白的检测步骤如下：
1)SDS-PAGE凝胶配制；
2)上样和电泳：取10μl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量为20μl。再取10μl样品蛋白溶液，加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5μl和10μl。电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳；
3)凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1h左右；
4)脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
6.如权利要求1所述的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：所述的步骤八中Western blot技术包括蛋白质电泳、转膜、免疫反应、X射线曝光和洗照片。